2 od microscopía de luz
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Microscopio, del griego: "mikro" = pequeño y "scopeõ" = mirar (para mirar cosas pequeñas)
MICROSCOPÍA MICROSCOPÍA
DE LUZ
MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA
se clasifican en:
De acuerdo con la radiación que utilizan
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La naturaleza de la luz • Puede ser descrita mediante dos modelos:
– Por su forma de propagación, naturaleza ondulatoria (James Clerk Maxwell)
– Por su forma de interactuar con la materia, naturaleza corpuscular ó fotónica (Albert Einstein)
• Forma parte del espectro electromagnético • Luz blanca está constituida por varios colores diferentes (Isaac
Newton)
Espectro electromagnético
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ESPECTRO VISIBLE
ESPECTRO ELECTROMAGNÉTICO
Luz visible Forma parte de una estrecha franja que va
desde longitudes de onda de 400 nm (violeta) hasta los 700 nm (rojo). (0.4 – 0.7 mm)
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El espectro de luz visible puede ser percibido
por el ojo humano y su frecuencia determina su
color.
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Las Lentes
• Objetos que concentran o hacen
diverger los rayos de luz
• Existen dos tipos principales de
lentes:
Convergentes: forman imágenes
reales
Divergentes: forman imágenes
virtuales
Lentes convergentes
Lentes divergentes
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Amplificación Vacía: Incremento de la imagen sin que pueda percibirse mayores detalles.
Amplificación total: Dado por el producto de la lente ocular por el objetivo.
Amplificación: Aumento del tamaño de la imagen.
Conceptos en microscopía Ocular 10x
Objetivo 10x
Aumento Total 100x
Poder de Resolución: Medida de la capacidad para ver puntos vecinos como entidades diferentes. El límite de resolución del microscopio de luz es de 0.2 micrómetros (0.22 μm) ó 200nm.
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• Milímetro: milésima parte del metro (mm)
• Micrómetro: milésima parte del milímetro (mm)
• Nanómetro: milésima parte del micrómetro (nm)
• Angstrom: décima parte del nanómetro (Aº)
Medidas Microscópicas
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Microscopio
compuesto
fabricado en
1751 por
Magny.
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El microscopio compuesto • Instrumento óptico que se usa para
aumentar o amplificar las imágenes de objetos y organismos no visibles a simple vista.
• Se utiliza para examinar objetos transparentes o cortados en láminas tan finas que se transparentan
• Está conformado por tres sistemas:
1. Iluminación 2. Óptico 3. Mecánico
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Formación de la imagen
LENTE INTRAOCULAR
Genera la imagen sobre la retina que es la que el cerebro interpreta
LENTE OCULAR
Amplifica la imagen anterior y forma una IMAGEN VIRTUAL
LENTE OBJETIVO
Amplifica la imagen y forma: IMAGEN REAL E INVERTIDA
CONDENSADOR
Concentra los rayos dispersos e ilumina solo la muestra
FUENTE DE LUZ
Imprescindible para que funcione el microscopio
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• El contraste lo provee la tinción de las
muestras
Imágenes con microscopio
de campo claro
1. Campo claro, brillante o luminoso:
La luz proveniente de la fuente converge sobre la muestra se forma un
campo brillante alrededor de la imagen de la muestra.
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MICROSCOPIOS DE CAMPO CLARO, BRILLANTE Ó LUMINOSO
Microscopio óptico convencional Microscopio óptico convencional con doble óptica para
aprendizaje
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TEMPORALES
FIJAS
Muestra +Colorante + Medio de Montaje
Muestra + Fijadores + Tinción + Medio de Montaje
Cubreobjeto Portaobjeto
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• Permite observar muestras vivas, o carentes de color.
• sin uso de colorantes
2. Contraste de Fases:
Convierte la diferencia de índices de
refracción en diferencias de intensidad.
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Fibroblastos teñidos con el fluorocromo FITC
Bacillus subtilis esporulando teñidos con FITC, DAPI y
βgalactosidasa.
3. Fluorescencia:
Utiliza moléculas fluorescentes que al iluminarlas con radiación invisible, emiten radiación
visible.
Utiliza luz de longitud de onda corta (uv) para excitar los electrones de la muestra.
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La muestra se “tiñe” con una sustancia fluorescente (fluorocromos) que absorbe la energía de las ondas cortas de la luz y emite la luz de longitudes de ondas más largas (verde).
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• Se basa en la birrefringencia (emite brillantez) de los objetos.
• Utiliza luz polarizada plana.
• Las muestras se colocan entre dos láminas polaroid que tienen sus direcciones de vibración perpendiculares
Cristales de ácido urico observados con microscopio de luz polarizada
4. DE LUZ POLARIZADA:
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5. MICROSCOPIO DE CAMPO OSCURO
• Dispositivo que permite transmitir la luz de forma circular, dejando el centro oscuro.
• Con esto conseguimos que el fondo de la muestra aparezca negro y los especímenes brillantes.
• El objeto iluminado dispersa la luz y se hace así visible contra el fondo oscuro que tiene detrás, como las partículas de polvo iluminadas por un rayo de sol que se cuela en una habitación cerrada.
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• Las porciones transparentes del
espécimen quedan oscuras, mientras que las superficies y partículas se ven brillantes, por la luz que reciben y dispersan en todas las direcciones
• Se utiliza para analizar elementos biológicos transparentes y sin pigmentar, invisibles con iluminación normal, sin fijar la muestra, es decir, sin matarla.
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Utiliza muestras de cortes seriados teñidas con fluorescencia, para reconstruir una imagen tridimensional
6. Confocal: Combina la microscopía fluorescente con el análisis
electrónico de la imagen para obtener imágenes tridimensionales.
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Microscopio confocal
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MICROSCOPIA OPTICA
CAMPO CLARO Requiere tinciones
CONTRASTE DE FASES
Permite diferenciar densidades, no
tinciones
FLUORESCENCIA Utiliza luz UV, usa
fluorocromos
DE LUZ POLARIZADA Produce birrefringencia
CAMPO OSCURO Permite ver muestras
vivas, no tinciones
CONFOCAL Forma imágenes 3D