新規ATG非依存性RAN翻訳の

抑制によるALSの治療薬開発

2017年11月19日2017年 日本ALS協会

IBCグラント研究報告会

永井 義隆大阪大学大学院医学系研究科

神経難病認知症探索治療学寄附講座

【目的】 神経変性疾患・認知症の病態を解明し、その

バイオマーカー・治療法を開発する

【特徴】 医学系のみならず理学・薬学・農学系など多

様なメンバーが幅広い視点から研究を進める

【研究技術】

• 蛋白質構造解析、分子生物学的in vitro 解析

• 培養細胞などを用いた細胞生物学的解析

• 様々な疾患モデル動物（ショウジョウバエ、マウ

ス、マーモセット）を用いたin vivo解析

• 化合物スクリーニング

【構成メンバー】

• 教授１、講師１、特任助教２、研究員１、大学院

生５、技術員３、秘書１ 計１４名

自己紹介

永井義隆

1990年 大阪大学医学部卒、神経内科医

1997年 米国デューク大学・ポスドク

2000年 大阪バイオサイエンス研究所・学振PD

2001年 大阪大学臨床遺伝学・助教/准教授

2008年 国立精神・神経医療研究センター・室長

2016年 大阪大学大学院医学系研究科・教授

大阪大学大学院医学系研究科神経難病認知症探索治療学寄附講座

１．神経変性疾患と蛋白質の凝集・蓄積

２．新しい筋萎縮性側索硬化症の原因遺伝子C9orf72

３．C9-ALSモデルショウジョウバエを用いたRAN翻訳

の抑制によるALSの治療法開発

１．神経変性疾患と蛋白質の凝集・蓄積

２．新しい筋萎縮性側索硬化症の原因遺伝子C9orf72

３．C9-ALSモデルショウジョウバエを用いたRAN翻訳

の抑制によるALSの治療法開発

本日の話題

• それぞれ特有の領域の神経細胞が原因不明で進行性に脱落・

変性する疾患群の総称。

• アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、

ハンチントン病、脊髄小脳変性症、プリオン病などが代表。

• 多くは有効な治療法に乏しく、根本的な治療法はない。

• 多くで脳内に異常蛋白質封入体を認める。

神経変性疾患と様々な蛋白質封入体

アルツハイマー病

老人斑（アミロイドβ）神経原線維変化（タウ）

パーキンソン病

レビー小体（αシヌクレイン）

筋萎縮性側索硬化症

Skein様封入体（TDP-43）

分子遺伝学

原因

生化学

薬理学

症候学

？

分子生物学

病理学

神経変性疾患研究における分子遺伝学の貢献

遺伝

環境

遺伝

環境

遺伝

遺伝

遺伝性疾患（単因子遺伝性）

孤発性疾患（多因子遺伝性）

神経変性疾患発症に関わる遺伝的因子と環境因子

遺伝子多型

（SNP、CNV、etc.）

遺伝子変異

（点変異、欠失、重複、リピート伸長、etc.）

連鎖解析

遺伝子クローニング

ゲノムワイド関連解析（GWAS）

次世代シーケンス

神経変性疾患の蓄積蛋白質・原因遺伝子の同定

アルツハイマー病 パーキンソン病 筋萎縮性側索硬化症 前頭側頭葉変性症 ポリグルタミン病

'84 Amyloid-β蓄積

'86 Tau蓄積

'91 APP遺伝子変異

'95 PS1/2遺伝子変異

'97 αSyn遺伝子変異

'97 αSyn蓄積

'03 αSyn遺伝子重複

'93 SOD1遺伝子変異

'06 TDP43蓄積

'08 TDP43遺伝子変異

'09 FUS遺伝子変異

'11 C9orf遺伝子変異

'98 Tau遺伝子変異

'06 PRGN遺伝子変異

'06 TDP43蓄積

'09 FUS蓄積

'11 C9orf遺伝子変異

'91 SBMA遺伝子/AR

'93 HD遺伝子Htt

'93 SCA1遺伝子Atx1

'94DRPLA遺伝子Atp1

'94 SCA3遺伝子Atx3

'96 SCA2遺伝子Atx2

'97 SCA6遺伝子CACL

'97 Htt封入体

'97 SCA7遺伝子Atx7

'01 SCA17遺伝子TBP

神経変性

神経変性疾患における共通の発症分子メカニズム～蛋白質のミスフォールディング・凝集～

アルツハイマー病

APPプレセニリン1/2

アミロイドβタウ

ハンチンチンアタキシン

筋萎縮性側索硬化症パーキンソン病

タウプログラニュリン

αシヌクレインLRRK2

異常蛋白質

原因遺伝子

ポリグルタミンTDP-43

FUSSOD1

タウTDP-43

ミスフォールド蛋白質の凝集・蓄積

前頭側頭葉変性症

αシヌクレイン

コンフォメーション病/ミスフォールディング病

タンパク質構造解析

化合物スクリーニング

培養細胞

ショウジョウバエ

マウス

マーモセット

ポリグルタミン病

疾患横断的な普遍的メカニズム

TDP-43FUS

SOD1

１．神経変性疾患と蛋白質の凝集・蓄積

２．新しい筋萎縮性側索硬化症の原因遺伝子C9orf72

３．C9-ALSモデルショウジョウバエを用いたRAN翻訳

の抑制によるALSの治療法開発

１．神経変性疾患と蛋白質の凝集・蓄積

２．新しい筋萎縮性側索硬化症の原因遺伝子C9orf72

３．C9-ALSモデルショウジョウバエを用いたRAN翻訳

の抑制によるALSの治療法開発

本日の話題

• 約5-10%が遺伝性、残り90-95%が孤発性

• 大脳皮質運動領野・脊髄前核の運動神経の変性

• レビー小体様封入体（TDP-43）、ブニナ小体（シスタチンＣ）

• 運動障害（筋力低下、筋萎縮）、構音・嚥下・呼吸障害が主症状

• 日本人では約2-7人/10万人

• 優性遺伝性のタイプでSOD1、TDP-43、FUS、C9orf72 、VCP、p62、劣性遺伝性のタイプでアルシン、オプティニューリンの遺伝子異常

• 治療法はない

筋萎縮性側索硬化症

ルー・ゲーリック

家族性筋萎縮性側索硬化症の原因遺伝子

家族性ALS Genes Locus Inheritance YearALS1 SOD1 21q22.11 AD 1993ALS2 Alsin 2q33.2 AR 2001ALS3 ? 18q21 ADALS4 SETX 9q34.13 AD 2004ALS5 SPG11 15q14 AR 2010ALS6 FUS/TLS 16p11.2 AD 2009ALS7 ? 20p13 ADALS8 VAPB 20q13.33 AD 2004ALS9 Angiogenin 14q11.1 AD 2006

ALS10 TDP-43 1p36.22 AD 2008ALS11 FIG4 6q21 AD 2006ALS12 OPTN 10p13 AR? 2009ALS13 Ataxin-2 12q24.1 ? 2010ALS14 VCP 9p13.3 AD 2010ALS15 UBQLN1 Xp11.21 XD 2011ALS16 SIGMAR1 9p13.3 AR 2011ALS17 CHMP2B 3p11.2 AD 2006ALS18 PFN1 17p13.3 AD 2012ALS19 ERBB4 2q33.3-q34 AD 2013ALS20 HNRNPA1 12q13.1 AD 2013ALS21 MATR3 5q31.2 AD 2014

ALS/FTD1 C9ORF72 9p21.2 AD 2011ALS/FTD2 CHCHD10 22q11.23 AD 2014ALS/FTD3 SQSTM1/p62 5q35 AD 2011

Ling et al. Neuron 2013

前頭側頭型認知症（FTD）

筋萎縮性側索硬化症（ALS）

• 大脳の前頭葉および側頭葉の神経変性

• 症状：認知症、人格変化、行動異常、失語症

• 病理：神経細胞内に封入体（Tau、TDP-43、FUS）

• 原因遺伝子：Tau、progranulin、TDP-43など

• 変性性認知症では、アルツハイマー病、レビー小体型

に次いで多い

• 大脳皮質・脊髄の運動神経の変性

• 症状：運動障害（筋力低下、筋萎縮）、嚥下・呼吸障害

• 病理：神経細胞内に封入体（TDP-43）

• 原因遺伝子：TDP-43、FUSなどRNA結合蛋白質

• 日本人では約9000人

分子病理学的共通性

筋萎縮性側索硬化症（ALS）と前頭側頭型認知症（FTD）

家族性ALS/FTD家系におけるC9orf72遺伝子内GGGGCCリピート異常伸長の発見

n>20?-1600

•白人では最も多い遺伝子変異（家族性

ALS/FTDの25%、孤発性の6%）

Majounie et al. Lancet Neurology 2012

•日本人では比較的稀（紀伊半島など）

Ishiura et al. Arch Neurol 2012

Mori et al. (2013)Dejesus-Hernandez et al. (2011)Gijselinck et al. (2012)

DeJesus-Hemandaz et al. Neuron 2011Renton et al. Neuron 2011

C9orf72遺伝子

リボゾーム

ノンコーディング病の発症分子メカニズム：1)異常RNAの毒性、2)RNA結合蛋白質の機能喪失、3)RAN翻訳

異常伸長リピートRNAの転写

RBP

RBP

RNA結合蛋白質の巻き込み

RNA foci形成

RNAGain of function

RNA結合蛋白質Loss of function

Hairpin RNA MBNL1 CUG, CAGCUGBP1 CUGhnRNPA2/B1 CGGPur α CGG

RNAスプライシング異常RNAプロセシング異常

リピート関連ATG非依存性(RAN)翻訳

ノンコーディングリピート病：C9orf72-ALS/FTD, SCA8, 10, 31, 36, FXTAS, DM1, 2

リピートペプチド（DPR）

１．神経変性疾患と蛋白質の凝集・蓄積

２．新しい筋萎縮性側索硬化症の原因遺伝子C9orf72

３．C9-ALSモデルショウジョウバエを用いたRAN翻訳

の抑制によるALSの治療法開発

１．神経変性疾患と蛋白質の凝集・蓄積

２．新しい筋萎縮性側索硬化症の原因遺伝子C9orf72

３．C9-ALSモデルショウジョウバエを用いたRAN翻訳

の抑制によるALSの治療法開発

本日の話題

１．個体（in vivo）での機能解析

・神経変性・神経症状を簡便に評価

２．世代時間の短さ

・世代時間は約10-14日

・寿命は約50-60日

３．遺伝学的解析

・遺伝子変異体ライブラリーの整備

・遺伝学的スクリーニング法の充実

４．遺伝学情報の蓄積

・ヒト疾患遺伝子の約75%が保存

・全遺伝子の約70%はヒトホモログが存在

５．ハイスループット解析

・安価な遺伝子組換え体の作製・入手

・省スペースでの解析・系統維持

Wt MJDtr-Q78S

Warrick et al. Cell 1998

神経変性疾患研究におけるショウジョウバエモデルの利点

LM

PolyQ病モデル TDP-43 CtrlALSモデル

Climbing

病態関連遺伝子

P

F1

疾患モデル 変異体ライブラリー

神経変性疾患モデルショウジョウバエを用いた関連遺伝子のスクリーニングと治療薬スクリーニング

/Mut 2 /Mut 3疾患モデル

/Mut 1

・・・

遺伝子スクリーニング

改善

治療薬スクリーニング

治療薬候補

疾患モデル

化合物ライブラリー

+Comp 2 +Comp 3疾患モデル+Comp 1

・・・

改善

・・・

神経変性疾患モデルショウジョウバエバンクの構築

• 神経変性疾患モデルの樹立・収集および病態解析。

• AD、PD、ALS/FTLD、PolyQ病など100系統以上を保有。

• 全国的共同研究：東京医歯大、東北大、京都府医大、神戸大、京都工繊大、新潟大、東工大、徳島大、岡山大、NCNP、医学研など。

正常：(GGGGCC)9

UAS

C9orf72遺伝子GGGGCCリピートの異常伸長によるALSモデルショウジョウバエの樹立

ALS：(GGGGCC)50

ALS：(GGGGCC)89

UAS

UAS

G4C2 ··· 9回 ··· G4C2

G4C2 ······ 50回 ······ G4C2

G4C2 ········ 89回 ········ G4C2

GAL4 ドライバー系統

UAS 遺伝子X 系統

Promotor GAL4

UAS Gene X

組織特異的プロモーター

組織特異的遺伝子Ｘ発現

GAL4-UASシステム

複眼での異常伸長GGGGCCリピートの発現によりALSモデルショウジョウバエは強度の複眼変性を呈する

LM(G4C2)89(S)(G4C2)89(W)(G4C2)50EGFP (G4C2)9

25℃

23℃

Lethal

複眼変性

Ueyama et al. in revision

Climbing Survival

0 20 40 60 80Age (days)

Surv

ival

rate

(%)

100

80

60

40

20

0

寿命短縮

(G4C2)9

(G4C2)89

(G4C2)50

神経系での異常伸長GGGGCCリピートの発現によりALSモデルショウジョウバエは運動障害、寿命短縮を呈する

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

Clim

bing

sco

re

1 5Age (days) 1 5 1 5

***運動障害

******

C9-ALS/FTD患者脳におけるリピート関連ATG非依存性(RAN)翻訳によるリピートペプチド発見

Mori et al. Science 2013

リボゾーム リピートペプチド（DPR）

C9-ALSモデルショウジョウバエにおいてGGGGCCリピートRNA、RAN翻訳によるリピートペプチド（DPR）の蓄積を認める

LM

IHC

p(GP) p(GR)

(G4C2)89(S) Fly (C4G2)4 probe

RNA蓄積

RAN翻訳

p(GA)

FISH

異常伸長リピートRNAの転写

神経変性

RAN翻訳によるC9-ALS/FTDの発症メカニズムとRBP1による治療標的

RB

P1RB

P1

リボゾーム

RAN 翻訳

RBP1結合

DPR凝集

RNAシャペロン

治療効果

特許出願、Ueyama et al. in revision

共同研究者

大阪大学 大学院医学系研究科神経難病認知症探索治療学寄附講座

武内 敏秀 上山 盛夫小澤 大作 前田 和宏堺 竜介（D3） 田港 朝也（D2）曽我部 俊策（神大D2） 小笠原 佑介（神大M2）張 暁曼 坂井 聖子山本 かおり 内田 裕美子

（OB）鈴木 マリ 吉田 隼 金井 雅裕

（独）国立精神・神経医療研究センター神経研究所 疾病研究第四部

皆川 栄子斉藤 勇二盆子原 紘子和田 圭司

（OB）ポピエル 明子 藤掛 伸宏畑中 悠佑 石黒 太郎岡本 佑馬 滝澤 歩武山根 宏志 高橋 光里五領田 小百合 赤川 裕美

新潟大学脳研究所神経内科

小野寺 理今野 卓哉小山 哲秀

東京医科歯科大学脳神経内科

水澤 英洋石黒 太郎石川 欽也

Mayo Clinic JacksonvilleTania F. GendronLeonard Petrucelli