7/22/2019 2008 Nad

1/80

1

KINETIKA INHIBISI EKSTRAK ETANOL SELEDRI (ApiumgraveolensL.) DAN FRAKSINYA TERHADAP ENZIM XANTIN

OKSIDASE SERTA PENENTUAN SENYAWA AKTIFNYA

NADINAH

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2008

7/22/2019 2008 Nad

2/80

2

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN

SUMBER INFORMASI

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Kinetika Inhibisi Ekstrak

Etanol Seledri (Apium graveolensL.) dan fraksinya terhadap Enzim XantinOksidase serta Penentuan Senyawa Aktifnya adalah karya saya dengan arahan

komisi pembimbing dan Belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan

tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang

diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks

dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.

Bogor, Agustus 2008

Nadinah

G452050081

7/22/2019 2008 Nad

3/80

3

ABSTRACT

NADINAH. Inhibition kinetic of Apium graveolens L. ethanol extract and itsfraction on the Activity of Xanthine Oxidase Enzyme and Active Compound

Determination. Under direction of DYAH ISWANTINI PRADONO andLATIFAH K. DARUSMAN.

Apium graveolens is one of the traditional medicinal plants that has a

potential as antigout. It has been reported that flavonoid ofApium graveolens

could inhibit activity of xanthine oxidase enzyme up to 85.44 % (Ramdhani.

2004). The aim of the research was to investigate the type inhibition kinetic of

Apium graveolenss ethanol crude extract, and its the fraction kinetic of inhibition,

also the determination of active compound. The result of the research showed that

Apium graveolenss 10.40% ethanol crude extract was 10.40 % (LC50 1968.19

ppm) with the yield of inhibitory power was 6.04 % until 74.01 % (100 2000

ppm). Inhibition kinetic of 1500 ppm crude extract caused increase of KM(0.10

mM) and unchanged of Vmax. Based on that, the type of inhibition wascompetitive. Purification of crude extract resulted 7 fractions and the highest

activity was achieved by fraction 6 (inhibitory power was 85.08 %). The

purification of crude extract caused the increasing of inhibitory power effect.

Inhibition kinetic of fraction 6 (150 ppm) caused increase of KM (0.30 mM) andunchanged of Vmax. Based on that, the type of inhibition was competitive.

Purification of fraction 6 resulted 6 fraction and the highest activity was achievedby fraction 5 (inhibitory power was 88.41 %). Based on analysis of LCMS and

NMR, the active compound of Apium graveolens extract (fraction 5) werepotential to inhibit the activity of xanthine oxidase, the active compound was 5,7-

dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-one and 2,3-dihydro-6-hidroxy-5-benzofuran carboxylic acid.

Keywords : Apium graveolens, flavonoid, xanthine oxidase enzyme, inhibition

kinetic

7/22/2019 2008 Nad

4/80

4

RINGKASAN

NADINAH. Kinetika Inhibisi Ekstrak Etanol Seledri (Apium graveolensL.) danfraksinya terhadap Enzim Xantin Oksidase serta Penentuan Senyawa Aktifnya.

Dibimbing oleh DYAH ISWANTINI PRADONO dan LATIFAH K.DARUSMAN.

Tumbuhan berbunga yang berpotensi sebagai tumbuhan obat di Indonesia

ada sekitar 30000 spesies tumbuhan (Dirjen Bina Produksi Hortikultura 2002),

diantara tumbuhan yang diakui khasiatnya adalah seledri (Apium graveolensL.).

Seledri (Apium graveolens L.) merupakan salah satu tumbuhan obat tradisional

yang diketahui memiliki potensi sebagai obat asam urat. Telah dilaporkan bahwa

flavonoid asal seledri mampu menghambat enzim xantin oksidase (enzim yang

dapat mnyebabkan terjadinya asam urat) hingga 85,44 % (Rambhani 2004).

Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui mekanisme kinetika

inhibisi yang terbentuk dari ekstrak kasar etanol dan untuk mengetahui

mekanisme kinetika inhibisi hasil fraksinasinya serta penentuan senyawa aktifyang berperan dalam menghambat enzim xantin oksidase. Sementara manfaat dari

penelitian ini adalah memberikan informasi tentang mekanisme inhibisi ekstrak

dan hasil fraksi seledri sebagai inhibitor enzim xantin oksidase serta mengetahui

senyawa aktif yang berperan sebagai inhibitor enzim xantin oksidase. Metode dalam penelitian ini meliputi pembuatan ekstrak etanol seledri, uji

fitokimia untuk mengetahui keberadaan senyawa metabolit sekunder, uji toksisitas(LC50), uji inhibisi (untuk mencari konsentrasi terbaik yang memiliki daya inhibisi

tertinggi), fraksinasi (untuk pemurnian sampel), uji kinetika (untuk mengetahuimekanisme kinetikanya), serta penentuan struktur senyawa aktifnya menggunakan

Fourir Transformation Infra Red (FT-IR) yang digunakan untuk menganalisiskualitatif keberadaan gugus fungsi senyawa yang berperan dalam menghambat

enzim xantin oksidase,High Performance Liquid Chromatography (HPLC) yang

digunakan untuk analisis kualitatif pemurnian senyawa aktifnya, Liquid

Chromatography Mass Spectroscopy(LC-MS) untuk menentukan bobot molekul,

Nuclear Magnetik Resonance(NMR) untuk menentukan strukturnya.

Hasil penelitian menghasilkan ekstrak kasar etanol sebesar 10,40% (LC501969,18 ppm) dengan efek inhibisi 6,04 % hingga 74,01% (100-2000 ppm).

Kinetika inhibisi dari ekstrak kasar etanol pada konsentrasi 1500 ppm

menyebabkan peningkatan nilai KM(0,10 mM atau meningkat sebesar 134,48 %)

dari 0,29 mM menjadi 0,39 mM dengan perubahan Vmax yang sangat kecil.

Berdasarkan hasil tersebut dapat dikatakan inhibisi hambatan yang terjadi

mengarah pada mekanisme inhibisi kompetitif. Pemurnian ekstrak kasar

menghasilkan 7 fraksi dan aktivitas tertinggi dimiliki oleh fraksi 6 dengan dayainhibisi mencapai 85,08 %. Kinetika inhibisi dari fraksi 6 dengan konsentrasi 150ppm menyebabkan peningkatan nilai KM (0,30 mM atau meningkat sebesar

203,45 %) dari 0,29 mM menjadi 0,59 mM dengan perubahan Vmaxyang sangatkecil. Pemurnian fraksi 6 dengan menggunakan High Performance Liquid

Chromatography (HPLC) diperoleh 6 fraksi dan dan fraksi 5 merupakan fraksiteraktif dengan daya inhibisi mencapai 88,41 %. Berdasarkan hasil analisisLiquid

Chromatography Mass Spectroscopy(LC-MS) danNuclear Magnetik Resonance

7/22/2019 2008 Nad

5/80

5

(NMR), Senyawa aktif yang berasal dari ekstrak seledri (fraksi 5) yang telah

dimurnikan kembali dengan High Performance Liquid Chromatography (HPLC)yang dapat menghambat enzim xantin oksidase diduga adalah senyawa 5,7-

dihidroksi-2-(4-hidroksipenil)-4H-1-benzopiran-4-on dan asam 2,3-dihidro-6-hidroksi-5-benzofuran karboksilat.

Kata-kata kunci : selederi, flavonoid, enzim xantin oksidase, kinetika inhibisi

7/22/2019 2008 Nad

6/80

6

Hak Cipta Institut Pertanian Bogor, tahun 2008

Hak Cipta dilindungi undang-undang

1. Dilarang mengutip sebagaian atau seluruh karya tulis ini tanpamencantumkan atau menyebutkan sumber

a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian,

penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau

tinjauan suatu masalahb. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB

2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karyatulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB

7/22/2019 2008 Nad

7/80

7

KINETIKA INHIBISI EKSTRAK ETANOL SELEDRI

(Apium graveolensL.) DAN FRAKSINYA TERHADAP ENZIM

XANTIN OKSIDASE SERTA PENENTUAN SENYAWA

AKTIFNYA

NADINAHG452050081

TesisSebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Magister Sains pada

Program Studi Kimia

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2008

7/22/2019 2008 Nad

8/80

8

Penguji Luar Komoisi pada Ujian Tesis Dr Djarot S Hamiseno

7/22/2019 2008 Nad

9/80

9

Judul Tesis : Kinetika Inhibisi Ekstrak Etanol Seledri (Apium graveolens

L.) dan fraksinya terhadap Enzim Xantin Oksidase serta

Penentuan Senyawa Aktifnya

Nama : Nadinah

NRP : G452050081

Disetujui

Komisi Pembimbing

Dr. Dyah Iswantini Pradono. M.Agr Prof. Dr. Ir. Latifah K. Darusman,

MSKetua Anggota

Diketahui

Ketua Program Studi Kimia Dekan Sekolah Pascasarjana

Prof. Dr. Ir. Latifah K. Darusman, MS Prof. Dr. Ir. Khairil A. Notodiputro,

MS

Tanggal Ujian : Tanggal lulus :

7/22/2019 2008 Nad

10/80

10

PRAKATA

Puji dan Syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala Rahmatdan Karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Penelitian

dengan judul Kinetika Inhibisi Ekstrak Etanol Seledri (Apium graveolensL.)danFraksinya serta Penentuan Senyawa Aktifnya dapat diselesaikan selama 12 bulan

mulai dari Mei 2007 sampai dengan Mei 2008 bertempat di Laboratorium Kimiaanalitik dan Pusat studi Biofarmaka IPB, laboratorium Departemen Kelautan

Sukabumi dan Laboratorium Kimia LIPI serpong.

Terima Kasih penulis ucapkan kepada berbagai pihak yang telah

membantu dalam penyelesaian karya ilmiah ini, antara lain Ibu Dr. Dyah

Iswantini Pradono, MAgr dan Ibu Prof. Dr. Ir. Latifah Kosim Darusman, MS

selaku komisi pembimbing dan selaku ketua Program Studi Kimia Sekolah

Pascasarjana IPB, serta bapak Dr. Muhammad Hanafi MSc dari LIPI Serpong

yang telah membantu menganalisis struktur senyawa aktif. Terima kasih kepada

Pusat Studi Biofarmaka yang telah mendanai sebagaian dari penelitian ini dan

telah diikutkan dalam kegiatan riset melalui penelitian tentang penyakit asam urat.Ungkapan terima kasih juga diungkapkan khusus kepada ayahanda tercinta

M.Sarimin dan ibunda tercinta Tri Payem, ayunda tercinta Titi Almi dan adik-

adikku tercinta, W. Mulyatno Saputra, Parno Mulyadi, M. Rezeki Farhan dan S.

Ana Sahroni serta Totok Eka Suharto yang selalu memberikan semangat dandukungan dalam penyelesaian karya ilmiah ini. Di samping itu ucapan terima

kasih juga disampaikan kepada Pak Eman, Laboran PSB, mbak Siti dariLaboratotium Kimia bersama, pak Hery dari Laboratorium Kelautan Sukabumi,

Rahma Juwita, Ramdhan Hidayat, semua teman-teman Kimiapasca 2005 yangbanyak membantu dan selalu menjaga kebersamaan.

Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat, amin.

Bogor, Agustus 2008

Nadinah

7/22/2019 2008 Nad

11/80

11

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Sragen pada tanggal 23 maret 1980 sebagai anak

pertama dari lima bersaudara, anak pasangan M. Sarimin dan Tri Payem.Pendidikan sarjana ditempuh di Jurusan Kimia, Fakultas Keguruan dan Ilmu

Pendidikan, Universitas Bengkulu, dan lulus pada tahun 2002 sebagai sarjanapendidikan. Penulis pernah bekerja di bank permata pada tahun 2003-2004 di

Jakarta, dan pada tahun 2005 penulis melanjutkan studi program pascasarjana di

Institut Pertanian Bogor.

7/22/2019 2008 Nad

12/80

12

DAFTAR ISI

HalamanDAFTAR TABEL.................................................................................... xii

DAFTAR GAMBAR................................................................................ xiiiDAFTAR LAMPIRAN............................................................................ xiv

PENDAHULUAN.................................................................................... 1

Latar Belakang.............................................................................. 1

Tujuan Penelitian ......................................................................... 3

Manfaat Penelitian........................................................................ 3

Hipotesis....................................................................................... 3

TINJAUAN PUSTAKA

Seledri (Apium graveolens L.)..................................................... 4

Xantin Oxidase............................................................................. 5

Flavonoid dan alkaloid................................................................. 6 Gout (asam urat)........................................................................... 7

Obat Gout...................................................................................... 9

Kinetika Inhibisi Enzim................................................................ 12

Penelitian tentang kinetika inhibisi enzim xantin oksidase.......... 18Fourir Transformation Infra Red(FT-IR)........ 19

High Performance Liquid Chromatography(HPLC)................... 19Liquid Chromatography Mass Spectroscopy(LC-MS)................ 20

Nuclear Magnetik Resonance(NMR).......................................... 21

BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian....................................................... 22

Bahan dan Alat ............................................................................. 22

Metode Penelitian ......................................................................... 22

Ekstraksi Etanol ................................................................ 22

Uji Toksisitas ekstrak terhadap Artemia Salina L ............ 23

Uji daya inhibisi terhadap enzim xantin oksidase ............ 23

Uji kinetika inhibisi terhadap enzim xantin oksidase........ 24

Fraksinasi ekstrak kasar etanol.......................................... 25

Identifikasi fraksi teraktif ................................................. 26

HASIL DAN PEMBAHASAN

Ekstraksi Etanol ............................................................................ 27

Uji Fitokimia dan Uji Sitotoksin (LC50)........ 27Daya Inhibisi Ekstrak kasar Etanol Herba terhadap EnzimXantin Oxidase.............................................................................. 28

Uji Kinetika Ekstrak Kasar Etanol terhadapEnzim Xantin Oksidase................................................................. 29

Fraksinasi Ekstrak Etanol Herba Seledri....................................... 31Daya inhibisi hasil fraksinasi terhadap

enzim xantin oksidase................................................................... 32

7/22/2019 2008 Nad

13/80

13

Kinetika inhibisi hasil fraksinasi terhadap

enzim xantin oksidase.................................................................... 34Identifikasi Fraksi teraktif.............................................................. 35

Analisis dengan menggunakan Fourir TransformationInfra Red(FT-IR)............................................................. 35

Analisis dengan menggunakanLiquid ChromatographyMass Spectroscopy (LC-MS).......................................... 36

Analisis dengan menggunakanNuclear MagneticResonance(NMR) .......................................................... 37

SIMPULAN DAN SARAN...................................................................... 39

DAFTAR PUSTAKA ............................................................................... 40

LAMPIRAN.............................................................................................. 44

7/22/2019 2008 Nad

14/80

14

DAFTAR TABEL

Tabel Halaman

1 Metode penentuan kinetika inhibisi enzim................................. 17

2 Fitokimia ekstrak kasar etanol ................................................... 27

3 Fitokimia hasil kromatografi ..................................................... 32

4 Nilai spektrum fraksi 6............................................................... 36

5 Daya inhibisi fraksi 6 yang telah dimurnikan lagi

dengan HPLC............................................................................. 36

7/22/2019 2008 Nad

15/80

15

DAFTAR GAMBAR

Gambar Halaman

1 Pengubahan xantin menjadi asam urat.............................................. 5

2 Struktur enzim xantin oksidase ........................................................ 6

3 Protein dan pembentukan asam urat ................................................ 9

4 Struktur allopurinol .......................................................................... 10

5 Struktur flavonoid apigenin ............................................................. 11

6 Pola kinetika yang terbentuk akibat adanya inhibitor kompetitif .... 14

7 Struktur Allopurinol dan struktur xantin .......................................... 15

8 Pola kinetika yang terbentuk akibat

adanya inhibitor unkompetitif............................................................ 15

9 Pola kinetika yang terbentuk akibat

adanya inhibitor nonkompetitif.......................................................... 16

10 Daya inhibisi ekstrak kasar etanol..................................................... 29

11 Pola kinetika inhibisi ekstrak kasar etanol......................................... 30

12 Eluen terbaik (CHCl3: MeOH = 9,5 : 0,5)........................................ 31

13 Daya inhibisi hasil kromatografi........................................................ 33

14 Perbandingan daya inhibisi ekstrak kasar dengan

hasil kromatografi.............................................................................. 34

15 Polakinetikahasilkromatografi........................................................... 35

16 Senyawa 1 : 5,7-dihidroksi-2-(4-hidroksipenil)

-4H-1-benzopiran-4-on..................................................................... 37

17 Senyawa 2 : asam 2,3-dihidro-6-hidroksi-5-benzofuran

Karboksilat....................................................................................... 37

7/22/2019 2008 Nad

16/80

16

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran Halaman

1 Diagram Alir Penenlitian............................................................ 44

2 Kadar Air.................................................................................... 45

3 Uji Toksisitas dan Kurva Standar Xantin................................... 46

4 Daya inhibsi ekstrak kasar etanol terhadap xantin oksidase....... 47

5 Kinetika inhibisi ekstrak kasar.................................................... 49

6 Profil Pola pemisahan ekstrak etanol herba seledri

pada berbagai eluen..................................................................... 51

7 Profil Spesifikasi dan pola pemisahan hasil kromatografi.......... 52

8 Rendemen hasil kolom, fitokimia dan nilai toksisitas................. 53

9 Nilai toksisitas hasil fraksinasi.................................................... 54

10 Daya inhibisi ekstrak hasil Fraksinasi......................................... 55

11 Kinetika hasil kolom.................................................................... 56

11 Spektrum serapan FT-IR Fraksi 6 ............................................... 57

12 Spektrum analisis HPLC............................................................ 58

13 Spektrum analisis LCMS............................................................. 59

14 Spektrum analisis NMR Proton................................................... 61

15 Spektrum analisis NMR Karbon.................................................. 62

16 Prosedur analisis kadar air dan fitokimia..................................... 63

7/22/2019 2008 Nad

17/80

17

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Tumbuhan berbunga yang berpotensi sebagai tumbuhan obat di Indonesia

ada sekitar 30000 spesies tumbuhan (Dirjen Bina Produksi Hortikultura 2002),

diantara tumbuhan yang diakui khasiatnya adalah seledri (Apium graveolensL.).

Seledri merupakan tanaman tegak, tahunan, tinggi 25-100 cm, batang bersegi dan

beralur membujur, bunga banyak dan berwarna putih kehijauan. Dapat

dibudidayakan dimana-mana dari dataran rendah sampai dataran tinggi (IPTEK

2005). Tanaman ini lebih dikenal masyarakat sebagai sayuran. Di samping hanya

sekedar sebagai sayuran, seledri jauh lebih bermanfaat yakni sebagai obat

penyakit, di antaranya adalah penyakit gout.

Gout adalah penyakit kelainan metabolik karena adanya endapan kristal

monosodium urat yang terkumpul didalam sendi sebagai akibat tingginya kadar

asam urat didalam darah. Asam urat yang tinggi ini dapat menyebabkan rasa sakit

pada persendian akibat respon peradangan yang ditimbulkannya dan dampak

jangka panjangnya adalah meningkatnya tekanan darah, penyakit batu ginjal,

hingga dapat menyebabkan cacat tubuh. Juandy (2007) melaporkan terdapat 730

kasus gout baru dari 47.150 responden selama dua belas tahun terakhir. Jumlah

penderita ini cenderung meningkat dari tahun ke tahun, sejalan dengan pola

kehidupan masyarakat yang lebih gemar mengkonsumsi makanan tinggi protein.

Data ilmiah pendukung yang mengungkap khasiat seledri sebagai

biomedicine diantaranya pemakaian infus daun seledri dengan kadar 10 persen

sebanyak 5 ml/kg bb menurunkan kadar asam urat darah kera (Winata dan

Wilman 1988 dalam ixoranet 2007), pemberian ekstrak seledri dengan cara peras

maupun refluks dapat menurunkan tekanan darah kucing (Dondokambey 1985

dalam Ixoranet 2007), efek diuresis infusa daun seledri pada tikus putih (Setiawan

& Putri 2007),Dan beberapa paten diantaranya Paten (6352728 tahun 2002 dan

6576274 tahun 2003) yang berisi estrak tunggal seledri tetapi efikasi yang ditelaah

adalah antiinflamasi dan Paten (P00200400339 tahun 2004) yang berisi tentang

formula ekstrak gabungan seledri dan sidaguri untuk antigout. Data ilmiah lain

adalah Ramdhani (2004) yang meneliti isolasi dan identifikasi senyawa bioaktif

seledri dalam menghambat aktivitas enzim xantin oksidase dimana dalam

7/22/2019 2008 Nad

18/80

18

penelitiannya disebutkan bahwa senyawa aktif yang berperan dalam menghambat

enzim xantin oksidase adalah senyawa dari golongan flavonoid.

Obat-obatan asam urat yang kini beredar di masyarakat umumnya

berkhasiat hanya untuk jangka waktu tertentu dan cenderung menimbulkan gejala

ketergantungan (peningkatan dosis pakai) bahkan beberapa diketahui memiliki

efek samping yang membahayakan hidup. Misalnya allopurinol, obat ini umum

digunakan di kalangan penderita asam urat. Walaupun murah dan efektif

meringankan rasa sakit, namun obat ini diketahui sarat dengan efek samping yang

merugikan seperti sakit kepala, kebotakan, kegagalan ginjal dan hati, hingga

resiko kematian (Sydpath 1999), selain itu allopurinol juga bisa menyebabkan

gangguan pencernaan, timbulnya ruam di kulit, berkurangnya jumlah sel darah

putih dan kerusakan hati (Medicastore 2007). Seledri merupakan tumbuhan yangdapat dimanfaatkan sebagai obat alternatif pengganti obat-obatan sintetis sejenis

allopurinol. Secara umum tumbuhan ini dikenal memiliki efek penyembuh

dengan tingkat resiko dan efek samping yang rendah dibandingkan dengan obat-

obatan sintetis lainnya. Penelitian yang mengungkap peran senyawa aktif seledri

dalam menghambat enzim xantin oksidase untuk penyembuhan asam urat pernah

dilakukan (Iswantini & Darusman 2004) dan Ramdhani (2004), tetapi penelitian

tentang uji kinetika ekstrak kasar seledri dan hasil fraksinasinya yang

dihubungkan dengan penyakit gout dan inhibitor enzim xantin oksidase serta

penentuan senyawa aktifnya belum pernah dilakukan.

Penentuan tipe kinetika inhibisi dari suatu senyawa bahan alam yang akan

digunakan sebagai calon obat penting dilakukan untuk melihat mekanisme

hambatan yang terjadi. Mekanisme hambatan yang terbentuk selanjutnya dapat

menjelaskan kekuatan ikatan antara enzim sebagai target dan senyawa calon obat,

apakah ikatan tersebut bersifat sementara (inhibisi kompetitif dan inhibisi

unkompetitif) ataukah permanen (inhibisi non kompetitif). Mekanisme tipe

hambatan yang terjadi umumnya mengarah pada jenis inhibisi kompetitif namun

beberapa mengarah pada jenis inhibisi nonkompetitif. Beberapa senyawa alam

seperti flavonoid dan senyawa polifenol dilaporkan berperan sebagai inhibitor

kompetitif terhadap enzim xantin oksidase, diantara senyawa itu adalah teaflavin,

teaflavin-3-galat, teaflavin-3-3-digalat, (-)-epigalokatekin-3-galat, dan asam galat

7/22/2019 2008 Nad

19/80

19

(Jen et al. 2000), teaflavin -3,3-digalat (Dew et al. 2005), serta apigenin-4-O-

(2-O-p-coumaroyl)--D-glukopiranosida yang merupakan derivat apigenin (Jiao

et al. 2006), begitu juga dengan penelitian yang dilakukan oleh Hidayat (2006)

yang mengungkapkan bahwa flavonoid asal sidaguri mengarah ke inhibitor

kompetitif. Sedangkan beberapa golongan flavonol meliputi jenis flavonol krisin,

luteolin, kaemferol, kuersetin, mirisetin, dan isorhamnetin dilaporkan memiliki

efek hambatan terhadap xantin oksidase melalui mekanisme inhibitor

nonkompetitif (Nagao et al. 1997), beberapa kelompok flavonol dan polifenol

asal teh seperti (-)-epikatekin, (-)-epigalokatekin, (-)-epikatekin galat (Aucump et

al. 1997). Selain itu flavonoid flavonol kaemferol asal teh hijau (Parket al. 2006)

dan kalkon juga mempunyai daya inhibisi yang sangat kuat terhadap enzim xantin

oksidase (Beiller 1951 dalam Martin 2007) tetapi disini tidak dijelaskan tipeinhibisinya.

Tujuan Penelitian

Menentukan tipe kinetika inhibisi ekstrak kasar etanol herba (daun dan

batang) seledri terhadap enzim xantin oksidase, menentukan tipe kinetika inhibisi

ekstrak hasil fraksinasi dan menentukan senyawa aktif yang berperan sebagai

inhibitor enzim xantin oksidase.

Manfaat Penelitian

Memberikan informasi tentang mekanisme inhibisi ekstrak dan hasil fraksi

seledri sebagai inhibitor enzim xantin oksidase serta mengetahui senyawa aktif

yang berperan sebagai inhibitor enzim xantin oksidase.

Hipotesis

Ekstrak kasar herba (daun dan batang) seledri memiliki mekanismeinhibisi kompetitif terhadap enzim xantin oksidase, ekstrak hasil fraksinasi

memiliki mekanisme inhibisi kompetitif dan senyawa aktif yang terdapat dalam

seledri dapat menginhibisi enzim xantin oksidase.

7/22/2019 2008 Nad

20/80

20

TINJAUAN PUSTAKA

Seledri (Apium graveolens leach)

Seledri merupakan tanaman tegak, tahunan, tinggi 25-100 cm, batang

bersegi dan beralur membujur, bunga banyak dan berwarna putih kehijauan.

Dapat dibudidayakan dimana-mana dari dataran rendah sampai dataran tinggi

(IPTEK 2005). Tanaman ini lebih dikenal masyarakat sebagai sayuran. Disamping

hanya sekedar sebagai sayuran, seledri jauh lebih bermanfaat yakni sebagai obat

penyakit.

Diantara manfaat tanaman seledri sebagai obat penyakit itu adalah

mengobati hipertensi, gout, diabetes, diare, mencegah stroke dan urine keruh

(Sinar Harapan 2003). Selain itu akar seledri juga berkhasiat memacu enzim

pencernaan dan peluruh kencing atau diuretik, buah dan bijinya sebagai pereda

kejang (antipasmodik), menurunkan kadar asam urat darah, antirematik,

karminatif dan sedatif serta herbanya bersifat tonik, memacu enzim pencernaan,

menurunkan tekanan darah, peluruh kencing, peluruh haid, mengelurkan asam

urat darah yang tinggi (Ixoranet 2007) serta seledri dapat digunakan untuk

mencegah masuk angin, menghilangkan rasa mual dan sebagai pelengkap sayur.

Seledri juga mengandung senyawa metabolit sekunder diantaranya herba

seledri mengandung flavonoid, saponin, tanin, apiin, minyak atsiri, apigenin,

kolin, vitamin A, B, C, zat pahit asparagin, apigenin dan akarnya mengandung

asparagin, manit, zat pati, lendir minyak atsiri pentosa, glutamin dan tirosin serta

bijinya mengandung apiin, minyak atsiri, apigenin dan alkaloid (Ixoranet 2007).

Kemudian seledri juga mengandung gizi berupa air, protein, lemak, karbohidrat,

serat, kalsium, besi, riboflavin, nikotinamida dan asam askorbat (Ashari 1995).

Data ilmiah yang mendukung tentang khasiat senyawa aktif dalam seledri.

Diantaranya pemakaian infus daun seledri dengan kadar 10 persen sebanyak 5

ml/kg bb menurunkan kadar asam urat darah kera (Winata dan Wilman 1988

dalam ixoranet 2007), pemberian ekstrak seledri dengan cara peras maupun

refluks dapat menurunkan tekanan darah kucing (Dondokambey 1985 dalam

Ixoranet 2007), efek diuresis infusa daun seledri pada tikus putih (Setiawan &

Putri 2007), Juga beberapa Paten diantaranya Paten (6352728 tahun 2002 dan

6576274 tahun 2003) yang berisi estrak tunggal seledri tetapi efikasi yang ditelaah

7/22/2019 2008 Nad

21/80

21

adalah antiinflamasi dan Paten (P00200400339 tahun 2004) yang berisi tentang

formula ekstrak gabungan seledri dan sidaguri untuk antigout. Berdasarkan studi

literatur juga penelitian tentang seledri yang dihubungkan dengan penyakit gout

dan inhibitor enzim xantin oksidase masih sangat sedikit, diantaranya Ramdhani

(2004) yang menyebutkan bahwa senyawa bioaktif seledri yang dapat

menghambat aktivitas enzim xantin oksidase merupakan senyawa dari golongan

flavonoid, Paten (6589573 tahun 2003) berisi tentang inhibitor enzim xantin

oksidase yang diperoleh dari tanaman banaba (Lagerstroemia speciosa) serta

Iswantini dan Darusman (2004), dalam penelitiannya diketahui bahwa ekstrak

kasar seledri memiliki daya inhibisi terhadap enzim xantin oksidase cukup tinggi,

lebih kuat dari kemampuan produk jamu komersial lainnya seperti jamu dua

walet, jamu jaya asli dan jamu keju jimpe. Sementara uji kinetika inhibisi xantinoksidase pernah dilakukan tetapi menggunakan senyawa aktif sidaguri (Sida

rhombifolia L.) dimana tipe kinetika awal dengan menggunakan metode Line Weaver-

Burk mengarah ke inhibisi kompetitif(Hidayat 2006), Sedangkan penelitian tentang

uji kinetika ekstrak kasar dan hasil fraksinasinya yang dihubungkan dengan

penyakit gout dan inhibitor xantin oksidase serta penentuan senyawa aktifnya

belum pernah dilakukan.

Xantin Oksidase Peristiwa timbulnya gout tak terlepas dari peran serta enzim xantin

oksidase. Enzim ini mampu mengubah xantin menjadi asam urat melalui reaksi

oksidasi seperti ditunjukan oleh Gambar 1

Gambar 1 Pengubahan xantin menjadi asam urat (Hille 2006)

Xantin oksidase (Gambar 2) merupakan suatu kompleks enzim yang terdiri dari

molibdenum, FAD dan Fe2S2 sebagai pusat reaksi redoks. Enzim ini terdiri dari

dua subunit identik yang saling berhadapan, memiliki 1332 residu asam amino

Xantin Asam urat

N

H

HN

N

H

N

O

O N

H

HN

N

H

H

N

O

O

O

H2O2

xantin oksidase

O2 + H2O

7/22/2019 2008 Nad

22/80

22

dengan bobot molekul sekitar 270000 Da. Selain fungsi katalisis mengubah

hipoxantin menjadi xantin maupun xantin menjadi asam urat, telah ditemukan

fungsi lain dari enzim ini dalam mengkatalisis reduksi nitrat dan nitrit menjadi

nitrit oksida (Millaret al. 2002) dan sekaligus menyebabkan pembentukan radikal

superoksida yang dapat menyebabkan peradangan (Bodamyali et al. 2002).

Gambar 2 Model struktur enzim xantin oksidase (Hille 2006)

Enzim xantin oksidase di dalam tubuh manusia terdapat pada hati, jika enzim ini

terdapat diluar hati mengindikasikan kerusakan fungsi hati (Hille 2006).

Flavonoid dan Alkaloid

Enzim xantin oksidase mengkatalisis purin menjadi asam urat. Allopurinol

secara farmakologis dapat digunakan dalam mengatasi sakit gout dengan caramenginhibisi aktivitas xantin oksidase. Nakanishi (1990) melaporkan flavonoid

krisin, baekeilin, isorhamnetin, dan ester asam kafeat juga tergolong efektif dalam

mengatasi sakit gout. Studi invitro menunjukkan bahwa beberapa flavonoid

terutama letuolin dan apigenin dapat juga bekerja sebagai inhibitor xantin

oksidase dengan daya kerja yang hampir sama dengan allopurinol (Cos et al.

1998). Inhibitor xantin oksidase lain, namun dengan daya inhibisi rendah adalah

antosianidin dan proantosianidin (Duke 1999), hesperetin dan teaflavin-3,3-

digalat juga dapat berperan sengai inhibitor enzim xantin oksidase (Dew et al.

2005), serta derivat apigenin daripalhinhaea cernuajuga dapat menjadi inhibitor

enzim xantin oksidase dengan daya inhibisi yang cukup tinggi (Jiao et al. 2006).

Sementara itu Jen at al (2000) juga melaporkan hubungan antara struktur

flavonoid dengan aktivitasnya sebagai inhibitor xantin oksidase disebabkan

7/22/2019 2008 Nad

23/80

23

karena adanya gugus hidroksil (gugus OH) pada C-5 dan C-7 dan ikatan rangkap

antara C-2 dan C-3.

Alkaloid merupakan senyawa kimia bersifat basa yang mengandung satu

atau lebih atom nitrogen, umumnya tidak berwarna, berwarna jika mempunyai

struktur kompleks dan bercicin aromatik. Alkaloid tumbuhan juga dipercaya

sebagai obat gout yang mampu menekan dan mengurangi frekuensi serangan akut

dan menghilangkan rasa nyeri dengan cara menghambat sntesis dan pelepasan

leukotrien (Mycek 1997). Contoh penggunaan alkaloid secara komersial adalah

kolkisin yang diisolasi dari tanaman Colchium autumnale.Materia Medika (1995)

mengatakan bahwa ada golongan alkaoid dari suatu tanaman tertentu dipercaya

menghambat produksi enzim xantin oksidase, senyawa kimia lainnya adalah

polifenol dan flavonoid. Suatu senyawa dalam tanaman yang analog dengan purinpun dapat dimanfaatkan sebagai inhibitor bagi xantin oxidase, dan dilaporkan juga

bahwa alkaloid yang terkandung dalam biji seledri mempunyai efek sedatif dan

antikonsulvan pada tifus (Ixoranet 2007).

Gout (Asam Urat)

Gout atau asam urat adalah salah satu bentuk penyakit artritis yang

disebabkan oleh penumpukkan kristal asam urat pada sendi yang ditandai dengan

pembengkakan dan biasanya menyerang pada ibu jari kaki (Bardin 2003). Secara

garis besar gout termasuk ke dalam reumatik artikular bersama-sama dengan

osteoartritis dan artritis reumatoid. Kadar asam urat normal dalam darah berkisar

antara 25-75 g/ml dengan volume urin yang dieksresikan per harinya antara 250

hingga 750 mg (Pachla et al. 1987). Kandungan asam urat yang tinggi dalam

darah Hiperurisemia tidak mesti berakhir dengan terbentuknya gout, namun gout

selalu didahului oleh hiperurisemia (Myceket al. 2001) dan Sturrok (2000) juga

melaporkan hal yang sama.

Bagi wanita, konsentrasi normal asam urat berkisar antara 25-60 g/ml,

sedangkan bagi pria adalah 30-70 g/ml (Artiss & Entwistle 1981). Bagi wanita

konsentrasi asam urat di atas 60 g/ml sudah dapat dikatakan hiperurisemia,

namun tidak bagi pria selama konsentrasinya di bawah 70 g/ml. Walaupun

batasan normal hiperurisemia pada pria lebih besar dari wanita, namun pria

7/22/2019 2008 Nad

24/80

24

memiliki resiko terkena serangan gout jauh lebih tinggi dibanding wanita. Data

rasio hiperurisemia dan gout di Jawa pada tahun 2001 antara pria dan wanita

menunjukkan perbandingan 2:1 untuk kasus hiperurisemia dan 34:1 untuk kasus

gout (Heryanto 2003), Juandy (2007) melaporkan terdapat 730 kasus gout baru

dari 47.150 responden selama dua belas tahun terakhir.

Tingginya kadar asam urat dalam darah pada penderita gout maupun

hiperurisemia diakibatkan oleh faktor produksi asam urat berlebihan, obesitas,

diabetes yang disertai dengan tekanan darah tinggi (Galvan et al. 1995), hal yang

sama juga dilaporkan oleh Schumacher (2006) & Rematologi Amerika (2007)

hingga stress tinggi (Montgomery et al. 1993) dan faktor makanan terutama

protein hewani maupun nabati atau sayur-sayuran kaya purin dalam jumlah

banyak (Juandy 2007). Pada kasus obesitas ataupun diabetes, sebagian besar lipiddan glukosa diubah bentuk menjadi asetil-CoA dilanjutkan dengan reaksi

pembentukan -ketoglutarat disertai pembebasan sejumlah energi dalam siklus

asam sitrat. -ketoglutarat ini kemudian bereaksi dengan asam amino dalam

serangkaian reaksi dan berakhir dengan terbentuknya glutamin. Glutamin inilah

yang kemudian dimetabolisir menjadi asam nukleat (basa purin). Purin yang

terbentuk ini dalam keadaan normal memiliki peluang untuk membentuk asam

urat (Voet & Voet 2001).

Mekanisme pembentukan asam urat dari protein bermula dari degradasi

diet protein menjadi asam amino. Beberapa asam amino ini selanjutnya

didegradasi membentuk glutamat. Glutamat yang terbentuk selanjutnya

dimetabolisir membentuk -ketoglutarat, aspartat, dan sebagian membentuk

glutamin. Ketika glutamin bereaksi dengan fosforibosil pirofosfat (PRPP, suatu

gula derivatif dari ribosa-5-fosfat) maka akan terbentuk fosforibosalamin.

Fosforibosalamin merupakan prekursor bagi pembentukan asam nukleat purin.

Melalui serangkaian reaksi yang melibatkan penambahan asam amino glisin,

glutamin, aspartat, dan koenzim N10-formil-THF (tetra hidro folat) akan terbentuk

inosin monofosfat (IMP). IMP merupakan prekursor dalam sintesis purin, IMP

ini yang selanjutnya diubah bentuk menjadi AMP dan GMP maupun bentuk basa

bebasnya, adenin dan guanin. Melalui mekanisme regulasi sel, purin yang

terbentuk ini selanjutnya dimetabolisir untuk beberapa keperluan diantaranya

7/22/2019 2008 Nad

25/80

25

sintesis senyawa berenergi tinggi seperti ATP, bahan baku dalam pelaksanaan

ekspresi genetik (sintesis protein) ataupun transformasi genetik, dan beberapa

purin ini dikatabolisme membentuk asam urat (Gambar 3).

Gambar 3 Protein dan pembentukan asam urat (Myceket al. 2001)

Obat Gout

Strategi pengobatan gout pada umumnya adalah dengan menurunkan

kadar asam urat sampai di bawah titik jenuhnya. Allopurinol (Gambar 4)

merupakan obat gout yang paling efektif dalam menghambat pembentukan asam

urat yang dipakai masyarakat selama ini. Walaupun murah, dengan harga eceran

Rp. 2700,00 per stripnya (Kimia Farma 2004), namun obat ini diketahui sangat

berbahaya bila tidak digunakan dengan hati-hati. Dilaporkan telah terjadi kasus

kematian sebanyak 156 jiwa dari total 600 pasien (26%) akibat mengkonsumsi

allopurinol (Sydpath 1999). Penggunaan allopurinol dilaporkan dapat menjadi

penyebab kejadian difusi vaskuler yang berakhir dengan kematian. Allopurinol

Sintesis Purin

Ribosa-5-fosfat

Katabolisme Purin

IMP

Hipoksantin

(inosin, adenosin, guanosin)

AMP

Adenosin

Inosin

GMP

Xantin

Guanosin

Guanin

Protein

PRPP + glutamin(12 reaksi)

Asam Urat

7/22/2019 2008 Nad

26/80

26

juga dapat menyebabkan gangguan pencernaan, timbulnya ruam di kulit,

berkurangnya jumlah sel darah putih dan kerusakan hati (Medicastore 2007).

Selain itu, penggunaan allopurinol dapat mengakibatkan hipersensitifitas yang

akan terus melemahkan respon tubuh penderita terhadap konsentrasi allopurinol,

sehingga pengguna allopurinol cenderung mengalami penambahan dosis

pemakaian.

Gambar 4 Struktur allopurinol (Terkeltaub 2005)

Oksipurinol yang merupakan hasil penguraian allopurinol di dalam tubuh,

merupakan suatu senyawa yang memiliki efek penghambatan yang sama namun

lebih lama dibandingkan allopurinol dalam menghambat kerja xantin oksidase.

Dilaporkan bahwa oksipurinol memiliki waktu paruh yang cukup lama, sekitar

21,20,4 jam, lebih lama dibandingkan allopurinol yang memiliki waktu paruh

1,30,1 jam (Yarindo Farmatama 2003). Efek oksipurinol ini yang kemudian

diduga kuat menjadi penyebab kejadian difusi vaskuler.

Melihat beragamnya efek samping yang ditimbulkan obat sintetis, sangat

diperlukan obat-obatan sejenis yang memiliki khasiat yang sama dengan harga

terjangkau, dan efek samping yang sesedikit mungkin. Untuk tujuan itu, maka

studi pemanfaatan tumbuhan sebagai obat alternatif harus terus dijalankan

mengingat penggunaan bahan alami sebagai sumber obat pada dasarnya jauh lebih

aman dan jauh dari kemungkinannya toksik karena kandungannya yang masih

lengkap walaupun pemakaiannya dalam jumlah yang besar (Sidiket al. 1995)

Cos et al(1998) melaporkan bahwa beberapa senyawa flavonoid bersifat

antioksidan dan dapat menghambat kerja enzim xantin oksidase maupun reaksi

superoksida. Kemudian dilaporkan juga senyawa flavonoid dari stereospermum

personatumselain bersifat antioksidan, senyawa tersebut juga dapat menghambat

kerja enzim xantin oksidase (Kumaret al. 2005). Flavonoid merupakan golongan

senyawa polifenol yang terdiri atas 15 karbon sebagai kerangka dasarnya. Kelima

7/22/2019 2008 Nad

27/80

27

belas atom tersebut membentuk dua cincin aromatik (C6) yang terikat pada rantai

propana (C3) sehingga membentuk susunan C6-C3-C6 (Gambar 5 ). Dari susunan

ini dapat dihasilkan 3 jenis struktur, yaitu flavonoid (1B-2C),isoflavonoid (1B-

3C), dan 1 neoflavonoid (1B-4C). Flavonoid terdapat pada semua bagian

tumbuhan mulai dari daun, akar kulit kayu, tepung sari, nektar, bunga, buah,

hingga biji (Markham 1982).

Flavonoid quersetin, quersitin, miristin, dan mirisetin asal tanaman salam

(Eugenia polyantha) berkhasiat dalam menghambat kerja enzim xantin oksidase

(Schemeda et al. 1987). Demikian halnya dengan flavonoid chriysin, batcalein,

isorhamnetin, dan ester asam kafeat juga berkhasiat dalam menghambat xantin

oksidase (Nakanhisi 1990). Penelitian Cos et al (1998) flavonoid luteolin dan

apigenin (Gambar 5) memiliki kemampuan menginhibisi terhadap xantin oksidasedengan kemampuan daya inhibisi mendekati allopurinol, kemudian senyawa

bioaktif polifenol yang terdapat pada teh, yaitu teaflavin, teaflavin-3-galat,

teaflavin-3-3-digalat, (-)-epigalokatekin-3-galat, dan asam galat mampu

menghambat kerja enzim xantin oksidase dalam membentuk asam urat melalui

mekanisme inhibitor kompetitif (Jen et al. 2000). Aktivitas tertinggi dimiliki oleh

asam galat yang mampu memberikan efek penghambatan hingga di atas 50%.

Dew et al (2005) melaporkan bahwa flavonoid teaflavin-3,3-digalat berperan

sebagai penghambat enzim xantin oksidase. Selain itu juga dilaporkan bahwa

derivat apigenin (yang merupakan senyawa golongan flavonoid) asal tumbuhan

palhinhaea cernuajuga berperan sebagai penghambat enzim xantin oxidase (Jiao

et al. 2006), dimana semua penelitian di atas dilakukan secara invitro.

Gambar 5 Struktur flavonoid apigenin (Cos et al. 1998)

Adanya ikatan rangkap pada flavonoid memungkinkan untuk

melangsungkan reaksi adisi (oksidasi oleh xantin oksidase), adanya ikatan

rangkap pada atom C2 dengan C3 akan mengakibatkan posisi ring B co-planar

7/22/2019 2008 Nad

28/80

28

terhadap ring A sehingga lebih memudahkan dalam berinteraksi dengan enzim

zantin oksidase. Selain itu adanya gugus hidroksil yang terdapat pada flavonoid

turut berperan dalam memberikan efek penghambatan (Cos et al. 1998).

Selain flavonoid, alkaloid tumbuhan dipercaya dapat juga berfungsi

sebagai obat yang mampu menekan sekaligus mengurangi frekuensi serangan akut

dan menghilangkan rasa nyeri dengan cara menghambat sintesis dan pelepasan

leukotrien (Mycek et al. 2001). Materia Medika (1995) mengatakan bahwa

terdapat golongan alkaoid dari suatu tanaman tertentu dipercaya menghambat

produksi enzim xantin oksidase, senyawa kimia lainnya adalah polifenol dan

flavonoid. Suatu senyawa dalam tanaman yang analog dengan purin pun dapat

dimanfaatkan sebagai inhibitor bagi xantin oxidase, dan dilaporkan juga bahwa

alkaloid yang terkandung dalam biji seledri mempunyai efek sedatif danantikonsulvan pada tikus (Ixoranet 2007).

Kinetika Inhibisi Enzim

Enzim merupakan unit fungsional dari metabolisme sel yang terdiri atas

protein makromolekul dengan mekanisme kinetika yang mirip dengan katalis

heterogen dengan aktivitas reaksi yang sangat spesifik. Faktor-faktor utama yang

dapat mempengaruhi aktivitas enzim antara lain konsentrasi enzim, konsentrasi

substrat, jumlah produk yang terbentuk, adanya senyawa inhibitor dan aktivator,

pH, kekuatan ion, serta suhu lingkungan (Thenawijaya 1995).

Reaksi enzimatis bekerja dengan urut-urutan yang terartur, enzim

mengkatalis ratusan reaksi bertahap yang menguraikan molekul nutrien, reaksi

yang menyimpan dan mengubah energi kimiawi, dan yang membuat

makromolekul sel dari prekusor sederhana. Di antara sejumlah enzim yang

berpartisipasi di dalam metabolisme ada yang dinamakan dengan enzim pengatur

(regulasi enzim) yang dapat mengenali berbagai isyarat metabolik dan mengubah

kecepatan katalitiknya sesuai dengan isyarat yang diterima. Melalui aktivitasnya,

sistem enzim terkoordinasi dengan baik, menghasilkan suatu hubungan yang

sesuai diantara sejumlah aktivitas metabolik yang berbeda yang diperlukan untuk

menunjang kehidupan (Webb 1963).

7/22/2019 2008 Nad

29/80

29

Mekanisme regulasi enzim dilakukan melalui kontrol ketersediaan enzim

dan kontrol aktivitas enzim. Dalam kontrol ketersediaan enzim, keberadaan enzim

diatur oleh sel, pengaturan kapan suatu enzim disintesis dan kapan akan

didegradasi bergantung pada ketersediaaan subtrat dan produk. Proses degradasi

dan sntesis enzim dapat berlangsung dalam hitungan menit (pada bakteri) hingga

jam (pada organisme tingkat tinggi). Pada kontrol aktivitas, aktivitas katalitik

enzim dipengaruhi oleh struktur sisi aktif tempat enzim dan subtrat berikatan.

Aktivitas struktur tersebut dapat dilakukan melalui mekanisme penambahan suatu

molekul tertentu (efektor allosterik) atau dengan modifikasi kovalen seperti

fosforilasi dan defosforilasi pada residu asam amino spesifik pada sisi aktif enzim

tersebut (Voet & Voet 2001).

Dalam mempelajari kinetika enzim, berbagai faktor penentu laju aktivitasdipelajari secara lebih seksama dan kondisinya diatur sedemikian rupa dengan

harapan reaksi yang terjadi dapat lebih terkendali dan murni hanya diakibatkan

oleh interaksi enzim-substrat. Untuk beberapa keperluan, seperti dalam

mempelajari kemampuan senyawa bioaktif sebagai obat (inhibitor/aktivator

enzim), terhadap lingkungan tempat reaksi enzim tersebut berlangsung

ditambahkan senyawa bioaktif dengan konsentrasi tertentu dan pola kinetika yang

terbentuk diperbandingkan dengan pola kinetika dasarnya (hanya interaksi enzim-

substrat) untuk melihat adanya perubahan pola kinetika (Price & Stevens 2004).

Beberapa senyawa bioaktif asal tumbuhan ketika ditambahkan ke dalam

sistem reaksi enzimatis dapat berperan sebagai aktivator, yang berarti dapat

meningkatkan laju reaksi pembentukan produk dan beberapa justru dapat

menyebabkan penurunan laju reaksi (inhibitor). Secara kimiawi, suatu inhibitor

akan sulit dibedakan dari aktivator. Kedua senyawa ini dapat jelas dibedakan jika

keduanya telah berinteraksi dengan enzim yang secara langsung akan

mempengaruhi laju reaksinya. Ikatan inhibitor ataupun aktivator dengan enzim

dapat mengubah kemampuan daya katalisatornya. Hal ini secara umum terjadi

akibat adanya perubahan struktur enzim ketika suatu inhibitor ataupun aktivator

berinteraksi dengannya (Boyer 1970).

Mekanisme inhibisi dapat berlangsung secara kompetitif, unkompetitif atau

nonkompetitif. Pada jenis inhibisi kompetitif, terjadi kompetisi antara substrat

7/22/2019 2008 Nad

30/80

30

dengan inhibitor dalam memperebutkan sisi aktif dari enzim (Gambar 6). Reaksi

akan terjadi dan produk akan dihasilkan, walaupun enzim bereaksi dengan

inhibitor. Produk yang dihasilkan dari inhitor akan berbeda jenisnya dengan

produk yang dihasilkan dari subtrat. Pada jenis penghambatan ini, adanya

inhibitor dapat menyebabkan perubahan nilai KM (konstanta Michaelis-Menten)

menjadi lebih besar dari nilai KM semula tanpa mengubah nilai Vmax-nya

(kecepatan maksimum reaksi enzimatis). Vmaxpada jenis inhibisi kompetitif tetap

dapat tercapai, namun membutuhkan waktu yang lebih lama dari kondisi

normalnya dan untuk mempercepatnya dapat dilakukan penambahan konsentrasi

substrat yang akan memperbesar peluang bagi subtrat untuk berikatan dengan sisi

aktif enzim, yang pada akhinrnya dapat membantu meningkatkan Vmax.

Gambar 6 Pola kinetika inhibisi yang terbentuk akibat adanya inhibitor kompetitif

(Price & Stevens 1996)

Inhibitor kompetitif, umumnya memiliki struktur yang serupa dengan

subtrat. Sebagai contoh adalah allopurinol, yang strukturnya hampir sama dengan

xantin atau subtrat asli (Gambar 7 ). Allopurinol dapat berikatan dengan enzim

xantin oksidase pada sisi aktifnya membentuk ikatan yang terdiri dari kombinasi

ikatan kovalen, elektrostatik, dan ikatan hidrogen. Allopurinol memiliki afinitas

puluhan kali lebih kuat terhadap enzim xantin oksidase dibandingkan xantin. Oleh

karena itu, apabila dalam lingkungan terdapat inhibitor ini bersama-sama

bersama-sama dengan subtrat (xantin), maka allopurinol yang akan lebih bereaksi

dengan xantin oksidase membentuk produk (oksipurinol) dibandingkan dengan

subtratnya sendiri, sehingga efek penghambatan pembentukan asam urat dapat

berlangsung terus selama masih terdapat allopurinol dalam lingkungan (Voet &

Voet 2001).

7/22/2019 2008 Nad

31/80

31

Gambar 7 Struktur allopurinol dan struktur xantin (Hille 1996)

Inhibisi kompetitif oleh produk reaksi sangat bermanfaat untuk

menghentikan atau menurunkan kerja enzim ketika telah terbentuk cukup produk

untuk kebutuhan biokimiawi sel (salah satu bentuk regulasi / kendali metabolik).

Pada jenis inhibisi unkompetitif, inhibitor terikat padsa sisi allosterik enzim

setelah terbentuk komplek enzim-subtrat. Pada jenis inhibisi ini, inhibitor tidak

dapat langsung berikatan dengan enzim dalam keadaan bebas, namun hanya dapatterikat jika telah terbentuk kompleks enzim-subtrat (Gambar 8 ). Dalam bentuk

kompleks enzim-subtrat*inhibitor, enzim akan kehilangan sifat katalisatornya

(inaktif) dan produk tidak akan terbentuk. Produk hanya akan terbentuk, jika

inhibitor terlepas dari kompleks enzim-subtrat*inhibitor.

Gambar 8 Pola kinetika inhibisi yang terbentuk akibat adanya inhibitor

unkompetitif (Price & Stevens 1996)

Umumnya, inhibisi unkompetitif terjadi akibat adanya akumulasi produk

dari reaksi enzim itu sendiri dan sangat jarang dijumpai pada reaksi enzim yang

melibatkan hanya satu subtrat dan satu produk. Pola kinetika yang terbentuk

akibat adanya inhibitor pada jenis inhibisi unkompeitif ini adalah terjadinya

penurunan nilai KM dan Vmax dari keadaan normalnya (Voet & Voet 2001).

Pada jenis inhibisi nonkompetitif, antara subtrat dan inhibitor tidak terjadi

kompetisi dalam memperebutkan sisi aktif enzim. Inhibitor dan subtrat tidak

memiliki kemiripan struktur. Inhibitor berikatan dengan enzim pada lokasi diluar

7/22/2019 2008 Nad

32/80

32

sisi aktifnya. Efek penghambatan akan terjadi karena inhibitor berikatan dengan

sisi allosterik enzim, dan akan mengubah bentuk sisi aktif enzim seperti

ditunjukkan pada Gambar 9. Akibat dari jenis inhibisi ini adalah terjadinya

penurunan Vmaxtanpa mengubah nilai KM-nya (Voet & Voet 2001).

Gambar 9 Pola kinetika inhibisi yang terbentuk akibat adanya inhibitor

nonkompetitif (Price & Stevens 1996)

Berbeda dengan jenis inhibisi unkompetitif, pada inhibisi nonkompetitif,

inhibitor dapat membentuk ikatan dengan enzim dalam keadaan bebasnya

disamping dapat membentuk ikatan dengan kompleks enzim-subtrat. Ikatan

inhibitor terhadap enzim bebas dan kompleks enzim-subtrat dapat meyebabkan

terbentuknya kompleks enzim*inhibitor dan enzim-subtrat*subtrat yang bersifat

tidak produktif, karena kedua kompleks ini tidak dapat membentuk produk

(Gambar 7). Produk hanya akan terbentuk jika ikatan inhibitor terlepas dari

kompleks enzim-subtrat*inhibitor. Reaksi sampingan yang sangat merugikan

akibat pengaruh inhibitor pada jenis penghambatan ini adalah besarnya peluang

bagi sisi aktif enzim untuk berubah secara permanen dari keadaan alaminya jika

terbentuk komplek enzim*inhibitor dengan ikatan yang sangat kuat. Hal ini akan

menyebabkan enzim kehilangan reaktifitasnya secara permanen.

Suatu senyawa aktif yang akan digunakan sebagai kandidat obat bagi

penyakit kelainan metabolik (akibat aktivitas enzim), harus melalui serangkaian

uji kinetika. Pengujian ini diharapkan dapat memberikan informasi tipehambatannya. Sehingga dapat dipastikan bahwa suatu senyawa yang diisolasi

tersebut benar-benar aman dan tidak akan mengubah struktur enzim secara

permanen. Penentuan pola kinetika inhibisi enzim dapat ditentukan dengan

menggunakan metode Michaelis-Menten, Lineweaver-Burk, Dixon, Hanes atau

Eddie-Hofstee seperti terlihat pada Tabel 1.

7/22/2019 2008 Nad

33/80

33

Tabel 1. Metode penentuan mekanisme inhibisi enzim (Price & Stevens 1996)

K M ( 1 + ) + S ( 1 + )

i c h a e l is - M e n t e n

i n e W e a v e r - B u r k

D i x o n

H a n e s

K o m p e t i t i f N o n k o m p e t i t i f U n k o m p e t i t i f

V m

V m ap p

K mK m ap p

V = K m + S

V m (S )

V m ( S )V =

K M + S ( 1 + )K i

I

S

V

S

S + IV m ap p

K m = K m ap p

K i

V m

S

V

S

S + I

V = K m + S

V m (S )

V m ( S )V =

K i

I I

V m

K m ( 1 + ) + SK iI

V m . SV =

V m ap p

K m K m ap p

S

S + I

V = K m + S

V m (S )V

S

-K m -K m ap p

1 /V m = 1 / V m ap p

K m 11 / V = ( 1 + I /K i ) +

V m V m

1 /S

1 /

V

S

S + I K m 1 11 / V = +

V m S V m

- K m = - K m ap p

1 / V m ap p

K m 11 / V = ( 1 + I /K i ) + ( 1 + I / K i )

V m V m

1 /S

1 /V

1 / V mS

S + I K m 1 11 / V = +

V m S V m

-K m ap p

K m 1 11 / V = +

V m S V m

1 /S

1 /V

1 / V m ap p

1 / V m

S

S + I

K m 11 / V = + ( 1 + I / K i )

V m V m

- K m

I

K m + ( S ) K m1 / V = + ( I )

V m ( S ) V m . K i .( S )1 /V

-K i

S 1S 2

S 1 < S 2

S 1

S 2 S 1 < S 2

1 /V

- K iI

K m + ( S ) K m + (S )1 / V = + (I )

V m ( S ) V m . K i .( S )S 1

S 2S 1 < S 2

1 /V

I

K m + ( S ) ( S )1 / V = + (I )

V m ( S ) V m . K i . ( SK m

- K i ( 1 + )S

V = V m . ( 1 + I / K i) - K m . V / ( s)

V

V /S

V = V m . ( 1 + I/ K i ) - K m . V / ( s ) .. ( 1 + I /K i )

V

V /S

tg = - K m

V m = V m ap p V = V m K m .V / ( s )

tg = - K m ap p

tg = - K m

tg = - K m ap pV m ap p

V m V = V m K m . V / ( s)

V = V m K m . V / (s ) . ( 1 + I/ K i )

V

V /S

= tg = tg - K m = - K m ap p

V m ap p

V m V = V m K m . V / ( s)

E d d i e - H o f s t e e

K m SS / V = ( 1 + I /K i ) + ( 1 + I / K i )

V m V m

K m SS / V = ( 1 + I /K i ) +

V m V m

K m SS / V = + ( 1 + I / K i )

V m V m

K m SS / V = +

V m V m

S /V

S

K m ap p ( 1 + I / K i )

V m ap p K m

V m

K m SS / V = +

V m V m

S

S /VK m ap p

( 1 + I / K i )V m ap p

K m

V m

K m SS / V = +

V m V m

S /V

K m ap p ( 1 + I / K i )

V m ap p K m

V mS

M e t o d e

Nilai KM dan Vmax sangat sulit ditentukan secara tepat berdasarkan grafik

Michaelis-Menten, sehingga untuk mendapatkan nilai Vmaks dan KM yang lebih

tepat persamaan Michaelis-Menten tersebut ditransformasikan kepersamaan

Lineweaver-Burk, Dixon, Hanes atau Eddie-Hofstee. Metode Lineweaver-Burk

merupakan metode awal penentuan kinetika enzim, dari persamaan ini hanya

7/22/2019 2008 Nad

34/80

34

diperoleh Vmaks, KM dan (afinitas inhibitor), sementara untuk mendapatkan

konsatanta inhibitor (Ki) maka perlu dilakukan uji kinetika lanjut menggunakan

metode Dixon.

Penelitian tentang kinetika inhibisi enzim xantin oksidase

Beberapa senyawa baham alam seperti flavonoid telah diketahui bersifat

inhibitor bagi enzim xantin oksidase dan di harapkan bermanfaat dalam

pencegahan panyakit asam urat. Mekanisme tipe hambatan yang terjadi umumnya

mengarah pada jenis inhibisi kompetitif namun beberapa mengarah pada jenis

inhibisi nonkompetitif. Berikut beberapa penenlitian mengenai sifat inhibisi

kompetitif dan nonkompetitif yang dilakukan secara invitrodiantaranya flavonoid

dan senyawa polifenol dilaporkan berperan sebagai inhibitor kompetitif terhadap

enzim xantin oksidase, diantaranya adalah teaflavin, teaflavin-3-galat, teaflavin-3-

3-digalat, (-)-epigalokatekin-3-galat, dan asam galat (Jen et al. 2000), teaflavin -

3,3-digalat (Dew et al. 2005), serta apigenin-4-O-(2-O-p-coumaroyl)--D-

glukopiranosida yang merupakan derivat apigenin (Jiao et al. 2006). Sedangkan

beberapa golongan flavonol meliputi jenis flavonol krisin, luteolin, kaemferol,

kuersetin, mirisetin, dan isorhamnetin dilaporkan memiliki efek hambatan

terhadap xantin oksidase melalui mekanisme inhibitor nonkompetitif (Nagao et al.

1997), beberapa kelompok flavonol dan polifenol asal teh seperti (-)-epikatekin,

(-)-epigalokatekin, (-)-epikatekin galat (Aucump et al. 1997). Selain itu flavonoid

flavonol kaemferol asal teh hijau (Parket al. 2006) dan kalkon juga mempunyai

daya inhibisi yang sangat kuat terhadap enzim xantin oksidase (Beiller 1951

dalam Martin 2007) tetapi disini tidak dijelaskan tipe inhibisinya.

Flavonoid mampu menghambat enzim xantin oksidase karena adanya

kemiripan struktur antara flavonoid dengan xantin (subtrat). Kerja spesifik xantin

oksidase terhadap xantin melalui reaksi transfer/penambahan oksigen pada atom C

nomor 2 dan C nomor 8 (gambar 5) oleh asam amino pada sisi aktif enzim disertai

dengan reduksi kofaktor Molibdat, dari Mo(VI) menjadi Mo(IV) (Massey et al,

1970). Besarnya kekuatan inhibisi flavonoid sangat dipengaruhi oleh besarnya

kekuatan mereduksi/derajat oksidasi yang dapat dilihat dari sejumlah gugus fungsi

hidroksil (-OH) dan karboksi (-C=O) di dalamnya. Hasil peneletian Jen et al

7/22/2019 2008 Nad

35/80

35

(2000) menunjukkan bahwa kekuatan inhibisi teaflavin-3-3-digalat>teaflavin-3-

galat>(-)-epigalokatekin-3-galat>teaflavin. Jiao et al (2006) juga melaporkan

bahwa gugus fungsi hidroksil dan karboksil yang terdapat pada flavonoid

mempengaruhi besarnya daya inhibisi.

Fourir Transformation I nfra Red(FT-IR)

FT-IR merupakan metode analisis kualitatif suatu senyawa kimia.

Instrumentasi FT-IR terdiri atas sumber radiasi, sampel kompartemen,

monokromator, detektor, amplifier dan rekorder (sistem pembacaan). Radiasi

inframerah yang digunakan untuk analisis senyawa kimia adalah pada panjang

gelombang sekitar 4000 670 cm-1

. Panjang gelombang ini menyebabkan energi

elektromagnetik radiasi inframerah gugus-gugus atom bervibrasi. Vibrasi alamiah

gugus molekul yang sesuai dengan radiasi inframerah akan menyebabkan

interaksi medan listrik sehingga akan terjadi perubahan-perubahan vibrasi yang

menunjukan terjadinya absorpsi inframerah yang berupa puncak-puncak tertentu.

Spektrum pada FT-IR dapat terbentuk dengan cara melewatkan radiasi inframerah

ke sampel yang kemudian diproses melalui alat interferometer yang dibaca oleh

detektor berupa sinyal. Sinyal ini yang kemudian diubah menjadi bentuk

spektrum dengan bantuan komputer berdasarkan operasi matematika fourir

transform(Choltup at el. 1988).

Metode ini dapat digunakan untuk menentukan gugus fungsi suatu

senyawa kimia, seperti dilakukan oleh Jiao at el (2006) yang mencoba

menganalisis gugus fungsi senyawa aktif yang berperan dalam menghambat

enzim xantin oksidase dari palhinhaea cernua diperoleh serapan gugus fungsi

pada panjang gelombang 3249 3500 cm-1

(hidroksil), 1714 & 1659 cm-1

(karbonil) serta 1586 & 1455 cm-1

(penil).

High Perf ormance Liqui d Chromatography(HPLC)

HPLC atau kromatografi cair kinerja tinggi merupakan teknik pemisahan

dan analisis kuantitatif atau kualitatif suatu senyawa. Instrumentasi HPLC terdiri

atas reservoir yang berisi fase gerak, sebuah pompa untuk memompa fase gerak

melalui sistem bertekanan tinggi, injektor, kolom yang merupakan tempat

7/22/2019 2008 Nad

36/80

36

terjadinya pemisahan, detektor yang berfungsi untuk menditeksi keberadaan

senyawa dan integrator yang berfungsi untuk memperkuat pembacaan sinyal oleh

detektor. Sinyal ini yang kemudian diubah menjadi bentuk spektrum dengan

bantuan komputer (Kellneret al. 2004).

Penggunan analisis kualitatif dari metode ini bertujuan untuk memurnikan

suatu senyawa yang akan dianalisis lebih lanjut, seperti dilakukan oleh Parket al

(2006) yang mencoba memisahkan senyawa aktif yang dapat menghambat enzim

xantin oksidase yang berasal dari teh hijau dengan menggunakan HPLC, yang

kemudian senyawa aktif tersebut dianalisis lebih lanjut dan diperoleh senyawa

flavonol kaemferol.

L iquid Chromatography M ass Spectroscopy(LC-MS)LC-MS merupakan metode analisis kuantitatif yang merupakan kombinasi

antara kromatografi cair dengan spektroskopi massa. Instrumentasi LC-MS terdiri

atas inlet-LC, sumber ion, tekanan permukaan, Mass analyzer, detektor,

instrument kontrol dan proses data. Prinsip dari metode analisis ini adalah ionisasi

molekul, dimana molekul ditembak oleh radikal bermuatan positif sehingga

terfragmen lebih lanjut dan terditeksi ion-ion positifnya. Kumpulan ion-ion yang

dihasilkan merupakan karakteristik suatu molekul. Spektrum LC-MS dapat

terbentuk dengan melewatkan sumber ion ke sampel yang kemudian diproses

dengan suhu tinggi (karena sampel masih dalam bentuk cair setelah dipisahkan

oleh LC) melalui suatu alat mass analyseryang kemudian dibaca oleh detektor

berupa sinyal. Sinyal ini yang kemudian diubah menjadi bentuk spektrum dengan

bantuan komputer (Willard et al. 1988).

Metode ini digunakan untuk menentukan massa molekul dan rumus

molekul yang sangat membantu dalam elusidasi struktur molekul baik organik

maupun anorganik. Seperti yang dilakukan oleh Jiao at el (2006) yang

menganalisis rumus molekul senyawa aktif yang dapat menghambat enzim xantin

oksidase dari palhinhaea cernua dengan LC-MS memperoleh bobot molekul

(m/z) sebesar 579,1200 dengan rumus molekul C30H27O12.

7/22/2019 2008 Nad

37/80

37

Nuclear Magnetik Resonance(NMR)

NMR merupakan metode kualitatif yang didasarkan pada telaah absorpsi

radiasi frekuensi radio oleh inti. Instrumentasi NMR terdiri atas superkondukting

magnit, shimcoil-shim power supply, detektor RF, digitizer, pulse program, RF

source, RF amplifier dan komputer untuk memproses data. Prinsip dari NMR

adalah semua inti yang bermuatan akan mengalami spin (perputaran) pada sumbu

inti dengan menghasilkan suatu dipol magnit sepanjang sumbu dengan

momentum megnetik. Bila inti tersebut diletakkan dalam suatu medan magnet

kuat akan mengalami rotasi atau spin pada sumbu inti dan energi unsur tersebut

akan pecah menjadi 2 tingkat energi terkuantisasi atau lebih sebagai akibat sifat

magnit inti tersebut. Transisi antara tingkat-tingkat energi yang terjadi karena di

induksi medan magnit dapat terjadi bila mengabsorpsi radiasi elektromagnetikdengan frekuensi yang tepat. Lingkungan kimia dalam molekul mempengaruhi

absorpsi oleh inti dalam suatu meden megnit. Spektrum nmr dapat terbentuk

dengan melewatkan radiasi eletromagnetik ke sampel yang kemudian diproses

melalui peralatan medan magnit sehingga dibaca oleh detektor radio frekuensi

berupa sinyal. Sinyal ini yang kemudian diubah menjadi bentuk spektrum dengan

bantuan komputer (Breitmaier 1993).

Metode ini dapat digunakan dalam menentukan struktur molekul organik

dan anorganik dengan tingkat akurasi yang tinggi. Seperti dilakukan oleh Jiao et

al (2006) yang menganalisis struktur senyawa aktif yang dapat menghambat

enzim xantin oksidase daripalhinhaea cernua diperoleh struktur 5,7-dihidroksi-2-

(4-hidroksipenil)-4H-1-benzopiran-4-on-4-o-(2-o-p-kumaroil)--D-

glukopiranosida.

7/22/2019 2008 Nad

38/80

38

BAHAN DAN METODE

Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini berlangsung selama 12 bulan, mulai Mei 2007 hingga Mei

2008 bertempat di Laboratorium Kimia analitik, Pusat studi Biofarmaka IPB serta

Laboratorium Departemen Kelautan Sukabumi.

Bahan dan Alat

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi sampel seledri

asal Semarang, bufer fosfat, heksana, CHCl3, etil asetat, aseton, etanol, metanol,

air, HCl, aseton, etil asetat, pelat KLT, silika gel GF254, silika gel G40-63,

pereaksi Meyer, Dragendorf, dan Wagner, Artemia salina L., kertas saring, air

laut, air bebas ion, aquades, xantin dari sigma, dan enzim xantin oksidase dari

sigma yang berasal dari Bovin.

Alat-alat yang digunakan antara lain neraca analitik, hotplate, oven,

desikator, penggilingan, saringan, corong buchner, kolom gelas, rak tabung reaksi,

waterbath, pH meter, pengering beku, rotary evaporator, spektrofotometer,

autopipet, stopwatch, vorteks mixer, alat-alat gelas, spektrometer, instrumen FT-

IR, HPLC, LC-MS dan NMR.

Metode Penelitian

Pada penelitian ini dimulai dengan pembuatan ekstrak hingga analisis

NMR. Diagram alir dari penelitian ini selengkapnya dapat dilihat pada Lampiran

1.

Ekstraksi etanol

Seledri kering herba (batang dan daun) diekstraksi dengan etanol dengan

perbandingan bahan dan pelarut 1 : 3 (g/v) hingga filtrat terakhir menunjukkan

negatif untuk uji flavonoid, lalu disaring dan dipekatkan dengan rotavapor.

Ekstrak yang didapat kemudian dikeringbekukan, dan rendemen yang diperoleh

dicatat. Rendemen tersebut lalu diuji kualitatif (Harborne 1987), diuji

sitotoksinnya terhadapArtemia Salina L.(Finney 1971), diuji daya inhibisi dan

mekanisme kinetikanya terhadap xantin oksidase serta difraksinasi dengan kolom

7/22/2019 2008 Nad

39/80

39

silika gel untuk mendapatkan senyawa aktif yang lebih murni. Terhadap sampel

seledri yang lain ditentukan kadar airnya (AOAC 1984).

Uji toksisitas ekstrak terhadap Artemia SalinaL.

Tahap awal uji toksisitas adalah penetasan kista Artemia Salina L.Kista

Artemia Salina L. ditimbang sebanyak 50 mg kemudian dimasukkan kedalam

wadah yang berisi air laut bersih dilengkapi aeroton dan dibiarkan selama 48 jam

dibawah pencahayaan lampu agar menetas sempurna. Larva yang sudah menetas

digunakan dalam uji sitotoksin. Dalam uji sitotoksin sebanyak 10 ekor larva

Artemia Salina L. dimasukkan dalam vial yang berisi air laut lalu ditambahkan

larutan ekstrak etanol (ekstrak kasar maupun hasil fraksinasi) sehinggakonsentrasi akhir ekstrak menjadi 1000, 100, 10 ppm. Pengamatan dilakukan

setelah 24 jam dengan menghitung jumlah larva yang mati (Finney 1971).

Pengolahan data persen mortalitas komulatif dilakukan dengan analisis probit

(LC50) menggunakan program Minitab 14 pada selang kepercayaan 95 %.

Uji Daya Inhibisi Terhadap Xantin Oksidase

Uji daya inhibisi ekstrak kasar maupun senyawa aktif hasil fraksinasi

terhadap xantin oksidase dilakukan pada kondisi optimumnya. Kondisi optimum

pengujian mengacu pada hasil penelitian Iswantini dan Darusman (2003), yaitu

pada waktu inkubasi 45 menit, suhu 20OC, pH 7,5, konsentrasi xantin oksidase 0,1

unit/ml, dan konsentrasi substrat (xantin) 0,7 mM.

Ekstrak kering (ekstrak kasar maupun hasil fraksinasi) dimasukkan ke

dalam tabung reaksi dengan variasi konsentrasi tertentu. Khusus untuk senyawa

aktif seledri hasil fraksinasi, variasi konsentrasi didasarkan pada hasil uji BSLT.

Selanjutnya kedalamnya ditambahkan larutan bufer kalium fosfat 50 mM pH 7,5

sampai volumenya menjadi 1,9 ml. Campuran kemudian ditambah 1 ml xantin

2,1 mM dan xantin oksidase 0,1 unit/ml sebanyak 0,1 ml lalu diinkubasi pada

suhu 20C selama 45 menit. Setelah masa diinkubasi, ke dalam campuran dengan

segera ditambahkan HCl 0,58 M sebanyak 1 ml. Campuran selanjutnya diukur

7/22/2019 2008 Nad

40/80

40

serapannya menggunakan spektrofotometer UV pada panjang gelombang 262 nm

untuk melihat seberapa besar sisa xantin yang tidak bereaksi dalam sampel uji.

Jumlah asam urat yang terbentuk selanjutnya dibandingkan dengan jumlah

xantin yang direaksikan. Dengan bantuan standar xantin, akan diketahui seberapa

besar jumlah xantin dalam sampel uji yang bereaksi. Ekstrak tidak memberikan

khasiat apabila jumlah asam urat yang terbentuk sama besar dengan jumlah xantin

yang diberikan dan dikatakan berkhasiat apabila jumlah asam urat yang

dihasilkannya lebih sedikit dari kontrol (perlakuan tanpa ekstrak). Semakin sedikit

asam urat yang terbentuk, ini berarti ekstrak semakin berkhasiat dalam

menghambat kerja xantin oksidase.

Uji Kinetika Awal Inhibisi Terhadap Xantin Oksidase

Uji kinetika inhibisi dilakukan pada ekstrak kasar etanol herba dan hasil

fraksinasinya. Prosedur uji kinetika inhibisi mirip dengan pelaksanaan uji

penentuan daya inhibisi, hanya saja pada uji kinetika, konsentrasi substrat (xantin)

divariasikan mulai dari 0,00 hingga 1,00 ppm dengan kenaikan interval setiap

0,05 ppm. Sebelum uji ini dilakukan perlu diketahui terlebih dahulu pada

konsentrasi berapa ekstrak kasar ekstrak kasar etanol akar seledri dan ekstrak

kasar etanol herba (daun dan batang) memberikan hambatan maksimumnya.

Untuk itu sederetan konsentrasi ekstrak mulai dari 100, 150, 200, 300 hingga

2000 ppm akan diujikan (diuji sesuai dengan uji daya inhibisi). Ekstrak dengan

konsentrasi terbaik yang kemudian dijadikan kandidat bagi pelaksanaan uji

kinetika inhibisi.

Dalam pelaksanaannya, sederetan konsentrasi substrat disiapkan

(0,00; 0,05; 0,10; 0,15 s/d 1,00 mM) dan diuji sebagaimana penentuan daya

inhibisi, dari sini akan diperoleh kinetika enzim xantin oksidase dalam keadaan

normal. Sedangkan untuk melihat kinetika enzim akibat mendapat perlakuan

ekstrak, ke dalam sederetan konsentrasi substrat yang lain ditambahkan ekstrak

(konsentrasi terpilih), dan diinkubasi sesuai kondisi optimumnya, lalu dibaca

serapannya pada panjang gelombang 262 nm.

Data yang diperoleh kemudian dikonversi dan diinterpretasikan ke dalam

persamaan Lineweaver-Burk dalam bentuk grafik. Konsentrasi xantin (substrat)

7/22/2019 2008 Nad

41/80

41

diubah menjadi 1/[xantin] pada sumbu X, dan kecepatan reaksi pembentukan

asam urat diubah menjadi 1/kecepatan pada sumbu Y. Selanjutnya dicari

persamaan garis yang terbentuk dan tipe hambatannya berdasarkan perpotongan

garis antara kinetika enzim normal dengan kinetika enzim setelah mendapat

perlakuan ekstrak kasar etanol herba (daun dan batang).

Fraksinasi Ekstrak Kasar etanol

Fraksinasi dilakukan untuk memurnikan ekstrak kasar etanol herba (daun

dan batang) yang didapat. Fraksinasi dilakukan pada kolom silika gel G40-63

menggunakan eluen kombinasi terbaiknya (kloroform : metanol : 9,5 : 0,5). Untuk

memilih eluen terbaik dicoba dengan berbagai eluen heksana, kloroform, etil

asetat, aseton, etanol, metanol dan air. Eluen tunggal dengan pemisahan terbaikkemudian dikombinasikan satu dengan yang lainnya dengan berbagai

perbandingan. Fraksinasi dilakukan dengan maksud untuk mencari kemungkinan

adanya senyawa tunggal yang memiliki daya inhibisi yang lebih baik

dibandingkan ekstrak kasarnya.

Elusidasi ekstrak dalam kolom silika gel dilakukan dengan eluen

kombinasi terbaiknya secara gradien. Dari sini diharapkan senyawa aktif seledri

dapat lebih banyak terpisah dan proses purifikasi dapat berlangsung dengan lebih

cepat. Elusidasi dilakukan terhadap 10 gram ekstrak kasar etanol akar dan ekstrak

kasar herba (daun dan batang) seledri yang terbagi dalam dua kali periode kolom,

yaitu 5 g pada kolom berukuran 15cm x 44mm dengan laju alir dijaga konstan 10

ml/menit.

Eluat hasil fraksinasi kolom ditampung setiap 5 ml, menggunakan tabung

reaksi kaca, dilakukan penggabungan fraksi dengan mengacu pada nilai Rf dan

kesamaan pola kromatogram menggunakan bantuan KLT analitik, dan setiap

fraksi gabungan yang terbentuk dikering bekukan, dihitung rendemennya, serta

diuji aktivitasnya terhadapArtemia salina L., dari hasil ujiArtemiaakan diperoleh

informasi awal tingkat toksisitas fraksi (LC50). Pemeriksaan toksisitas diperlukan

untuk mengetahui tingkat konsentrasi yang tepat dalam pengujian dan untuk

menghindari efek toksik bagi senyawa yang akan dijadikan sebagai calon obat.

Nilai LC50 yang didapat ini kemudian dijadikan acuan sebagai konsentrasi

7/22/2019 2008 Nad

42/80

42

maksimum yang diperkenankan dalam uji daya inhibisi terhadap xantin oksidase,

serta nilai inhibisi tertinggi dijadikan sebagai acuan pada kinetika untuk

mengetahui tipe kinetikanya.

Identifikasi dan Pemurnian Fraksi Teraktif

Identifikasi awal fraksi teraktif (yang diperoleh dari fraksinasi tahap

pertama) dilakukan dengan menggunakan analisis FT-IR dengan metode pelet

KBr, yakni dengan cara mencampur 2 mg sampel dengan 200 mg KBr kemudian

dipres hingga terbentuk pelet KBr yang kemudian diletakkan kedalam tempat

sampel analisisnya.

Sebelum dilakukan analisis kualitatif dengan HPLC maka dilakukan

scanning terlebih dahulu terhadap sampel fraksi teraktif untuk mengetahuipanjang gelombang (max) untuk. Setelah diperoleh max, maka dilakukan analisis

kualitatif dengan HPLC. Analisis HPLC dilakukan secara isokratik dengan

menggunakan fase gerak eluen terbaik (kloroform : metanol : 9,5 : 0,5) dan fase

diam kolom C18, Sementara detektor yang digunakan adalah diode array, karena

detektor ini dapat menditeksi sampel pada panjang gelombang 180-700 nm.

Sampel fraksi teraktif dilarutkan dengan eluen terbaik kemudian diinjekkan

kedalam HPLC dengan volume injek 400 l dan laju alir 0,60 ml/min. Kemudian

masing-masing fraksi dari pemurnian HPLC ditampung dan diujikan kembali

keaktivitas enzim xantin oksidase. Fraksi teraktif dari pemurnian HPLC kemudian

dianalisis lebih lanjut untuk mengetahui bobot molekul dan strukturnya.

Penentuan bobot molekul (fraksi teraktif dari pemurnian HPLC) dianalisis

dengan menggunakan Liquid Chromatography Mass Spectroscopy (LC-MS)

secara kuantitatif. Analisis ini menggunakan teknikelectrospray ionisationpada

energi 70 ev dengan tujuan agar diperoleh fragmentasi yang sempurna. Analisis

dilakukan dengan cara melarutkan 2 mg sampel ke dalam 20 ml pelarut metanol

80%, dengan volume injek 10 l dan laju alir 0,1 ml/min.

Penentuan struktur fraksi teraktif dilakukan dengan analisis Nuclear

Magnetik Resonance(NMR) yaituHNMR dan

CNMR. Analisis dilakukan dengan

melarutkan 10 mg sampel kedalam 15 ml pelarut CD3OD dengan standar TMS

dan pada frekuensi 500 Hz.

7/22/2019 2008 Nad

43/80

43

HASIL DAN PEMBAHASAN

Ekstraksi Etanol

Estraksi etanol dilakukan terhadap tiga jenis sampel yakni 50 gram herba

seledri Cipanas, 150 gram herba seledri Cipanas dan 400 gram herba seledri

Semarang. Pelarut yang digunakan adalah EtOH : H2O ( 7 : 3 ), sebanyak lima

kali ulangan dengan tujuan menarik semua flavonoid yang terdapat pada sampel

dan diperoleh rendemen masing-masing sebesar 9,11%, 8,90% dan 10,40%.

Berdasarkan analisis kadar air terhadap ketiga sampel tersebut diperoleh masing-

masing 11,23%, 12,76% dan 6,08% (Lampiran 2). Menimbang serangkaian uji

yang akan dilakukan maka herba semarang dipilih sebagai sampel yang akan

dianalisis lebih lanjut karena rendemen ekstrak herba Semarang paling tinggi dan

sampel Semarang merupakan sampel terbaik, Ramdhani (2004) juga melaporkan

Sampel seledri asal Semarang merupakan sampel terbaik.

Uji Fitokimia dan Uji Sitotoksin (LC50)

Uji fitokimia dilakukan untuk mengetahui adanya kandungan senyawa

metabolit sekunder yang terdapat dalam suatu sampel bahan alam, hasil analisis

fitokimia seperti terlihat pada Tabel 2.

Tabel 2 Fitokimia ekstrak kasar etanol

No. Uji Nama Uji Hasil Pengamatan

1 Alkaloid ++

2 Triterpenoid +3 Steroid +

4 Kuinon +5 Saponin --

6 Tanin +

7 Flavonoid +++

Terjadi sedikit perbedaan dengan uji fitokimia yang dilakukan oleh Ramdhani(2004), yaitu pada uji kuinon (+) sedangkan pada penelitian Ramdhani (2004)

negatif, hal ini diduga karena asal sampel yang berbeda.

Sementara uji toksisitas adalah uji yang dilakukan untuk mengetahui jumlah

konsentrasi yang tepat dari suatu senyawa bioaktif sebagai calon obat. Uji

toksisitas yang digunakan dalam penelitian ini adalah uji letal Consentrasi (LC50).

7/22/2019 2008 Nad

44/80

44

Uji ini digunakan untuk menentukan batas tingkat konsentrasi yang menyebabkan

keracunan. Hasil analisis Probit diperoleh bahwa ekstrak etanol herba memiliki

nilai LC50 sebesar 1969,18 ppm. Menurut Meyer (1982) senyawa yang dapat

dikatakan sebagai obat dan bersifat bioaktif adalah senyawa yang memiliki nilai

LC50kurang dari 1000 ppm. Berdasarkan hasil analisis nilai LC50pada penetian

ini menunjukkan bahwa ekstrak kasar etanol herba seledri masih kurang

berpotensi sebagai obat asam urat maupun senyawa yang bersifat sebagai

bioaktivitas. Hal ini diduga dalam ekstrak kasar tersebut masih banyak sekali

golongan senyawa sehingga mengakibatkan ekstrak memiliki daya bunuh kuman

yang rendah. Tetapi setelah dilakukan Fraksinasi terhadap ekstrak kasar etanol

kemampuan daya bunuh kumannya meningkat, hal ini dapat dilihat dari nilai LC50

pada berbagai fraksi (Lampiran 9). Nilai LC50 pada berbagai fraksi hasil kolommenunjukkan bahwa ekstrak tersebut sangat berpotensi sebagai calon obat dan

bersifat bioaktivitas. Meningkatnya nilai LC50 setelah di fraksinasi menguatkan

dugaan bahwa kandungan senyawa yang ada dalam esktrak tersebut semakin

murni sehingga daya bunuh terhadap kuman pun semakin tinggi.

Daya Inhibisi Ekstrak kasar Etanol Herba terhadap Enzim Xantin Oksidase

Analisis daya inhibisi ekstrak kasar etanol terhadap enzim xantin oksidase,

dilakukan pada berbagai variasi konsentrasi dari ekstrak yang didasarkan pada

nilai LC50. Variasi konsentrasi ekstrak ini bertujuan untuk mencari konsentrasi

terbaik dan memiliki daya inhibisi terbaik. Konsentrasi terbaik dengan daya

inhibisi tertinggi inilah yang akan digunakan untuk uji kinetika. Berdasarkan

analisis daya inhibisi ekstrak kasar etanol herba seledri dapat dilihat pada Gambar

10.

7/22/2019 2008 Nad

45/80

45

6.048.20

11.6 4

6.47

29.75

40.67

45.56

57.19

63.66

67.6966.69

54.9

61.9461.22

65.68

74.01

68.82

65.25 65.39

58.35 57.19

0

10

20

30

40

50

60

70

80

DayaInhibis

i(%)

10 0 15 0 2 0 0 3 0 0 4 0 0 50 0 6 0 0 70 0 8 0 0 0 9 0 0 10 0 0 110 0 1 20 0 13 0 0 14 0 0 150 0 16 0 0 170 0 1 80 0 19 0 0 2 0 0 0

Konsentrasi (ppm)

Gambar 10 Daya inhibisi ekstrak kasar etanol terhadap enzim xantin oksidase

Pada Gambar diatas memperlihatkan peningkatan daya inhibisi yang tidak

seiring dengan bertambahnya konsentrasi ekstrak. Peningkatan yang tidak

signifikan ini diduga adanya karakteristik komponen senyawa yang berbeda dalam

sampel yang ikut terekstrak oleh etanol air. Golongan senyawa tersebut dapat

berfungsi sebagai inhibitor ataupun aktivator enzim, seperti terpenoid, alkaloid

(Harborne 1987) .

Melihat tingginya daya inhibisi ekstrak kasar etanol tersebut (74,01%)

dengan konsentrasi 1500 ppm, menunjukkkan bahwa ekstrak kasar etanol

berpotensi sebagai obat asam urat maupun sebagai senyawa yang bersifat sebagai

senyawa bioaktivitas, hal ini diperkuat oleh Ramdhani (2004) yang melaporkan

bahwa daya inhibisi ekstrak kasar etanol seledri mencapai di atas 50 %.

Uji Kinetika Ekstrak Kasar Etanol terhadap Enzim Xantin Oksidase

Pada uji kinetika ini digunakan konsentrasi ekstrak kasar 1500ppm,

pemilihan konsentrasi ini didasarkan pada nilai daya inhibisinya yang besar

(74,01%) dengan konsentrasi yang masih dibawah nilai LC50 nya. Berdasarkan

analisis kinetika enzim menurut persamaan Michaelis Menten dan turunanya

(Lineweaver- Burk) selengkapnya dapat dilihat pada Lampiran 4 dan hasil

rataannya dapat dilihat pada Gambar 11.

7/22/2019 2008 Nad

46/80

46

1500 ppm (ekstrak)

0 ppm (normal)

R2= 0.9115

R2= 0.9033

-750

-500

-250

0

250

500

750

1000

1250

1500

1750

2000

0 1.0526 1.1765 1.3333 1.5385 1.8182 2.2222 2.8571 4.0000 6.6667 20.0000

1/(xantin)

1/(kecepatan)

Gambar 11 Pola kinetika inhibisi ekstrak kasar etanol

Berdasarkan analisis grafik di atas diperoleh perubahan nilai KM yang

cukup signifikan dan perubahan Vmaxyang sangat kecil sekali. Pola kinetika yang

terbentuk setelah penambahan ekstrak mengakibatakan peningkatan KM sebesar

0,10 mM dari 0,29 mM menjadi 0,39 mM dan penurunan Vmax sebesar 0,001

mM/Menit dari 0,0065 mM/Menit menjadi 0,0036 mM/Menit. Kecilnya

perubahan Vmax diasumsikan tidak ada. Menurut Voet & Voet (2001) jenis

inhibisi kompetitif adalah inhibisi dimana terjadi peningkatan nilai KM dengan

Vmaxyang tetap. Pada inhibisi kompetitif, inhibitor berkompetisi dengan subtrat

untuk memperebutkan sisi aktif enzim dan peristiwa ini menyebabkan nilai KM

menjadi lebih besar dari keadaan normalnya dengan Vmax yang relatif tetap. Maka

dapat disimpulkan bahwa tipe inhibisi yang terjadi adalah tipe inhibisi kompetitif.

Berdasarkan analisis ini diperoleh nilai afinitas inhibitor () ekstrak kasar

etanol seledri sebesar 1,4. Nilai ini diperoleh dengan membandingkan nilai KM

enzim ekstrak dengan nilai KMenzim normal. Nilai di atas menunjukkan bahwa

inhibisi kompetitif yang terjadi cukup kuat, seperti dijelaskan oleh Voet & Voet

(2000) bahwa nilai afinitas inhibitor yang lebih besar dari 1 menunjukaninhibisinya cukup kuat.

7/22/2019 2008 Nad

47/80

47

Fraksinasi Ekstrak Etanol Herba Seledri

Sebelum dilakukan fraksinasi terhadap ekstrak kasar etanol, dilakukan

pencarian eluen terlebih dahulu dengan menggunakan KLTa. Eluen ini berfungsi

sebagai fase gerak saat fraksinasi. Eluen yang digunakan adalah heksana,

kloroform, etil asetat, aseton, etanol, metanol dan air. Eluen dengan pemisahan

terbaik kemudian dikombinasikan satu dengan yang lainnya dengan berbagai

perbandingan. Berdasarkan analisis dengan menggunakan KLTa diperoleh eluen

terbaik yang terdiri dari campuran CH3Cl : MeOH = 9,5 : 0,5 (Gambar 12).

Markam (1988) menggunakan CHCl3 : MeOH sebagai eluen pada pemisahan

flavonoid menggunakan penjerap silika gel berhasil dengan baik pada

perbandingan 15 : 1 sampai 3 : 1.

Gambar 12 Eluen terbaik (CHCl3: MeOH = 9,5 : 0,5)

Fraksinasi ekstrak etanol dilakukan dengan menggunakan flash kolom dan

dilakukan terhadap 10 gram sampel ekstrak dengan dua kali periode kolom

fraksinasi, masing-masing 5 gram perkolomnya. Kolom yang digunakan adalah

silikagel G40-60 berukuran 15 cm x 40 mm dengan laju alir 10 ml/unit. Fraksinasi

ini bertujuan untuk memperoleh pola pemisahan yang lebih sempurna, fraksi yang

di dapat akan lebih murni senyawa aktif akan lebih banyak terisolasi.

Berdasarkan hasil fraksinasi diperoleh 7 fraksi gabungan. Rendemen fraksi

terbesar terdapat pada fraksi 1 (22,17%) dan rendemen terkecil pada fraksi 3

(1,98%), data rendemen selengkapnya dapat dilihat pada lampiran 8. Ketuju fraksi

tersebut kemudian dilakukan uji sitotoksan dan uji fitokimia. Secara keseluruhan

nilai sitotoksan dari hasil fraksinasi sangat jauh lebih tinggi (Lampiran 8)

dibanding dengan ekstrak kasarnya (1969,18 ppm). Hal ini menunjukkkan

besarnya aktivitas yang dimiliki oleh ekstrak setelah melalui proses fraksinasi.

7/22/2019 2008 Nad

48/80

48

Sementara uji fitokimia yang dilakukan terhadap ketuju fraksi tersebut hanya uji

flavonoid, hal ini mengingat jumlah sampel hasil fraksi yang terbatas, Hasil

analisis fitokimia dapat dilihat pada Tabel 3.

Tabel 3 Fitokimia hasil kromatografi

No. Nama Uji Flavonid

1 Fraksi 1 +

2 Fraksi 2 --

3 Fraksi 3 --4 Fraksi 4 --

5 Fraksi 5 ++6 Fraksi 6 +++

7 Fraksi 7 +

Terlihat bahwa fraksi 5 dan fraksi 6 positif flavonoid, hal ini menunjukkan

bahwa dalam fraksi tersebut mengandung senyawa yang memungkinkan dapat

mengahambat enzim xantin oksidase.

Daya inhibisi hasil fraksinasi terhadap enzim xantin oksidase

Berdasarkan uji daya inhibisi fraksi hasil kolom diperoleh sederetan

konsentrasi fraksi yang akan digunakan dalam pengujian. Sederetan kosentrasi ini

diujikan terhadap enzim xantin oksidase, pengujian konsentrasi ini dimulai dari 50

ppm sampai 450 ppm, nilai ini didasarkan pada nialai sitotoksan dari seluruh

fraksi (Lampiran 9), hasil kolom memiliki daya inhibisi yang bervariasi (

Lampiran 10). Sebagai pembanding nilai daya inhibisi antar fraksi digunakan

konsentrasi 150 ppm karena konsentrasi ini terdapat pada semua fraksi kolom.

Fraksi keenam mempunyai daya inhibisi paling kuat terhadap enzim xantin

oksidase pada konsentrasi tersebut, di susul dengan fraksi 5 dan terakhir fraksi 1

seperti terlihat pada Gambar 13.

7/22/2019 2008 Nad

49/80

49

42.82

51.88