214716732 curs metode moderne de control microbiologic al alimentelor 1
TRANSCRIPT
-
7/25/2019 214716732 Curs Metode Moderne de Control Microbiologic Al Alimentelor 1
1/61
Metode moderne decontrol microbiologic
al alimentelorSuport Curs Masterat Anul I
Titular curs: Conf. dr. Marcel Avramiuc
-
7/25/2019 214716732 Curs Metode Moderne de Control Microbiologic Al Alimentelor 1
2/61
2
Metodele de evaluare a populaiilor microbiene
Metode dir ecte, care permit evaluarea concentraiei de celule sau a biomasei;
Metode indirecte, n care evaluarea se va face prin analiza unui parametru aflat n
corelaie cu coninutul de biomas (turbiditatea mediului cultivat, fluorescena,
impedana);
Metode culturale, care necesit o perioad de incubare pentru creterea
coloniilor i stabilirea rezultatului analizei;
Metode automatizate, "on line", care permit analiza direct a probelor din
fermentator, sau metode care necesit prelevarea aseptic de probe pentru analiz.
Tehnici de diluare
Seri i li niare, n care concentraia de microorganisme descrete n progresie
aritmetic (de exemplu: 0.8/0.6/0.4/0.2) i care sunt puin utilizate;
Seri i logartmice (diluii decimale), n care concentraia de microorganisme
descrete n progresie geometric (ex. 0,1/0,01/0,001/0,0001 etc.).
Pentru realizarea diluiilor decimale, ntr-un numr de eprubete sterile egal cu
numrul de diluii necesar a se efectua, se pipeteaz aseptic 9 cm3de lichid de diluie (ser
fiziologic steril, ap distilat steril, mediu Ringer - pentruEscherichia coli).
Tehnici de concentrare
Sunt utilizate n special pentru punerea n eviden a microorganismelor
patogene;
Metode de mbogire, care presupun inocularea probei de analiz ntr-un mediufavorabil pentru multiplicarea rapid a celulelor aflate n concentraii reduse n proba de
analizat i, dup termostatare n condiii optime de cultivare, se verific prezena sau
absena microorganismelor analizate, cu sau fr o determinare efectiv a concentraiei
de celule;
Metode de separare fizic sau fizico-chimic a celulelor prin filtrare,
centrifugare, floculare, sedimentare, n care se determin concentrarea celulelor pe
unitatea de volum, ceea ce asigur posibilitatea evidenierii lor ulterioare prin tehnici
directe sau culturale;
-
7/25/2019 214716732 Curs Metode Moderne de Control Microbiologic Al Alimentelor 1
3/61
3
Metode de separare prin interaciuni hidrofobe-hidrofile, interaciuni ale
sarcinilor electrice, anticorp-antigen, cu lectine.
I. TEHNICI MODERNE DE ESTIMARE DIRECT A
NUMRULUI DE MICROORGANISME
Estimarea electronic a numrului de microorganisme
Aparatul de tip Coulter
funcioneaz dup urmtorul
principiu:
De o parte i de alta a unuitub prevzut cu un orificiu calibrat
sunt dispui doi electrozi de platin
imersai ntr-un electrolit, ale cror
borne sunt conectate la tensiune
continu.
Prin aspiraia provocat la
partea superioar a tubului, celulele
aflate n exteriorul tubului trec pe rnd prin orificiu i deplaseaz o dat cu fiecare pasaj
un volum de electrolit egal cu cel al celulei. Aceasta provoac o cretere tranzitorie a
rezistenei circuitului, ceea ce genereaz un impuls electric a crui amplitudine este
proporional cu volumul celulei.
Impulsurile fiind de foarte scurt durat, aparatul permite numrarea unui numr
mare de celule, una cte una, ntr-un timp foarte scurt.
Este posibil i o clasificare a celulelor n funcie de de volumul lor.
Aceast tehnic, dei sofisticat, este considerat extrem de interesant i se aplic
cu succes pentru analiza suspensiilor de drojdii, realiznd simultan cu numrarea i
dimensionarea celulelor.
Rezultatele sunt reproductibile cnd se utilizeaz suspensii diluate de celule;
Sarcina electric a celulelor poate influena analiza conducnd la obinerea de
rezultate eronate;
-
7/25/2019 214716732 Curs Metode Moderne de Control Microbiologic Al Alimentelor 1
4/61
4
Aceast tehnic nu se poate aplica n cazul culturilor ce conin n suspensie, alturi
de celulele microorganismului cultivat, i particule solide.
Citometrie n flux
Permite numrarea i aprecierea strii fiziologice a celulelor, cnd detecia se
face prin msurarea fluorescentei emise de celulele n prealabil marcate cu un colorant
(fluorocrom).
Dup colorare, celulele sunt antrenate printr-un orificiu ngust i trec una cte
una prin faa unei surse luminoase.
Fluorescenta emis de fiecare microorganism este captat printr-un
fotomultiplicator i analizat. Rezultatele sunt traduse pe o histogram care red numrulde evenimente n funcie de intensitatea fluorescentei. Aceast histogram traduce deci
un profil al populaiei.
Adesea markerii colorani utilizai pot oferi diferite tipuri de rspunsuri:
Dac colorantul este un marker de viabilitate, din histogram se deduce numrul
de celule viabile i stareafiziologic a populaiei.
Dac histograma cuprinde net dou picuri este posibil numrarea separat amicroorganismelor dintr-o cultur mixt (de exemplu, streptococi i lactobacili).
Dac markerul este un anticorp se pot numra specific anumite microorganisme
dintr-o populaie heterogen.
Principiul de funcionare al citometrului n flux:a, bexemple de sisteme de deteciec
diagram de repartiie a dimensiunilor
-
7/25/2019 214716732 Curs Metode Moderne de Control Microbiologic Al Alimentelor 1
5/61
5
Tehnica de microscopie n fluorescen i imunofluorescen
Tehnica de microscopie n fluorescen utilizeaz colorani specifici pentru
diferenierea celulelor vii de cele moarte.
Prin suspensionarea celulelor de drojdie n soluie diluat de albastru de metilen
cu citrat n preparat microscopic se vor putea diferenia celulele vii (incolore) de cele
moarte (colorate n albastru).
n mod similar, pot fi difereniate bacteriile vii de cele moarte dup colorare cu
acridin oranj.
Tehnica de microscopie n imunofluorescenpermite detectarea unei categorii
particulare de microorganisme cu ajutorul anticorpilor specifici.
Tehnica DEFTDirect Epifluorescent Filter Technique
Cupleaz filtrarea prin membrane cu colorarea vital a celulelor. Se aplic n
cazul analizei microbiologice a produselor lichide (bere, vin, lapte).
Numrarea se realizeaz prin studiu microscopic, dup filtrarea produsului prin
membran (sau diluarea sa) i colorarea vital a celulelor.
Procedeul este rapid (10-20 min) i sensibil. Limita de detecie este de 104
microorganisme/cm3, utiliznd volume de probe de 100 cm3.
Numrarea se poate realiza cu un microscop optic obinuit dup colorare cu
albastru de metilen, albastru Loeffler sau amestec fucsin-albastru de metilen.
Rezultate mai bune se obin cnd numrarea se realizeaz cu un microscop cu
fluorescent sub lumin UV. n acest caz se utilizeaz colorani fluoresceni
(fluoresceina, primulina, auramina, acridin oranj, galben de acridin, acriflavina) cepermit studiul la grosismente mici cu evidenierea celulelor vii i a celor moarte.
II. TEHNICI INDIRECTE (CULTURALE) DE EVALUARE A
NUMRULUI DE MICROORGANISME
A.metode de cul ti vare pe medii dense(metoda cultural Koch);
B. metode de cultivare n medii lichide (metoda titrului - metoda tuburilormultiple; metoda diluiilor limit).
-
7/25/2019 214716732 Curs Metode Moderne de Control Microbiologic Al Alimentelor 1
6/61
6
Dezavantaje: volum mare de munc, sunt necesare ustensile sterile i medii de
cultur adecvate, iar rezultatul analizei se obine dup un timp de termostatare necesar
dezvoltrii i multiplicrii celulelor, difereniat n funcie de natura microorganismelor (n
general: 3-5 zile/25...28C -pentru fungi; 2 zile/37C - pentru bacterii aerobe mezofile).
A. Numrarea microorganismelor prin cultivare pe medii dense
Const n inocularea unui volum cunoscut din suspensia de celule pe medii de
cultur solidificate, n plci Petri i, dup o perioad de cultivare n condiii optime, se
numr coloniile formate.
Rezultatul se exprim n:
numr de microorganisme [N/cm3sau g] - n cazul microorganismelor care prezint
celule individuale, neasociate;
uniti formatoare de colonii (ufc) [ufc/cm3sau g]n cazul microorganismelor la
care celulele formeaz asociaii (lanuri, pachete, pseudomiceliu).
Tehnici de cultivare i numrare a microorganismelor: a - prin
filtrare; b - prin diluare (sau inoculare n volume mari)
-
7/25/2019 214716732 Curs Metode Moderne de Control Microbiologic Al Alimentelor 1
7/61
7
A. 1. Tehnica clasic de numrare prin cultivare pe medii dense,
n plci Petri
Metodologia de analiz presupune adoptarea a dou modaliti de inoculare a
celulelor n/pe mediul de cultur solidificat, n plci Petri, i anume:
a. inoculare n masa mediului solidificat, cnd 1 cm3 din fiecare diluie se
transfer cu cte o pipet steril n plci Petri sterile. Peste suspensia din fiecare plac se
repartizeaz cte o eprubet de mediu de cultur specific, cu agar (10-15 cm3), fluidificat
i temperat la 40...45C. Mediul se omogenizeaz cu suspensia din plac prin micri
orizontale, circulare ale plcii. Dup solidificarea mediului, prin termostatare n condiii
optime, se vor forma colonii att la suprafaa mediului ct i n profunzimea acestuia.
Acest mod de cultivare este cel mai favorabil pentru microorganismele facultativ
anaerobe, dar i microorganismele aerobe le tolereaz destul de bine. n cazul
microorganismelor anaerobe se recomand cultivarea n dublu strat, adic dup
nglobarea celulelor n mediu i solidificare, primul strat de mediu se acoper cu nc un
strat de mediu steril;
b. inoculare prin rspndirea celulelor pe suprafaa mediului solidificat- 0,1
cm
3
prob diluat se transfer ntr-o plac Petri steril, n care, n prealabil, a fostrepartizat mediul de cultur cu agar. Suspensia se rspndete uniform pe ntreaga
suprafa a mediului de cultur cu ajutorul unui instrument special (de exemplu, spatul
Drigalski). Aceast tehnic prezint dezavantajul c unele celule pot s rmn ataate de
instrumentul de etalare, cu efecte negative asupra acurateei rezultatului analizei.
Pentru obinerea unor rezultate mai concludente se recomand inocularea a cte
dou plci n paralel pentru fiecare diluie analizat.
-
7/25/2019 214716732 Curs Metode Moderne de Control Microbiologic Al Alimentelor 1
8/61
8
Numrarea indirect a microorganismelor prin cultivare pe medii
dense
Citirea i interpretarea rezultatelor
Dup termostatarea n condiii optime, apariia vizibil a coloniilor va depinde de
particularitile fiziologice ale microorganismelor cultivate i de condiiile de cultivare,
de obicei dup 48-72 h de cultivare.
n funcie de numrul de colonii evideniate n plcile din care s-a fcut
numrarea se va calcula numrul de microorganisme pe gram sau cm3prob de analiz,
cu formula:ufc/cm3(g) = n d
n care d este coeficientul de diluie corespunztor plcii din care s-a realizat
numrarea.
n cazul n care pentru aceeai diluie s-au inoculat cte dou plci n paralel, n
reprezint media aritmetic a coloniilor numrate n cele dou plci.
In cazul numrrii coloniilor punctiforme se pot folosi sisteme dotate cu surs de
lumin, lup pentru mrirea imaginii i un dispozitiv de marcare i nregistrare a
coloniilor numrate.
-
7/25/2019 214716732 Curs Metode Moderne de Control Microbiologic Al Alimentelor 1
9/61
9
A.2. Utilizarea Petrifilmelor pentru analiza microbiologic
cantitativ i calitativ
"Petrifilms" - discuri n care mediul de cultur specific este deshidratat i
acoperit cu o folie din plastic. La inocularea a 1 cm3suspensie de celule, apa coninut n
suspensie rehidrateaz mediul i prin termostatare este posibil creterea
microorganismelor. Exist diferite tipuri de Petrifilm pentru: numr total de
microorganisme, drojdii, bacterii coliforme.
Avantaje: reducerea timpului de analiz, reducerea preului de cost/prob,
creterea numrului de probe analizate, creterea calitii i mbuntirea substanial a
productivitii.
Tehnica de utilizare a Petrifilmelor
Tip Petrifilm Caracteristici
Petri film 3Mbacterii aerobe determinarea numrului total de bacterii aerobe;analiza este eficient prin prezena unui indicator care
coloreaz coloniile n rou
Petrifilm jM1'1 drojdii imucegaiuri
determinarea numrului total de drojdii i mucegaiuri;nu necesitadugarea de antibiotice sau acid tartric
Petrifilm 3MEnterobacleriaceae
evideniere bacterii din familia Enterobacteriaceae;producerea de acid evideniat cu ajutorul unui
indicator de pH ce vireaz n galben;evideniere formare gaz prin fermentaia heterolactic
a lactozei
Petrifilm 3M coliformi totali evideniere coliformi totali;analiza este nlesnit de prezena unui indicator care
coloreaz coloniile n rou; filmul superior reine gazele rezultate prin fermentaia
substratului lactoz
-
7/25/2019 214716732 Curs Metode Moderne de Control Microbiologic Al Alimentelor 1
10/61
10
Petrifilm 3M de naltsensibilitate pentru evideniere
bacterii coliforme - HSCC
evideniere bacterii coliforme la diluii mari n probelede analizat - 1-2 celule/g;
permite inocularea a 5 cm' prob sau diluii aleacesteia;
evaluare identic cu Petrifilm 3M coliformi totalii fecali
Petrifilm 3M Escherichia coli
dou teste n unul singur: evaluare cantitativ acoliformilor fecali i a lui E. coli;conine indicator P-glucuronidaz pentru evidenierea
lui E coli;
rezultate pozitive n 24-48 h: nalt selectivitate
Petrifilm 3M coliformi 2000(P2000)
dezvoltarea rapid a bacteriilor coliforme; indicator depH foarte sensibil - evidenierea producerii
de acid chiar de la nceputul formrii coloniilor; reducerea timpului de analiz prin asigurarea unei
creteri accelerate;
rezultate test prezumtiv n 6-14 h. cu confirmare n 18-24 h
Kit HEC evideniere serotipurile enteropatogene 0157: H7 E.coli, care produc glucuronaze;
se bazeaz pe utilizarea membranei active ELISA, carese pune n contact 2 min cu Petrifilmul; dup 18 h deincubare testul pozitiv se evideniaz prin apariia petelorgri pe membran;analiz simpl, rapid i precis far echipament
special
Petrifilm 3M - teste de control almediului
control mediu prin contact direct sau tergere;metod simpl i eficient
Particulariti ale Petrifilmelor 3M
Caracteristici
Tipuri de microorganisme
Bacterii aerobe mezofile Coliformi
totali
Escherichia
coli
Drojdii i mucegaiuri
Indicator TTC TTC TTC BCIP
Mediu PCA VRBL VRBL+BCIG OGA+cIoram.clortelr.
Temperatura 30C 30/44cC 30/44C 20/30CIncubare 48/72 h 24 h 24 h 72/120 h
TTCclorur de trifenil tetrazoliu (culoarea vireaz spre rou datorit reducerii
de ctre microorganisme cu formare de formazan);
BCIP - brom cloro indoxil fosfat (indicator pentru fosfataz, produs in general
de drojdii i mucegaiuri; virajul culorii, precipitat bleu);
-
7/25/2019 214716732 Curs Metode Moderne de Control Microbiologic Al Alimentelor 1
11/61
11
BCIGbrom cloro indoxil glucuronid este indicator al glucuronidazei, pe
care o posedEscherichia coli; are loc virajul culoriiprecipitat bleu.
Tipuri de Petrifilme
1. Petrifilm pentru numrat bacterii aerobe i facultativ anaerobe
2. Petrifilm pentru numrat drojdii i mucegaiuri
Conine un mediu selectiv cu 2
antibiotice cu spectru larg, pentru suprimarea
creterii bacteriilor i BCIP (brom cloro
indoxil fosfat), ca indicator.
3. Petrifilm pentru numrat bacterii coliforme
Conine un mediu selectiv cu bil, lactoz i 2 indicatori: VR (rou violet) i TTC
-
7/25/2019 214716732 Curs Metode Moderne de Control Microbiologic Al Alimentelor 1
12/61
12
4. Petrifilm pentru numrat E. coli , coliformi i necoliformi
Conine un mediu selectiv cu bil, lactoz i BCIG (brom cloro indoxil
glucuronid) ca indicator.
A.3. Evaluarea numrului de microorganisme dup filtrare prin
membran
Aceast metod se preteaz la analiza probelor lichide cu un coninut redus de
microoganisme, care nu conin compui ce produc colmatarea filtrului.
Pentru analiz, o cantitate controlat de lichid de analizat (1 - 10 cm3) se
transfer aseptic n rezervorul aparatului de filtrare, apoi lichidul se trece prin fi ltru (cu
pori mici, capabili s rein toate microorganismele), dup care membrana se ridic
aseptic cu o penset steril i se transfer ntr-o plac Petri steril n care n prealabil s-a
repartizat mediul de cultur adecvat, cu agar. In alte cazuri, mediul de cultur specific
este impregnat n membran i astfel, dup filtrare, membrana se plaseaz ntr-o plac
Petri steril.
Prin termostatare n condiii optime la suprafaa membranei se formeaz colonii
caracteristice, care se pot numra i analiza dinpunct de vedere morfologic.
Firme specializate produc i comercializeaz medii specifice i membrane
destinate analizei prin filtrare: Hach, Sartorius, Millipore.
A.4. Evaluarea numrului de microorganisme prin utilizarea
mediilor de imersie
Tehnici moderne prevd cultivarea microorganismelor pe lame de mediu cu
geloz sau benzi de hrtie impregnate cu medii adecvate.
-
7/25/2019 214716732 Curs Metode Moderne de Control Microbiologic Al Alimentelor 1
13/61
13
Lamele cu medii de cultur gelozate se menin n tuburi speciale, sterile. In
momentul utilizrii se extrage aseptic lama din tub, se imerseaz n proba de analizat,
dup care se reintroduce n tubul steril i se termostateaz la temperatura optim de
cretere, specific microorganismelor analizate. Dup termostatare, 16-24 h pentru
bacterii i 3-4 zile pentru drojdii i mucegaiuri, se pot numra coloniile caracteristice care
s-au dezvoltat la suprafaa lamei.
Lame specializate pentru control microbiologic selectiv
Lame Hychech (Difco) (medii gelozate: PCA + PCA 0,01 TTC*) - destinate pentru
determinarea numrului total de microorganisme;
Lame pentru evidenierea bacteriilor din familia Enterobacteriaceae (geloz
tripticaz soia + VRBC geloz);
Lame pentru evidenierea selectiv a bacteriilor din genul Pseudomonas (mediu
specific cu geloz);
Lame pentru determinarea fungilor filamentoi (geloz tripticaz soia; tripticaz
soia cu TTC + geloz cu roz bengal i cloramfenicol .a.);
Lame Biokar -pentru numr total de coliformi; numr total de drojdii i mucegaiuri;
Lame Lactocult - pentru controlul microbiologic al laptelui;
Lame Microtest.
Benzile de hrtie impregnate cu medii selective (Dacto Strip)
Sunt alte sisteme comerciale pentru controlul microbiologic rapid i eficient al
alimentelor;
Se preteaz cel mai bine la controlul produselor lichide (industria laptelui);
Constau din benzi sterile de hrtie impregnate cu mediu specific, pentru care se
precizeaz: timpul necesar de meninere n contact cu proba de analizat; volumul de
lichid pe care l adsorb (0,1-1 cm3);
Pentru analiz, banda steril se imerseaz n lichidul de analizat, apoise reintroduce
in ambalajul steril i se termostateaz in condiii optime.
-
7/25/2019 214716732 Curs Metode Moderne de Control Microbiologic Al Alimentelor 1
14/61
14
B. Evaluarea numrului de microorganisme prin cultivare n
medii lichide
Prin inocularea celulelor n medii lichide i termostatare n condiii optime de
multiplicare se determina statistic numrul de microorganisme n funcie de observaiile
privind prezena sau absena creterii (determinare de uft - uniti formatoare de
turbiditate).
Creterea poate fi apreciat vizual, prin analiz turbidimetric, prin virajul culorii
mediului, formarea de gaz .a.
Avantajele utilizrii mediilor lichide
Este posibil analiza unor cantiti mari de produse, fapt extrem de important pentru
cercetarea, n special, a microorganismelor patogene;
Este posibil studiul unor proprieti fiziologice (producere de acid, formare de gaze
.a);
Permite cultivarea n condiii selective, specifice pentru un grup de microorganisme
ce trebuie determinat.
Metoda de cultivare n medii lichide se bazeaz pe dou tehnici de
analiz:
Metoda diluiilor limit- prin inoculare din proba de analizat i diluii decimale
succesive n cte o eprubet cu mediu de cultur adecvat i, dup termostatare
corespunztoare, prin analiza probelor se stabilete numrul de microorganisme, n
funcie de ultima diluie n care a fost observat creterea. Aceasta este o metod
semicantitativ i permite evaluarea orientativ a gradului de contaminare al produsului
de analizat;
Metoda titrului (metoda tuburilor multiple) presupune inocularea
microorganismelor prezente n proba de analiz i diluii decimale succesive, n mai
multe eprubete n paralel (2-5) cu mediu de cultur adecvat (9 sau 10 cm), Dup
termostatare n condiii optime se fac aprecieri asupra creterii i se stabilete numrul de
microorganisme prin analiza statistic a rezultatelor, folosind tabelul Mac Grady.
-
7/25/2019 214716732 Curs Metode Moderne de Control Microbiologic Al Alimentelor 1
15/61
15
Metoda diluiilor limit
Metoda titrului (metoda tuburilor multiple)
a) Determinarea bacteriilor coliforme
Metoda include teste prezumtive i de confirmare, bazate, n primul rnd, pe
capacitatea bacteriilor de a fermenta lactoza cu producere de acid lactic, CO2, H2, n timp
de 48 ore la 35C.
Testul prezumtivconst n inocularea probei n mediu nutritiv BCLP (bulion de
carne cu lactoz i plutitor), mediu de mbogire favorabil nmulirii att a bacteriilorcoliforme ct i a altor bacterii care folosesc lactoza ca sursa de carbon.
Testul de confirmare, const n inocularea culturilor din eprubetele pozitive ale
testului prezumtiv pe medii selective BBLVP (bulion, bil cu lactoz, verde briliant i
plutitor) care inhib dezvoltarea bacteriilor nsoitoare i asigur nmulirea bacteriilor
coliforme.
Din grupul coliform, cel mai frecvent ntlnit este genul Escherichia cu specia
Escherichia coli, care indic o contaminare fecal recent.
-
7/25/2019 214716732 Curs Metode Moderne de Control Microbiologic Al Alimentelor 1
16/61
16
a) Determinarea bacteriilor coliforme. Tehnica de lucru
Din prob i diluii succesive de inoculeaz cte 1ml n cte 3 eprubete cu BCLP.
Se termostateaz la 37C timp de 24-48 ore. Se nregistreaz eprubetele pozitive (mediu
tulbure, bule de gaz n plutitor, pH acid), iar eprubetele negative sunt din nou
termostatate timp de 24 ore i se nregistreaz din nou eprubetele pozitive.
Pentru confirmare, din eprubetele pozitive se recolteaz cte o ans i se
inoculeaz eprubete cu BBLVP; dup incubare la 37C timp de 48 ore, n condiiile n
care se produc din nou gaze n plutitor, tulburare, virajul culorii indicatorului verde
briliant de la verde la galben, nseamn c n apa (produsul analizat) sunt prezente
bacteriile coliforme.
Calcul i interpetare
Folosind metoda titrului, n funcie de numrul eprubetelor pozitive se stabilete
numrul caracteristic (NC), i din tabelul lui Mac Grady, corespunzator numrului
caracteristic se noteaz numrul probabil de microorganisme (NPM). Pentru a calcula
numrul probabil de coliformi/cm3produs analizat, valoarea din tabel se nmulete cu
factorul de diluie corespunzator primei cifre din numrul caracteristic. Numrul de
coliformi admii n 100 ml ap, conform SR EN ISO 9308 -1/2004, este de 0.Determinarea bacteriilor coliforme(Schem)
-
7/25/2019 214716732 Curs Metode Moderne de Control Microbiologic Al Alimentelor 1
17/61
17
Tabelul Mac Grady
NC NPM NC NPM
000 0,0 102 1,1
001 0,3 110 0,7
010 0,3 111 1,1
011 0,6 222 3,5
020 0,6 223 4,0
100 0,4 321 15,0
101 0,7 333 140
-
7/25/2019 214716732 Curs Metode Moderne de Control Microbiologic Al Alimentelor 1
18/61
18
III. TEHNICI DE EVALUARE A CRETERIIPRIN
DETERMINAREA GLOBAL A BIOMASEI
Pot fi aplicate att pentru evaluarea populaiilor aparinnd microorganismelor
unicelulare, dar mai ales n cazul microorganismelor filamentoase.
Biomasa microbian este recuperat, n general prin centrifugare (2000-4000 rot.,
10 min., la 4C), este splat de mai multe ori cu soluie 0,9% NaCl, pentru ndeprtarea
impuritilor din mediul de fermentaie, reinute o dat cu celulele, apoi uscat la
temperatura de 105C, pn la greutate constant.
Dezavantaje
Este puin sensibil;
Nu se aplic dect n cazul mediilor lichide fermentate n care microorganismele
sunt singurele particule n suspensie;
Nu se poate face distincie ntre biomasa vie i cea autolizat;
Coninutul de biomas nu reflect ntotdeauna gradul de multiplicare al celulelor.
De exemplu, n cazul mucegaiurilor, celulele cresc acumulnd intracelular substane de
rezerv i formeaz perei celulari groi fr s se produc diviziunea celular.
IV. ESTIMAREA CANTITII DE BIOMASA PRIN DOZAREA
UNOR CONSTITUENI CELULARI
Determinarea cantitativ a unor componeni aflai n concentraie aproximativ
constant n celulele microbiene ofer indicaii asupra evoluiei unei culturi.
Principiul acestor metode const n msurarea concentraiei unor componeni
celulari i, considernd aceasta aproximativ constant per celul, este posibil stabilirea
prin echivalen a concentraiei de biomasa.Astfel de componeni sunt: proteine, acizi nucleici (ARN, ADN), ATP, NADH.
Celulele separate de mediul de fermentaie prin filtrare sau centrifugare sunt
splate pentru ndeprtarea impuritilor, apoi sunt supuse unor tratamente mecanice sau
fizice pentru eliberarea componenilor celulari i evaluarea acestora prin tehnici
standardizate de analiz.
-
7/25/2019 214716732 Curs Metode Moderne de Control Microbiologic Al Alimentelor 1
19/61
19
Determinarea concentraiei proteinelor celulare
Creterea i multiplicarea celulelor este n dependen direct cu biosinteza de
proteine. Pentru evaluarea coninutului total de proteine sunt recomandate metodele
clasice: metoda biuretului, metoda Lowry, metoda Bradford, metoda Kjeldahl, sau
hidroliza proteinelor i dozarea aminoacizilor.
Metoda biuretului este cea mai recomandat n astfel de studii. Principiul
metodei const n formarea unui complex colorat ntre ionii de cupru i gruprile proteice
ncrcate cu sarcini negative.
Metoda Lowry se utilizeaz atunci cnd concentraia de celule n suspensia de
analizat este mic. Cantitatea de proteine se determin prin comparaie cu o curb etalon
cu albumina seric bovin.
Coninutul n proteine se poate exprima i prin dozarea azotului, utiliznd
metoda Kjeldahl(proteine = Nx 6,25).
Determinarea acizilor nucleici
Biomasa microbian are un coninut remarcabil, constant, de ADN.
Acest constituent este n general absent n ingredientele mediului de cultur, ceeace exclude eventualele interferene, dar, din pcate, determinarea sa este destul de
sofisticat, necesitnd tehnici de liz a celulelor, extracie, separare.
Pentru dozare se apeleaz la metode spectrofotometrice (= 260 nm) sau
colorimetrice ( = 600 nm) prin reacia cu difenilamin n prezen de acid percloric.
Studiul acizilor nucleici este utilizat mai mult pentru identificare.
Determinarea coninutului de ATPEvaluarea biomasei microbiene prin determinarea coninutului de ATP tinde s
se generalizeze.
ATP-ul este un constituent normal al celulelor vii, fiind un intermediar important
al metabolismului celular cu rol n metabolismului energetic.
Principiul metodei de determinare a ATP-ului se bazeaz pe emisia luminoas
produs prin oxidarea luciferinei la oxiluciferin, reacie catalizat de ctre enzimaluciferaz n prezen de ATP.
-
7/25/2019 214716732 Curs Metode Moderne de Control Microbiologic Al Alimentelor 1
20/61
20
Aceast emisie, care poate fi msurat spectrofotometric, este obinut n cteva
secunde, conform ecuaiei:
ATP + luciferina + O2 oxiluciferin + AMP+ PPi + CO2+ lumina
Msurarea bioluminescenei se realizeaz la = 562 nm cu ajutorul unor aparate
speciale (fluorimetre).
Variaia coninutului de ATP al microorganismelor este n funcie de specie i de
starea fiziologic, cu factori de variaie de la 1 la 10. Se consider coninutul mediu de
ATP n celule microbiene ca fiind aproximativ 5x 10-16g ATP/celul (= 1 mg ATPg-1
substan uscat biomas).
Dezavantaje
Metoda este laborioas mai ales dac se au n vedere dificultile de extracie a
ATP-ului din celulele microbiene;
Tehnica de analiz a ATP-ului nu ofer rezultate corespunztoare n cazul unor
populaii heterogene ce conin celule de vrste variabile;
Se aplic cu succes pentru studiul culturilor pure n sisteme continue de fermentaie;
Pentru rezultate mai concludente se recomand corelarea coninutului n ATP cu
numrul de celule.
Msurarea spectrofotometric a fluorescentei
Aceasta poate fi emis de anumii componeni celulari, care au abilitatea de a
reemite lumina absorbit prin modificarea lungimii de und.
-
7/25/2019 214716732 Curs Metode Moderne de Control Microbiologic Al Alimentelor 1
21/61
21
Compuii care emit fluorescent (fluorofluori) cu importan pentru
evaluarea populaiilor microbiene
Relaia dintre fluorescent i concentraia compusului care emite
fluorescent
Dac fiecare celul conine o concentraie intracelular aproximativ constant a
unuia din fluorofluorii prezentai n tabelul 7.5. concentraia de celule se poate determina
n funcie de fluorescenta emis, msurat spectrofotometric, conform curbei
Principiul msurrii fluorescentei unei culturi
Dintre compuii fluorofluori, cel mai adesea se recurge la NADH, care emite
fluorescent la 460 nm, cnd este excitat n lumin la lungimea de und = 340 nm. n
forma oxidat (NAD+) coenzima nu are fluorescen. n cursul creterii celulare,
cantitatea de NADH crete n raport direct proporional cu multiplicarea celulelor,
permind astfel evaluarea concentraiei de biomas.
-
7/25/2019 214716732 Curs Metode Moderne de Control Microbiologic Al Alimentelor 1
22/61
22
Factori care influeneaz fluorescenapH, temperatura, prezena unui agent antispumant, modificri ale activitii
metabolice a celulelor determinate, spre exemplu, prin limitarea oxigenului. Pentru
msurare se lucreaz ntotdeauna cu celule vii, cu o stare fiziologic constant.
Aceast metod de analiz permite evaluarea celulelor vii, este relativ specific,
sensibil i exact, dar aplicarea sa este recomandat pentru evaluarea populaiilor ce
conin celule cu vrste i stri fiziologice constante (culturi continue, sincrone). n
practica industrial fluorescenta se msoar "on line" direct n bioreactor.
Determinarea coninutului de chitin i ergosterol
Metoda este recomandat pentru estimarea biomasei fungilor filamentoi.
Chitina, polimer de N-acetil-D-glucozamin, este un constituent major al
pereilor hifali i nveliurilor sporale. Ea este prezent n exoscheletul insectelor, dar
lipsete din compoziia bacteriilor i alimentelor. Astfel, prin determinarea cantitativ aconinutului de chitin din mucegaiuri se poate estima indirect cantitatea de biomas.
-
7/25/2019 214716732 Curs Metode Moderne de Control Microbiologic Al Alimentelor 1
23/61
23
V. TEHNICI TURBIDIMETRICE I NEFELOMETRICE DE
EVALUARE A CRETERII MICROORGANISMELOR
V.1. Metoda comparativ
Const n compararea turbiditii unei suspensii de celule cu turbiditatea unor
etaloane cu albumin. De exemplu, turbiditatea unei suspensii de bacterii de 5-109
bacterii/cm3corespunde unei suspensii cu o concentraie de 0,5 g/dm3albumin.
Aceast metod este mai puin precis i se utilizeaz de obicei n studii
comparative.
V.2. Metoda turbidimetricTehnica permite stabilirea concentraiei de celule n funcie de absorbana
suspensiei de celule, care se determin cu ajutorul unui spectrofotometru sau
nefelometru.
Principiul metodei
Similar cu legea Beer-Lambert exist o proporionalitate ntre absorbanta culturii
(densitatea optic) i concentraia de celule n suspensie, conform relaiei:
A=IC, n care: A este absorbanta, msurat la = 600 nm; - coeficient de
extincie ''celular, C - concentraia celulelor n suspensie.
n funcie de substana uscat a masei celulare i de absorbana culturii,
comparativ cu mediul de cultur steril considerat ca referin, poate fi trasat o curb
etalon A = f (biomas substan uscat)
Aceast corelaie este valabil pn la o valoare limit a absorbantei, variabil n
funcie de: aparatul de msur, lungimea de und, natura suspensiei .a.
-
7/25/2019 214716732 Curs Metode Moderne de Control Microbiologic Al Alimentelor 1
24/61
24
Corelaia absorban-biomas substan uscat
Aplicabilitate
Aceast metod rapid este valabil n cazul microorganismelor unicelulare
dezvoltate n medii definite i limpezi. Prezena de particule n suspensie, altele dect
celulele microbiene, perturb evident msurtorile.
Tehnica nu se preteaz ntotdeauna pentru evaluarea creterii microorganismelor
filamentoase.
Se poate aplica pentru msurri n sistem continuu ("on line"), pe tot parcursul
desfurrii procesului fermentativ, graie punerii la punct a unor biofotometre
sterilizabile cu funcionare continu.
Exist aparate care msoar turbiditatea n microplac, cum este de exemplu
analizorul Bioscreen-Labsistem.
Metoda nefelometric
Permite msurarea luminii difuze i ofer informaii asupra dimensiunilor celulelor
i concentraiei lor n suspensii lichide.
n practica de laborator se prepar etaloane nefelometrice din sulfat de bariu; ntr-o
serie de 10 eprubete egale se repartizeaz o soluie de clorur de bariu 1%, n cantiti
progresiv crescnde de la 0,1 cm3Ia 1 cm3.
n fiecare eprubet se completeaz apoi volumul pn la 10 cm3
, cu o soluie de acidsulfuric 1%.
-
7/25/2019 214716732 Curs Metode Moderne de Control Microbiologic Al Alimentelor 1
25/61
25
Opacitatea format de sulfatul de bariu rezultat din reacie corespunde n prima
eprubet unei concentraii bacteriene de 3108celule/cm3; etalonul urmtor corespunde la
o concentraie de 6108celule/cm3; al treilea etalon, la 9108celule/cm3.
n momentul utilizrii, eprubetelor care conin etaloanele li se omogenizeaz
coninutul.
VI. ESTIMAREA CANTITII DE BIOMAS PRIN
EVALUAREA ACTIVITII METABOLICE A CELULELOR
Prin activitatea metabolic a celulelor, compoziia mediului de cultur se
modific considerabil pe tot parcursul desfurrii procesului fermentativ.
n paralel cu acumularea de biomas se produce un consum al nutrienilor,oxigenului i amoniacului, formarea produilor de metabolism i de asemenea se degaj
cldura rezultat prin reacii catabolice exergonice.
Tehnicile de analiz nu sunt aplicabile dect n condiii bine definite: faza
exponenial de cretere, temperatur, mediu de cultivare adecvate. Modificrile strii
fiziologice ale celulelor conduc la activiti variabile care nu sunt ntotdeauna corelate cu
cantitatea de biomas.
Aceste metode asigur n primul rnd evaluarea strii metabolice a celulelor i, n
mai mic msur, determinarea concentraiei de biomas.
VI.1. Msurarea luminescenei naturale Ia bacterii
Unele bacterii aparinnd genurilor Alternomonas, Photobacterium, Vibrio .a.,
prezint o luminescen natural.
n general, aceast luminescen este emis ca urmare areaciei:
FMNH2+ RCHO + O2 FMN + H2O + RCOOH + lumin ( = 490 nm)
Msurarea luminii emise se realizeaz prin numrarea fotonilor i
fotomultiplicare. Aceasta permite ntr-o oarecare msur aprecierea numrului de
microorganisme.
-
7/25/2019 214716732 Curs Metode Moderne de Control Microbiologic Al Alimentelor 1
26/61
26
VI.2. Studiul proprietilor fizico-chimice ale mediului de
fermentaie
Potenial redox
pH
Vscozitate
Cantitate de cldur degajat
Formarea de CO2
Impedana
Potenialul de oxido-reducere - rH
Numeroase microorganisme modific potenialul oxido-reductoral mediilor de
cultur utiliznd oxigenul i elibernd substane reduc-toare ca urmare a activitii lor
reductazice.
Intensitatea i viteza de modificare a potenialului redox depind de numrul i
natura microorganismelor, de activitatea metabolic, de natura mediului de cultur i de
condiiile de mediu (aerare, agitare, temperatur) etc.
Tehnici de evaluare a activitii reductazice se aplic n prezent pentru aprecierea
numrului de microorganisme vii din lapte, carne, sucuri
Principiul metodelor bazate pe studiul potenialului oxido-reductor
Acestea se bazeaz pe msurarea timpului necesar pentru virajul culorii unui
indicator redox, timp care este n direct concordan cu numrul de microorganisme vii
din proba de analizat. De exemplu, un numr de 106 bacterii produc reductaze care
determin decolorarea unei soluii de albastru de metilen dup o or, ca urmare a trecerii
albastrului de metilen din forma oxidat, colorat n albastru, la un leucoderivat incolor.
Aceast metod nu este specific i, n general, este utilizat pentru aprecierea
numrului total de bacterii vii.
Cei mai utilizai indicatori redox sunt: resazurina, albastru de metilen, clorura de
trifeniltetrazoliu (TTC).
-
7/25/2019 214716732 Curs Metode Moderne de Control Microbiologic Al Alimentelor 1
27/61
27
Resazurina este un indicator redox care i schimb culoarea de la albastru violet
spre roz i incolor, n funcie de potenialul de oxido-reducere. Cu albastru de metilen
reducerea se traduce prin virarea culorii indicatorului de la albastru la incolor, iar n cazul
clorurii de trifeniltetrazoliu culoarea variaz de laincolor la rou-violet.
Indicatori redox utilizai pentru aprecierea numrului total de bacterii
Determinarea pH - ului
Ca urmare a activitilor metabolice, microorganismele determin frecvent
modificarea pH-ului mediului de cultur prin formare sau consum de acizi organici,
producerea de compui alcalini sau ca efect al schimburilor ionice.
Atunci cnd aceste modificri pot fi corelate cu creterea, este posibil estimarea
concentraiei de biomas. Modificarea pH-ului mediilor de cultur este n general sesizat
senzorial prin virajul culorii unui indicator de pH. Nivelul de detecie al acestei metode
este foarte sczut.
Se prefer s se realizeze dozarea titrimetric cu determinarea: aciditii totale i
volatile (aciditate Dornic la lapte); alcalinitii totale (alcalinitate brut); azotului bazic
total, volatil (ABVT).
-
7/25/2019 214716732 Curs Metode Moderne de Control Microbiologic Al Alimentelor 1
28/61
28
Evaluarea vscozitii mediului
Ca urmare a evoluiei proceselor metabolice celulare pe parcursul fermentaiei se
produc modificri ale proprietilor reologice ale mediului fermentativ.
Modificarea vscozitii mediului fermentativ poate constitui un criteriu de
evaluare a creterii. Aceasta se poate datora fie consumului unui nutrient (de exemplu
glicerol), fie acumulrii de produi de fermentaie (poliglucide: xantan, dextran .a.), sau
ca urmare a creterii concentraiei de celule.
Exist n prezent vscozimetre pentru un domeniu larg de msurare a
vscozitii, care pot face msurtori online".
n cazul vscozitilor foarte mari, nu s-a realizat pn un prezent un instrument
de precizie pentru msurarea acestora.
Determinarea CO2
Sunt cunoscute n prezent mai multe tehnici de evaluare a coninutului de CO2
rezultat ca urmare a activitii metabolice a microorganismelor.
Una dintre metode se bazeaz pe msurarea conductivitii ntr-un mediu cu
geloz i KOH n care este captat CO2rezultat prin fermentaie.
Prin nlocuirea progresiv a ionilor hidroxil cu ioni carbonat, mai slabi
conductori, se reduce conductivitatea mediului.
Aceast tehnic se utilizeaz n special pentru evaluarea numrului de drojdii,
Clostridium tyrobutyricum, coliformi totali,Escherichia coli etc.
Msurarea impedanei
Impedana electric Z, sau conductana mediului de cultur, se modific prin
dezvoltarea celulelor microbiene pe parcursul desfurrii procesului fermentativ, ca
urmare a transformrii moleculelor electric neutre n molecule ionizante, cu att mai
rapid cu ct microorganismele se dezvolt mai repede.
Modificarea impedanei variaz n funcie de: concentraia de celule i tipul
microorganismului, mediul de cultur, temperatur, modul de msurare, frecvena
semnalului aplicat, proprietile suprafeei i geometria electrodului i distana dintre
electrozi.
-
7/25/2019 214716732 Curs Metode Moderne de Control Microbiologic Al Alimentelor 1
29/61
29
Se msoar modificarea impedanei mediului pe parcursul dezvoltrii culturii,
Za, comparativ cu un mediu martor de referin, Zref. Variaia impedanei se calculeaz
cu formula:
Aplicabilitate
Metoda este rapid i permite analiza unui numr mare de probe, dar nu permite
evaluarea numrului de celule vii, iar n cazul culturilor de drojdii i mucegaiuri nu se
produc modificri mari ale conductanei mediului, deoarece prin metabolismul lor se
produc puine molecule ionizabile.
Aceast metod este utilizat pentru analiza crnii, a laptelui, iar pragul de detecie
este de aproximativ 106-10
7celule/cm
3.
Aparatele utilizate pentru astfel de determinri sunt cunoscute sub denumirea
comercial: Bactometru-Bactomatic (Meriuex); Bactobridge (TEM, CS); Bactrac (Sy-
Lab/Foss Electric): Malthus (Tacussel); Rabbit (Whitler-AES); ESP (Difco) .a
VI.3. Evaluarea consumului de substrat i formare de produi de
metabolism
Creterea i multiplicarea celulelor microbiene ntr-un mediu adecvat au ca
rezultat consumul de substrat i formarea produilor de metabolism.
Dac biomasa este produsul principal al fermentaiei, atunci, prin msurarea
consumului de substrat se poate determina concentraia de biomas. Astfel, substana
uscat solubil a mediului se regsete n substana uscat a biomasei.
n acest caz, se poate urmri cinetica creterii i multiplicrii celulelor prin
analiza densimetric sau refractometric a mediului fermentativ. La microorganismele
aerobe,folosirea surselor de C, N, O sau minerale, reprezint indicii ale creterii culturii.
Evaluarea consumului de substrat i formarea produilor de metabolism se poate
realiza prin:
Dozarea chimic
-
7/25/2019 214716732 Curs Metode Moderne de Control Microbiologic Al Alimentelor 1
30/61
30
Evaluarea activitii unor enzime
Dozarea n flux continuu
Msurarea direct a schimburilor de gaze
Tehnici radiometrice
Dozarea chimic
Determinarea cantitativ a produilor de fermentaie careau legtur direct cu
creterea: CO2, etanol, acid acetic, ergosterol (n cazul mucegaiurilor) .a., ofer
informaii asupra evoluiei culturii i pot fi corelai cu creterea.
Prin cromatografie de nalt performan a fost posibil cuantificarea foartefin a
cineticii formrii substanelor volatile n timpul fermentaiei i corelarea acestora cucreterea celulelor. De exemplu, aplicnd aceast metod a fost posibil stabilirea
corelaiei dintre cinetica producerii aldehidei acetice i cinetica creterii celulelor de
Streptococcus salivarius ssp. thermophilus.
Evaluarea activitii unor enzime
Testele se refer la dozarea de compui din mediul de fermentaie (substrat sau
produi de fermentaie), care pot fi determinai prin evaluarea activitii unor enzime. n
prezent, firme specializate (ex. compania Boehringer) comercializeaz numeroase kituri
de dozare, i anume:
teste pentru msurarea n UV a unui cofactor oxidat
(NAD NADH + H+): aldehida acetic - aldehid dehidrogenaza; acid acetic -
citrat sintetaza, malat dehidrogenaza, lactic dehidrogenaza;
teste colorimetrice: acid ascorbic - ascorbat oxidaza; acid gluconic - gluconat
kinaza; acid glutamic - diaforaza, glutamat dehidrogenaza;
Prin cromatografie gaz-lichid se poate determina cantitativ metanolul eliberat din
pectin de ctre pectinesterazele fungice i prin aceasta se poate estima indirect cinetica
creterii culturii fungice.
Dozarea n flux continuu (Flow Injection Analysis - FIA)
Aceste tehnici automatizate permit dozarea a unor compui (alcooli, glucide,
uree, oxigen, fosfat .a.) prin metode chimice, biochimice, spectrofotometrice i anume:
-
7/25/2019 214716732 Curs Metode Moderne de Control Microbiologic Al Alimentelor 1
31/61
31
Sistemul FIA Enviroflow (Tecator/Perstorp) permite determinarea, prin analiz
spectrofotometric, n flux continuu, a substraturilor sau produilor rezultai din
activitatea metabolic a microorganismelor din ap i diferite alimente;
Cromatografa n faz gazoas i cromatografa n faz lichid (HPLC) permit
dozarea unei game largi de compui. Prin cromatografie n faz gazoas se pot determina:
etanolul, ali alcooli, acizii volatili, acetoina, hidrocarburile, CO2. Cromatografa n faz
lichid permite evidenierea: glucidelor, etanolului, acizilor organici, aminoacizilor,
hidrocarburilor, fosfailor, antibioticelor;
Biosenzorii sunt instrumente de msur a concentraiei unei game variate de
compui sau de determinare a numrului de celule dintr-o populaie de micro-organisme.
Biosenzorii sunt utilizai pentru: controlul proceselor biotehnologice industriale, controlulcalitii produselor alimentare (detectarea concentraiei unor substane utile: glucide,
acizi organici, alcooli, aminoacizi, nitrai, ioni metalici; detectarea contaminrii cu
microorganisme - Salmonella, Listeria, Staphylococcus), monitorizarea parametrilor
mediului nconjurtor:
Alte metode utilizate pentru dozarea compuilor chimici sunt: rezonana
magnetic nuclear (RMN) - pentru dozarea etanolului, compuilor cu azot, ionilor
fosfat; analiza n infrarou (IR) - pentru alcooli, CO2; analiz paramagnetic -
determinarea oxigenului; spectrometrie de mas (SM) - pentru alcooli, amoniu, oxigen;
absorbia atomic -pentru metale.
Msurarea direct a schimburilor de gaze
Se poate realiza printr-o tehnic manometric cu ajutorul aparatului clasic
Warburg sau cu ajutorul unui oximetru Gilson.
Se consider c intensitatea acestor schimburi este direct proporional cu
mrimea unei populaii de celule, dar aceast corelaie este mult influenat de starea
fiziologic a celulelor .
Tehnici radiometrice
Tehnica de analiz const n cultivarea celulelor pe un substrat radioactiv, dup
care se msoar radioactivitatea mediului, prin analiza unui compus marcat (de exemplu,
-
7/25/2019 214716732 Curs Metode Moderne de Control Microbiologic Al Alimentelor 1
32/61
32
se determin cantitatea de 14CO2rezultat din metabolizarea14
C glucoza). Aceste tehnici
sunt complexe i, n prezent, puin utilizate.
TEHNICI DE STUDIU I IDENTIFICARE A
MICROORGANISMELOR
Identificarea unui microorganism se poate realiza numai dup ce a fost izolat n
cultur pur. Tehnicile utilizate sunt numeroase, variate i specifice in funcie de natura
microorganismelor studiate (bacterii, drojdii, mucegaiuri). Identificarea
microorganismelor se realizeaz pe baza caracterelor morfologice (culturale,
microscopice), fiziologice (biochimice), sexuale, imunologice, genetice, lizotipice i de
patogenitate.
I.1 Studiul microscopic al microorganismelor
Cu ajutorul preparatelor microscopice se pot studia forma i dimensiunile
celulelor unor elemente de structur, starea fiziologic i se pot evidenia tinctorial
anumite proprieti ale microorganismelor.
Examenul microscopic ncepe ntotdeauna prin realizarea unui preparat ntre
lam i lamel (umed), care se analizeaz cu obiective uscate, cu grosisment x 10 i x40.
Acest examen permite diferenierea culturilor de drojdii i mucegaiuri de cele de bacterii.
n cazul microorganismelor eucariote (drojdii, mucegaiuri) examenul
microscopic n stare vie, n preparate umede, permite un studiu eficient al caracterelor
morfologice, studiul unor particulariti privind modul de reproducere i dimensionarea
n plan orizontal a celulelor.
n cazul bacteriilor, utilizarea preparatelor umede pentru studiul morfologic nueste eficient din cauza dimensiunilor lor extrem de reduse. Cu excepia unor studii de
evideniere a mobilitii, bacteriile se studiaz numai in preparate uscate i colorate
(colorarea simpl, colorare diferenial, colorare de structuri celulare: capsule, cili.
incluziuni .a).
Dimensionarea n plan orizontal a celulelor microbiene
Msurtorile n plan orizontal permit stabilirea, pe cale microscopic, n modindirect, a dou din dimensiunile celulei (lungime - lime), prin intermediul unei scri
-
7/25/2019 214716732 Curs Metode Moderne de Control Microbiologic Al Alimentelor 1
33/61
33
arbitrare - micrometru ocular, etalonat pentru grosismentul de lucru al microscopului
prin intermediul micro-metrului obiectiv(scara etalon).
Pentru msurare se folosesc de preferin preparate umede n care suspendarea
celulelor se face n soluie de 0,1% geloz, pentru a evita deplasarea celulelor.
Micrometrul ocular i Micrometrul obiectiv
Micrometrul ocular este un disc de sticl n centrul cruia se afl o scar gradat
cu lungimea de 10 mm, divizat n 100 de diviziuni. Se monteaz n interiorul ocularului
prin deurubarea lentilei superioare i se sprijin pe diafragma ocularului. n cazul n care
liniile scrii nu se vd distinct, se potrivete distana optim prin deplasarea diafragmei
din tub i se nurubeaz din nou lentila frontal a ocularului.
Micrometrul obiectiv este o lam de sticl dreptunghiular n centrul creia se
afl un cerc cu contur uniform n care este gravat scara de 1 mm mprit n 100 de
diviziuni egale. O diviziune a micrometrului obiectiv este egal cu 10 m.
Mod de dimensionare
Se plaseaz lama micrometrului obiectiv pe msua microscopului i se caut
imaginea scrii etalon cu obiectivul cu grosisment x10 i apoi cu cel x45; prin
manevrarea platinei se face suprapunerea celor dou scri. Se noteaz cte diviziuni ale
micrometrului obiectiv se suprapun exact peste un numr de diviziuni ale micrometrului
ocular. Cunoscnd c o diviziune real a scrii etalon este egal cu 10 m, se calculeaz
coeficientul micrometric, care stabilete corespondena dintre cele dou scri:
unde: C este coeficientul micrometric;Nnumrul de diviziuni
pe micrometrul obiectiv; n numrul de diviziuni ale micrometrului ocular care se cuprind
n N
Dup stabilirea coeficientului micrometric, n locul scrii etalon, pe msua
microscopului se aeaz preparatul care conine celulele de dimensionat. Cu ajutorul
scrii, prin rotirea ocularului sau prin deplasarea platinei, se determin numrul de
diviziuni ale celulelor (pentru lungime/lime). Pentru obinerea dimensiunilor reale ale
celulelor dimensionate, numrul de diviziuni citite cu ajutorul micrometrului ocular semultiplic cu coeficientul micrometric stabilit anterior.
-
7/25/2019 214716732 Curs Metode Moderne de Control Microbiologic Al Alimentelor 1
34/61
34
I.2 Studiul caracterelor culturale
Caractere culturale ale microorganismelor n diverse tipuri de culturi
a - forma coloniil or:punctiform (1); circular
(2); ondulat (3); lobat (4); erodat (5); filamentoas
(6); rizoidal (7); plisat cu striaiuni radiale (8); plisat
cu striaiuni concentrice (9); form de fus n masa de
geloz (10);
b -profi lul coloniil or: plat (1): bombat (2);
convex (3); n form de dom (4); umbonat (5):
c -culturi pe geloz nclinat (inoculare
linear): biomasa invadeaz ntreaga suprafa (1);
cretere filiform (2); cretere ondulat (3); cretere
difuz (4); cretere rizoidal sau arborescent (5);
d - culturi prin nepare n medii cu gelatin;
filiform (1); perlat (2); ondulat (3); arborescent (4):
lichefiere cratiform (5); lichefiere stratiform (6);
lichefiere sub form de sac (7): lichefiere total (8);
ecultur i pe mediu l ichid: sediment (1): tulburare (2); pelicul sub form de inel
(3), voal (4).
II. STUDIUL PROPRIETILOR BIOCHIMICE I
FIZIOLOGICE ALE MICROORGANISMELOR
II.1. Stabilirea tipului de metabolism energetic
Viaa celulei microbiene n condiii compatibile oferite de mediul ambiant este
determinat de caracterele genetice care i imprim un anumit metabolism, determinat de
totalitatea reaciilor biochimice catalizate secvenial de enzimele celulei vii, prin care se
asigur transferul de mas i energie ntre celul i mediul ambiant.
Importana general a metabolismului energetic n viaa microorganismelor, a
surselor de energie, a donatorilor de electroni sau de hidrogen i a acceptorului final de
-
7/25/2019 214716732 Curs Metode Moderne de Control Microbiologic Al Alimentelor 1
35/61
35
electroni, a determinat utilizarea acestora drept criterii de clasificare i nomenclatur a
principalelor tipuri de metabolism.
n funcie de natura acceptorului final de electroni, microorganismele pot
prezenta trei tipuri de metabolism energetic.
Respiraia aerob
Este procesul n cursul cruia reaciile chimice productoare de energie necesit
prezena oxigenului molecular ca acceptor final de electroni.
Procesul este dependent de oxigenul din aer, avnd ca produse finale CO2i H2O.
Respiraia aerob este foarte avantajoas din punct de vedere energetic pentru
celula microbian, de aceea, atunci cnd urmrim obinerea de celule n cantiti mari(drojdie comprimat) sau obinerea de substane intracelulare, cultivarea se face n
condiii de aerare.
Respiraia aerob este dependent de cantitatea de oxigen din aer, iar carbonul
din compusul organic se regsete n dioxidul de carbon.
Microorganismele aerobe dispun de o caten respiratorie diversificat, n
componena creia intr dehidrogenaze: citocromi, citocrom-oxidaze, oxidaze.
Numeroase bacterii pot oxida hidrogenul (Pseudomonas), amoniacul pn la NO2
(Nitrosomonas), sulful i H2S pn la sulfat (Thiobacillus) sau fierul Fe2+
la Fe3+
(Thiobacillus ferooxidans) cu rol important ncircuitul natural al elementelor.
Respiraia anaerob
Este procesul prin care substratul este transformat pn la CO2, iar e-sunt cedai
prin procesul de oxidare unor compui anorganici acceptori.Este ntlnit la bacteriile strict anaerobe, cnd acceptorul de electroni sau
hidrogen este un compus anorganic. Aceste bacterii obin o cantitate mic de energie i
pot crete n absena oxigenului molecular, Ia un potenial deoxidoreducere de -0,2; -0,3
V.
innd cont c mediile ce vin n contact cu O2 au un potenial redox de +0,2;
+0,4 atunci cnd pH = 7, pentru a asigura dezvoltarea anaerobilor, n mediu se adaug
substane cu caracter reductor ca tioglicolat de Na, cistein, sulfura de Na. Substanele
-
7/25/2019 214716732 Curs Metode Moderne de Control Microbiologic Al Alimentelor 1
36/61
36
reductoare permit meninerea unui potenial de oxido-reducere sczut. Pentru cultivarea
anaerobilor se pot folosi i vase speciale numite anaerostate n care O2este legat chimic,
sau cultura se menine n atmosfer de gaze inerte (CO2, N2).
FermentaiaEste un proces n care reaciile chimice productoarede energie necesit prezena
unor compui organici ca acceptori finali de electroni.
Metabolismul oxidativ anaerob poate fi ntlnit i la microorganisme facultativ
anaerobe. Aceste microorganisme au capacitatea de a crete aerob utiliznd oxigenul din
aer (respiraie aerob) sau anaerob, folosind compui organici ca acceptori finali ai
electronilor.
Microorganismele facultativ anaerobe, n condiii aerobe, i adapteaz
echipamentul enzimatic pentru procese de oxidare pn la produii finali, utiliznd
preferenial oxigenul cnd este disponibil, datorit cantitii mai mari.
Tipuri de comportamente difereniate ale microorganismelor
Aerobe- sunt dependente de oxigenul din aer, se dezvolt la suprafaa lichidelor,
a mediilor solide. Oxigenul servete caacceptor final de electroni transportai prin catena
respiratorie;
Facultativ anaerobe - nu necesit oxigen pentru cretere, dar cresc mai bine n
prezena sa. Se dezvolt bine n medii lichide n care solubilitatea oxigenului din aer este
mai redus;
Aerotolerante anaerobe - nu necesit O2pentru cretere i cresc la fel de bine n
prezena sau absena sa (ex.Enterococcus fecalis, Lactobacillus plantarum).
Microorganismele incluse n aceste tipuri pot produce superoxid dismutaz i
catalaz care catalizeaz reaciile:
Microaerofile - se dezvolt la distan mic de suprafaa mediului de cultur
cnd concentraia n oxigen este de 2-10%;
Strict (obligat) anaerobe - nu tolereaz oxigenul i mor n prezena acestuia,
deoarece nu pot descompune apa oxigenat cu efect distructiv asupra celulei. Nu pot
-
7/25/2019 214716732 Curs Metode Moderne de Control Microbiologic Al Alimentelor 1
37/61
37
obine energie prin respiraie propriu-zis i folosesc fermentaia i respiraia anaerob n
acest scop (ex. bacterii butirice, metanogene).
II.1.1 Tehnici de studiu al tipului de metabolism energetic
n eprubete (8 x 180 mm) se repartizeaz
cte 10-15 cm3mediu de cultur, BCA+ glucoz i
se sterilizeaz. n momentul utilizrii, mediul se
fluidific prin nclzire pe baie de ap i apoi se
tempereaz la 42...45C. Urmeaz inocularea n strii
n profunzimea masei de gel, cu ajutorul unei pipete
Pasteur. Pipeta se introduce pn la partea inferioar
a eprubetei, apoi se ridic ncet pentru inoculareauniform (cu 3-4 picturi suspensie celule) a
mediului de cultur. Dup rcire i solidificare
mediul se termostateaz corespunztor. n funcie de particularitile de cretere n raport
cu necesarul de oxigen, microorganismele sunt ncadrate n 4 categorii principale: strict
aerobe (a), strict anaerobe (b), aerotolerante anaerobe (c), microaerofile (d).
II.1.2 Evidenierea metabolismului oxidativ i fermentativDeterminarea produselor rezultate prin metabolismul celulei microbiene (acizi,
alcooli, enzime .a.) prezint interes practic n scopul stabilirii condiiilor optime de
mediu pentru creterea randamentului n produsul cu importan economic, la selectarea
unor microorganisme nalt productive.
n funcie de particularitile metabolice i de condiiile de cultivare,
microorganismele au capacitatea de a metaboliza n mod diferit substratul cu formare de
acizi, CO2i ap (metabolism oxidativ), sau acizi, alcooli i gaze (CO2, H2)(metabolism
fermentativ anaerob).
Evidenierea tipului de metabolism se va face prin punerea n eviden a
produilor finali de metabolism, n special formarea de gaze, care n cazul
metabolismului fermentativ se concretizeaz n: acumulare de gaz n tub Durham (mediu
lichid), formarea de alveole de gaz (n mediu cu geloz). n cazul respiraiei aerobe, prin
dezvoltarea microorganismelor la suprafaa mediului de cultur, CO2format este eliberatn mediul nconjurtor.
-
7/25/2019 214716732 Curs Metode Moderne de Control Microbiologic Al Alimentelor 1
38/61
38
Pentru evidenierea tipului de metabolism se utilizeaz dou metode principale.
A. Metoda bazat pe studiul pH-ului
Se aplic n general pentru studiul bacteriilor, care prin fermentaie produc acizi
i uneori gaze.Pentru cultivare, se utilizeaz un mediu semisolid care conine un indicator de
pH.
nainte de utilizare, mediul se fluidific pe baie de ap, apoi se adaug soluie de
glucoza astfel nct concentraia final n mediu s fie de 0,1% i se solidific din nou.
Pentru analiz se utilizeaz cte dou eprubete de mediu care se inoculeaz prin
nepare cu firul exact n zona central a tubului de gel.n una din eprubete se acoper suprafaa mediului cu 1 cm3ulei de parafin steril.
Dup termostatare corespunztoare, se examineaz eprubetele i se noteaz
virarea culorii indicatorului i eventual formarea de gaz
Posibile rezultate
Acidifiere la suprafaa mediului din eprubeta fr parafin;
Absen modificri n eprubeta cu parafin - metabolism oxidativ;
Absen acidifiere sau formare de gaz; uneori crete alcalinitatea n eprubeta cu
parafin- metabolism inactiv sau "inert";
Acidifiere n ambele eprubete cu sau fr formare de gaz; modificarea poziiei
dopului de parafin - metabolism fermentativ.
Dup inoculare i termostatare rezultatele se interpreteaz astfel:
absen formare gaz; absen acidifiere sau alcalinizare mediu; uneori acidifieremediu fr formare de gaz - metabolism oxidativ sau"inert";
acidifiere cu formare de gaz; formare gaz fr acidifiere; uneori acidifiere fr
formare de gaz - metabolism fermentativ (bacterii).
B. Metoda bazat pe evidenierea producerii de gaz
Se utilizeaz frecvent n cazul drojdiilor, dar i pentru anumite bacterii.
Pentru analiz se utilizeaz un mediu lichid, ce conine o surs de carbonasimilabil i un indicator depH.
-
7/25/2019 214716732 Curs Metode Moderne de Control Microbiologic Al Alimentelor 1
39/61
39
Mediul se repartizeaz n eprubete cu tub Durham i se sterilizeaz.
Cele mai utilizate medii sunt: pentru drojdii - mediul Wieckerman; pentru
bacterii - bulion de carne cu lactoz (BCL), bulion de carne - lactoz - bil - verde
briliant (BLBV).
Studiul potenialului oxidativ sau fermentativ al microorganismelor
a - cultivare pe mediul Hugh l Leifson:
metabolism oxidativ (1); metabolism inactiv sau
inert n raport cu substratul (2); metabolism
fermentativ (3, 4, 5); b - cultivare pe mediul
Wickerham: metabolism oxidativ sau inert (1, 2);
metabolism fermentativ (3, 4).
II.1.3 Evidenierea capacitii unor microorganisme de a cataliza
procese de respiraie anaerob
Punerea in eviden a acestei capaciti se poate realiza prin procedeele
urmtoare:
Reducerea nitrailor i nitriilor
Reducerea compuilor cu sulf
Reducerea nitrailor i nitriilor
Reducerea nitrailor de ctre
microorganisme se poate realiza prin
mecanisme moleculare, cu semnificaie
diferit pentru microorganismele
efectoare:
A) denitrificarea sau reducerea
dezasimilatorie adevrat;
B) reducerea asimilatorie.
Produii finali ai reducerii pot
fi: N2 n cazul procesului de
denitrificare (tip A) sau NH3 n cazul
-
7/25/2019 214716732 Curs Metode Moderne de Control Microbiologic Al Alimentelor 1
40/61
40
procesului de reducere asimilatorie (tip B).
Reducerea compuilor cu sulf
Reducerea sulfailor (SO42-) se studiaz foarte puin.
Reducera sulfiilor (SO32-
) se evideniaz prin cultivare pe medii care coninsulfii i o sare a unui metal solubil (n general fier sau, uneori, bismut sau plumb).
Bacteriile anaerobe sunt de multe ori capabile s utilizeze sulfiii ca acceptori de
hidrogen. Caracterul sulfito-reductor se evideniaz prin cultivare pe bulion de carne sau
bulion de carne cu extract de drojdie la care se adaug, dup sterilizare, 0,4% sulfit de
sodiu i cteva picturi de citrat de fier (sau alaun de fier). Dup inoculare i termostatare
corespunztoare, reducerea sulfitului se evideniaz prin apariia petelor negre date de
sulfur. Se pot utiliza i alte medii precum: bulion-lactoz-sulfit; geloz Wilson Blair.
Reducerea tiosulfatului (S2O32-) se studiaz prin cultivarea microorganismelor pe
bulion de carne sau bulion de carne cu extract de drojdie cu adaosul unei sri de fier, sau
pe mediul geloz cu acetat de plumb, prin adugarea unei picturi de 10 % tiosulfat de
sodiu.
Producerea de H2S este caracteristic i microorganismelor care au capacitatea de
a produce reducerea sulfailor i sulfiilor prezeni n mediul de cultur. Din grupul
microorganismelor sulfito-reductoare fac parte bacteriile anaerobe din genul
Clostridium (Cl. sporogenes, CI. perfringens .a.).
Prin cultivare, n condiii strict anaerobe, pe mediii specifice ce conin sulfat de
fier, timp de 10-14 zile, testul este pozitiv cnd la baza vasului de cultivare se formeaz
un sediment de sulfur de fier de culoare neagr.
II.1.4 Evidenierea puterii reductoare
Punerea n eviden a capacitii reductoare a unor microorganisme se realizeaz
prin cultivare pe medii specifice n prezena indicatorilor redox: albastru de metilen,
clorur de trifenil tetrazoliu (TTC) sau tinctur de turnesol. Reacia de reducere este
catalizat de reductazele produse de celulele vii. Reducerea este certificat de schimbarea
culorii probei.
Pentru studiul streptococilor se recomand utilizarea mediului Sherman - lapte cu
0,1% albastru de metilen. n aerobioz se produce reoxidarea albastrului de metilen cu
-
7/25/2019 214716732 Curs Metode Moderne de Control Microbiologic Al Alimentelor 1
41/61
41
oxigenul din aer, cu eliberare, n cazul unei aerri puternice, de ap oxigenat. n aceste
condiii se dezvolt numai microorganismele catalazo-pozitive.
Prin reducere, clorura de trifenil tetrazoliu (TTC) i modific culoarea de la
glbui la rou-brun ca urmare a apariiei formazanului (punerea n eviden a
streptococilor fecali sau a entero-bacteriilor).
Reducerea turnesolului se evideniaz prin decolorare indicatorului, reacie
utilizat pentru studiul bacteriilor lactice, prin cultivare pe lapte turnesolat.
II.1.5 Evidenierea enzimelor respiratorii
Punerea n eviden a enzimelor respiratorii se face, nspecial, prin:
Evidenierea producerii de oxidazeEvidenierea producerii de catalaz
Studiul inhibiiei enzimelor respiratorii
Evidenierea producerii de oxidaze
Oxidazele microbiene au proprietatea de a cataliza reacia de oxidare a unui
substrat organic, n prezena oxigenului din aer. Substratul utilizat este soluie 1% oxalat
de N-dimetil parafenilen diamin. Acest compus este incolor n forma redus i secoloreaz n rou-violet cnd trece n forma oxidat. Se mai poate utiliza clorhidrat de
tetrametilen parafenilen diamina, care d o coloraie purpurie.
Analiza permite evidenierea global a potenialului oxidazic (oxidazo pozitiv) al
unei tulpini, fr a putea evidenia prezena unor oxidaze particulare.
Pentru studiu se utilizeaz o cultur tnr aflat pe mediul cu geloz, utiliznd
diferite tehnici de analiz.
Tehnica de pulverizare a reactivului Mac Lead se poate aplica pentru coloniile
dezvoltate pe medii dense, n cutii Petri. Se utilizeaz o soluie proaspt de reactiv, care
se pulverizeaz pe suprafaa culturii. Coloniile oxidazo-pozitive se vor colora n rou n
cteva minute. Pentru a evita pierderea culturii, se face imediat repicarea culturii de
interes, deoarece reactivul are o aciune toxic asupra celulelor.
-
7/25/2019 214716732 Curs Metode Moderne de Control Microbiologic Al Alimentelor 1
42/61
42
Evidenierea producerii de catalaz
Catalazaeste enzima care catalizeaz reacia de descompunere a apei oxigenate
formate prin activitatea metabolic a microorganismelor.
Pentru evidenierea activitii catalazice se depun pe o lam o pictur din
suspensia de celule de analizat i o pictur soluie proaspt de ap oxigenat (10
volume). Celulele au activitate catalazic cnd n scurt timp se observ degajarea de bule
de gaz, prin formare de spum. Reacia se poate verifica i ntr-o suspensie dens de
celule sau direct pe mediu solidificat, cnd coloniile formate la suprafaa mediului se
acoper cu 2-3 picturi ap oxigenat. La suprafaa coloniilor catalazo-pozitive se va
evidenia degajarea de bule de gaz cu formare de spum mai mult sau mai puin
abundent, n funcie de potenialul catalazic al microorganismelor.
La unele bacterii lactice poate s se evidenieze un fals efect catalazo-pozitiv.
Pentru confirmare se realizeaz un test cu benzidin.
Dintr-un amestec format din 0,5 cm3 reactiv (cu benzidin) + 0,5 cm3 H2O2 (4
volume) se depun cteva picturi pe o cultur aflat pe mediu solidificat. Apariia unei
coloraii albastru nchis confirm prezena catalazei.
Studiul inhibiiei enzimelor respiratorii
Se utilizeaz testul de inhibiie cu cianur. Cianura inhib enzimele respiratorii
implicate n secvenele cilor metabolice terminale. Microorganismele care posed aceste
enzime nu se pot dezvolta ntr-un mediu cu KCN. Mediile recomandate pentru acest test
sunt: Buttiaux, Braun sau Mller,pH =7,5.
Dup preparare, mediul se repartizeaz n eprubete, se sterilizeaz i se rcete,
apoi se adaug 0,5 cm3
soluie apoas 0,5% cianur de potasiu, pH=7,5. Celulelerecoltate cu o ans, dintr-o cultur n vrst de 24 h, se inoculeaz n mediul astfel
pregtit, apoi, dup 48 h de termostatare n condiii optime, se examineaz creterea
microorganismelor.
Se apreciaz: KCN (+) - microorganisme dezvoltate n condiiile testate;
KCN (-) - absen cretere.
-
7/25/2019 214716732 Curs Metode Moderne de Control Microbiologic Al Alimentelor 1
43/61
43
II.2 Studiul capacitii microorganismelor de a metaboliza glucidele
Pentru identificarea microorganismelor, este important s se studieze i
capacitatea lor de a se dezvolta pe anumite medii selective de diagnosticare sau prin
urmrirea potenialului de metabolizare a unor compui introdui n mediul de cultur almicroorganismului studiat.
II.2.1 Asimilarea glucidelor simple - auxanograma
Pentru identificarea microorganismelor organotrofe se stabilesc glucidele care le
favorizeaz creterea, atunci cnd acestea reprezint unica surs de carbon prezent n
mediul de cultur. Dintre acestea mai frecvent se utilizeaz: arabinoza, xiloza, glucoza,
fructoza, galactoza, zaharoza, maltoza, lactoza. Prin metabolizarea specific a acestorsubstane se pot forma acizi organici, gaze, aldehide i cetone.
II.2.2 Studiul potenialului de hidroliz al amidonului
Unele microorganisme (bacterii i mucegaiuri) sunt capabile s sintetizeze
hidrolaze extracelulare de tipul i amilaze, glucoamilaze, care pot hidroliz enzimatic
amidonul pn la produse cu greuti moleculare din ce n ce mai mici, i anume
eritrodextrine, acromo-dextrine, maltoz, glucoza, ce pot fi utilizate de microorganismedrept surse de carbon i energie. Pentru punerea n eviden a acestor proprieti se
folosete un mediu nutritiv (BCA sau MMA) cu 0,2% amidon solubil. Dup sterilizare,
mediul se repartizeaz n plci Petri i dup solidificare, cu firul inoculat n suspensia de
celule se inoculeaz "n punct" sau se traseaz o linie de-a lungul diametrului plcii.
Dup 7-10 zile se observ vizual hidroliza amidonului dup zona clar aflat n jurul
coloniei sau n jurul liniei de inoculare. Zona devine mai evident prin adugarea n plac
a unei soluii de Lugol. n acest caz amidonul nehidrolizat va cpta culoare albastr,
zona de formare a dextrinelor o culoare roie-brun, iar zona n care amidonul este
complet hidrolizat va rmne incolor. Determinarea semicantitativ a activitii
amilolitice a diferitelor microorganisme se poate realiza prin stabilirea raportului ntre
diametrul zonei n care s-a produs hidroliza complet a amidonului i diametrul coloniei
microorganismului de studiat, n condiii determinate de timp i temperatur de
termostatare.
-
7/25/2019 214716732 Curs Metode Moderne de Control Microbiologic Al Alimentelor 1
44/61
44
II.2.3 Studiul fermentaiei alcoolice
Pentru studiul fermentaiei alcoolice i al factorilor care condiioneaz viteza de
fermentare a glucidelor fermentescibile se folosesc culturi pure de drojdii aparinnd
genului Saccharomyces.
Pentru obinerea inoculului, celulele de drojdie din eprubeta cu cultur pur, pe
must de mal-agar nclinat, se transfer n must de mal lichid (baloane cu 25 cm3mediu)
i se termostateaz 24 h la 25...30C.
Inoculul obinut se transfer, n proporie de 2-4 %, cu o pipet steril n 3 vase
de fermentare ce conin 150 cm3 must de mal cu aceeai concentraie sau must de
struguri cu 20% zahr, prevzute cu ventile de fermentaie.
Dup montarea ventilului de fermentaie, sterilizat separat de vasul ce conine
mediul, n ventilse introduce, prin orificiul superior, un volum redus (2-3 cm3) de acid
sulfuric concentrat. Acesta va permite eliminarea dioxidului de carbon rezultat in timpul
fermentaiei i va reine vaporii de ap i alte substane volatile.
Dup cntrirea iniial a fiecrui vas, la o balan cu precizie, acestea se
termostateaz la 30C, timp de 3 zile. La intervale de 6, 24, 48, 72 ore se face agitarea
mustului pentru eliminarea CO2 format, apoi se cntrete fiecare vas i se calculeazprin diferen cantitateamedie de CO2degajat.
II.2.4 Studiul fermentaiei lactice
Fermentaialactic este un proces anaerob prin care substratul hidrocarbonat este
metabolizat sub aciunea echipamentului enzimatic al bacteriilor lactice n acid lactic ca
produs principal al fermentaiei.
n cazul bacteriilor lactice homofermentative, pe lng acid lactic se acumuleaz
i produse secundare: acid acetic, alcool etilic, glicerol, CO2.
II.2.5 Studiul fermentaiei butirice
Fermentaia butiric este un proces strict anaerob, prin care substratul
hidrocarbonat (amidon, dextrine, lactoz, glucoza .a) este metabolizat n condiii neutre
depH, sub aciunea enzimelor elaborate de bacterii din genul Clostridium, n acid butiric,
CO2i H2ca produse principale.
-
7/25/2019 214716732 Curs Metode Moderne de Control Microbiologic Al Alimentelor 1
45/61
45
II.3 Studiul metabolismului compuilor cu azot
II.3.1 Evidenierea potenialului microorganismelor de a hidroliza ureea
Hidroliza ureei este realizat de un grup numeros de microorganisme capabile s
produc enzima ureaz.
Ele aparin eubacteriilor (genurile: Achromobacter, Bacillus, Clostridium,
Corynebacterium, Pseudomonas), actinomicetelor i fungilor filamentoi, urobacteriilor
(caracterizate prin rezisten la concentraii mari de uree i pH alcalin i prin capacitatea
de a elibera cantiti mari de NH3).
Din grupul urobacteriilor fac parte o serie de bacterii precum:Bacillus probatus,
Bacillus freudenreichii, Urobacillus paslearii, Urobacillus miquellii. Sarcina ureae,
Micrococcus ureae, Planosarcina ureae .a.
Conversia ureei la NH3, sub aciunea ureeazei decurge conform reaciilor:
CO(NH2)2+ 2H2O (NH4)2CO3 2NH3+ CO2+ H2O
Evidenierea producerii de ureaz este sesizat calitativ, ca urmare a creterii
alcalinitii, printr-un indicator depH. Cultivarea se realizeaz pe medii lichide specifice:
mediul Ferguson (uree-idol); mediul Stuart (care conine rou de fenol). n cazul
microorganismelor ureazo-pozitive, culoarea mediului vireaz n rou.
II.3.2 Studiul activitii de proteoliz (hidroliza gelatinei i a cazeinei)
Bacteriile de putrefacie i majoritatea fungilor produc enzime proteolitice
extracelulare i determin degradarea substraturilor bogate n protide. Pentru
determinarea activitii de proteoliz se folosesc metode calitative i cantitative bazate pe
hidroliza enzimatic a gelatinei sau a unor protide mai complexe (cazein, ovalbumin).
Hidroliza gelatinei
n funcie de potenialul lor de biosintez a enzimelor proteolitice, micro-
organismele pot fi capabile s produc lichefierea gelatinei (bacterii, fungi filamentoi),
sau sunt lipsite de aceast proprietate (drojdii).
Dup inocularea culturii de studiat, prin nepare n tub de mediu drept (bulion de
carne cu gelatin-BCG sau must de mal cu gelatin-MMG), n eprubete, i termostatare
-
7/25/2019 214716732 Curs Metode Moderne de Control Microbiologic Al Alimentelor 1
46/61
46
la temperatura de 20C, la o periodicitate de 48 h, pe un interval de 2 sptmni, se
descrie modul n care s-a produs lichefierea gelatinei, pentru culturile gelatinazo-pozitive.
Pentru determinri semicantitative se recomand utilizarea mediului Frazier (cu
4% gelatin). Dup inocularea "n punct" a celulelor aparinnd microorganismului de
testat, pe suprafaa mediului Frazier repartizat n plci Petri i termostatare la 37C, timp
de 24-48 h (pentru bacterii de putrefacie), sau la 25...28C, timp de 3 zile (pentru
mucegaiuri), se inund placa cu soluie de clorur mercuric.
n aceste condiii, n jurul coloniilor aparinnd microorganismelor cu activitate
gelatinolitic apare o zon clar, transparent, n contrast cu zona opac n care gelatina
nu a fost hidrolizat.
Hidroliza cazeinei
Studiul capacitii microorganismelor de a produce hidroliza cazeinei se
realizeaz prin cultivare pe diferite medii cu lapte. Laptele, prin coninutul su n lactoz,
cazein, vitamine i sruri minerale, reprezint un mediu optim pentru dezvoltarea
bacteriilor care pot produce fermentarea lactozei, proteoliza cazeinei sau ambele
transformri.
Prin inoculare '"n punct" pe medii solidificate cu agar ce conin i 10% lapte i
termostatare n condiii optime de cretere, coloniile cu activitate cazeinolitic vor
prezenta n jurul lor o zon clar, comparativ cu restul mediului careeste opac. Apariia
zonei clare se datoreaz hidrolizei cazeinei din imediata vecintate a coloniilor ca urmare
a producerii de proteaze extracelulare de ctre microorganismele cu activitate
cazeinolitic.
Mediile conin drept indicator depH,purpur de brom crezol,pHla valoarea 7,3.
Modificarea culorii indicatorului, caracteristic unui pHacid, denot acidifiere
asociat cu coagularea laptelui ca urmare a fermentrii lactozei i formrii de acid lactic.
Cnd microorganismele de studiat produc proteoliza cazeinei, pH-ul rmne
neutru sau devine alcalin, cu modificarea specific a culorii indicatorului n domeniul
alcalin depH.
n stadii avansate de proteoliza are loc peptonizarea laptelui.
-
7/25/2019 214716732 Curs Metode Moderne de Control Microbiologic Al Alimentelor 1
47/61
47
II.3.3 Metabolismul aminoacizilor
Formarea amoniacului
Amoniacul poate s rezulte n urma dezaminrii aminoacizilor prezeni n mediul
de cultur al microorganismului de studiat. Acesta este parial folosit drept surs de azot,
iar excesul se elimin i poate fi evideniat pe cale chimic. Pentru evidenierea
producerii de amoniac, drept medii de cultur se recomand apa peptonat sau un mediu
lichid care conine un aminoacid special (de exemplu, bulion-arginin). Mediul se
repartizeaz n eprubete, se sterilizeaz i se inoculeaz cu celulele aparinnd
microorganismului de studiat. Dup termostatare n condiii oprime, producerea de
amoniac este evideniat prin reacia de culoare cu reactivul Nessler (cteva picturi),
cnd proba capt culoare galben-oranj.
Producerea de H2S
Sub aciunea unor microorganisme asupra aminoacizilor ce conin sulf n
molecul (metionin, cistin, cistein), prezeni n mediul de cultur, are loc eliberarea de
H2S. Aceast proprietate se poate pune n eviden prin cultivarea microorganismelor n
mediu de bulion de carne cu peptonrepartizat n eprubete i sterilizat. Dup inoculareamediului cu o suspensie de celule, ntre dopul de vat i gtul eprubetei se introduce o
band de hrtie steril mbibat n soluie 10% acetat de plumb, astfel nct s nu ating
suprafaa mediului. Se recomand ca dopul eprubetei s se acopere cu o folie din plastic
pentru a evita evaporarea rapid a gazului care se formeaz. Durata cultivrii este 7-10
zile. Eliberarea de H2S se evideniaz prin nnegrirea hrtiei, ca rezultat al formrii
sulfurii de plumb (PbS).
O alt metod de evideniere a H2S eliberat de ctre microorganisme const n
cultivarea acestora pe un mediu specific, care conine proteine i sulfat de fier: mediul
pepton-fier-agar, mediul Mossel, mediul Lingby cu geloz. Mediul cu agar repartizat n
eprubete se sterilizeaz la 0,5 atm. i se nclin sau se pstreaz ca atare, sub form de tub
de gel. Cu firul ncrcat cu celule se aplic striuri la suprafaa mediului (pentru
microorganisme aerobe), sau inocularea se realizeaz n profunzimea tubului de gel drept
(pentru microorganisme anaerobe, facultativ anaerobe sau microaerofile). Prin creterea
-
7/25/2019 214716732 Curs Metode Moderne de Control Microbiologic Al Alimentelor 1
48/61
48
biomasei, o dat cu eliberarea de H2S, are loc nnegrirea mediului ca rezultat al formrii
sulfurii de fier.
II.4 Studiul metabolismului lipidic
Activitatea lipazic (esterazic) a microorganismelor poate fi pus n eviden
prin:
Cultivarea "n punct" pe un mediu solidificat cu adaos de ulei de msline steril
(nainte de repartizarea n plci Petri). n mediu se adaug 0,006 % albastru de Victoria.
Tulpinile cu activitate lipolitic vor fi puse n eviden prin prezena n jurul coloniilor a
unui precipitat de culoare albastru-deschis, dat de acizii eliberai n mediu;
Cultivarea "n punct" pe mediu solidificat cu adaos de tributirin - prin aceasta,
tulpinile lipazo-pozitive vor prezenta n jurul coloniilor o zon clar. n acest caz, se pot
utiliza i variante de mediu de cultur cu adaos de compui indicatori. De exemplu, dac
mediul conine albastru Evans, n jurul coloniilor cu activitate lipazic va aprea o zon
clar, comparativ cu restul mediului de culoare albastr. Dac n compoziia mediului de
cultur se utilizeaz un indicator de pH (de exemplu, rou de fenol), n jurul coloniilor
tulpinilor active va aprea o zon cu coloraie galben ca urmare a acidifierii produse de
acidul butiric format;
Studiul activitii lecitinazice - se face utiliznd un mediu cu glbenu de ou.n
geloz nutritiv obinuit se adaug o soluie (5-10%) de glbenu de ou n ser fiziologic
steril. Mediul se repartizeaz n plci Petri sterile i dup solidificare celulele
microorganismelor de studiat se inoculeaz "n punct" pe suprafaa mediului. Dup
termostatare n condiii optime de cretere, tulpinile cu activitate lecitinazic vor prezenta
n jurul coloniilor o zon opac.
III. STUDIUL ALTOR PROPRIETI FIZIOLOGICE
GENERALE
III.1 Evidenierea mobilitii celulelor
Mobilitatea celulelor, n special n cazul bacteriilor, se poate evidenia prin
examen microscopic direct (n preparat umed n pictur suspendat) sau prin examencultural.
-
7/25/2019 214716732 Curs Metode Moderne de Control Microbiologic Al Alimentelor 1
49/61
49
Pentru examenul cultural se folosesc medii semisolide speciale cu geloz. Pentru
studiu, celulele sunt inoculate n mediu cu firul drept, iar dup termostatare
corespunztoare mobilitatea se apreciaz n funcie de potenialul de invadare, mai mare
sau mai redus, al mediului de cultur.
Se poate utiliza, de asemenea pentru studiul mobilitii, mediul cu manitol, slab
solidificat, care poate conine nitrai i un indicator de culoare ce permite evidenierea
degradrii manitolului prin virajul culorii de la rou la galben.
III.2 Studiul comportamentului microorganismelor n medii
hipertonice (halofilia, osmofilia)
Pentru evidenierea capacitii unor microorganisme de a se dezvolta n medii cu
concentraii ridicate de sare sau zahr, se recomand cultivarea lor n medii lichide sau
solidificate, cu adaos de pn la 60 % glucoza sau zaharoz (pentru microorganisme
osmofile) i pn la 10% NaCl (pentru microorganisme halofile). Capacitatea de
dezvoltare pe astfel de medii se verific dup o perioad de termostatare, la temperatura
optim de cretere, specific microorganismelor testate.
III.3 Stabilirea domeniului de temperaturi eugenezice pentru
dezvoltarea microorganismelor
Domeniul general al temperaturilor eugenezice pentru majoritatea
microorganismelor cu implicaii n industria alimentar este situat ntre 0 i 75C i este
mai extins nlimite extreme de - 34...250C, n cazul archebacteriilor.
Pentru analiz, se prepar un mediu nutritiv lichid,optim pentru cretere, care se
repartizeaz n eprubete i se sterilizeaz. n momentul utilizrii, se inoculeaz maimulte
eprubete n paralel, cu aceeai concentraie de celule n stare activ a microorganismelorde studiat, apoi eprubetele se plaseaz n termostate reglate la intervale apropiate de
temperaturi n domeniul eugenezic. De exemplu, pentrumicroorganisme mezofile la: 20;
30; 37; 42; 48C.
Dup 48 h de cultivare se analizeaz turbidimetric gradul de dezvoltare al culturii
i se apreciaz cu:
0 = cretere absent;
+ = cretere slab;
-
7/25/2019 214716732 Curs Metode Moderne de Control Microbiologic Al Alimentelor 1
50/61
50
++ = cretere bun;
+++ = cretere foarte bun.
Aceste rezultate permit stabilirea temperaturii optime i a temperaturilor limit
de dezvoltare.
III.4 Evidenierea capacitii de sporogenez a bacteriilor
Prezena endosporilor bacterieni se poate pune n eviden prin pasteurizarea unei
suspensii de celule, timp de 10 min, Ia 70...80C, cnd sunt distruse toate formele
vegetative ale bacteriilor, n timp ce endosporii supravieuiesc prin acest tratament.
Creterea bacteriilor dup acest tratament presupune prezena sporilor. Se recomand
cultivarea pe medii care induc sporularea, nainte de tratamentul termic.
Evidenierea endosporilor bacterieni se poate realiza i prin examen microscopic
direct. Sporii bacteriilor, aparinnd genurilor Bacillus, Clostridium, prezint anumite
particulariti citologice care i difereniaz de celula vegetativ.
n preparat microscopic sporii se pot evidenia prin studiul celulelor vii sau prin
metode de colorare diferenial.
n frotiurile clasice fixate i colorate simplu sau dup metoda Gram, endosporii
nu se coloreaz, ei putnd fi observai n celul sub form de incluziune necolorat, n
timp ce exosporium se coloreaz.
Prin metode speciale de colorare (nclzire n prezen de colorani) se produce
colorarea att a sporilor ct i a citoplasmei, iar dup splare cu ap citoplasma se
decoloreaz, n timpce sporii rmn colorai deoarece rein puternic colorantul.
III.7 Studiul rezistenei microorganismelor la antibiotice sau la ali
compui cu efect inhibitor
Rezistena microorganismelor fa anumite antibiotice este un caracter frecvent
utilizat n studii de taxonomie i de asemenea prezint un interes deosebit pentru industria
de biosintez.
Microorganismului testat se cultiv pe un mediu de cultur lichid sau solidificat
care conine antibioticul sau compusul cu aciune inhibitoare, sterilizat prin filtrare i
adugat, n momentul inoculrii, n mediul de cultur steril. Dup termostatare n condiii
-
7/25/2019 214716732 Curs Metode Moderne de Control Microbiologic Al Alimentelor 1
51/61
51
optime, se apreciaz gradul de dezvoltare al culturii i, n funcie de acesta, sensibilitatea
sau rezistena microorganismului.
Prin metode semicantitative se poate evalua gradul de inhibare, precum i
concentraia care determin un efect microbiostatic sau microbicid.
Mediile de cult