2015版药典无菌检查 - zgmdf.cn · 无菌检查的环境要求...
TRANSCRIPT
主要内容
无菌检查法的发展
无菌检查法概述
无菌检查法的过程控制
无菌检查法的溯源性调查
无菌检查法的起源
1665年，欧洲勃兰登堡侯国御医约翰·西吉斯蒙德·埃尔
斯霍尔茨发表了《新灌药法及其方式方法》
1831年，西欧霍乱肆虐，苏格兰医生赖特用大量煮沸过的
食盐水静脉输注，大部分人获救的同时，赖特也发现了
“注射热”
随着显微镜的发明和微生物的发现，开始有了对输液产品
无菌检查的研究
无菌检查法发展历史
国际无菌检查发发展历史 1925年 直接接种法首先在英国使用
1932年 英国药典推荐使用无菌测试
1936年 美国药典第十一章首先引用单个培养基的直接接种法
1950年 美国药典第十六章推荐使用FTG和SB两种培养基分别培养需、厌氧菌和真菌
1957年 美国FDA和MILLIPORE公司介绍膜过滤法用于抗生素无菌测试
1963年 英国药典63版收载薄膜过滤法无菌测试
1965年 美国药典引用薄膜过滤法用于非抑菌性药品的无菌测试
1971年 欧洲药典第二版公布参照薄膜过滤法无菌测试
1978年 欧洲药典修订版发行公布推荐使用薄膜过滤法无菌测试
1988年 美国FDA规定：假如第一次无菌检查不符合规定的样品不再测试，这一批次的药品应报废。实际上排除了药品无菌阳性后再测试的机会
1998年 英国药典1998无菌测试以一次检出为准，取消复试。
2000年 美国药典24版无菌测试以一次检出为准，取消复试。
我国历版药典无菌检查法发展历史 1953版 实验环境仅要求半无菌操作箱；仅收载一种直
接接种法；用一种培养基检查
1963版 仅直接接种法；用三种培养基分别培养细菌和霉菌
1977版 开始收载薄膜过滤法（简单装置），用两种培养基分别培养细菌和霉菌
1985版 收载薄膜过滤法限于抗生素样品；用需、厌气菌培养基及霉菌培养基；要求实验环境为紫外线灭菌的无菌室。
1990版 与85版相同
1995版 开始要求对培养基进行灵敏度检查
2000版 规定实验环境为100级洁净度；检验数量从2支/瓶增加为6～11支/瓶；明确薄膜过滤法为首选方法，收载全封闭过滤技术。
2005版 收载隔离系统，强调洁净度验证；培养基适用性检查包括无菌性检查和灵敏度检查；增加稀释液、冲洗液的品种；开始明确规定检验方法的验证试验要求；应优先采用薄膜过滤法，延长培养时间为至少14天，取消复试。
无菌检查的相关概念
定义
性质
影响
因素
局限性
·用于药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器具、
原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法
·是有关药品安全的一种定性试验
·根据培养基中是否有微生物生长判断结果
·环境、人员、用品无菌性、检验数量、检验量、培
养基适用性、方法适用性、培养条件等
·微生物污染不均匀
·检验方法局限
无菌检查的局限性
如果因灭菌不完全或产品密封系统出现偏差，一个批次中有
10%的产品受到微生物污染，从该批次中取一个成品样做无
菌检查，那么存在两种可能，取到一个无菌样，或取到一个
染菌样，取到无菌样的概率p=0.9，取到染菌样的概率q=0.1
(p+q)n=1 即（0.9+0.1)n=1.0
该事件中，无菌检查通过率为90%
无菌检查的局限性
如果从这个批次中取2个成品样做无菌检查，则存在三种可
能：2个无菌样，2个染菌样，1个无菌样和1个染菌样
即(p+q)2=p2+2pq+q2=1
分别把p=0.9和q=0.1代入
q2=0.81（取到2支无菌样的概率）
q2=0.01（取到2支染菌样的概率）
2pq=0.18（取到1支无菌样和1支染菌样的概率）
该事件中，无菌检查通过率为81%
无菌检查的局限性
通过无菌检查的概率： pn=(1-q)n
取样量，污染率%，无菌检查通过率%
取样量
污染率%
0.5 1 2 5 10 20 30
1 99.5 99 98 95 90 80 70
2 99 98 96 90.3 81 64 49
5 97.5 95 90 77 59 36 16
10 95 90 81 59 35 12 2.8
15 93 86 72 46 21 4 0.5
20 91 82 64 36 12 1 0.08
25 88 78 60 28 7 0.4 0.01
30 86 70 49 21.5 4.2 0.1 0.02
无菌检查的局限性
无菌是根据概率的原则判断的。从给定批号的所有产品中
存在被污染产品的概率得出判断
无菌测试本身并不是设计用于保证产品无菌或产品已灭菌。
产品的无菌保证是通过灭菌工艺或灭菌工艺的验证来得到
的
无菌测试适用于药典要求无菌的药物成分，配制剂或制剂。
然而，合格结果仅说明在测试条件下受检的样品中未发现
微生物污染
无菌检查的过程控制
环境保证 培养基保证
有效的方法 SOP操作
有效的结果
可靠的结论
结果判断
无菌性检查
灵敏度检查
方法验证
对照培养基
无菌检查用隔离
系统验证指导原则
药品微生物实验室质量管理指导原则
药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则
微生物鉴定指导原则
非无菌产品微生物限度监测指导原则
药品微生物检验替代方法验证指导原则
无菌检查的过程控制
环境保证 培养基保证
有效的方法 SOP操作
有效的结果
可靠的结论
结果判断
无菌性检查
灵敏度检查
方法验证
对照培养基
无菌检查的环境要求
《中国药典》（2010年版）
万级下的百级
《中国药典》（2015年版）
9205 药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则
9206 无菌检查用隔离系统验证指导原则
B+A 或隔离系统
清洁、消毒和卫生
·理想的消毒剂
可杀死广泛的微生物；对人类无毒害；不会腐蚀或沾污设备；
具有清洁剂作用；稳定；起效快；不会被有机物灭活；
极小的残留；价格合理
·主要的消毒剂类型
酚类；季铵盐类；次氯酸钠；二氧化氢；过氧化氢；过乙酸；
过乙酸/过氧化氢混合物；戊二醛/甲醛；醇类
喷雾70%酒精 抹擦70%异丙醇 喷雾间抹擦
金黄色葡萄球菌 99.8 99.6 100.0
枯草芽孢杆菌 27.6 80.6 93.9
无菌隔离系统与传统洁净技术的对比
项目 消毒/灭菌方法
洁净环境的控制
对操作人员的防护
物料传送方式
人员进出 运行所需能耗
误操作导致的无菌环境污染的风险
传统洁净技术
消毒剂擦拭/熏蒸/紫外线照射等方法受空间等诸多因素影响效果难以验证
易受人员、物料等诸多因素影响，易受污染，难以控制
取决于操作人员自身技术和熟练程度
传统的传递窗，易导致无菌室环境破坏和物料的污染
需复杂的换鞋/工作服更换等步骤，带来额外工
作量
高 误操作可能性大，与操作人员有较大相关性
无菌隔离器技术
自动气体灭菌，省时省力，气体分布均匀，效果较好，容易验证
与外界完全隔离，仅通过
HEPA进行空气交换并可恒定舱内压力以阻绝外界污染
安全系数高
双门快速传递系统保证在无菌环境中传递，无菌保证程
度高
仅通过穿戴手套/半身工作服
即可
低 可能性极小
三种主要设备比较
生物安全柜 层流柜 无菌隔离器
人员保护 ☆☆ ☆ ☆☆☆
环境要求 ☆☆ ☆☆☆ ☆
样品保护 ☆☆ ☆☆ ☆☆☆
处理样品灵活性 ☆☆☆ ☆☆ ☆
操作难度 ☆☆ ☆☆☆ ☆
运行维护难度 ☆☆ ☆☆☆ ☆
无菌检查的过程控制
环境保证 培养基保证
有效的方法 SOP操作
有效的结果
可靠的结论
结果判断
无菌性检查
灵敏度检查
方法验证
2015版无菌检查培养基与USP、BP的比较
药典 USP BP 中国药典2015
名称 Fluid Thioglycollate
Medium硫乙醇酸盐流体培养基
Fluid Thioglycollate
Medium 硫乙醇酸盐流体培养基
Fluid Thioglycollate
Medium 硫乙醇酸盐流体培养基
目的 培养需氧、厌氧和微需氧微生物（主要是厌氧菌）
培养需氧、厌氧和微需氧微生物（主要是厌氧菌）
培养需氧、厌氧微生物
培养条件 14天于30～35℃及20～25℃
配方 Pancreatic Digest of Cassein（胰酪蛋白胨） 15.0g
Yesat Extract（酵母浸出粉） 5.0g
Dextrose（葡萄糖） 5.5g
Sodium Chloride（氯化钠） 2.5g
L-Cystine（L-胱氨酸） 0.5g
Sodium Thioglycollate（硫乙醇酸钠） 0.5g
Agar（琼脂） 0.75g
Resazur in（刃天青） 1.0mg
大豆胰酪胨培养基（TSB）&改良马丁培养基
药典 USP36 BP-2013 中国药典2010版 中国药典2015版
名称 Tryptic Soy Broth（Soybean
Casein Digest Medium）大豆-胰酪胨培养基
改良马丁培养基 胰酪大豆胨液体培养基
配方 胰酪蛋白胨 7.0g
大豆木瓜蛋白酶消化物 3.0g
氯化钠 5.0g
磷酸氢二钾 2.5g
一水葡萄糖 2.5g
蛋白胨 5.0g
酵母浸出粉 2.0g
葡萄糖 20.0g
磷酸氢二钾 1.0g
硫酸镁 0.5g
胰酪胨 17.0g
大豆木瓜蛋白酶水解物 3.0g
氯化钠 5.0g
磷酸氢二钾 2.5g
葡萄糖 2.5g
目的 支持广泛微生物的生长，包括需氧菌、专性和兼性厌氧菌、真菌（主要是需氧菌）
用于培养真菌 支持广泛微生物的生长，包括需氧菌、专性和兼性厌氧菌、真菌（主要是需氧菌）
培养条件 14天于30～35℃及20～25℃
14天于20～25℃
14天于30～35℃及20～25℃
微生物实验室常用菌株
铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）
[CMCC(B)10104]
大肠埃希菌（Escherichia coli）
[CMCC(B)44102]
金黄色葡萄球菌（Staphylocococcus aureus)
[CMCC(B)26003]
生孢梭菌（Clostridium sporogenes)
[CMCC(64941)]
枯草杆菌（Bacillus subtilis）
[CMCC(B)63501]
白色念珠菌（Candida albicans)
[CMCC(F)98001]
黑曲霉（Aspergillus niger）
[CMCC(F)98003]
G-杆菌
G+球菌
G+芽孢杆菌
酵母菌
霉菌
兼性需氧菌
专性需氧菌
专性厌氧菌
在硫乙醇酸盐流体培养基中生长差异
需氧层厌氧层均生长
仅在厌氧层生长
仅在需氧层生长
·铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）
CMCC（B）10104
·大肠埃希菌（Escherichia coli）
CMCC（B）44102
·金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
CMCC（B）26003
·生孢梭菌（Clostridium sporogenes）
CMCC（B）64941
·枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
CMCC（B）63501
无菌性检查
每批培养基随机取不少于5支（瓶），置各培养基规定的温度培养
14天，应无菌生长。
灵敏度检查
·菌液制备
·培养基接种
培养基的适用性检查
无菌检查的过程控制
环境保证 培养基保证
有效的方法 SOP操作
有效的结果
可靠的结论
结果判断
无菌性检查
灵敏度检查
方法验证
2010版 （方法验证）
硫乙醇酸盐流体培养基接入小于100cfu的
①金黄色葡萄球菌
②大肠埃希菌
③枯草芽孢杆菌
④生孢梭菌
改良马丁培养基接入小于100cfu的
①白色念珠菌
②黑曲霉
2015版（方法适用性试验）
硫乙醇酸盐流体培养基接入小于100cfu的
①金黄色葡萄球菌
②大肠埃希菌
③生孢梭菌
胰酪大豆胨液体培养基接入小于100cfu的
①枯草芽孢杆菌
②白色念珠菌
③黑曲霉
方法适用性内容修订
利用供试品与微生物的差异，降低或消除供试品的影响
通过模拟实验对降低或消除效果加以检验
方法适用性的一般程序与环节
检查
验证前处理方法对污染菌生长、检出的影响
样品
需前处理
不需前处理
有抑菌作用
无抑菌作用
去除抑菌作用
可通过适用
性实验判断
验证抑菌活性去除
的有效性，以及去
除方法对污染菌生
长、检出的影响
稀释法——降低供试品的相对浓度
薄膜法——利用体积差异分离
中和法——利用化学（生物）专属性灭活
联合法——上述几种方法的组合
供试品中抗菌活性的去除
无菌检查法包括薄膜过滤法和直接接种法。只要供试品性质允许，应采
用薄膜过滤法。供试品无菌检查所采用的检查方法和检验条件应与方法
适用性试验确认的方法相同。
无菌试验过程中，如需使用表面活性剂、灭活剂、中和剂等试剂，应证
明其有效性，且对微生物无毒性。
检验数量 一次试验所用供试品最小包装容器的数量，成品每亚批均应进行无
菌检查。除另有规定外，出厂产品按表1规定；上市产品监督抽验按表2规定。
表1、表2中最少检验数量不包括阳性对照试验的供试品用量。
供试品的无菌检查
供试品 批产量N（个） 接种每种培养基的最少检验数量
医疗器具 ≤100
100＜N≤500
＞500
10%或4件（取较多者）
10件
2%或20件（取较少者）
表1 批出厂产品及生物制品的原液和半成品最少检验数量
表2 上市抽验样品的最少检验数量
供试品 供试品最少检验数量（瓶或支）
液体制剂
固体制剂
医疗器具
10
10
10
检验量 供试品每个最小包装接种至每份培养基的最小量（g或mL）。除另有规定
外，供试品检验量按表3规定。若每支（瓶）供试品的装量按规定足够接种两种培
养基，则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基。采用薄膜过
滤法时，只要供试品特性允许，应将所有容器内的全部内容物过滤。
阳性对照 应根据供试品特性选择阳性对照菌：无抑菌作用及抗革兰氏阳性菌为主
的供试品，以金黄色葡萄球菌为对照菌；抗革兰氏阴性菌为主的供试品以大肠埃希
菌为对照菌；抗厌氧菌的供试品，以生孢梭菌为对照菌；抗真菌的供试品，以白色
念珠菌为对照菌。阳性对照试验的菌液制备同方法适用性试验，加菌量小于100cfu，
供试品用量同供试品无菌检查时每份培养基接种的样品量。阳性对照管培养72小时
内应生长良好。
阴性对照 供试品无菌检查时，应取相应溶剂和稀释液、冲洗液同法操作，阴性对
照不得有菌生长。
供试品的无菌检查
表3 供试品的最少检验量
供试品 供试品装量 每支供试品接入每种培养基的最少量
液体制剂 ≤1mL
1mL＜V≤40mL
40mL＜V≤100mL
V＞100mL
全量
半量，但不得少于1mL
20mL
10%但不少于20mL
固体制剂 M＜50mg
50mg≤M＜300mg
300mg≤M＜5g
M≥5g
全量
半量
150mg
500mg
半量（生物制品）
生物制品的原液及其半成品
半量
医疗器具 外科用敷料棉花及其纱布
缝合线、一次性使用医用材料
带导管的一次性医疗器具（如输液袋）
其他医疗器具
取100mg或1cm×3cm
整个材料*
二分之一内表面积
整个器具（切碎或拆散开）*
*如果医用器械体积过大，培养基用量可在2000mL以上，将其完全浸没。
供试品处理及接种培养基
操作时，取适宜的消毒液对供试品容器表面进行测定消毒，如果供试品容器内
有一定的真空度，可用适宜的无菌器材（如带有除菌过滤器的针头）向容器内导入
无菌空气，再按无菌操作启开容器取出内容物。
薄膜过滤法
薄膜过滤法一般应采用封闭式薄膜过滤器。无菌检查用的滤膜孔径应不大于
0.45μ m，直径约为50mm。根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质。使用时，应
保证滤膜前后的完整性。
水溶性供试液过滤前应将少量的冲洗液过滤，以润湿滤膜。油类供试品，其滤
膜和过滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品
溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，
每张滤膜每次冲洗量一般为100mL,且总冲洗量不得超过1000mL，以避免滤膜上的微
生物受损伤。
供试品的无菌检查
水溶液供试品
水溶性固体供试品
非水溶性供试品
可溶于十四烷酸异丙酯的膏剂和黏性油剂供试品
无菌气（喷）雾剂供试品
装有药物的注射器供试品
带有导管的医疗器具（输血、输液袋等）供试品
供试品的无菌检查（薄膜过滤法）
直接接种法适用于无法用薄膜过滤法进行无菌检查的供试品，即取规
定量供试品分别等量接种至硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体
培养基中。
每个容器中培养基的用量应符合接种的供试品体积不得大于培养基体
积的10%
硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少于15mL，胰酪大豆胨液体培养基
每管装量不少于10mL。供试品检查时，培养基的用量和高度同方法验
证性试验。
供试品的无菌检查（直接接种法）
混悬液等非澄清水溶性供试品
固体供试品
非水溶性供试品
敷料供试品
肠线、缝合线等供试品
灭菌医用器具供试品
放射性药品
供试品的无菌检查（直接接种法）
硫乙醇酸盐流体培养基 30℃ ～35 ℃
胰酪大豆胨液体培养基 20℃ ～25 ℃
培养时间：14天
逐日观察并记录
培养液涂片、染色、镜检
供试品的无菌检查（培养及观察）
阳性对照管（+），阴性对照管（-）
若供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，即判合格。
若供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长，即判不合格。
当符合下列至少一个条件时可判试验结果无效
·设备、环境的微生物监控结果超标
·回顾试验过程，发现污染因素
·鉴定微生物，确认是操作引入的
试验若经确认无效，应重试。
无菌试验经确认无效，可重试。
供试品的无菌检查（结果判断）
无菌检验的溯源分析
微生物实验室
环境/过程
微生物检测 产品的微生物检测
环境/过程微生物
与产品微生物的比较 结论
产品污染
溯源分析
整改
实验污染
污染源排除 重试
微生物鉴定原则
表观水平 生化水平 分子水平
·菌株采集
·菌株纯化
·菌落形态观察
·细胞形态观察
·革兰氏染色
·鞭毛
微生物鉴定应遵循逐步缩小范围的原则
依据分类学知识，将微生物逐步分类至科、属、种
各类常见微生物的菌落特征
微生物类别
菌落特征
单细胞微生物 菌丝状微生物
细菌 酵母菌 放线菌 霉菌
主
要
特
征
细胞
形态特征 小而均匀、个别有芽孢
大而分化 细而均匀 粗而分化
相互关系 单个分散或
按一定方式排列
单个分散或
假丝状
丝状交织 丝状交织
菌
落
含水情况 很湿或较湿 较湿 干燥或较干燥 干燥
外观特征 小而突起
或大而平坦
大而突起 小而紧密 大而疏松
或大而致密
其
他
特
征
菌落透明度 透明或稍透明 稍透明 不透明 不透明
菌落与培养基结合度 不结合 不结合 牢固结合 较牢固结合
菌落颜色 多样 单调 十分多样 十分多样
菌落正反面颜色差别 相同 相同 一般不同 一般不同
细胞生长速度 一般很快 较快 慢 一般较快
气味 一般由臭味 多带酒香 带有泥腥味 霉味
革兰氏染色
革兰氏染色原理
第一步：结晶紫使菌体着上紫色
第二步：碘和结晶紫形成脂溶性大分子复合物，分子大，能被细胞壁阻留
在细胞内
第三步：酒精脱色，细胞壁成分和构造不同，出现不同反应
第四步：番红复染，增加脱色菌与背景的反差并区别于未脱色菌。
G+菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一透性屏障，当乙醇脱色时，肽聚
糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上，呈紫色
G-菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高，
乙醇将脂溶解，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，番红复染后呈红色。
实验室常用细菌革兰氏染色结果
G-杆菌代表菌种：
铜绿假单胞菌
（Pseudomonas
aeruginosa）
大肠埃希菌
（Escherichia coli）
G+芽孢杆菌代表菌种：
枯草杆菌
（Bacillus subtilits）
G+球菌代表菌种：
金黄色葡萄球菌
（Staphylococcus aureus）
原理：革兰氏阴性细菌的细胞壁在稀碱溶液中易于破裂，释放出未断裂的
DNA螺旋，使氢氧化钾菌悬液呈现粘性，可用接种环搅拌后拉出粘丝，而革
兰氏阳性细菌没有上述变化
方法：取1滴40g/L KOH水溶液（新鲜配制）于洁净玻片上，取新鲜菌落少
许，与KOH水溶液搅拌混匀，并每隔几秒钟上提接种环，观察能否拉出粘丝
用接种环拉出粘丝者为阳性，仍为混悬者为阴性
应用：主要用于革兰氏阴性菌与易脱色的革兰氏阳性菌的鉴别。大多数革
兰氏阴性菌于5～10s内出现阳性反应，有的则需30～45s，假单胞菌、无色
杆菌、黄杆菌、产碱杆菌、莫拉菌等大多数在10s内呈阳性，不动杆菌、莫
拉菌反应慢，大多数菌株在60s内出现阳性，而革兰氏阳性菌在60s以后仍
为阴性。
KOH拉丝试验
细菌鉴定技术
表型鉴定
基因型鉴定
色谱光谱
·营养物质代谢试验
·碳源和单元利用实验
·各种酶类试验
·API试验条
·各种自动检定系统
·16s rRNA分型
·核糖体分型
·脉冲场电泳
·傅里叶变换红外技术
细菌的鉴定流程
样品接收
分离纯化得到单菌落
菌落形态检验
革兰氏染色
形态鉴定
DNA提取
通用引物扩增细菌16srDNA序列
16srDNA序列分析 16srDNA序列分析
分子生物学鉴定
生化鉴定
鉴定结论
需大量纯的单克隆培养物
微生物技术培养中，细胞的恢复和鉴定受到培养时间的局限，甚至有些环
境中的微生物并不能用常规微生物生长培养基恢复
从初始培养物中刚分离出的，受损的次代培养物可能不能进行完整的基因
表达
基因型和表型的差异相对比较少见，且基因型的明显差异说明其并非同种
或同属
理论上，基因型微生物鉴定更可靠
表型鉴定与基因型鉴定
检定系统同样不能鉴定所有的微生物
需要昂贵的分析设备及耗材
通过仅有关键的微生物调查才会应用
仅凭基因型数据做出决定，对于考虑微生物特征，测试历史及微生物来源，
是没有意义的
当今伯杰氏手册中的分类学手段基于遗传物质并非遵循表观水平，导致一
些已知的微生物分类学发生改变及重命名
基因型鉴定的局限性
通过整合，使用多层面的信息，如微生物特征确定、表型及基因型数据、
微生物来源，将多相分类学的概念应用于微生物鉴定
建立内部数据库
无论哪种方式，在确认过程中，应根据供应商或药典的建议，使用适当的
质控菌株
微生物实验室微生物鉴定原则
无菌检查的基本概念
定性、局限性、影响因素
无菌检查的过程控制
环境保障、培养基保障、操作保障
无菌检查的溯源性调查
过程微生物信息的全面性、微生物鉴定结果的准确性
总结