2550 ัมหาวิทยาลัิยศลปากร ·...

การโคลนและการศึกษาคุณสมบัติทางพันธุศาสตรโมเลกุลของยีนท่ีเก่ียวของกับ การพัฒนาเปนเมล็ดในขาว

โดย นางพิศมยั ชวาลกุล

วิทยานิพนธนีเ้ปนสวนหนึง่ของการศึกษาตามหลักสูตรปริญญาวิทยาศาสตรมหาบณัฑิต สาขาวิชาเทคโนโลยีชีวภาพ ภาควชิาเทคโนโลยีชีวภาพ

บัณฑิตวิทยาลัย มหาวิทยาลัยศิลปากร ปการศึกษา 2550

ลิขสิทธ์ิของบณัฑิตวิทยาลัย มหาวิทยาลัยศิลปากร

CLONING AND MOLECULAR GENETIC CHARACTERIZATION OF GENE RELATED TO GRAIN FILLING IN RICE

By Pitsamai Chawankun

A Thesis Submitted in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree MASTER OF SCIENCE

Department of Biotechnology Graduate School

SILPAKORN UNIVERSITY 2007

บัณฑิตวิทยาลัย มหาวิทยาลัยศิลปากร อนุมัติใหวิทยานิพนธเรื่อง “การโคลนและการศึกษาคุณสมบัติทางพันธุศาสตรโมเลกุลของยีนที่เกี่ยวของกับการพัฒนาเปนเมล็ดในขาว” เสนอโดย นางพิศมัย ชวาลกุล เปนสวนหนึ่งของการศึกษาตามหลักสูตรปริญญาวิทยาศาสตรมหาบัณฑิต สาขาวิชาเทคโนโลยีชีวภาพ

……........................................................... (รองศาสตราจารย ดร.ศิริชัย ชินะตงักูร)

คณบดีบัณฑติวิทยาลัย วันที่..........เดอืน.................... พ.ศ...........

อาจารยที่ปรึกษาวิทยานิพนธ 1. ผูชวยศาสตราจารย ดร.บษุราภรณ งามปญญา 2. รองศาสตราจารย ดร.กัลยาณี จิรศรีพงศพันธ 3. ผูชวยศาสตราจารย ดร.เจษฎาวรรณ วิจติรเวชการ คณะกรรมการตรวจสอบวทิยานิพนธ .................................................... ประธานกรรมการ (ผูชวยศาสตราจารย ดร.พิมพชนก จตุรพิรีย) ............/......................../.............. ................................................... กรรมการ ............................................................กรรมการ (ผูชวยศาสตราจารย ดร.บุษราภรณ งามปญญา) (รองศาสตราจารย ดร.กัลยาณี จิรศรีพงศพันธ) ............/......................../.............. ............/......................../.............. .................................................... กรรมการ .................................................... กรรมการ (ผูชวยศาสตราจารย ดร.เจษฎาวรรณ วจิิตรเวชการ) (ดร.อรนุช ลีลาพร) ............/......................../.............. ............/......................../..............

ง

48401201 : สาขาวิชาเทคโนโลยีชีวภาพ คําสําคัญ : การออกดอกในขาว, การพัฒนาเปนเมล็ดในขาว, OsORFX พิศมัย ชวาลกุล : การโคลนและการศกึษาคุณสมบัติทางพันธุศาสตรโมเลกุลของยีนที่เกี่ยวของกับการพัฒนาเปนเมล็ดในขาว. อาจารยที่ปรึกษาวิทยานิพนธ : ผศ.ดร.บุษราภรณ งามปญญา , รศ.ดร.กัลยาณี จิรศรีพงศพันธ และ ผศ.ดร.เจษฎาวรรณ วจิิตรเวชการ. 85 หนา. งานวิจัยนี้มีวัตถุประสงคเพื่อโคลนและศึกษาลักษณะสมบัติของยีนที่อาจมีบทบาทสําคัญตอการออกดอกและพัฒนาเปนเมล็ดในขาว โดยเริ่มจากการโคลนลําดับนิวคลิโอไทดที่สมบูรณของ EST clone AU058193 (ไดจากการทํา EST microarray analysis ในชวงระหวางการออกรวงและพัฒนาเปนเมล็ดในขาว) ในรูปจีโนมิคดีเอ็นเอดวยเทคนิค PCR ซ่ึงจากการทดลองสามารถโคลนยีนในรูปจีโนมิคดีเอ็นเอที่มีความยาว 959 คูเบสได โดยไดตั้งชื่อตอมาภายหลังวา OsORFX และจากการวิเคราะหสายนิวคลิโอไทดของยีนที่โคลนไดพบวา ประกอบดวย 4 exons และ 3 introns ขณะที่การวิเคราะหดวยเทคนิค Southern ก็ไดแสดงใหเห็นวา ยีนดังกลาวนี้มีเพียง 1 copy ในจีโนมของขาว และจากการศึกษารูปแบบการแสดงออกของยีน OsORFX ในที่เกี่ยวของกับการพัฒนาทางลําตนและการสืบพันธุของขาวญี่ปุนในชวงระหวางการออกดอกและพัฒนาเปนเมล็ดในขาวนั้นก็พบวา ยีนมีการแสดงออกมากในชวงตนของการผสมเกสร(หลังดอกบานหนี่งวัน) หรือชวงระยะเริ่มแรกของการพัฒนาเปนเมล็ดและการแสดงออกของยีนจะลดลงเรื่อยๆ เมื่อพัฒนาจากดอกจนกลายเปนเมล็ดที่สมบูรณ นอกจากนี้ยังพบรูปแบบการแสดงออกของยีนที่คลายกันนี้ในขาวอินดิคาดวย ดังนั้นขอมูลทั้งหมดจึงอาจเปนสิ่งบงชี้ไดถึงความสําคัญของ OsORFX ที่มีผลตอการผสมเกสรของขาวและการพัฒนาเปนเมล็ดในชวงแรก ภาควิชาเทคโนโลยีชีวภาพ บัณฑิตวิทยาลัย มหาวิทยาลัยศิลปากร ปการศึกษา 2550 ลายมือช่ือนักศึกษา........................................ ลายมือช่ืออาจารยที่ปรึกษาวทิยานิพนธ 1. ....................... 2. ....................... 3. .......................

จ

48401201 : MAJOR : BIOTECHNOLOGY

KEY WORD : FLOWERING IN RICE, GRAIN FILLING OF RICE, OsORFX

PITSAMAI CHAWANKUN : CLONING AND MOLECULAR GENETIC CHARACTERI-

ZATION OF GENE RELATED TO GRAIN FILLING IN RICE. THESIS ADVISORS : ASST.PROF.

BUDSARAPORN NGAMPANYA, ASSOC. PROF. KALYANEE JIRASRIPONGPUN AND ASST.

PROF. JESDAWAN WICHITWECHAKARN, 85 pp.

The aims of this research were to clone and characterize gene which may play an

important role to flowering and grain filling in rice. The full length genomic nucleotide

sequence of EST clone AU058193 (obtained previously from EST microarray analysis during

flowering and grain filling in rice) was performed by using PCR technique. Genomic

nucleotide sequence of gene with 959 bp in length, named OsORFX was able to clone. The

analysis of nucleotide sequence of cloned gene contained 4 exons and 3 introns composed in

gene sequence, while the Southern analysis showed only one copy of the gene located on

rice genome. Additionally, the study of OsORFX expression pattern in vegetative and

reproductive parts of japonica rice during flowering and grain filling have found the high

expression of gene in early stage of pollination (one day after flowering) or the beginning of

grain filling. The expression level of gene was decreased in consecutively until the complete

seed was formed. Furthermore, the similar expression pattern of gene was also found in

indica rice. Inconclusion experimental data obtained here may indicate the importance of

OsORFX to the early stage of pollination and seed development in rice.

Department of Biotechnology Graduate School, Silpakorn University Academic Year 2007 Student's signature ........................................ Thesis Advisors' signature 1. ....................... 2. ....................... 3. .......................

ฉ

กิตติกรรมประกาศ

ผูวิจัยขอกราบขอบพระคุณ ผศ. ดร.บุษราภรณ งามปญญา อาจารยที่ปรึกษาการวิจัยที่กรุณาใหความอนุเคราะหในเรื่องขอมูล ความรู คําแนะนําตางๆ ที่เปนประโยชนและตรวจแกไขปริญญานิพนธฉบับนี้ใหมีความถูกตองและสมบูรณยิ่งขึ้น

ขอกราบขอบพระคุณ รศ.ดร.กัลยาณี จิรศรีพงศพันธ ผศ.ดร.เจษฎาวรรณ วิจิตรเวชการ ผศ.ดร. พิมพชนก จตุรพิรียและ ดร.อรนุช ลีลาพร ที่ใหความกรุณาเปนกรรมการในการสอบและตรวจแกไขปริญญานิพนธฉบับนี้ใหมีความถูกตองสมบูรณยิ่งขึ้น

ขอกราบขอบพระคุณคณาจารยประจําภาควิชาเทคโนโลยีชีวภาพ คณะวิศวกรรมศาสตร และเทคโนโลยีอุตสาหกรรม มหาวิทยาลัยศิลปากรทุกทาน ทีไ่ดมอบวิชาความรูและใหคําแนะนําที่เปนประโยชนตอการศึกษาวิจัยคร้ังนี ้

ขอขอบพระคุณ คุณฑิพาภรณ ทรัพยสมบูรณ และคณุประไพ บางเชย ที่อํานวยความสะดวกและใหความชวย เหลือในดานเครือ่งมืออุปกรณและสารเคมีที่ใชในการวิจยั

ขอขอบพระคุณ คุณอภิรพร ชาวปากน้ํา ทีใ่หความชวยเหลือในการศึกษาวิจยัคร้ังนี้ และคุณชวัล มนสัพล ที่ใหคําแนะนําตางๆ รวมทั้งนองๆ คณะวิศวกรรมศาสตรและเทคโนโลยีอุตสาหกรรมทุกคนที่ใหความชวยเหลือและกําลังใจในการทํางานมาโดยตลอด

สุดทายนี้ขอกราบขอบพระคุณ บิดามารดาและสามีที่ไดใหกําลังใจ และสนับสนุนปจจัยทางดานการศกึษามาโดยตลอด

ช

สารบัญ หนา บทคัดยอภาษาไทย .................................................................................................................... ง บทคัดยอภาษาอังกฤษ ............................................................................................................... จ กิตติกรรมประกาศ..................................................................................................................... ฉ สารบัญภาพ ............................................................................................................................... ซ บทที่ 1 บทนํา............................................................................................................................. 1 ความเปนมาและความสําคัญของปญหา ................................................................ 1 ความมุงหมายและวัตถุประสงคการศึกษา ............................................................. 3 ขอบเขตการศึกษา .................................................................................................. 3 2 เอกสารและงานวจิัยที่เกี่ยวของ...................................................................................... 4 การเจริญเติบโตและพัฒนาของตนขาว.................................................................. 4 โครงสรางของเมล็ดขาว ........................................................................................ 9 งานวิจยัที่เกีย่วของกับการพฒันาเปนเมล็ดขาวที่สมบูรณ...................................... 14 3 อุปกรณและวิธีการทดลอง ............................................................................................ 17 สารเคมีและอุปกรณที่ใชในการทดลอง ................................................................. 17 วิธีการทดลอง ........................................................................................................ 22 4 ผลการทดลองและวจิารณผลการทดลอง ....................................................................... 38 5 สรุปผลการทดลอง ........................................................................................................ 62 บรรณานุกรม .......................................................................................................................... 63 ภาคผนวก ............................................................................................................................... 66 ภาคผนวก ก ........................................................................................................... 66 ภาคผนวก ข........................................................................................................... 73 ภาคผนวก ค........................................................................................................... 77 ภาคผนวก ง ........................................................................................................... 79 ภาคผนวก จ ........................................................................................................... 81 การนําเสนอผลงานทางวิชาการที่เกี่ยวของกับวิทยานิพนธ ....................................................... 85 ประวัติผูวจิัย .............................................................................................................................. 86

ซ

สารบัญภาพ ภาพที ่ หนา 1 ลําดับนิวคลีโอไทดที่สมบูรณในรูป cDNA ของยีนที่โคลนได จาก EST clone AU058193 ................................................................................. 2 2 ลําดับกระบวนการงอกของเมล็ดขาว .................................................................. 5 3 การออกรวงของตนขาว ...................................................................................... 7 4 ลําดับภาพอธบิายการเปดและปดของดอกขาวในขณะดอกบาน ......................... 8 5 การพัฒนาของดอกไปเปนเมล็ดที่สมบูรณหลังการผสมเกสร............................. 9 6 โครงสรางของเมล็ดขาวกลองผาตัดตามยาว ....................................................... 10 7 โครงสรางเมล็ดขาวเปลือก.................................................................................. 11 8 เยื่อหุมชัน้นอก (pericarp) และ เปลือกเมล็ด (testa)............................................. 12 9 เอ็มบริโอ (embryo) หรือคัพภะ ........................................................................... 13 10 แผนที่ของpGEM®-T Easy Vector ..................................................................... 21 11 การยายแถบดีเอ็นเอไปยังเมมเบรน ..................................................................... 28 12 ลําดับนิวคลีโอไทดของไพรเมอรที่ใชในการเพิ่มปริมาณยีน 18s rRNA ............. 34 13 ลําดับนิวคลีโอไทดของไพรเมอรที่ใชในการเพิ่มปริมาณยีน OsORFX............... 35 14 ลําดับนิวคลิโอไทดที่สมบูรณของยีนทีไ่ดจาก EST clone AU058193 ในรูปของ cDNA ........................................................................................... 38 15 ผลที่ไดจากการทํา blast search แบบ blastn ของลําดับนิวคลิโอไทด ที่สมบูรณของยีนที่ไดจาก EST clone AU058193 ในรูปของ cDNA (Ngampanya, 2003) กับยนีอื่น ๆ ใน GenBank............................................... 39 16 ลําดับนิวคลีโอไทดที่เหมือนกันของ AP005002.3 กับลําดับนิวคลีโอไทด ที่สมบูรณของยีนที่ไดจาก EST clone AU058193 ในรูปของ cDNA ........... 41 17 การทํา sequence alignment ระหวางลําดับนิวคลิโอไทดที่สมบูรณของยีน ที่ไดจาก EST clone AU058193 ในรูปของ cDNA กับ AP005002.3 โดยใช Vector NTI Suite 6 ............................................................................. 43 18 ลําดับนิวคลิโอไทดที่สมบูรณของยีนทีไ่ดจาก EST clone AU058193 ในรูปของ genomic DNA ที่มีขนาด 1030 bp ที่ไดจากการทํานาย .............. 44 19 Gel electrophoresis ของ PCR product ที่ไดจากการทํา PCR โดยใช annealing temperature เปน 58 องศาเซลเซียส บน 1% agarose gel.. 45

ฌ

สารบัญภาพ (ตอ) ภาพที ่ หนา 20 Gel electrophoresis ของพลาสมิดจาก transformants ที่ไดรับการถายโอนยีน เมื่อตัดดวยเอนไซมตัดจําเพาะ EcoRI บน 1% อะกาโรสเจล ......................... 46 21 Gel electrophoresis ของ PCR product ที่ไดจาก transformants ที่คาดวามียีน ที่สนใจสอดแทรกอยู และเพิ่มปริมาณยนีดวยเทคนิค PCR............................. 47 22 ผลการเปรียบเทียบลําดับนวิคลิโอไทดในรูปของ genomic DNA (ORFX predict) ที่ไดมีการทาํนายโดยใช Vector NTI Suite 6 กับลําดับนิวคลิโอไทดที่ไดจากการ

สงพลาสมิดไปทํา sequencing เมื่อใช T7 เปน forward primer (T_7comp)และ SP6 เปน reward primer (T_SP6).................................................................... 50 23 ลําดับนิวคลิโอไทดที่สมบูรณของยีนทีไ่ดจาก EST clone AU058193 ในรูป ของ genomic DNA (OsORFX) ที่ไดจากการโคลนยีนที่มีขนาด 959 bp...... 50 24 ผลการเปรียบเทียบลําดับนวิคลิโอไทดในรูปของ genomic DNA (ORFX predict) ที่ไดมีการทาํนายโดยใช Vector NTI Suite 6 กับลําดับนิวคลิโอไทดที่ไดจาก การสงพลาสมิดไปทํา sequencing (OsORFX) และ cDNA sequence ที่สมบูรณ ของ EST AU058193 (cDNA AU058193)...................................................... 52 25 intron และ exon ของ OsORFX genomic DNA จากการทํา sequence alignment ระหวางลําดับนิวคลิโอไทด OsORFX genomic DNA และ cDNA sequence ที่สมบูรณของ EST AU058193 โดยใช Vector NTI Suite 6 Program .......... 54 26 ผลของการนําลําดับนิวคลิโอไทดที่สมบูรณของยีนทีไ่ดจาก EST clone AU058193 ในรูปของ genomic DNA (OsORFX genomic DNA)ไปเปรียบเทียบความเหมือน ลําดับนิวคลีโอไทดอ่ืนใน GenBank โดยใช Blastn ........................................ 55 27 Southern blot analysis ของ OsORFX ................................................................. 56 28 การแสดงออกของยีน OsORFX ในขาวระยะกอนออกรวง (before heading stage) และในระยะหลังออกรวง (after heading stage) .............................................. 57 29 การแสดงออกของยีน OsORFX ในขาวระยะระหวางการออกดอกและการพัฒนา เปนเมล็ดขาว (grain filling stage) ................................................................... 59 30 การแสดงออกของยีน OsORFX ในขาวหอมมะลิ 105 ในชวงระยะกอนออกรวง (before heading stage) และ ในระยะหลงัออกรวง (after heading stage) ......... 60

1

บทที่ 1 บทนํา

ความเปนมาและความสําคญัของปญหา

เปนที่ทราบกันโดยทั่วไปวาคุณลักษณะที่มีความสําคญัทางเศรษฐกจิของธัญพืชก็คือการใหผลผลิตและคุณคาทางโภชนาการที่สูง ซ่ึงก็รวมไปถึงคุณภาพการนํามาหงุตมดวย โดยการใหผลผลิตและคุณคาทางอาหารของธัญพืชจะขึ้นอยูกบักระบวนการสังเคราะหและสะสมคารโบไฮเดรต โปรตีน และแรธาตุตางๆ ที่เกิดขึ้นระหวางการพัฒนาไปเปนเมล็ดที่สมบูรณเปนหลัก มีรายงานการสะสมสารอาหารตางๆ ไดแก คารโบไฮเดรต โปรตีน และกรดไขมันในระหวางการพัฒนาของเมล็ดจะเกิดขึน้โดยอาศยักลไกตางๆ ซ่ึงสงผลตอคุณภาพของแปงในเมล็ดนั้นเกีย่วของกับการแสดงออกของยีนหลายชนิดดวยกันและเมือ่ไมนานมานีก้็ไดมีความพยายามเปนอยางมากที่จะศกึษาเพื่อใหเขาใจถงึความสัมพันธของการแสดงออกของยีนเหลานี้ในระหวางการพัฒนาเปนเมล็ดโดยอาศัยเทคนิค microarrays analysis มาชวยเปนตนวา มีการใช cDNA microarrays มาวิเคราะหรูปแบบการแสดงออกของยนีในระหวางการพัฒนาเปนเมล็ดของ Arabidopsis (Ruuska et al., 2002) และใช GeneChip microarray ที่ออกแบบใหครอบคลุมขอมูลทางพันธุกรรมบางสวนของจีโนมขาวที่มาคนหายนีตางๆในขาว (Zhu et al., 2003) โดย Zhu และคณะไดวนิิจฉยัยีนทีเ่กีย่วของกับกระบวนการพัฒนาเปนเมล็ดและพบวาการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวของกับวิถีตางกันถูกควบคมุอยางเชื่อมโยงใหเปนไปในแนวทางเดียวกนัระหวางการพัฒนาของเมล็ด แมวารูปแบบการแสดง ออกของยีนทีจ่ําเพาะตอกระบวนการพฒันาเปนเมล็ดไดถูกเปดเผยโดย Zhu และคณะ แตยีนที่มีบทบาทสําคัญตอการออกดอกของขาวในระยะ แรกๆ กย็งัไมมีการศึกษา ซ่ึงตอมาในป 2003 Ngampanya ไดรายงานการศึกษาบทบาทของยีนดังกลาวโดยทําการศกึษารูปแบบการแสดงออกของยีนในขาวครอบคลุมตั้งแตระยะแรกของการออกดอกไปจนถึงการพัฒนาเปนเมล็ดที่สมบูรณโดยใช EST microarray และไดกลาวรายงานวาในระยะแรกของการออกดอกและผสมเกสรมีการแสดงออกของ EST clones ที่คลายกับยีนในกลุมที่เกี่ยวของกับกลไกการปองกันตนเองของพืชเปนจํานวนมาก ซ่ึงก็สอดคลองกับงานวจิัยอ่ืนๆ ที่แสดงใหเห็นถึงการปองกันความเสียหายของเซลลเมื่อเกิดการสูญเสียน้ําอยางรวดเร็วเมื่อมีการผสมเกสรเกิดขึ้น และทีน่าสนใจมากในระยะนี้ก็คือ พบการแสดงออกของ EST clones ที่คลายกับยนีที่เกีย่วของกบัพัฒนาการของการสืบพันธุดวย คือ EST clone AU058193 ที่มีระดับการแสดงออกของยีนในสวนของ maternal tissue มากกวาสวนของ

2

filial tissue ประมาณสองเทาและยังมกีารแสดงออกที่สูงในชวงแรกของการออกดอก จากนั้นจึงลดระดับลงในเวลาตอมา นอกจากนี้ Ngampanya ยังพบวา predicted amino acid sequence ของยีนดังกลาวนัน้คลายกับยนีที่เกีย่วของกับชวงแรกของการออกดอกในพิทูเนีย (Guyon et al., 2000) และมะเขือเทศ (Frary et al., 2000) เปนอยางมาก ยิ่งไปกวานัน้ Ngampanya ไดศึกษาและทําการโคลนลําดับนิวคลิโอไทดทีส่มบูรณในรูป cDNA ของยีนดัง กลาวขึน้มาดังแสดงในภาพที่ 1 1 ATGTATCCCT CCGCCCCTCC CGACGCGTAT AACAAGTACA GCGCCGGTGC 51 TCCACCGACG GCGCCGCCGC CGGCAACGTA CCAGCTGCCG ACGATGAACA 101 CCCCACGCAC CGGCGGCGGG CTGACGCGAT GGTCCACCGG CCTTTTCCAC 151 TGCATGGACG ATCCCGGAAA CTGTCTCATC ACATGCGTGT GCCCCTGCAT 201 CACCTTTGGG CAGGTCGCTG ACATCGTGGA CAAGGGCACC TGCCCATGCC 251 TCGCGAGCGG GACGGCTTAC GCGCTCCTCT GCGCGTCGGG GATGGGGTGC 301 CTGTACTCGT GCTTCTACCG GTCCAAGATG AGGGCTCAGT TCGACCTGGA 351 CGAAGGGGAT TGCCCCGATT TCCTCGTCCA TTTCTGCTGC GAGTACTGCG 401 CGCTGTGCCA GGAGTACCGG GAGCTCAAGA ACCGCGGCTT CGACTTGGGG 451 ATCGGTTGGG CTGCCAATGT GGACAGGCAG AGGCGAGGCG TCACCGGAGC 501 GTCGGTGATG GGAGCTCCTG GCGTCCCGGT CGGCATGATG AGGTAGACGA 551 AGATGGCGAA CGCGAAATGG TGCGCTTTTG TGTTCTTGTG TTGCAATATG 601 TTCTCTGTGG TTTTCATTTG GAGATCACTG CCTATTTCAT GTATCGTATA 651 CTCCTATTTA GCTTGATTTG TTGGGTTTCA AAAAAAAAAA AAAAAA

ภาพที่ 1 ลําดับนิวคลิโอไทดที่สมบูรณในรูป cDNA ของยีนที่โคลนไดจาก EST clone AU058193 (Ngampanya, 2003) ลําดับนิวคลิโอไทดที่ขีดเสนใตแสดงโคดอนของการเริ่ม (ATG) และหยุด (TAG) การแปลรหัส อยางไรกต็าม ลําดับนิวคลิโอไทดที่สมบูรณของยีนในรูป genomic DNA คุณลักษณะตางๆ ของยีน เชน การหาจํานวน copy number ของยีนในจีโนมและการนําเอาลําดับนิวคลิโอไทดของ ยีนมาวิเคราะหในแงตางๆ ตลอดจนการศึกษาการแสดงออกของยีนยงัไมไดทําการวิเคราะหจากเหตุผลที่ไดกลาวมาขางตนจงึทําใหในการดําเนินการวิจยัในครั้งนีจ้ึงสนใจและมุงเนนที่จะศกึษาไปที่ลําดับนิวคลิโอไทดที่สมบูรณของยีนในรูป genomic DNA วิเคราะหคุณลักษณะตางๆ ของยีนที่โคลนไดและพรอมกับศึกษาการแสดงออกของยีนดังกลาวดวย

3

ความมุงหมายและวัตถุประสงคของการศึกษา 1. เพื่อโคลนลําดับนิวคลิโอไทดที่สมบูรณในรูป genomic DNA ของยีนที่เกีย่วของกับการออกดอกและพัฒนาเปนเมล็ดในขาวจาก EST clone AU058193 2. เพื่อศึกษาคุณลักษณะตางๆ ของยีนที่โคลนได 3. เพื่อศึกษารูปแบบการแสดงออกของยีนที่โคลนได ขอบเขตการศึกษา 1. ทํานายลําดับนิวคลิโอไทดที่สมบูรณของยีนทีไ่ดจาก EST clone AU058193ในรูปของ genomic DNA โดยใชลําดบันิวคลิโอไทดที่สมบูรณของยีนที่ไดจาก EST clone AU058193 ในรูปของ cDNA (Ngampanya, 2003) มาทํา BLAST search และทํา sequence alignment โดยใชโปรแกรม Vector NTI พรอมกับหาลําดับนิวคลิโอไทดที่สมบูรณของยีนที่ไดจาก EST clone AU058193 ในรูปของ genomic DNA โดยการทํา DNA sequencing 2. ศึกษาคุณลักษณะตางๆ ของยีน เชน การหาจํานวน copy number ของยีนในจีโนมโดยใชวธีิ Southern blot analysis 3. ศึกษาการแสดงออกของยีนจากตนขาวในระยะตาง ๆ ครอบคลุมตั้งแตระยะแรกของการออกดอกไปจนถึงการพัฒนาเปนเมล็ดที่สมบูรณและนํามาทํา semi-quantitative RT-PCR เพื่อศึกษาระดับการแสดงออกของยีน

4

บทที่ 2 เอกสารและงานวิจัยท่ีเก่ียวของ

1. การเจริญเติบโตและพัฒนาของตนขาว โดยธรรมชาติทั่วไปของตนขาวมีกระบวนการเจริญเติบโตและพัฒนาแบงได 3 ขั้นตอนหลักใหญๆ คอื ขั้นแรก vegetative growth หรือข้ันการเจริญเติบโตและพัฒนาทางลําตนจะเริ่มตั้ง แตระยะการงอกของเมล็ดออกจากคัพภะหรือเอ็มบริโอ (embryo) จนถึงระยะการใหกําเนดิชอดอกหรือรวงออน(initiation of panicle primordium) ขั้นที่สอง reproductive growth หรือข้ันการเจริญ เติบโตและพฒันาทางการสืบพันธุ จะเริ่มตั้งแตระยะการใหกําเนิดชอดอกหรือรวงออนจนถึงระยะขาวออกดอก (flowering stage) และขั้นที่สามซึ่งเปนขั้นที่สําคัญมากตอการใหผลผลิตที่มีคุณภาพ คือ grain filling / grain development /caryopsis development หรือ ขั้นการเจริญเติบโตและพัฒนาเปนเมล็ดจะเริม่ตั้งแตระยะขาวออกดอกและมีการสืบพันธุจนถึงเมล็ดสุกแกเต็มที่พรอมเก็บเกีย่วได (Hoshikawa, 1989; International Rice Research Institute, 2000; Wang and Li, 2005 ; บุญหงษ, 2004) ซ่ึงแตละขั้นตอนหลักใหญพบวามีระยะยอยที่สําคัญดังนี ้ 1.1 การเจริญเติบโตและพฒันาการทางลาํตน (vegetative growth and development) มีระยะที่เกี่ยวของ 2 ระยะ คือ 1.1.1 ระยะตนกลา (seedling stage) เปนระยะที่เร่ิมตั้งแตขาวงอกออกจากสวน embryo จนถึงเขาสูระยะแตกกอใชระยะเวลาประมาณ 20 วัน (ขึ้นอยูกับสายพนัธุ) ซ่ึงในระยะนี้จะพบการเปลี่ยนแปลงลกัษณะทางกายภาพที่เรียกวา germinated หรือ การงอกของเมล็ด (แสดงในภาพที่ 2) กระบวนการงอกของเมล็ดนัน้เริ่มจากสวนของฐานเมล็ด(lemma) และสวนที่เปน embryo ที่อยูภายในเริ่มบวมขึ้น ซ่ึงสังเกตไดจากเปลือกเมล็ดขาวเริ่มเคลื่อนที่แยกออกจากกันและพบสวนของ embryo โผลพนออกมาจากสวนของเปลือกเมล็ดขาวที่หอหุม ในขณะทีส่วนของ lemma จะแตก แยกออกจากกนัและพบสวนของใบออน (plumule) และรากแรกเกิด (radicle) เกิดขึน้(Hoshikawa, 1989) การงอกของเมล็ดขาวเปลือกสามารถเกิดขึ้นไดทัง้ในสภาวะที่มแีสงหรือสภาวะที่มีออกซิเจน (aerobic condition) และสภาวะทีไ่มมีแสงหรือไมมีออกซิเจน (anaerobic condition) ซ่ึงการงอกในสภาวะทีไ่มมอีอกซิเจนจะใชพลังงานที่ไดจากการหมกัมาใชในการงอกของเมล็ด (Moldenhaur and Gibbon, 2003) เมื่อนําเมล็ดขาวเปลือกเพาะในที่มีแสงสวางจะพบสวนของ radicle กอนโดยมีเปลือกหุม radicle (coleorhiza) หุมสวนของรากนีไ้วและในระยะตอมาสวนใบ

5

ของ plumule จึงงอกออกมา ในทางตรงขามหากนําเมล็ดขาวเปลือกเพาะในที่มืดกจ็ะพบสวนของตนออนงอกออกมากอนสวนของ radicle ซ่ึงมีปลอกหุมตนออน (coleoptile) หุมสวนของตนออนไว การงอกของตนกลาจะสามารถมองเห็นสวนของลําตนที่ยืดตวั (mesocotyl) ไดชัดเจน (บุญหงษ, 2004) รากแขนง (fibrous roots) จะแตกออกจากขอใตระดับดินของตนขาวเพื่อทดแทนรากแรกเกิดที่สลายตัวไป เมื่อปลอกหุมรากออนและปลอกหุมตนออนยืดตวัยาวถึงดินและผวิน้ําตามลําดับและจะเกิดใบที ่1 (McDonald, 1979) ตนขาวในระยะนี้จะพฒันาใบขึ้นมาจนถึงในที่ 5 และใชสารอาหารจากสวนแปง (endosperm) ของเมล็ดในระยะแรก ตอมาเมือ่รากสมบูรณก็หันไปใชสารอาหารจากดินเพื่อใชในการเจริญเติบโตแทน (บุญหงษ, 2004)

ภาพที่ 2 ลําดับกระบวนการงอกของเมล็ดขาว

ลักษณะการงอกของเมล็ดที่มีเปลือกหุมเมล็ด(ดานซาย) และเมล็ดไมมเีปลือกหุมเมลด็ (ดานขวา) เมื่อแชน้ําลึก 2 ซม. อุณหภูมิ 28 องศาเซลเซียส 1: 30 ช่ัวโมงของเมล็ดหลังแชน้ํา 2: 48 ช่ัวโมงของเมล็ดหลังแชน้ํา

3: 72 ช่ัวโมงของเมล็ดหลังแชน้ํา 4: 84 ช่ัวโมงของเมล็ดหลังแชน้ํา ที่มา : (Hoshikawa, 1989)

6

1.1.2 ระยะแตกกอ (tillering stage) เร่ิมจากระยะที่ตนขาวเริ่มมีการแตกกอ (primary teller) ออกมาจากตาขางลําตนที่อยูในซอกใบที่สองของตนหลัก (main culm) จนถึงระยะแตกกอสูงสุด (maximum tillering stage) ของตนขาว โดยปกติหนอแรกของตนขาวจะแตกออกภายหลัง ปกดําประมาณ 10 วันและตนขาวจะแตกกอสูงสุดเมื่อเร่ิมใหกําเนิดชอดอกหรือรวงออน (panicle initiation) ระยะแตกกอจะใชระยะเวลาประมาณ 30– 50 วันหลังจากระยะตนกลาขึ้นอยูกับการตอบ สนองตอชวงการรับแสงของพันธุขาว 1.2 การเจริญเติบโตและพฒันาการทางการสืบพันธุ (reproductive growth and development) มีระยะทีเ่กีย่วของ 4 ระยะ คอื 1.2.1 ระยะกําเนิดชอดอกหรือระยะการสรางรวงออน (panicle initiation stage) หลังจากแตกกอเต็มที่แลวก็จะเขาสูระยะสรางหรือพัฒนาชอรวงออนซ่ึงในระยะนี้จะเกดิไดนัน้ขึ้นอยูกับปจจัยหลักที่สําคัญ คือ การไดรับชวงแสงที่เหมาะสม (McDonald, 1979) ระยะนี้ตนกลาจะเปลี่ยน-แปลงจากตนที่มีลักษณะแบนกลายเปนลักษณะกลมอยางเห็นไดชัดและจะมกีารยดืปลอง (stem elongation) ในอัตรารวดเรว็และพบปลายสุดของลําตนขาวจะมีสามเหลี่ยมที่มีสีขาวปุยๆ เกดิขึ้นซึ่งประกอบดวย เยื่อกั้นน้ําฝน (ligules) และเขีย้วกันแมลง (auricles) (บุญหงษ, 2004 ; อรอนงค, 2007) 1.2.2 ระยะตั้งทอง (booting stage) เปนระยะที่ตนขาวมกีารพัฒนาจากการถือกําเนิดชอ-ดอกไปเปนรวงออนภายใตกาบใบธงที่หุมไว และตนขาวมีการยดืปลองอยางเหน็ไดชัดพรอมกับตรงกาบใบธงจะอวนพองขึน้ ระยะตั้งทองนี้จะใชเวลาประมาณ 5- 6 วันกอนออกรวง 1.2.3 ระยะออกรวง (heading stage) เปนระยะที่ชอดอกหรือรวงขาวโผลพนออกมาจากกาบใบธง (แสดงในภาพที่ 3) ในระยะนี้ตนขาวจะมกีารยดืปลองรองสุดทายจากปลายสุดของลําตนอยางสมบูรณกอน หลังจากนั้นปลองสุดทายก็จะมีการยดืตัวอยางรวดเร็วเพื่อดันใหรวงขาวโผลพนออกจากกาบใบธง (flag leaf) เมื่อรวงขาวสัมผัสกับอากาศภายนอก สวนของกลีบดอกใหญและ กลีบดอกเล็ก (lemma and paleas) ของดอกจะเปลี่ยนจากลักษณะที่นุมเปยกกลายเปนแข็งและแหง (Hoshikawa, 1989) 1.2.4 ระยะดอกบาน (flowering or anthesis stage) (Hoshikawa, 1989; บุญหงษ, 2004) เปนระยะเวลาการปดและเปดของดอกขาว (แสดงในภาพที่ 4) ซ่ึงโดยปกติจะใชเวลาประมาณ 1- 2.5 ช่ัวโมง ในระยะนี้กอนที่กลีบดอกใหญและกลีบดอกเล็ก (lemma and palea) จะเปดอาออก ชวงเวลา 10- 20 นาทีตอมาอับเรณู (anther) จากภายในดอกจะแตกและละอองเรณูจะหลุดจากอับเรณู (pollen sac) ไปตกบนยอดเกสรตัวเมยี และงอกเขาไปผสมกับไข 20- 30 นาทีหลังจากกลีบ-ดอกเปดอาก็จะเกดิการผสมตัวเอง (self-fertilization) อยางสมบูรณภายในดอกเดยีวกนัขึ้นซึ่งเกิด ขึ้นเปนสวนใหญในการสืบพันธุของขาว นอกจากนี้เมือ่กลีบดอกทั้งสองอาออกกานเกสรตัวผู

7

(filament) ก็จะยืดตัวออกใหอับละอองเรณโูผลพนออกมาจากกลีบดอก จึงทําใหละอองเรณูบาง สวนฟุงกระจายไปตกลงบนยอดเกสรตวัเมยีของดอกอื่นกอใหเกิดการผสมขาม (cross pollination) ไดบางไมเกิน 5% ในธรรมชาติ การออกดอกและการผสมพันธุของขาวโดยปกติจะ เกิดขึ้นในชวงเวลา 1- 3 วัน หลังการออกรวง โดยดอกทีอ่ยูสวนปลายรวงจะเปดปดกอน รวงขาวแตละรวงจะออกดอกครบสมบูรณทุกดอกภายใน 7- 10 วัน การผสมพันธุมักจะเกดิขึ้นภายในเวลาประมาณ 5 ช่ัวโมง (Oka, 1988) จากการศึกษาพบวาละอองเรณูสามารถมีชีวิตอยูไดนานประมาณ 5 นาที หลังหลุดออกจากอับเรณแูละยอดเกสรตัวเมียสามารถรอรับการตกของละอองเรณูไดนานประมาณ 3- 7 วัน นอกจากนั้นยอดเกสรตัวเมียยังสามารถทนตออุณหภูมิสูงไดดีกวาละอองเรณอีูกดวย (Moldenhauer and Gibbon, 2003)

ภาพที่ 3 การออกรวงของตนขาว ระยะกอนออกรวง (1) ระยะเริ่มออกรวง(2) ระยะดอกบาน (3) และลักษณะการยืดปลองของลําตนกอนออกรวง (ดานขวา) ที่มา : (Hoshikawa, 1989)

8

ภาพที่ 4 ลําดับภาพอธิบายการเปดและปดของดอกขาวในขณะดอกบาน (a- d) ที่มา : (Hoshikawa, 1989) 1.3 การเจริญเติบโตและพฒันาของเมล็ด (grain ripening and development) ระยะเวลาตั้งแตขาวออกดอกและ มีการผสมพันธุจนถึงชวงเมล็ดสุกแกเต็มที่พรอมที่จะเก็บเกี่ยวในชวงนี้เมล็ดจะเร่ิมมีน้ําหนกัเพิ่มขึ้นสีเปลือกของเมล็ดก็จะเปลี่ยนจากสีเขียวเปนสีฟางขาวหรือน้ําตาลและในขณะ เดียวกันใบขาวก็จะเปลี่ยนเปนสีเหลืองแหงไป และน้ําหนักเมล็ดทีเ่พิม่ขึ้นนั้นเพราะไดมีการลําเลียงอาหารแปงและน้ําตาลที่สะสมอยูในลําตนและกาบใบมายังเมล็ดโดยตรง (Hoshikawa, 1989; บุญหงษ, 2004) กอนที่เมล็ดจะพัฒนาสมบูรณสุกแกเต็มทีน่ั้นมีขั้นตอนการพัฒนาอยู 3 ระยะ (แสดงใน ภาพที่ 5) ไดแก ระยะน้ํานม (milky stage) ซ่ึงจะเกดิหลังการออกดอกประมาณ 8- 13 วัน เมล็ดในระยะแรกจะมแีปงใสเหลว (watery) และตอมาจะเพิ่มความขนมากขึ้น เมื่อผานระยะน้ํานมไปแลว ก็จะมาถึงระยะที่เปนเมล็ด (dough stage) ในชวงเวลาประมาณ 14- 25 วันหลังการออกดอก ในชวงนี้น้ําในแปงของเมล็ดจะคอยๆ ระเหยไปทําใหเมล็ดประกอบดวยเนื้อแปงสวนใหญแตไมแข็งตัวเต็ม ที่หลังจากนัน้ในระยะตอมาเมล็ดก็จะมพีัฒนามาเปนระยะเมล็ดสุกแก (maturity stage) ในชวงเวลา 25- 35 วันหลังขาวออกดอก ในการพัฒนาเปนเมล็ดขาวนั้นพบวาสวนของเปลือกหุมเมล็ด (hull) เนื้อของเมล็ด (endosperm) และสวนของ embryo จะเจรญิไปพรอมกันดวย โดยเริ่มจากการแบงเซลลในระหวาง 24 ชม. แรกหลังการผสมเกสรและเจรญิเติบโตเปนเยื่อหุมตนออน เยื่อหุมรากออนและใบเลีย้งในวันที่ 3 สวนตนออนและสวนอื่นๆ ภายในเยื่อหุมรากออนจะเจริญเตบิโตเมื่อเมล็ดมีอายุ 5 วัน ตอมาในวนัที่ 6 จะเหน็ทอน้ําทออาหารปรากฏขึ้นในที่สุด embryo ก็จะเจริญเติบโตเต็มที่ในวนัที่ 13 หรือ ไมเกิน 20 วนั (Hoshikawa, 1989)

9

ภาพที่ 5 การพัฒนาของดอกไปเปนเมล็ดที่สมบูรณหลังการผสมเกสร การพัฒนาของรังไขหลังการผสมเกสรขณะที่มีเปลือกหุมเมล็ดโดยการวิเคราะหดวย X-ray (ดานบน) และการพัฒนาของรังไขหลังการผสมเกสรโดยไมมีเปลือกหุมเมล็ด (ดานลาง) a : รังไขขณะดอกบาน b: 3 วันหลังดอกบาน (DAF) c: 6 DAF d: 25 DAF e: 45 DAF ที่มา : (Hoshikawa, 1989) 2. โครงสรางของเมล็ดขาว เมล็ดของขาว (rice fruit, rice grain, rice seed, caryopsis grain หรือ brown rice) ซ่ึงในทางพฤกษศาสตรเรียกวา ผล (fruit) ที่มีลักษณะเปนผลเดี่ยว (single fruit) เกดิจากรังไขอันเดียวชนิด ลอยตัว (superior ovary) ของดอกเดีย่วในแตละดอกยอยที่เกิดรวมกันอยูเปนชอดอกผลเดี่ยวนี้จะติดแนนอยูกับผนงัรังไขหรือเยื่อหุมผล (pericarp) ซ่ึงเมื่อผลสุกหรือแกจะเปนผลแหง (dry fruit) ที่ไมแตก (indehiscent fruit) หรือเมล็ดที่มีเยื่อหุมผล และเปลือกหุมเมล็ด (seed coat หรือ testa) เชื่อมรวมกันอยางแนบแนนรวมกนัโดยตลอดผลหรือเมล็ดขาว สวนดานขนาด รูปรางสี การมีหาง (awn) ไมมีหาง มีขนหรือไมมีขน เปลือกแข็ง จะมีลักษณะแตกตางไปตามสายพันธุ (Hoshikawa, 1989; Julino, 1993; บุญหงษ, 2004; อรอนงค, 2007) เมล็ดขาว (แสดงในภาพที่ 6) ประกอบดวย 3 สวนหลัก คือ สวนที่หอหุมเมล็ด (hull หรือ husk) สวนเนื้อผลหรือผลแท หรือขาวกลอง และสวนสุดทายคอื สวนของตนออนโดยมีรายละเอียดของ แตละสวนดังนี้

10

ภาพที่ 6 โครงสรางของเมล็ดขาวกลองผาตัดตามยาว ที่มา: http://concise.britannica.com/ebc/art-164/The-outer-layers-and-internal-structures-of-a-rice-grain

สวนที่หอหุมเมล็ด (แสดงในภาพที่ 7) ซ่ึงขาวกลองถูกหอหุมดวยกลีบดอกใหญ (lemma) และกลีบดอกเล็ก (palea) ทําใหเปนโครงสรางของเมล็ดขาวเปลือกที่สมบูรณ กลีบดอกทัง้สองชนิดนี้เมื่อแกเต็มทีจ่ะมีลักษณะเปนเนื้อไมที่คอนขางเปราะและประกอบดวยธาตุซิลิกาเปนจํานวนมาก(บุญหงษ, 2004) นอกจากนีส้วนหอหุมเมล็ดยังประกอบไปดวย ขนหาง (awn) ขั้วเมล็ด (rachilla) และกลีบรองเมล็ด (sterile lemmas) ซ่ึงเชื่อมตอกับกาน (pedicel) (Hoshikawa, 1989; Julino, 1993; บุญหงษ, 2004)

11

ภาพที่ 7 โครงสรางเมล็ดขาวเปลือก (structure of paddy) 1: เมล็ดขาวมองดานกลีบดอกใหญ 2 : เมล็ดขาวดานขางที่มีทั้งกลีบดอกใหญและเล็ก 3: เมล็ดขาวมองดานกลีบดอกใหญ 4 : เมล็ดขาวมองดานบน 5: เมล็ดขาวมองดานลาง 6 : เมล็ดขาวกลอง (Brown rice) 7 : กลีบดอกเลก็ (palea) 8 : กลีบดอกใหญ (lemma) 9 : ขั้วดอก (rachilla) 10 : กาบประดับดานบน (upper glume) 11 : กาบประดับดานลาง (upper glume) 12 : rudimentary glume 13 : เมล็ดขาวเปลอืกผาครึ่งตามยาว 14 : เมล็ดขาวเปลือกผาครึ่งตามขวาง ที่มา : (Hoshikawa, 1989)

12

สวนขาวกลองหรือเนื้อผล (แสดงในภาพที่ 6) เมื่อนําเมล็ดขาวกลองผาตัดตามยาวและศึกษาภายใตกลองจลุทรรศนจะพบวาชั้นนอกสุดของขาวกลองจะมีลักษณะเยื่อบางๆ เรียกวา เยื่อหุมชั้น- นอก (pericarp) (แสดงในภาพที่ 8) ซ่ึงเปนชั้นที่กําหนดสขีองขาวกลองเปนสีน้ําตาลออน ถัดจากเยื่อช้ันนอกเขาไปดานในจะเปนเยื่อช้ันกลางจํานวน 2 ช้ัน ไดแก เยื่อหุมเมล็ด (seed coat) และ นิวเซลลัส (nucellus) หุมคัพภะ (embryo) นอกจากนี้สวนของเนื้อแปงที่เรียกวา เอ็นโดสเปริ์มนั้น จะเปนองคประกอบสวนใหญประมาณ 83% ของขาวกลอง เอ็นโดสเปริ์มจะถูกหอหุมดวยเยื่อหุมช้ันใน (aleurone layer) และตัวเอ็นโดสเปริ์มเองจะประกอบดวยเซลลพาเรนไคมา (parenchyma cells) ที่มีผนังบางซึ่งบรรจุเม็ดแปง (compound starch granules) ไวเต็ม โดยมีโปรตีนแทรกอยูรอบนอกใกลๆกับเยื่อหุมชั้นอยู 3 ลักษณะ คือ ลักษณะกลมใหญ กลมเล็ก และเปนผลึกติดกนั (Hoshikawa, 1989; Julino, 1993; บุญหงษ, 2004)

ภาพที่ 8 เยื่อหุมชั้นนอก (pericarp) และ เปลือกเมล็ด (testa)

ซาย: ภาพแสดงตัดตามขวางของสวนเยื่อหุมชั้นนอก สวนเยื่อหุมชั้นนอกเปนเนื้อเยื่อบางและสวนเปลือกเมล็ดจะเปนเนื้อเยื่อหนา ขวา: ภาพตัดตามขวางแสดงสวนทอน้ําทออาหาร (vascular bundle) ที่มา : (Hoshikawa, 1989)

13

สวนของตนออนหรือคัพภะ (แสดงในภาพที่ 9) นั้นมีขนาดเล็กมาก ตั้งอยูตรงดานฐานของเมล็ดขาวกลองดานที่มีกลีบดอกใหญหุมไว คัพภะประกอบดวย สวนของใบออน (plumule) และสวนของรากแรกเกิด (radicle) โดยมีสวนของลําตนออนส้ันๆ (mesocotyl) เชื่อมอยูตรงกลางระหวางสวนของใบและรากดังกลาว สวนของใบจะถูกหอหุมดวยปลอกหุมตนออน (coleoptile) และสวนรากกจ็ะถูกหอหุมดวยกลุมของเนือ้เยื่อที่มีลักษณะออนนุมเรยีกวา ปลอกหุมรากออน (coleorhiza) ดานนอกสุดของคัพภะจะอยูตดิชั้นของเยื่อหุมชั้นใน สวนปลอกหุมตนออนนั้นจะถูกลอมรอบดวยช้ันของเซลลที่มีช่ือวา สคิวเทลลัม (scutellum) และ อีพิบลาสต (epiblast) (Hoshikawa, 1989; Julino, 1993; บุญหงษ, 2004)

ภาพที่ 9 เอ็มบริโอ (embryo) หรือคัพภะ 1: เอ็มบริโอตัดแนวตั้ง 2: เอ็มบริโอตัดตามขวาง 3 : ดานหนาของเอ็มบริโอ ที่มา : (Hoshikawa, 1989)

14

3. งานวิจัยท่ีเก่ียวของการพฒันาเปนเมล็ดขาวที่สมบูรณ ขั้นตอนสําคัญในการเปลี่ยนแปลงดอกขาวไปสูการเปนเมล็ดและผลของขาวที่สมบูรณนั้นจะเร่ิมตั้งแตการออกดอกและผสมเกสร (Chen et al., 2001) โดยการออกดอกจะเริ่มจากการที่ละอองเรณูที่แกเต็มซ่ึงหลุดออกจากอับเรณูแลวถูกพาหะ ซ่ึงไดแก ลม แมลง นก คางคาว หรือพาหะอื่นนําพาไปตกอยูบนยอดเกสรเพศเมีย (stigma) ซ่ึงจะมีของเหลวคอยดกัจับเรณไูวเมือ่มีสภาพเหมาะสมละอองเรณูจะงอกและมีการเจริญของทอเรณูเพื่อเขาไปผสมกับเซลไข (egg cell) (Wolters-Arts et al., 1998) ในชวงนีจ้ะเกิดการสะสมของ RNA โปรตีน และโมเลกุลขนาดเล็ก เชน flavonols (FI) ซ่ึงเปนองคประกอบเฉพาะที่มีอยูในพืชมีสวนสําคัญตอการเจริญของละอองเรณูและทอเรณูซ่ึงไดมีรายงานไวในขาวโพดและพิทูเนยี (Mo et al., 1992; Ylstra, 1994) โดยถาพืชขาดองคประกอบชนิดนีจ้ะทําใหเปนหมัน (Mo et al., 1992) เนื่องจากไมมกีารเจริญของละอองเรณูและไมมีการเจริญของทอเรณู (Ylstra, 1994) นอกจากนีย้ังมีรายงานวายีนจํานวน 10% ของยีนทั้งหมดที่มีอยูประมาณ 20,000 ยีน จะมีการแสดงออกในระหวางที่มีการพัฒนาไปเปนละอองเรณู (Willing and Mascarenhas, 1984; Willing et al., 1998) หลังจากที่ละอองเรณูเกิด การแบงตัวแบบไมโทซิสครั้งแรกจะมีการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวของกับละอองเรณ ู โดยจะมีการ transcription ไปเปน mRNA และมีการ translation ตอไปในระหวางทีม่ีการเจริญ (Mascarenhas, 1990) ซ่ึงการควบคุมการเจริญของละอองเรณูและการผสมเกสรใหเปนไปในเวลาที่เหมาะสมจะชวยพัฒนาการสรางผลและเมล็ด และภายหลังการเกิดการผสมเกสร (ปฏิสนธิ) จะมีการสรางและพัฒนาไปเปนเมล็ดซึ่งเปนการบงบอกคุณลักษณะที่ดีของขาว ซ่ึงขาวสายพันธุที่ดีจะใหปริมาณของผลผลิตที่สูงและมีคุณคาทางโภชนาการสูง การใหผลผลิตและคุณคาทางโภชนาการที่สูง ซ่ึงก็รวมไปถึงคุณภาพการนํามาหุงตมดวย โดยการใหผลผลิตและคุณคาทางอาหารของธัญพืชจะขึ้นอยูกับกระบวนการสังเคราะหและสะสมคารโบไฮเดรต โปรตีน และแรธาตุตางๆ ที่เกิดขึน้ระหวางการพัฒนาไปเปนเมล็ดที่สมบูรณเปนหลัก ขณะที่คณุภาพในการนํามาหุงตมจะขึ้นอยูกบัการทํางานรวมกันของเอนไซมหลายชนิดเพื่อใหไดโครงสรางที่สมบูรณของแปงทั้งในระดับโมเลกุลและ การสรางเม็ดแปง การควบคมุกระบวนการดังกลาวใหดําเนินไปอยางเหมาะสมจึงสําคัญเปนอยางมากตอการปรบัปรุงคุณคาทางอาหารของธัญพืชชนิดตางๆ (Mazur et al., 1999 ; Ye et al., 2000) มีรายงานการสะสมสารอาหารตางๆ ไดแก คารโบไฮเดรต โปรตีน และกรดไขมันในระหวางการพัฒนาของเมล็ดจะเกิดขึ้นโดยอาศัยกลไกตางๆ ซ่ึงสงผลตอคุณภาพของแปงในเมล็ดนั้นเกีย่วของกับการแสดงออกของยีนหลายชนิดดวยกนัและเมื่อไมนานมานี้ก็ไดมคีวามพยายามเปนอยางมาก ที่จะศึกษาเพื่อใหเขาใจถึงความสัมพันธของการแสดงออกของยีนเหลานี้ในระหวางการพัฒนาเปนเมล็ด และเทคนิคหนึ่งที่นํามาใชในการศกึษาก็คือ microarrays ซ่ึงเปนเทคนิคที่มีประโยชนเปน

15

อยางมากตอการศึกษารูปแบบการแสดงออกของยีนเปนจาํนวนมากไดในคราวเดยีวกนั (Eisen and Brown, 1999 ; Schena et al., 1995) โดยใชอารเอ็นเอที่สกัดไดจากตวัอยางเดยีวกัน ทาํใหลดปญหาความยุงยากที่เกิดขึ้น เมื่อตองการเปรียบเทยีบการแสดงออกของยีนตางๆ จากตัวอยางเดียวกัน ซ่ึงเดิมนั้นตองศกึษาทีละยนีแลวจึงนําผลที่ไดมาเปรียบเทียบกัน ยิ่งไปกวานั้นความสําเร็จของโครง การหารหัสทางพันธุกรรมของพืชชนิดตางๆ เปนตนวา Arabidopsis (Arabidopsis genome initiative, 2000) และขาว (Goff et al., 2002) ในระดับจีโนมทําใหเกิดความเปนไปไดในการนําเอา microarrays analysis มาชวยในการหาบทบาทหนาที่และการแสดงออกของยีนจํานวนมากเหลานั้นได มีการใช cDNA microarrays มาวิเคราะหรูปแบบการแสดงออกของยีนในระหวางการพัฒนาเปนเมล็ดของ Arabidopsis (Ruuska et al., 2002) และใช GeneChip microarray ที่ออกแบบใหครอบคลุมขอมูลคร่ึงหนึ่งของรหัสพันธุกรรมของจีโนมขาวที่มีการเผยแพร (ประมาณ 21000 ยีน) มาคนหายนีตางๆในขาว (Zhu et al., 2003) โดย Zhu และคณะไดวินจิฉัยยีนทีเ่กี่ยวของกับกระบวนการพัฒนาเปนเมล็ดและพบวาการแสดงออกของยีนที่เกีย่วของกับวิถีตางกนัถูกควบคุมอยางเชื่อมโยงใหเปนไปในแนวทางเดียวกนัระหวางการพัฒนาของเมล็ด นอกจากนีย้ังพบวามกีารทํางานประสานกันระหวาง promoter element ที่ทราบชนิดในยีนที่ถอดรหัสให seed storage proteins กับกลุมของ transcription factor ตางๆ ซ่ึงผลที่ไดแสดงใหเห็นถึงกลไกสาํคัญในการควบคุมและชีใ้หเห็นถึงแนวทางในการที่จะดัดแปลงวิถีตางๆ ไดโดยการจัดการกับ regulatory element สําคัญๆ เพื่อปรับปรุงคุณภาพและปรมิาณของเมล็ด อยางไรกต็าม แมวารูปแบบการแสดง ออกของยีนทีจ่ําเพาะตอกระบวนการพฒันาเปนเมล็ดไดถูกเปดเผยโดย Zhu และคณะ แตยีนที่มีบทบาทสําคัญตอการออกดอกของขาวในระยะแรกๆ กย็ังไมมีการศึกษา ซ่ึงตอมาในป 2003 Ngampanya ไดรายงานการศกึษาบทบาทของยีนดังกลาวโดยทําการ ศกึษารูปแบบการแสดงออกของยนีในขาวครอบคลุมตั้งแตระยะแรกของการออกดอกไปจนถึงการพัฒนา เปนเมล็ดที่สมบูรณโดยใช EST microarray โดยสกัดอารเอ็นเอจากสวนของเมล็ดขาวอายุ 0 (ใชทั้งเมล็ด) 3 และ 6 วัน (แบงเปนสวนครึ่งลางของเมล็ด สวนครึ่งบนของเมล็ด และเปลอืกหุมเมล็ด) และ 10 และ 14 วัน หลังการผสมเกสร (แบงเปนสวนเพอริคารพ เอนโดสเปริ์ม และเปลือกหุมเมล็ด) แลวนําไปติดฉลากดวยฟลูออเรสเซนต และติดตามการแสดงออกของยีนเปาหมาย (EST clones ของขาวประมาณ 9,000 clones) แลวนําผลการทดลองมาวิเคราะหและทํา Blast search เพื่อหารูปแบบการแสดงออกของยีนที่จาํเพาะตอเนื้อเยื่อตางๆ โดยพบวา ในระยะแรกของการออกดอกและผสมเกสรมีการแสดงออกของ EST clones ที่คลายกับยีนในกลุมที่เกี่ยวของกบักลไกการปองกันตนเองของพืชเปนจํานวนมาก ซ่ึงกส็อดคลองกับงานวิจยัอ่ืนๆ ที่แสดงใหเหน็ถึงการปองกนัความเสียหายของเซลลเมื่อเกิดการสูญเสียน้ําอยางรวดเรว็เมื่อมีการผสมเกสรเกิดขึ้น และที่นาสนใจ

16

มากในระยะนีก้็คือ พบการแสดงออกของ EST clones ที่คลายกับยีนทีเ่กี่ยวของกับพฒันาการของการสืบพันธุดวย คือ EST clone AU058193 ที่มีระดับการแสดงออกของยีนในสวนของ maternal tissue มากกวาสวนของ filial tissue ประมาณสองเทาและยังมีการแสดงออกที่สูงในชวงแรกของการออกดอก จากนั้นจึงลดระดับลงในเวลาตอมา นอกจากนี้ Ngampanya ยังพบวา predicted amino acid sequence ของยีนดังกลาวนั้นคลายกับยีนทีเ่กี่ยวของกับชวงแรกของการออกดอก ในพิทูเนีย (Guyon et al., 2000) และมะเขอืเทศ (Frary et al., 2000) เปนอยางมาก ยิ่งไปกวานัน้ Ngampanya ไดศึกษาและทําการโคลนลําดับเบสที่สมบูรณในรูป cDNA ของยีนดังกลาวขึ้นมา และพบวายีนจาก EST clone AU058193 (Ngampanya, 2003) ที่แสดงความเหมือนกบัยีน ORFX ของมะเขือเทศคอนขางมาก โดยยนี ORFX เกี่ยวของกบัการแบงเซลลของคารเปลและมีความ สัมพันธกับขนาดใหญและเล็กของผลมะเขือเทศ ตรวจพบการแสดงออกในระยะแรกที่มีการพัฒนาของดอกและมีโครงสรางคลายกับ human oncogene (Frary et al., 2000) ซ่ึงตรวจพบระดับการแสดงออกที่สูงของ ORFX และ rice EST AU058193 ในสวนของ maternal tissue ในมะเขือเทศและขาวตามลาํดับทําใหเกิดการตั้งสมมุติฐานวา เปนไปไดหรือไมวา rice EST AU058193 เปนสวนหนึ่งของยนีทีม่ีบทบาทและหนาที่เชนเดยีวกับ ORFX ในมะเขือเทศ ซ่ึงถาเปนเชนนัน้ ยีนดังกลาวก็ควรที่จะมีความสําคัญตอการพัฒนาเปนเมล็ดในขาว โดยมันอาจเกี่ยวของกับกระบวนการผสมเกสรและการปฏิสนธิในดอก หรืออาจเกี่ยวของกับการแบงเซลลในระหวางการสรางเมล็ด จากเหตุผลที่ไดกลาวมาขางตน จึงทําใหในการดําเนินการวิจยัในครัง้นี้จึงสนใจและมุงเนนที่จะศกึษาไปที่ลําดบัเบสที่สมบูรณของยีนในรูป genomic DNA ศึกษาคุณลักษณะตางๆ ของยีนที่โคลนไดและพรอมกับศึกษาการแสดงออกของยีนดงักลาวดวย

17

บทที่ 3 อุปกรณและวิธีการทดลอง

สารเคมีและอุปกรณ 1. สารเคมีท่ีใชในการทดลอง สารเคมีและ reagent ที่ใชในการศึกษาเปนสารเคมีที่ใชศึกษาในระดับ molecular biology grade สารเคมี บริษัทผูผลิต Agar Bacteriological Scharlau Chemie Agarose Gibco BRL Ampicillin (C6H18NaN3SO4) Fluka Absolute ethanol Mallinckrodt Bacto tryptone Scharlau Chemie Bacto yeast extract Scharlau Chemie Bromophenol blue Fluka β-mercaptoethanol SIGMA Calcium Chloride (CaCl2) Fluka Chloroform (CHCl3) Lab Scan CTAB (Cetyl triethylammonium bromide) Sigma Deoxynucleotide-5’-triphosphate (dNTP) BIO-RAD DNA Ladder 1kb Fermentas DNA Ladder 1kb NEB Ethanol (C2H5OH) Mallinckrodt Ethidium bromide Fluka Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA, C10H16N2O8) Fluka Glacial acetic acid (CH3COOH) Anala R Glycerol Invitrogen Hydrochloric acid (HCl) Lab Scan Isoamyl alcohol Merck

18

Liquid Nitrogen (N2) Mastertax Litium Chloride (LiCl) Merck N,N-Dimethylformamide Fluka Magnesium dichloride (MgCl2) Fluka Maleic acid Fluka 2-mercaptoehanol Sigma 3-(N-morpholino)propanesulphonic acid (MOPs) Sigma Oligo dT(12-18) Invitrogen ORFX Forward primer Invitrogen ORFX Reward primer Invitrogen Phenol AMRESCO Sodium acetate (C2H3NaO2) Riedel-de Haen Sodium chloride (NaCl) Fluka Sodium dodecyl sulfate (SDS, C12H25NaSO4) Fluka Sodium hydroxide (NaOH) Lab Scan Tris base AMRESCO Tris-HCl Lab Scan HiYield TM Gel / PCR Extraction Kit Real Biotech DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I Roche 2. เอนไซมท่ีใชในการทดลองและแหลงท่ีมา เอนไซมที่ใชในการทดลองนี้เปนสารเคมทีี่ใชศึกษาในระดับ molecular biology grade เอนไซม บริษัทผูผลิต Taq DNA Polymerase (recombinant) Fermentas T4 DNA ligase Promega PvuII Fermentas SacII Fermentas BamHI Fermentas EcoRI Fermentas PstI Fermentas

19

3. เคร่ืองมือและบริษัทผูผลิตเครื่องมือ เคร่ืองมือ/อุปกรณ บริษัทผูผลิต Cuvette Starna® Gel document SYNGENE Hot plate Hot plate (Framo-Geratetechnik D-7821

Eisenbach Hochschwaxzwald 1) Incubator Scientific Promotion Microcentrifuge Gibthai :MPW-52 Microcentrifuge LABNET INTERNATIONAL Micropipette GILSON, BIO-LAD Microwave Microwave (Tubora TRX248G), Korea Shaker Super Line : SP-KR Spectrophotometer Spectronic Instrument : Spectronic Genesys 8 Vortex Scientific industries : vortex-genie 2 Water bath Eyela shaker water bath : Model ss-820 เครื่องชั่ง 2 และ 4 ตําแหนง Sartorius Basic BA20015 Precisa XT1200C,

Switzerland เครื่องผลิตน้ํา milliQ ELGA (Maxima LS. Model), UK เครื่องผลิตน้ํากลั่น ELGA (Reservoir75 : LC136), UK เครื่อง PCR PERKIN ELMER:GeneAmp PCR System 2400 ตูเย็น Whirlpool เครื่องวัดความเปนกรด-ดาง pH Meter CG840 Cyber500 Type S201B หมอนึ่งฆาเชื้อจุลินทรีย Autoclave ‘Tomy-SS325’Tomy KogyoCo., Ltd

3-14-17, Togara, Nerimaku, Tokyo Japan Hybond nylon membrane Hybond TM -N+ amersham Parafilm Pechiney Plastic Packing (M) กระดาษกรอง Whatman 3 MM

HindIII Fermentas EcoRV Fermentas

20

4. พืชทดลอง เมล็ดขาว ในงานวิจยันีใ้ชเมล็ดขาว (Oryza sativa L.) ชนดิ Japonica พันธุ Nipponbareไดมาจากหองปฏิบัติการของ Prof. Juniji Yamaguchi, Division of Biological Science, Hokkaido University, Japan และ ชนิด Indica พันธุขาวดอกมะลิ 105 (KDML 105) ไดมาจากศูนยวิจยัขาวปทุมธานี สถาบันวิจยัขาว กรมวิชาการเกษตร กระทรวงเกษตรและสหกรณ 5. เชื้อแบคทีเรียและอาหารเลี้ยงเชื้อ เชื้อแบคทีเรีย Escherichia coli สายพันธุ DH5α ที่เจริญอยูในอาหารเหลว LB medium (Luria Bertani ; 1% tryptone, 0.5% yest extract และ 1% Nacl หรือ LB Agar ; 1.5% agar) อาหารเลี้ยงเชื้อสําหรับใชในการคัดเลือกเซลลลูกผสม (transformant cells) คือ LB medium ที่เติมยาปฏิชีวนะ (antibiotic) ซ่ึงยาปฏิชีวนะที่ใชในการทดลองนี้คือ amplicillin ที่มีความเขมขน 100 ไมโครกรัมตอไมโครลิตร สภาวะที่ใชในการเจริญของเชื้อที่ 37 องศาเซลเซียสขามคืน และเก็บรักษาเชื้อที่เจริญที่ 4 องศาเซลเซียส เปนเวลา 2- 3 สัปดาห สําหรับการเกบ็เชื้อไวเปน stock cultures ใชสภาวะแชแขง็โดยนําเชื้อแบคทีเรียที่เจรญิใน LB medium ที่เจริญถึงขั้น exponential phase ปริมาตร 500 ไมโครลิตร กับ 40% glycerol ที่ผานการไรเชื้อแลว 500 ไมโครลิตร ผสมกันในอัตรสวน 1 : 1 แลวเก็บที่ -80 องศาเซลเซียส 6. ไพรเมอรท่ีใชในการทดลอง

6.1 ไพรเมอรสําหรับโคลนลําดับนิวคลิโอไทดที่สมบูรณของยีนที่ไดจาก EST clone AU058193 ในรูปของ genomic DNA คือ

ORFX Forward primer ซ่ึงมีลําดับนิวคลิโอไทด ดังนี ้5’ ATG TAT CCC TCC GCC CCT 3’

และ ORFX reward primer ซ่ึงมีลําดับนิวคลิโอไทด ดังนี้ 5’ TAG GCA GTG ATC TCC AAA TG 3’

6.2 ไพรเมอรสําหรับตรวจสอบการแสดงออกของยีน คือ 18s Forward primer ซ่ึงมีลําดับ นิวคลิโอไทด ดังนี ้

5’ AAC TAG CTA TGC GGA GCC AT 3’ และ18s reward primer ซ่ึงมีลําดับนิวคลิโอไทด ดังนี ้

5’ AGG TTC AAT GGA CTT CTC GC 3’ และ ORFX Forward และ ORFX Reward primer

21

7. พลาสมิดสําหรับการโคลนยีน พลาสมิด pGEM-T Easy (บริษัท Promega, สหรัฐอเมริกา) ประกอบดวยโปรโมเตอร T7 และ SP6 ควบคุมการแสดงออกของยีน LacZ และตานทานตอยาปฏิชีวนะ amplicillin ดังแสดงใน ภาพที่ 10

ภาพที่ 10 แผนที่ของ pGEM®-T Easy Vector ขนาด 3015 bp

ที่มา : http://www.promega.com/figures

22

วิธีการทดลอง

1. การเตรียมพืชทดลอง ลางทําความสะอาดเมล็ดขาวชนิด japonica พันธุ Nipponbare แลวเพาะโดยแชในน้ําเปน

เวลาประมาณ 2 สัปดาห โดยเปลี่ยนน้ําใหมทุกวัน จากนัน้นําปลูกในดนิ ที่รดน้ําดวยอาหารเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชสูตร MS (Murashing and Skoog, 1962) ที่เจือจาง 10 เทา เพือ่เตรียมตนพืชสําหรับศึกษาการแสดงออกของยีนในระยะตางๆ ระหวางการออกดอกและพัฒนาเปนเมล็ดที่สมบูรณ

2. การโคลนลําดับนิวคลิโอไทดท่ีสมบูรณของยีนจาก EST clone AU058193 ในรูป genomic DNA 2.1 การสกัดดเีอ็นเอจากพืชทดลอง นําตนขาวอายปุระมาณ 2 สัปดาหมาสกัด genomic DNA ดวยวิธี CTAB ดัดแปลงซึ่งมีขั้นตอนดังนี้ นําตนออนขาวมาทําการบดดวยไนโตรเจนเหลว ใสสารละลาย extraction buffer (1M Tris-HCl pH8.0, 0.5 M NaCl, CTAB และ β-mercaptoethanol) ปริมาตร 500 ไมโครลิตร และ 20% SDS ปริมาตร 40 ไมโครลิตร ในโกรงเย็น จากนั้นนําไปบมที่อุณหภูมิ 65 องศาเซลเซียสนาน 10 นาที เติม chloroform : isoamylalcohol (24 : 1) ขนาดปริมาณเทากับสารละลายผสมใหเขากัน นําไปหมนุเหวี่ยงตกตะกอนที่ 10,000 รอบตอนาที นาน 15 นาที ดูดสวนใส (supernatant) ใสลงใน eppendorf ใหม จากนั้นเติม 3M CH3COONa ปริมาตร เทากับ 1/10 ของสารละลายสวนใสที่ไดผสมใหเขากัน แลวเติม Absolute ethanol ปริมาตร 2 เทาของสารละลายสวนใส ผสมใหเขากัน โดยพลิกหลอดกลับไปมาเบาๆ เพื่อใหตะกอนดีเอ็นเอพันเปนเกลียว นําไปหมุนเหวีย่งที่ 10,000 รอบตอนาที นาน 10 นาที เทสารละลายทิ้งเก็บตะกอน (pellet) แลวลางตะกอนดวย 70% ethanol หมุนเหวีย่งตกตะกอนที่ 10,000 รอบตอนาที นาน 10 นาที หลังจากนัน้ทําตะกอนใหแหงภายใตสุญญากาศ (vacuum dry condition) นาน 5 นาที หรือปลอยแหงดวยอากาศ แลวนําตะกอนละลายดวยน้ํา milli Q ที่ผานการไรเชื้อแลว 20 ไมโครลิตร เก็บดีเอ็นเอที่ไดที่ - 20 องศาเซลเซียส 2.2 การทํานายลําดับนิวคลิโอไทดท่ีสมบูรณของยนีในรปู genomic DNA 2.2.1 การทํา Blast search นําเอาลําดับนิวคลิโอไทดที่สมบูรณของยีนที่ไดจาก EST clone AU058193 ในรูปของ cDNA (Ngampanya, 2003) มาทํา Blast search แบบ Nucleotide-nucleotide blast (BlastN) เพื่อหาความเหมือน (homology) ของลําดับนิวคลิโอไทดกับยนีอื่นๆ ที่อยูใน GenBank ผาน website http://www.ncbi.nih.gov

23

2.2.2 การทํา sequence alignment ทําการคัดเลือกขอมูลของยีนตางๆ ทีไ่ดจากการทํา Blast search และแสดงความเหมือนกับลําดบันิวคลิโอไทดของยีนที่ไดจาก EST clone AU058193 ในรูป cDNA(Ngampanya, 2003) มากที่สุดมาทํา alignment ดวยโปรแกรม Vector NTI เพื่อทํานายลําดับนิวคลิโอไทดที่สมบูรณของยนีที่ไดจาก EST clone AU058193 ในรูป genomic DNA 2.3 การโคลนยีนในรปู genomic DNA จาก EST clone AU058193 โดยวิธี PCR การโคลนยีนโดยใชเทคนิค PCR ทําโดยการนําเอา genomic DNA ที่สกัดจากตนออนขาว อายุ 2 สัปดาหมาเปนแมแบบ (template) และใช ORFX forward และ ORFX reward เปนคูไพร-เมอรสําหรับเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอของยีนเปาหมายดังรายละเอียดตอไปนี้คือ การเตรียม reaction mixture ทําไดดังนี้คือ เติมสวนที่เปนบัฟเฟอร (10x PCR buffer 1+ KCl – MgCl2) ปริมาตร 2 ไมโครลิตร 25 mM MgCl2 ปริมาตร 2 ไมโครลิตร นิวคลิโอไทด (10 mM dNTP mix) ปริมาตร 0.2 ไมโครลิตร 20 μM ORFX forward และ 20 μM ORFX reward primer แตละชนดิปริมาตรละ 0.2 ไมโครลิตร และสวนเอนไซม 5 unit/ul Taq DNA polymerase (บริษัท Fermentas เยอรมัน) ปริมาตร 0.2 ไมโครลิตร และเติมน้ํา milli Q จนครบปริมาตรสุดทายคือ 20 ไมโครลิตร ผสมกันเบาๆ นาํไป spin down แลวใสในเครื่อง DNA thermal cycle : GeneAmp PCR System 2400 (บริษัท Perkin Elmer สหรัฐอเมริกา) เพิ่มปริมาณดีเอ็นเอโดยตั้งโปรแกรมดังนี ้

โปรแกรมที่ 1 (initial denaturation) ที่ 95 องศาเซลเซียส 5 นาที 1 รอบ โปรแกรมที่ 2 (denataration) ที่ 94 องศาเซลเซียส 30 วินาที 30 รอบ (annealing) ที่ 58 องศาเซลเซียส 30 วินาที (extension) ที่ 72 องศาเซลเซียส 1 นาที โปรแกรมที่ 3 (extension) ที่ 72 องศาเซลเซียส 7 นาที ที่ 4 องศาเซลเซียส ∞ นําผลิตภัณฑที่ไดจากการทํา PCR มาตรวจสอบโดยวิธีอิเลคโตโฟลีซีสบน 1% อะกาโรสเจล เปรียบเทียบขนาดของดีเอ็นเอกับ 1 kb DNA ladder marker (บริษัท Bio-Labs สหรัฐราชอาณาจักร)

24

2.4 การสกัดแถบดีเอ็นเอที่ตองการจากเจลโดยใช HiYield TM Gel / PCR Extraction Kit นําชิ้นดีเอน็เอที่สังเคราะหไดจากกระบวนการ PCR มาทําบริสุทธิ์ดวย HiYield TM Gel / PCR Extraction Kit (บริษัท Real-Biotech ไตหวนั) เร่ิมจากการตัดเจลตรงตําแหนงของดีเอ็นเอที่ตองการใสหลอด eppendorf แลวเติม 500 ไมโครลิตรของ DF buffer ลงในหลอดตวัอยางผสมใหเขากันดวย vortex จากนัน้นาํไปบมที่อุณหภูมิ 55 องศาเซลเซียส นาน 10 นาทีหรือจนเจลละลายหมดในระหวางการบมทําการ vortex ทุกๆ 2-3 นาที นํา DF column ใสใน collection tube ขนาด 2 มิลลิลิตร แลวนําสารละลายจากขัน้กอนหนานี้เทใสใน DF column นําไปหมุนเหวีย่งดวยความเรว็ 8,000 รอบตอนาที นาน 30 วินาที เทสารละลายที่ผานลงมาจาก column ทิ้ง จากนั้นเติม Wash buffer ปริมาตร 500 ไมโครลิตรลงใน DE column นําไปหมุนเหวีย่งดวยความเรว็ 8,000 รอบตอนาที นาน 30 วินาที เทสารละลายที่ผานลงมาจาก column ทิ้ง แลวนําไปหมุนเหวีย่งดวยความเรว็ 14,000 รอบตอนาที นาน 2 นาที ยาย DF column ใสในหลอด eppendorf ใหมแลวเตมิ Elution buffer หรือ น้าํ milli Q ที่ผารการไรเชื้อแลว ปริมาตร 15 – 30 ไมโครลิตร (ขึ้นอยูกับความเขมของแถบดีเอ็นเอบนเจล) ใสตรงกลางของ DF membrane ตั้งทิ้งไวประมาณ 2 นาที แลวนําไปหมุนเหวีย่งดวยความเร็ว 10,000 รอบตอนาที เปนเวลา 2 นาที เก็บสารลายดีเอ็นเอที่ elute ไดไวที่อุณหภูมิ – 20 องศาเซลเซียส

2.5 การเตรียม competent E. coli strain DH5α เล้ียงแบคทีเรีย E. coli สายพันธุ DH5α ลงบนอาหาร LB agar บมเชื้อขามคืนที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส ถายเชื้อ E. coli สายพันธุ DH5α จํานวนหนึ่งโคโลนีจากจานเพาะเชื้อนําไป เล้ียงตอในอาหาร LB broth 3 มิลลิลิตร บมเชื้อขามคืน เขยาดวยความเร็วรอบ 250 รอบตอนาที ภายใตอุณหภมูิ 37 องศาเซลเซียส เพื่อเพิม่ปริมาณเชื้อใหมากขึ้นโดยนําไปเลี้ยงตอใน flask ที่มีอาหาร LB broth 20 มิลลิลิตร บมเชื้อเขยาดวยความเร็วรอบ 250 รอบตอนาที ภายใตอุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เปนเวลา 3 ช่ัวโมงหรือใหมีคา OD 600 ประมาณ 0.5 จากนั้นแบงถายเชื้อลงในหลอด centrifuge แลวหมุนตกตะกอนเซลลที่ 7000 รอบตอนาทีที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส นาน 10 นาที เทอาหารทิ้ง จากนัน้ resuspend ตะกอนเซลลดวย 0.1 M CaCl2 ที่เย็น ปริมาตร 10 มิลลิลิตร แลวแชในน้ําแข็งเปนเวลา 20 นาที หมุนเหวี่ยงตกตะกอนเซลลที่ 7000 รอบตอนาที ที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส นาน 5 นาที จากนั้น resuspend ตะกอนเซลลดวย 0.1 M CaCl2 ที่เย็น ปริมาตร 1 มิลลิลิตร แบงใสหลอด eppendorf หลอดละ100 ไมโครลิตร เก็บที่อุณหภูมิ – 80 องศาเซลเซียส

25

2.6 การเชื่อมตอ (ligation) ยนีกับพลาสมิดเวคเตอร เตรียมสารละลายตางๆ ใหมปีริมาตรสุดทาย 5 ไมโครลิตร ดังนี้คือ ใส 2x Rapid Ligation Buffer ปริมาตร 2.5 ไมโครลิตร, pGEM-TEasy Vector ปริมาตร 0.5 ไมโครลิตร, PCR product 1 ไมโครลิตร, T4 DNA Ligase ปริมาตร 0.5 ไมโครลิตร และเติมน้ํา milli Q ที่ผานการไรเชื้อแลวปริมาตร 0.5 ไมโครลิตร ผสมสารตางๆ ใหเขากัน แลวนําไปบมขามคืนที่ 4 องศาเซลเซียส 2.7 การนําดีเอ็นเอสายผสมเขาสูเซลลเจาบานดวยวิธี heat shock การนําดีเอ็นเอสายผสมเขาสูเซลลเจาบาน ( transformation) ในการทดลองนี้ใชวิธีของ Sambrook et al., 1989 ซ่ึงมีขั้นตอนดังนี้ ผสม ligation products ปริมาตร 5 ไมโครลิตร และcompetent cell ปริมาตร 50 ไมโครลิตร ผสมดีดเบาๆ หามใชปเปตตดดูขึ้นลง จากนัน้แชในน้ําแขง็เปนเวลา 30 นาที นําไปใหความรอนที่อุณหภูมิ 42 องศาเซลเซียส นาน 1 นาทีแลวยายแชในอางน้ําแข็งทันทีเปนเวลา 2 นาที จากนั้นเติมอาหาร LB broth ปริมาตร 486 ไมโครลิตร นําไปบมที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเปนเวลา 1-2 ช่ัวโมง จากนั้นปเปตตสารละลายเซลลที่ไดนั้น ปริมาตร 150 ไมโครลิตร spread เชื้อลงบนอาหาร LB agar plate ที่มียาปฏิชีวนะ ampicillin 2.8 การสกัดพลาสมิดของแบคทีเรียดวยวิธี rapid alkaline lysis คัดเลือกโคโลนีของเชื้อแบคทีเรียที่เจริญอยูใน LB agar plates + ยาปฏิชีวนะ ampicillin นําไปเลี้ยงตอในอาหาร LB broth + ยาปฏิชีวนะ ampicillin ปริมาตร 3 มิลลิลิตรบมเชื้อขามคืนที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส บนเครื่องเขยาจนเชื้อเจริญถึงระยะ log phase ( ประมาณ 16 ช่ัวโมง) จากนั้นนําเชื้อแบคทีเรียที่ไดไปหมุนเหวีย่งดวยความเรว็ 15000 รอบตอนาที เปนเวลา 1 นาทีแลวเทอาหารทิ้ง จากนั้นละลายตะกอนเซลลที่ไดดวย ice-cold solution I (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA) ปริมาตร 150 ไมโครลิตร ผสมสารละลายดวยการ vortex แลวเติม solution II (0.4 N NaOH, 2% SDS) ที่เตรียมใหมทุกครั้งปริมาตร 200 ไมโครลิตร ผสมใหเขากนัโดยพลิกหลอดกลบั ไปมาหลายๆ คร้ังแลวเติม ice-cold solution III (3M potassium acetate, 5M glacial acetic acid) ปริมาตร 150 ไมโครลิตร ผสมใหเขากันโดยพลิกหลอดทดลองกลับไปมา 10 วินาท ี จากนั้นนําสารละลายที่ไดแชในน้ําแข็งเปนเวลา 5 นาที จากนั้นนําไปหมุนเหวีย่งดวยความเรว็ 15000 รอบตอนาที เปนเวลา 5 นาที ที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส ดูดสารละลายสวนใสลงใน eppendorf ใหม แลวเติมสารละลาย phenol/chloroform (1/1) ปริมาตรเทากับสารละลายสวนใส ผสมใหเขากนัดวยการ vortex นําไปหมุนเหวีย่งดวยความเรว็ 15000 รอบตอนาที นาน 10 นาที จากนัน้นาํสารละลายสวนบนซึ่งมีพลาสมิดดีเอ็นเออยูมาตกตะกอนดวย Absolute ethanol ปริมาตรเปน 2.5 เทาของสาร-

26

ละลายที่อุณหภูมิหอง แลวนําไปหมุนเหวี่ยงดวยความเร็ว 15000 รอบตอนาที นาน 10 นาที เทสารละลายสวนบนทิ้ง ลางตะกอนดวย 70% ethanol ปริมาตร 500 ไมโครลิตร แลวนําไปหมุนเหวีย่งดวยความเร็ว 15000 รอบตอนาที นาน 10 นาที เทสารละลายทิ้ง ทําใหตะกอนแหง หลังจากนั้นละลายตะกอนดวย น้ํา milli Q ที่ผานการไรเชื้อแลว ปริมาตร 50 ไมโครลิตร 2.9 การตรวจสอบชิ้นดีเอ็นเอที่โคลนดวยการตัดดวยเอนไซมตัดจําเพาะ นําพลาสมิดที่สกัดไดจากแตละโคโลนีของเชื้อแบคทีเรียที่เจริญอยูใน LB agar plates + ยาปฏิชีวนะ ampicillin มาตรวจสอบชิ้นดีเอน็เอที่สนใจทีแ่ทรกอยูใน pGEM T-Easy Vector โดยทําการเตรียม reaction mixture โดย 1 reaction มีปริมาตรรวมสุดทาย 20 ไมโครลิตร ซ่ึงสวนประกอบ ของสารแตละชนิดดังนี้ เติมสวนที่เปนบัฟเฟอร (10x buffer EcoRI ปริมาตร 2 ไมโครลิตร) , สวนของเอนไซมตัดจําเพาะ EcoRI (บริษัท Promega, สหรัฐอเมริกา) ปริมาตร 0.5 ไมโครลิตร และสวนของพลาสมิดที่สกัดไดปริมาตร 3 ไมโครลิตรแลวเติมน้าํ milli Q ที่ผานการไรเชื้อแลวจนครบปริมาตร สุดทาย ผสมกันเบาๆ นําไป spin down นําไปบมที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส 3 ช่ัวโมงหรือบมขามคืน ตรวจสอบชิ้นดีเอ็นเอที่โคลนไดโดยวิธีอิเลคโตโฟลีซีสบน 1% อะกาโรสเจล เปรียบเทียบขนาดของดีเอน็เอกับ 1 kb DNA ladder marker (บริษัท Bio-Labs, สหรัฐราชอาณาจักร) 2.10 การหาลําดับนิวคลิโอไทดของยีนในรปู genomic DNA หลังจากตรวจสอบพบวามียนีที่สนใจในพลาสมิดที่สกัดไดจากโคโลนขีองเชื้อแบคทีเรียที่ผานการ transformation แลวจึงสงพลาสมิดที่สกัดไดดังกลาวไปหา sequence ที่ BIOSERVICE UNIT (BSU service) โดยใช T7 เปนโปโมเตอรของเสน forward และ ใช SP6 เปนโปโมเตอรของเสน reward เพื่อใชหาลําดบันิวคลิโอไทดที่สมบูรณของยีนในรูป genomic DNA หลังจากไดขอมูลลําดับนิวคลิโอไทดของยีน ทั้งสวนลําดบันิวคลิโอไทดของเสน T7 เปนโปรโมเตอรของเสน forward และลําดับนวิคลิโอไทดของเสน SP6 เปนโปรโมเตอรของเสน reward มาวิเคราะหดวยโปรแกรมคอมพิวเตอร Vector NTI Suite 6 เปรียบเทียบความเหมือนและความแตกตางของลําดับนิวคลิโอไทด เพื่อหาลําดับนิวคลิโอไทดของยีนที่สมบูรณที่โคลนไดจาก EST clone AU058193 ในรูป genomic DNA

27

3. การศึกษาคุณลักษณะตางๆ ของยีนในรปู genomic DNA จาก EST clone AU058193 3.1 การวิเคราะห Sequence 3.1.1 การหาสวนของ intron และ exon ของยีน นําลําดับนิวคลิโอไทดที่สมบูรณของยีนทีไ่ดจาก EST clone AU058193 ในรูปของ genomic DNA มาเทียบกับลําดับนิวคลิโอไทดของยีนในรูปของ cDNA (Ngampanya, 2003) โดยใชโปรแกรมคอมพิวเตอร Vector NTI Suite 6 3.2.2 การเปรียบเทียบความเหมือนของลําดับนิวคลีโอไทดกับขอมูลใน GenBank นําลําดับนิวคลิโอไทดของยีนในรูปของ genomic DNA ที่โคลนไดจาก EST clone AU058193 ที่ไดไปหาความเหมือนกับขอมูลอ่ืนที่มีใน GenBank ดวยโปรแกรม Blastn ผาน web site http://www.ncbi.mln.nih.gov/ 3.2 การตรวจสอบยีนโดยใชเทคนิค Southern blotting และ hybridization 3.2.1 การตัดดวยเอนไซมจําเพาะ นํา genomic DNA ของตนออนขาวที่มีปริมาตร 7 ไมโครกรัมมาตัดดวยเอนไซม ตัดจําเพาะ (restriction enzyme) คือ PvuII , SacII, EcoRV, EcoRI, BamHI, PstI และ HindIII บมขามคืนที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส หลังจากนั้นทําการ Inactivate การทํางานของเอนไซมตัดจําเพาะ ดังนี้ เอนไซมตัดจําเพาะ PvuII, BamHI และ PstI ให inactivate ที่อุณหภมูิ 80 องศาเซลเซียส นาน 20 นาที สวนเอนไซมตัดจําเพาะ SacII, EcoRI , HindIII และ EcoRV ให inactivate ที่อุณหภมูิ 65 องศา-เซลเซียส นาน 20 นาที กอนนําผลไปตรวจสอบแถบดีเอ็นเอโดยวิธีอิเลคโตโฟรีซีสบน 0.8 % อะกาโรส 3.2.2 การถายดีเอ็นเอที่ตองการตรวจสอบไปบนแผนไนลอน นาํแผนเจลที่ไดลางดวยน้ํา milli Q ที่ผานการฆาเชื้อแลว 2 คร้ัง แลวนําแผนเจลแชในสารละลาย depurination solution (0.125 M HCl) เขยาเบาๆ นาน 10 นาที ลางเจลดวยน้าํ milli Q ที่ผานการไรเชื้อแลว 1 คร้ัง ทําใหดีเอน็เอเปลี่ยนสภาพโดยแชใน denaturing buffer (1.5 M NaCl + 0.5 NaOH) เขยาเบาๆ นาน 30 นาที ลางเจลดวยน้ํา milli Q ที่ผานการฆาเชื้อแลว 1 คร้ัง แชเจลลงใน neutralization buffer (1.5 M NaCl + 1M Tris-HCl, pH 7.4) เขยาเบาๆ นาน 30 นาที เพื่อปรับสภาพเจลใหเปนกลาง ในระหวางรอใหเตรียมอุปกรณเพื่อทําการ blotting ดังแสดงในภาพที่ 11

28

มีรายละเอียดดังนี้ นําปลายสองดานของกระดาษกรอง 3MM ที่ใชเปนสะพานในการสงผานดีเอ็นเอจุมลงใน 6X SSC (Tri-Sodium citrate + NaCl, pH 7.8) ตัดแผน Hybond nylon membrane (บริษัท amersham, สหราชอาณาจกัร) ใหมีขนาดเทากับแผนเจลที่ตองการ blot จากนั้นวางแผนเจลลงบน กระดาษกรองที่ชุมดวย 6X SSC ระวังอยาใหมีฟองอากาศ วางแผน Hybond nylon membrane ลงบนเจลระวังอยาใหมฟีองอากาศ วางกระดาษกรอง 3 MM ซ่ึงมีขนาดเทากับแผนเจลประมาณ 5- 6 แผนลงบนแผน Hybond nylon membrane วางกระดาษทชิชูลงบนกระดาษกรอง แลววางอุปกรณที่มีน้ําหนกัวางทับลงบนกระดาษกรองหมัน่เปลี่ยนทิชชูบอยๆ ทิ้งไว 1 คืน ทําเครื่องหมายทีแ่ผน Hybond nylon membrane แลวแยกออกจากแผนเจล นําแผนไนลอนไปลาง 5 นาทีในน้ํา milli Q ที่ผานการไรเชื้อ ปลอยใหแหงดวยอากาศ หลังจากนัน้ตรึงดีเอ็นเอใหอยูบนเมมเบรนในตู oven ที่อุณหภูมิ 80 องศาเซลเซียส นาน 2 ช่ัวโมง จากนั้นนําไป hybridize กบั probe ที่เตรียมไว หรือเกบ็ไวที่ 4 องศาเซลเซียส จนกวาจะใช hybridize

ภาพที่ 11 การยายแถบดเีอน็เอไปยังเมมเบรน (DNA transfer to membrane) ที่มา: http://openlearn.open.ac.uk/mod/resource/view.php?id=172575

3.2.3 การเตรียมยีนตดิตาม การเตรียมยีนตดิตามโดยใชเทคนิค PCR ทําโดยการนําเอาพลาสมิดของ pGEM T-

Easy Vector ที่มียีน OsORFX ในรูป genomic DNA แทรกอยูที่สกัดไดจาก E.coli สายพันธุ DH5α มาเปนแมแบบ (template) และใช ORFX forward และ ORFX reward เปนคูไพรเมอรสําหรับเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอของยีนติดตามดังรายละเอยีดตอไปนี้คือ การเตรียม reaction mixture ทําไดดังนี้คือ เติมสวนที่เปนบัฟเฟอร (10x PCR buffer 1+ KCl– MgCl2) ปริมาตร 4 ไมโครลิตร, 25 mM MgCl2 ปริมาตร 4 ไมโครลิตร, นิวคลิโอไทด (10 mM dNTP mix) ปริมาตร 0.4 ไมโครลิตร, 20 μM ORFX forward และ 20 μM ORFX reward แตละชนดิปริมาตรละ 0.4 ไมโครลิตร และสวนเอนไซม 5 unit/ul Taq DNA polymerase (บริษัท

29

Fermentas เยอรมัน) ปริมาตร 0.4 ไมโครลิตร และเติมน้ํา milli Q จนครบปริมาตรสุดทายคือ 20 ไมโครลิตร ผสมกันเบาๆ นาํไป spin down แลวใสในเครื่อง DNA thermal cycle : GeneAmp PCR System 2400 (บริษัท Perkin Elmer สหรัฐอเมริกา) เพิ่มปริมาณดีเอ็นเอโดยตั้งโปรแกรมดังนี ้

โปรแกรมที่ 1 (initial denaturation) ที่ 95 องศาเซลเซียส 5 นาที 1 รอบ โปรแกรมที่ 2 (denataration) ที่ 94 องศาเซลเซียส 30 วินาที 35 รอบ (annealing) ที่ 58 องศาเซลเซียส 30 วินาที (extension) ที่ 72 องศาเซลเซียส 1 นาที โปรแกรมที่ 3 (extension) ที่ 72 องศาเซลเซียส 7 นาที ที่ 4 องศาเซลเซียส ∞ นําผลิตภัณฑที่ไดจากการทํา PCR มาตรวจสอบโดยวิธีอิเลคโตโฟลีซีสบน 1% อะกาโรสเจล เปรียบเทียบขนาดของดีเอ็นเอกับ 1 kb DNA ladder marker (บริษัท Bio-Labs สหรัฐราชอาณาจักร) จากนั้นนําชิ้นดีเอ็นเอที่สังเคราะหไดจากกระบวนการ PCR มาทําบริสุทธิ์ดวย HiYield TM Gel / PCR Extraction Kit (บริษัท Real-Biotech ไตหวนั) ดังรายละเอียดในขอ 2.4 3.2.4 การติดฉลากยีนติดตาม (gene probe) ดวย Dig (Digoxigenin) การติดฉลากยนีติดตามดวย DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I (บริษัท Roche เยอรมนั) มีขั้นตอนดงันี้ นํายนีติดตามที่ elute ไดจากเจลความเขมขน 1ไมโคร- กรัมใสใน eppendorf จากนัน้เติมน้ํา milli Q ที่ผานการไรเชื้อใหมีปริมาตรรวม 16 ไมโครลิตร จากนั้นทาํการเปลี่ยนสภาพดเีอ็นเอ (denature DNA) โดยนําไปบมที่ 95 องศาเซลเซียส นาน 10 นาที แลวทําใหเยน็ลงทันทีในน้ําแข็ง จากนั้นจึงเติม DIG High Prime (50 μl DIG High Prime, 5X Conc. Labeling mixture containing optical concentrations of random primers, nucleotides, DIG-dNTP (alkali-label), Klenow enzyme and buffer components) ปริมาตร 4 ไมโครลิตร ผสมใหเขากันนําไปบมทีอุ่ณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส นาน 3 ช่ัวโมง หรือบมขามคืน และทําการหยุดปฏิกิริยา โดยเติม 0.2 M EDTA pH 8.0 ปริมาตร 2 ไมโครลิตร ซ่ึงสุดทายแลวจะมีปริมาตรรวม 22 ไมโคร- ลิตร 3.2.5 การวัดประสิทธิภาพของยีนติดตามที่ติดฉลาก ทําการเจือจาง DIG-labeled gene probe และ DIG-labeled control DNA (5μg/ml pBR328 DNA (linearized with Bam HI) ) ใหมีความเขมขนเปน 1 นาโนกรัมตอไมโครลิตร แลวทําการเจือจางอีกครั้งตามตารางที่ 1

30

จากนั้นหยดสารละลายที่เจือจางไวจากหลอดที่ 2-9 ของทั้ง DIG-labeled gene probe และ DIG-labeled control DNA ลงบนแผนไนลอนโดยทํา cross linking ดวย oven นําแผนไนลอนดังกลาวใสกลองพลาสติกแลวเติม 20 ml Maleic acid buffer (0.1 M Maleic acid, 0.15 M NaCl pH 7.5 ที่ 20 oC) นําไปเขยาบนเครื่องเขยา 2 นาที ที่ 15-25 องศาเซลเซียส เทสารละลายทิ้งแลวเติม Blocking solution (เจือจาง 10X Blocking solution ในอัตราสวน 1:10 ดวย Maleic acid buffer) ปริมาตร 10 มิลลิลิตร นําไปเขยาเบาๆ บนเครื่องเขยา 30 นาที เทสารละลายทิ้ง แลวเตมิสารละลาย Antibody solution (หมุนเหวีย่ง Anti-Digoxigenin-AP 5 นาที ที่ 10,000 รอบตอนาที ดูดเอาสาร- ละลายที่ผิว จากนั้นเจือจาง Anti-Digoxigenin-AP 1:5000 (150 mU/ml) ดวย Blocking solution) ปริมาตร 10 มิลลิลิตร นําไปเขยาเบาๆ บนเครื่องเขยานาน 30 นาที เทสารละลายทิ้ง จากนั้นทาํการลางแผนไนลอนใน washing buffer 2 คร้ังๆ ละ 15 นาที เทสารละลายทิ้ง เติมสารละลาย Detection buffer (0.1 M Tris – HCl, 0.1 M NaCl, pH 9.5 (20 องศาเซลเซียส )) ปริมาตร 10 มิลลิลิตรนําไปเขยาบนเครื่องเขยา 2-5 นาที เทสารละลายทิ้ง จากนั้นนําแผนไนลอนใสในถุงพลาสติก แลวเติม color substrate solution (เติม NBT/BCIP stock solution ปริมาตร 200 ไมโครลิตร ลงไปใน Detection buffer ปริมาตร 10 มิลลิลิตร) ปริมาตร 10 มิลลิลิตร ทําการปดผนึกถุง แลวนําไปบมในที่มืด โดยไมมกีารเขยาประมาณ 30 นาทีถึง 1 ช่ัวโมง โดยจับเวลาที่แถบดีเอ็นเอขึ้นแลวเปรียบเทยีบคาความเขมขนในตารางที่ 2 จากนั้นทาํการหยุดปฏิกิริยาโดยการเติม 50 มิลลิลิตร ของ น้ํา milli Q หรือ TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 8.0) ทําการบันทึกภาพ 3.2.6 การ hybridization การทํา prehybridization โดยนําแผนไนลอนที่ไดรับการ transfer DNA จากตัวอยางที่ทําการทดลองใสลงใน ถุงพลาสติก แลวเติม preheat DIG Easy Hyb Granules 10 มิลลิลิตร ปดผนึกถุง แลวนาํไปบมใน Hybridization oven ที่อุณหภูมิ 42 องศาเซลเซียส นาน 30 นาที การทํา hybridization โดยเตมิ denature DIG – labeled DNA probe (นํา DIG-labeled DNA probe; ยนีติดตามผลที่ติดฉลากดวย Dig ความเขมขนประมาณ 25 นาโนกรัมตอมิลลิลิตรไปตมนาน 5 นาที แลวแชในน้าํแข็งทันท)ี ที่เตรียมไวแลวประมาณ 3.5 มิลลิลิตร ตอ 100 ตารางเมตรของแผนไนลอน ความเขมขนของ probe ประมาณ 51.136 นาโนกรัมตอมิลลิกรัม ลงในแผน ไนลอนที่ผานการ prehybridization ผสมใหเขากนัแลวนําไปบมขามคืนใน Hybridization oven ที่อุณหภูมิ 42 องศาเซลเซียส

31

3.2.7 การตรวจสอบสัญญาณบนแผนไนลอน หลังจากทํา hybridization แลวเทสารละลายทิ้งแลวนําแผนไนลอนลางใน 2X SSC, 0.1% SDS 2 คร้ังๆ ละ 5 นาที นําไปเขยาบนเครื่องเขยาทีอุ่ณหภูมิหอง เทสารละลายทิ้ง แลวลางซ้ําอีกดวย 0.5X SSC , 0.1% SDS 2 คร้ังๆ ละ 15 นาที บมใน Hybridization oven ที่อุณหภูมิ 68 องศา-เซลเซียส เทสารละลายทิ้ง นําแผนไนลอนที่ผานการลางเติม washing buffer (0.1 M Maleic acid, 0.15 M NaCl pH 7.5 , 0.3% (v/v) Tween 20) ใหทวมแผนไนลอนเขยาเบาๆ บนเครื่องเขยาที่อุณหภูมิหอง นาน 5 นาที เทสารละลายทิ้ง แลวเติม Blocking solution (เจือจาง 10X Blocking solution ในอัตราสวน 1:10 ดวย Maleic acid buffer) ปริมาตร 100 มิลลิลิตร นําไปเขยาเบาๆ บนเครื่องเขยา 30 นาที เทสารละลายทิ้ง แลวเตมิสารละลาย Antibody solution (หมุนเหวีย่ง Anti-Digoxigenin-AP 5 นาที ที่ 10,000 รอบตอนาที ดูดเอาสารละลายที่ผิว จากนั้นเจือจาง Anti-Digoxigenin-AP 1:5000 (150 mU/ml) ดวย Blocking solution) ปริมาตร 20 มิลลิลิตร นําไปเขยาเบาๆ บนเครื่องเขยานาน 30 นาที เทสารละลายทิ้ง จากนัน้ทําการลางแผนไนลอนใน washing buffer 2 คร้ังๆ ละ 15 นาที เทสารละลายทิ้ง เติมสารละลาย Detection buffer (0.1 M Tris – HCl, 0.1 M NaCl, pH 9.5 (200C))ปริมาตร 20 มิลลิลิตรนําไปเขยาบนเครื่องเขยา 2-5 นาที เทสารละลายทิ้ง จากนั้นนําแผนไนลอนใสในถุงพลาสติก แลวเติม color substrate solution (เติม NBT/BCIP stock solution ปริมาตร 200 ไมโครลิตร ลงไปใน Detection buffer ปริมาตร 10 มิลลิลิตร) ปริมาตร 10 มิลลิลิตร ทําการปดผนึกถุง แลวนําไปบมในที่มืดโดยไมมีการเขยาจนกระทั่งเห็นแถบดีเอ็นเอ จากนั้นทาํการหยุดปฏิกิริยาโดยการเติม 50 มิลลิลิตร ของ น้ํา milli Q หรือ TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 8.0) ทําการบนัทึกภาพ ตารางที่ 1 การเจือจางยีนติดตามที่ติดฉลาก (Dilution series) ดวย DNA Dilution Buffer

Tube DNA (μl) From tube #

DNA Dilution Buffer (vial 3) (μl)

Dilution Final concentration

1 2 Diluted original

1 ng/ μl

2 15 1 198 1:100 10 pg/ μl

3 5 2 35 1:3.3 3 pg/ μl

4 5 2 45 1:10 1 pg/ μl

5 5 3 45 1:10 0.3 pg/ μl

6 5 4 45 1:10 0.1 pg/ μl

7 5 5 45 1:10 0.03 pg/ μl

8 5 6 45 1:10 0.01 pg/ μl

9 0 - 50 - 0

32

ตารางที่ 2 ความสัมพันธระหวางระยะเวลาที่ใชในการบมและการปรากฏสีของแถบดีเอ็นเอที่ติดฉลากดวย DIG (Digoxigenin)

Incubation time Appearance

5-10 min 30 pg spot

30 min 3 pg spot

4. การวิเคราะหขอมูลทางอณูชีววิทยาบนเครือขายอินเตอรเน็ตและโปรแกรมสําเร็จรูป โปรแกรม BlastN จาก Website http:// www.ncbi.nml.nih.gov/cgi-bin/Blast/ และ โปรแกรม Vector NTI Suite 6 จะใชสําหรบัเปรียบเทียบความเหมือนระหวางสายดีเอน็เอหรือโปรตีนที่สนใจ

สวนโปรแกรม Vector NTI Suite 6 จะใชสําหรับหาตําแหนงตัดดวยเอน็ไซมจําเพาะบนสายดีเอ็นเอและการทํา sequence aligment 5. การศึกษาการแสดงออกของยีน OsORFX 5.1 การเตรียมพืชทดลอง เพาะเลี้ยงตนขาวพันธุ Nipponbare และขาวดอกมะลิ 105 ในอาหารเหลวสูตร 1/10 MS (Murashing and Skoog, 1962) แบบไฮโดรโปรนิค (hydroponic)โดยใหแสงและอณุหภูมิตามสภาพ แวดลอมธรรมชาติเปนเวลา 2 เดือน จากนัน้ยายปลกูในกระถางที่มีดินและรดดวยอาหาร 1/10 MS เปนระยะเวลาประมาณ 4 เดอืนจนกระทั่งตนขาวเขาสูระยะการออกดอกและพัฒนาเปนเมล็ดขาว จึงทําการเก็บตัวอยางเพื่อศกึษาการแสดงออกของยีนดังตอไปนี้ ใบแก (leaf blade) ใบธง (flag leaf) และรวงขาว (panicle) ในระยะกอนและหลังออกรวง สวนในระยะหลังดอกบานหรือระยะที่พัฒนาเปนเมล็ดขาว จะวิเคราะหในสวนที่เปนดอกขาวหรือเมล็ดเทานั้น คือ เก็บตัวอยางที ่0 1 3 10 15 30 วันหลังการผสมเกสร (DAP, day after pollination) 5.2 การสกัดอารเอ็นเอจากตนขาวในระยะตางๆโดยวิธี GTC นําตัวอยางจากตนขาวในระยะตางๆ ทั้งหมดมาแยกและสกัดอารเอ็นเอสําหรับใชในการวิเคราะห RT-PCR ดวยวิธี GTC (Gaunidium thiocyanate) ซ่ึงมีขั้นตอนดังนี้ บดตัวอยางจากตนขาวในระยะตางๆ ที่ตองการศึกษาในไนโตรเจนเหลวใหละเอียดเปนผงแลวตักใสหลอด eppendorf ขนาด 1.5 มิลลิลิตร ปริมาตร 1/3 ของหลอด เติม extraction buffer (4.2 M gaunidium thiocyanate, 25 mM sodium citrate dehydrate, 0.5% N-lauroylsarcosine sodium salt) ปริมาตร 600 ไมโครลิตร

33

แลวเติม β-mercaptoethanol ปริมาตร 10 ไมโครลิตร ผสมใหเขากันดวย vortex นําไปหมุนเหวีย่งที่ความเร็ว 12,000 รอบตอนาที นาน 5 นาที ที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส ดูดสวนใส (supernatant) ปริมาตร 600 ไมโครลิตรใสใน eppendorf ใหมแลวเติม 3 M CH3COONa, pH 5.2 ปริมาตร 60 ไมโครลิตร เติม Phenol : Chloroform (1 :1) ปริมาตร 650 ไมโครลิตรผสมใหเขากันดวย vortex นําไปหมุนเหวี่ยงดวยความเร็ว 15,000 รอบตอนาที นาน 5 นาที ที่อุณหภูมหิอง ดูดสวนใส 500 ไมโครลิตร ใสใน eppendorf ใหมแลวเติม Phenol : Chloroform (1 :1) ทําซํ้าอยางนอย 3-5 คร้ัง ดูดสวนบน (upper phase) ใสใน eppendorf ใหม แลวเตมิ cold absolute ethanol ปริมาตร 2.5 เทาของปริมาตรทั้งหมด กลับหลอดไปมานาน 30 วินาที แลวนําไปหมนุเหวีย่งดวยความเร็ว 12,000 รอบตอนาที นาน 20 นาที ทีอุ่ณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส เพื่อเก็บตะกอน (pellet) จากนั้นละลายตะกอนดวยน้าํ milli Q ที่ฆาเชื้อปริมาตร 400 ไมโครลิตร แลวเติม 10 M LiCl ปริมาตร 100 ไมโครลิตรบมไวที่อุณหภูม ิ4 องศาเซลเซียส นาน 2-3 ช่ัวโมงหรือขามคืน นําไปหมนุเหวี่ยงที่ 12,000 รอบตอนาที นาน 20 นาที ที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส ลางตะกอนดวย Cold 70% ethanol นําไปหมนุเหวี่ยงดวยความเร็ว 12,000 รอบตอนาที นาน 5 นาที ที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส จากนั้นทาํใหตะกอนแหงภายใตสุญญากาศ นาน 5 นาที หรือแหงดวยอากาศ แลวละลายตะกอนดวยน้ํา milli Q ที่ผานการไรเชื้อปริมาตรประมาณ 5-20 ไมโครลิตร เก็บอารเอ็นเอที่สกัดไดที่ -80 องศาเซลเซียส เพื่อนํา ไปตรวจสอบการแสดงออกของยีนดวยวิธีการทดลอง Semi-Quantitative RT-PCR ตอไป 5.3 การศึกษาการแสดงออกของยีนโดยวิธี Semi – Quantitative RT-PCR 5.3.1 การสังเคราะหสายดีเอ็นเอคูสม (cDNA) จากอารเอ็นเอโดยใช RevertAid TM M-MuLV Reverse transcriptase cDNA amplification kit (บริษัท Fermentas , เยอรมัน) 5.3.1.1 การสังเคราะห complementary DNA (cDNA) สายแรก เตรียม reaction mixture โดย 1 reaction ประกอบดวย Oligo (dT)12-18 ปริมาตร 1 ไมโครลิตร ความเขมขน 0.5 ไมโครกรัมตอไมโครลิตร, mRNA ที่ใชเปนแมแบบ ปริมาตร 2 ไมโครลิตร ความเขมขน 1 ไมโครกรัม และเติมน้ํา milli Q ที่ฆาเชื้อจนครบปริมาตรสุดทาย 11 ไมโครลิตร ผสมใหเขากนั บมที่อุณหภูมิ 70 องศาเซลเซียส นาน 5 นาที แชในน้ําแข็งทันที 2 นาที เติมสวนผสมของบัฟเฟอรสําหรับสังเคราะห cDNA สายแรก ที่ประกอบดวย 5X reaction buffer ปริมาตร 4 ไมโครลิตร , 10 mM dNTP mix ปริมาตร 2 ไมโครลิตร , RNase inhibitor ปริมาตร 0.5 ไมโครลิตร (20 Units) และเติมน้ํา milli Q ที่ฆาเชื้อจนครบปริมาตรสุดทาย 19 ไมโครลิตร ผสมใหเขากนั บมที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส นาน 5 นาที จากนัน้เติม M-MuLV

34

Reverse transcriptase ตัวอยางละ 1 ไมโครลิตร(200 Units) ซ่ึง 1 reaction จะมีปริมาตรสุดทาย 30 ไมโครลิตร ผสมใหเขากนั บมที่อุณหภมูิ 42 องศาเซลเซียส นาน 1 ช่ัวโมง จากนัน้ทําการหยุดปฏิกิริยา โดยนําไปบมที่อุณหภูมิ 70 องศาเซลเซียส นาน 10 นาที แชในน้ําแข็งทันที นําไปเก็บที ่ -20 องศาเซลเซียส หรือเก็บที่ 4 องศาเซลเซียส เพื่อใชวเิคราะหการแสดงออกของยีนตางๆ ตอไป 5.3.2 การเพิ่มปริมาณยีนดวยวิธี PCR เพื่อดูการแสดงออกของยีน 18s rRNA การเพิม่ปริมาณยีนดวยวิธี PCR เพื่อดูการแสดงออกของยีน 18s rRNA ซ่ึงเปนยีนที่ แสดงออกตลอดเวลา ทําไดดังนี ้คือ เตรียม reaction mixture ที่ประกอบดวย cDNA จากตนขาวระยะตางๆ เปนแมแบบ ปริมาตรตัวอยางละ 1 ไมโครลิตร เติมสวนของบัฟเฟอร (10X PCR buffer) ปริมาตร 2 ไมโครลิตร , 25 mM MgCl2 ปริมาตร 2 ไมโครลิตร เติมสวนนิวคลีโอไทด (10 mM dNTP) ปริมาตร 2 ไมโครลิตร เติมเอนไซม Taq Polymerase (5 Units/μl) ปริมาตร 0.2 ไมโครลิตร และเติมคูไพรเมอรที่จําเพาะตอการสังเคราะห ดเีอ็นเอ คอื 20 μM 18s rRNA Forward primer (ภาพที1่2 a) ปริมาตร 0.2 ไมโครลิตร และ 20 μM 18s rRNA Reward primer (ภาพที1่2 b) ปริมาตร 0.2 ไมโครลิตร หลังจากนั้นนําเขาเครื่อง DNA Thermal cycler : GeneAmp PCR System 2400 (บริษัท Perkin Elmer สหรัฐอเมริกา) เพิ่มปริมาณดีเอน็เอโดยตั้งโปรแกรมดังนี ้ โปรแกรมที่ 1 (initial denaturation) ที่ 95 องศาเซลเซียส 5 นาที 1 รอบ โปรแกรมที่ 2 (denaturation) ที่ 95 องศาเซลเซียส 30 วินาที 28 รอบ (annealing) ที่ 50 องศาเซลเซียส 30 วินาที (extension) ที่ 72 องศาเซลเซียส 1 นาที โปรแกรมที่ 3 (extension) ที่ 72 องศาเซลเซียส 7 นาที ที่ 4 องศาเซลเซียส ∞

a) 5’ ACC TAG CTA TGC GGA GCC AT 3’ b) 5’ AGG TTC AAT GGA CTT CTC GC 3’

ภาพที่ 12 ลําดับนิวคลีโอไทดของไพรเมอรที่ใชในการเพิ่มปริมาณยนี 18s rRNA a) 18s Forward primer b) 18s Reward primer

35

นําผลิตภัณฑที่ไดจากการทาํ PCR มาตรวจสอบโดยวิธีอิเลคโตโฟลีซีสบน 1% อะกาโรสเจล เปรียบเทียบขนาดของดีเอ็นเอกับ 1 Kb DNA ladder marker (บริษัท Fermentas เยอรมัน)

5.3.3 การเพิ่มปริมาณยนีดวยวิธี PCR เพื่อดูการแสดงออกของยีน OsORFX การเพิ่มจํานวนยนีดวยวิธี PCR เพื่อดูการแสดงออกของยีนที่โคลนจาก EST clone AU058193 มีรายละเอียดดังตอไปนี้คือ เตรียม reaction mixture ที่ประกอบดวย cDNA จากตนขาวระยะตางๆ เปนแมแบบ ปริมาตรตัวอยางละ 1 ไมโครลิตร เติมสวนของบัฟเฟอร (10X PCR buffer) ปริมาตร 2 ไมโครลิตร , 25 mM MgCl2 ปริมาตร 2 ไมโครลิตร เติมสวนนิวคลีโอไทด (10 mM dNTP) ปริมาตร 2 ไมโครลิตร เติมเอนไซม Taq Polymerase (5 Units/μl) ปริมาตร 0.2 ไมโครลิตร และเติมคูไพรเมอรที่จําเพาะตอการสังเคราะหยีน OsORFX คือ 20 μM ORFX Forward primer (ภาพที่ 13 a) ปริมาตร 0.2 ไมโครลิตร และ 20 μM ORFX reward primer (ภาพที่ 13 b) ปริมาตร 0.2 ไมโครลิตร หลังจากนั้นนําเขาเครื่อง DNA Thermal cycler : GeneAmp PCR System 2400 (บริษัท Perkin Elmer สหรัฐอเมริกา) เพิ่มปริมาณดีเอ็นเอโดยตั้งโปรแกรมดังนี ้ โปรแกรมที่ 1 (initial denaturation) ที่ 95 องศาเซลเซียส 5 นาที 1 รอบ โปรแกรมที่ 2 (denaturation) ที่ 95 องศาเซลเซียส 30 วินาที 20 รอบ (annealing) ที่ 55 องศาเซลเซียส 30 วินาที (extention) ที่ 72 องศาเซลเซียส 1 นาที โปรแกรมที่ 3 (extention) ที่ 72 องศาเซลเซียส 7 นาที ที่ 4 องศาเซลเซียส ∞

a) 5’ ATG TAT CCC TCC GCC CCT 3’ b) 5’ TAG GCA GTG ATC TCC AAA TG 3’

ภาพที่ 13 ลําดับนิวคลีโอไทดของไพรเมอรที่ใชในการเพิ่มปริมาณยนี OsORFX a) ORFX Forward primer b) ORFX Reward primer

36

นําผลิตภัณฑที่ไดจากการทาํ PCR มาตรวจสอบโดยวิธีอิเลคโตโฟลีซีสบน 1% อะกาโรสเจล เปรียบเทียบขนาดของ ดีเอน็เอกับ 1 kb DNA ladder marker (บริษัท Fermentas เยอรมัน)

5.3.4 การตรวจสอบการแสดงออกของยีน OsORFX ดวย Southern analysis และ hybridization

5.3.4.1 การทํา Southern analysis ยายแถบดีเอ็นเอบนแผนเจลที่ไดจากขั้นตอนที่ 5.3.3 ไปยังแผนเมมเบรน ตามขั้นตอนดงันี้ นําแผนเจลที่ไดลางดวยน้ํา milli Q ที่ผานการฆาเชื้อแลว 2 คร้ัง แลวนําแผนเจลแชในสารละลาย depurination solution ( 0.125 M HCl) เขยาเบาๆ นาน 10 นาที ลางเจลดวยน้ํา milli Q ที่ผานการไรเชื้อแลว 1 คร้ัง ทําใหดีเอ็นเอเปลี่ยนสภาพโดยแชใน denaturing buffer (1.5 M NaCl + 0.5 NaOH) เขยาเบาๆ นาน 30 นาที ลางเจลดวยน้ํา milli Q ที่ผานการไรเชื้อแลว 1 คร้ัง แชเจลลงใน neutralization buffer (1.5 M NaCl + 1M Tris-HCl, pH 7.4) เขยาเบาๆ นาน 30 นาที เพื่อปรับสภาพเจลใหเปนกลาง ในระหวางรอใหเตรยีมอุปกรณเพื่อทําการ blotting ดังแสดงในภาพที ่11 มีรายละเอยีดดังนี้ นําปลายสองดานของกระดาษกรอง 3MM ที่ใชเปนสะพานในการสงผาน ดีเอ็นเอจุมลงใน 6X SSC (Tri-Sodium citrate + NaCl , pH 7-8) ตัดแผน Hybond nylon membrane (บริษัท amersham , สหราชอาณาจักร) ใหมีขนาดเทากับแผนเจลที่ตองการ blot จากนั้นวางแผนเจลลงบนกระดาษกรองที่ชุมดวย 6X SSC ระวังอยาใหมฟีองอากาศวางแผน Hybond nylon membrane ลงบนเจลระวังอยาใหมฟีองอากาศ วางกระดาษกรอง 3 MM ซ่ึงมีขนาดเทากับแผนเจล ประมาณ 5- 6 แผนลงบนแผน Hybond nylon membrane วางกระดาษทชิชูลงบนกระดาษกรองแลววางอุปกรณทีม่ีน้ําหนกัวางทับลงบนกระดาษกรองหมัน่เปลี่ยนทิชชูบอยๆ ทิ้งไว 1 คืน ทําเครื่อง- หมายทีแ่ผน Hybond nylon membrane แลวแยกออกจากแผนเจล นําแผนไนลอนไปลาง 5 นาที ในน้ํา milli Q ที่ผานการไรเชื้อ ปลอยใหแหงดวยอากาศ หลังจากนัน้ตรึงดีเอ็นเอใหอยูบนเมมเบรนในตู oven ที่อุณหภูมิ 80 องศาเซลเซียส นาน 2 ช่ัวโมง จากนั้นนําไป hybridize กับ probe ที่เตรียมไว หรือเก็บไวที่ 4 องศาเซลเซียส จนกวาจะใช hybridize 5.3.4.2 การเตรียมยีนตดิตาม

การเตรียมยีนติดตามโดยใชเทคนิค PCR ทําโดยการนําเอาพลาสมิดที่ มียีน OsORFX ในรูป cDNA (Ngampanya, 2003) ที่สกัดไดจาก E.coli สายพันธุ JM109 มาเปน แมแบบ (template) และใช ORFX forward และ ORFX reward เปนคูไพรเมอรสําหรับเพิ่มปริมาณ ดีเอ็นเอของยนีติดตาม ดังรายละเอียดตอไปนี้คือ

37

การเตรียม reaction mixture ทําไดดังนี้คือ เติมสวนที่เปนบัฟเฟอร (10x PCR buffer 1+ KCl – MgCl2) ปริมาตร 2 ไมโครลิตร, 25 mM MgCl2 ปริมาตร 2 ไมโครลิตร, นิวคลีโอไทด (10 mM dNTP mix) ปริมาตร 0.2 ไมโครลิตร, 20 μM ORFX forward และ 20 μM ORFX reward แตละชนดิปริมาตรละ 0.2 ไมโครลิตร และสวนเอนไซม 5 Units/ul Taq DNA polymerase (บริษัท Fermentas เยอรมัน) ปริมาตร 0.2 ไมโครลิตร และเติมน้ํา milli Q จนครบปริมาตรสุดทายคือ 20 ไมโครลิตร ผสมกันเบาๆ นาํไป spin down แลวใสในเครื่อง DNA thermal cycler : GeneAmp PCR System 2400 (บริษัท Perkin Elmer สหรัฐอเมริกา) เพิ่มปริมาณดีเอ็นเอโดยตั้งโปรแกรมดังนี ้

โปรแกรมที่ 1 (initial denaturation) ท่ี 95 องศาเซลเซียส 5 นาที 1 รอบ โปรแกรมที่ 2 (denataration) ที่ 94 องศาเซลเซียส 30 วินาที 35 รอบ (annealing) ที่ 58 องศาเซลเซียส 30 วินาที (extension) ที่ 72 องศาเซลเซียส 1 นาที โปรแกรมที่ 3 (extension) ที่ 72 องศาเซลเซียส 7 นาที ที่ 4 องศาเซลเซียส ∞ นําผลิตภัณฑที่ไดจากการทํา PCR มาตรวจสอบโดยวิธีอิเลคโตโฟลีซีสบน 1% อะกาโรสเจล เปรียบเทียบขนาดของดีเอ็นเอกับ 1 kb DNA ladder marker (บริษัท Bio-Labs สหรัฐราชอาณาจักร) จากนั้นนําชิ้นดีเอ็นเอที่สังเคราะหไดจากกระบวนการ PCR มาทําบริสุทธิ์ดวย HiYield TM Gel / PCR Extraction Kit (บริษัท Real-Biotech ไตหวนั) ดังรายละเอียดในขอ 2.4 5.3.4.3 การติดฉลากยีนติดตาม (gene probe) ดวย Dig (Digoxigenin) ดําเนินการตามขั้นตอนในขอ 3.2.4 5.3.4.4 การวัดประสิทธิภาพของยีนติดตามที่ติดฉลาก ดําเนินการตามขั้นตอนในขอ 3.2.5 5.3.4.5 การ hybridization ดําเนินการตามขั้นตอนในขอ 3.2.6 5.3.4.6 การตรวจสอบสัญญาณบนแผนไนลอน ดําเนินการตามขั้นตอนในขอ 3.2.7

38

บทที่ 4 ผลการทดลองและวิจารณผลการทดลอง

1. การโคลนลําดับนิวคลิโอไทดท่ีสมบูรณของยีนจาก EST clone AU058193 ในรูป genomic DNA 1.1. การทํานายลําดับนิวคลิโอไทดท่ีสมบูรณของยนีในรปู genomic DNA จากการนําเอาลําดบันิวคลิโอไทดที่สมบูรณของยีนที่ไดจาก EST clone AU058193 ในรูปของ cDNA (Ngampanya, 2003) ดังรายละเอียดในภาพที่ 14 มาทําการเปรียบเทยีบลําดับ นิวคลิโอไทดแบบ Nucleotide-nucleotide blast (blastn) เพื่อหาความเหมือน (homology) ของลําดับนิวคลิโอไทดกับยีนอืน่ ๆ ที่อยูใน Genbank ผาน http://www.ncbi.nih.gov. ไดผลการวิเคราะหดังแสดงในภาพที่ 15 1 ATGTATCCCT CCGCCCCTCC CGACGCGTAT AACAAGTACA GCGCCGGTGC 51 TCCACCGACG GCGCCGCCGC CGGCAACGTA CCAGCTGCCG ACGATGAACA 101 CCCCACGCAC CGGCGGCGGG CTGACGCGAT GGTCCACCGG CCTTTTCCAC 151 TGCATGGACG ATCCCGGAAA CTGTCTCATC ACATGCGTGT GCCCCTGCAT 201 CACCTTTGGG CAGGTCGCTG ACATCGTGGA CAAGGGCACC TGCCCATGCC 251 TCGCGAGCGG GACGGCTTAC GCGCTCCTCT GCGCGTCGGG GATGGGGTGC 301 CTGTACTCGT GCTTCTACCG GTCCAAGATG AGGGCTCAGT TCGACCTGGA 351 CGAAGGGGAT TGCCCCGATT TCCTCGTCCA TTTCTGCTGC GAGTACTGCG 401 CGCTGTGCCA GGAGTACCGG GAGCTCAAGA ACCGCGGCTT CGACTTGGGG 451 ATCGGTTGGG CTGCCAATGT GGACAGGCAG AGGCGAGGCG TCACCGGAGC 501 GTCGGTGATG GGAGCTCCTG GCGTCCCGGT CGGCATGATG AGGTAGACGA 551 AGATGGCGAA CGCGAAATGG TGCGCTTTTG TGTTCTTGTG TTGCAATATG 601 TTCTCTGTGG TTTTCATTTG GAGATCACTG CCTATTTCAT GTATCGTATA 651 CTCCTATTTA GCTTGATTTG TTGGGTTTCA AAAAAAAAAA AAAAAA

ภาพที่ 14 ลําดับนิวคลิโอไทดที่สมบูรณของยีนที่ไดจาก EST clone AU058193 ในรูปของ cDNA (Ngampanya, 2003)

39

ภาพที่ 15 ผลที่ไดจากการทาํ blast search แบบ blastn ของลําดับนิวคลิโอไทดที่สมบูรณของยีนที ่ ไดจาก EST clone AU058193 ในรูปของ cDNA (Ngampanya, 2003)กับยีนอื่น ๆ ใน GenBank (ที่มา : http://www.ncbi.nih.gov.)

จากภาพที่ 15 จะเห็นไดวามยีีนที่มีความเหมือนกับลําดับนิวคลิโอไทดที่สมบูรณของยีนที่ไดจาก EST clone AU058193 ในรูปของ cDNA มากที่สุด 5 ยีน (แสดงในกรอบสี่เหล่ียม) ซ่ึงมี accession number ตาง ๆ ดงันี้ 1) AK241465 : Oryza sativa (japonica cultivar-group) cDNA, clone: J065164J03, full insert sequence , length 773 bp mRNA linear 2) NM_001054743 : Oryza sativa (japonica cultivar-group) Os02g0763000 (Os02g0763000) mRNA, complete cds, length 546 bp mRNA linear 3) AP008208 : Oryza sativa (japonica cultivar-group) genomic DNA, chromosome 2, length 35954743 bp DNA linear 4) AP004817 : Oryza sativa (japonica cultivar-group) genomic DNA, chromosome 2, PAC clone:P0539D10., length 158691 bp DNA linear 5) AP005002 :Oryza sativa (japonica cultivar-group) genomic DNA, chromosome 2, PAC clone:P0486G03., length 146713 bp DNA linear

40

เนื่องจาก AK241465 และ NM_001054743 มีลําดับนิวคลิโอไทดอยูในรูปของ mRNA แตในการทดลองนี้ลําดับนิวคลิโอไทดที่สนใจจะตองอยูในรูปของ genomic DNA ดังนั้นจึงเลือกยีนที่มีความเหมือนกบัลําดับนิวคลิโอไทดที่สมบูรณของยีนที่ไดจาก EST clone AU058193 ในลําดับรอง ลงมาซึ่งมีทั้งหมด 3 ยีน โดยท้ัง 3 ยีนนี้เปน genomic DNA เหมือนกนัและมีคาของ Score เทากับ 420 Bits และ E-Value เทากับ 4e-114 เทากัน ซ่ึงคา Score จะแสดงถึงจํานวนของนวิคลิโอไทดทีม่ีความเหมือนกบันิวคลีโอไทดที่สมบูรณของยีนที่ไดจาก EST clone AU058193 ในรูปของ cDNA สวนคา E-Value หมายถึง จํานวนความเหมอืนที่คาดหวังวาจะพบดวยความบังเอิญในการสืบคนฐานขอมูล และไดคาคะแนนหนึ่ง ๆ หรือดกีวาคา E-value ขึ้นกับขนาดของฐานขอมูลที่สืบคนโดยคา E-value ยิ่งต่ําคะแนนทีไ่ดยิ่งมีความนาเชื่อถือ (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookres.fcgi/ handbook/ch16d1.pdf) จากผลที่ไดนี้จึงสามารถเลือกยีนใดก็ไดมาทาํการ alignment ซ่ึงในการทดลองนี้ไดทาํการเลือก AP005002.3 ซ่ึงแสดงสวนที่เหมือนกับนวิคลิโอไทดที่สมบูรณของยีนที่ไดจาก EST clone AU058193 ในรูปของ cDNA (Query) ดังภาพที่ 16 >gi|46805885|dbj|AP005002.3| Oryza sativa (japonica cultivar-group) genomic DNA, chromosome 2, PAC clone:P0486G03 Length=146713

Score = 345 bits (174), Expect = 8e-93 Identities = 174/174 (100%), Gaps = 0/174 (0%) Strand=Plus/Plus Query 1 ATGTATCCCTCCGCCCCTCCCGACGCGTATAACAAGTACAGCGCCGGTGCTCCACCGACG 60

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 110416 ATGTATCCCTCCGCCCCTCCCGACGCGTATAACAAGTACAGCGCCGGTGCTCCACCGACG 110475

Query 61 GCGCCGCCGCCGGCAACGTACCAGCTGCCGACGATGAACACCCCACGCACCGGCGGCGGG 120

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 110476 GCGCCGCCGCCGGCAACGTACCAGCTGCCGACGATGAACACCCCACGCACCGGCGGCGGG 110535

Query 121 CTGACGCGATGGTCCACCGGCCTTTTCCACTGCATGGACGATCCCGGAAACTGT 174

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 110536 CTGACGCGATGGTCCACCGGCCTTTTCCACTGCATGGACGATCCCGGAAACTGT 110589

Query 173 GTCTCATCACATGCGTGTGCCCCTGCATCACCTTTGGGCAGGTCGCTGACATCGTGGACA 232

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 110703 GTCTCATCACATGCGTGTGCCCCTGCATCACCTTTGGGCAGGTCGCTGACATCGTGGACA 110762

Query 233 AGGGCACCTGCC 244

||||||||||||||||||| Sbjct 110763 AGGGCACCTGCC 110774

Score = 143 bits (72), Expect = 6e-32 Identities = 72/72 (100%), Gaps = 0/72 (0%) Strand=Plus/Plus Query 173 GTCTCATCACATGCGTGTGCCCCTGCATCACCTTTGGGCAGGTCGCTGACATCGTGGACA 232

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 110703 GTCTCATCACATGCGTGTGCCCCTGCATCACCTTTGGGCAGGTCGCTGACATCGTGGACA 110762

41

Query 233 AGGGCACCTGCC 244 |||||||||||||||||||

Sbjct 110763 AGGGCACCTGCC 110774

Score = 420 bits (212), Expect = 2e-115 Identities = 212/212 (100%), Gaps = 0/212 (0%) Strand=Plus/Plus

Query 245 CATGCCTCGCGAGCGGGACGGCTTACGCGCTCCTCTGCGCGTCGGGGATGGGGTGCCTGT 304

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 110877 CATGCCTCGCGAGCGGGACGGCTTACGCGCTCCTCTGCGCGTCGGGGATGGGGTGCCTGT 110936

Query 305 ACTCGTGCTTCTACCGGTCCAAGATGAGGGCTCAGTTCGACCTGGACGAAGGGGATTGCC 364

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 110937 ACTCGTGCTTCTACCGGTCCAAGATGAGGGCTCAGTTCGACCTGGACGAAGGGGATTGCC 110996

Query 365 CCGATTTCCTCGTCCATTTCTGCTGCGAGTACTGCGCGCTGTGCCAGGAGTACCGGGAGC 424

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 110997 CCGATTTCCTCGTCCATTTCTGCTGCGAGTACTGCGCGCTGTGCCAGGAGTACCGGGAGC 111056

Query 425 TCAAGAACCGCGGCTTCGACTTGGGGATCGGT 456

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 111057 TCAAGAACCGCGGCTTCGACTTGGGGATCGGT 111088

Score = 448 bits (226), Expect = 7e-124 Identities = 226/226 (100%), Gaps = 0/226 (0%) Strand=Plus/Plus Query 454 GGTTGGGCTGCCAATGTGGACAGGCAGAGGCGAGGCGTCACCGGAGCGTCGGTGATGGGA 513

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 111200 GGTTGGGCTGCCAATGTGGACAGGCAGAGGCGAGGCGTCACCGGAGCGTCGGTGATGGGA 111259

Query 514 GCTCCTGGCGTCCCGGTCGGCATGATGAGGTAGACGAAGATGGCGAACGCGAAATGGTGC 573

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 111260 GCTCCTGGCGTCCCGGTCGGCATGATGAGGTAGACGAAGATGGCGAACGCGAAATGGTGC 111319

Query 574 GCTTTTGTGTTCTTGTGTTGCAATATGTTCTCTGTGGTTTTCATTTGGAGATCACTGCCT 633

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 111320 GCTTTTGTGTTCTTGTGTTGCAATATGTTCTCTGTGGTTTTCATTTGGAGATCACTGCCT 111379

Query 634 ATTTCATGTATCGTATACTCCTATTTAGCTTGATTTGTTGGGTTTC 679

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 111380 ATTTCATGTATCGTATACTCCTATTTAGCTTGATTTGTTGGGTTTC 111425

ภาพที่ 16 ลําดับนิวคลีโอไทดที่เหมือนกนัของ AP005002.3 กับลําดับนิวคลีโอไทดที่สมบูรณของ ยีนที่ไดจาก EST clone AU058193 ในรูปของ cDNA (ที่มา : http://www.ncbi.nih.gov.)

42

ในการวิเคราะห sequence alignment ระหวางลําดับนิวคลิโอไทดของ AP005002.3 ตั้งแต ลําดับที่ 110416 -111425 กับลําดับนิวคลิโอไทดที่สมบูรณของยีนทีไ่ดจาก EST clone AU058193 ในรูปของ cDNA โดยใชโปรแกรมคอมพวิเตอร Vector NTI Suite 6 เพื่อทํานายลําดบันิวคลิโอไทดที่สมบูรณของยีนที่ไดจาก EST clone AU058193 ในรูปของ genomic DNA พบวา สามารถทํานายขนาดของยีนในรูปของ genomic DNA ไดเทากับ 1030 bp ประกอบดวย 4 exons (แสดงดวยตวั อักษรสีแดงแถบสีเทา) และ 3 introns (แสดงดวยตวัอักษรสีดํา) มีจํานวน 1 ชุด (copy) บนโครโม- โซมคูที่ 2 ดังรายละเอียดในภาพที่ 17 และทําสามารถทํานายลําดับนวิคลิโอไทดที่สมบูรณของยีนที่ไดจาก EST clone AU058193 ในรูปของ genomic DNA ดังแสดงในภาพที่ 18 เพื่อที่จะยนืยนัวา ลําดับนิวคลิโอไทดที่สมบูรณของยีนทีไ่ดจาก EST clone AU058193 ในรูปของ genomic DNA ที่ทํานายขึ้นมานี้มีความถูกตองหรือไม จึงไดโคลนยีนนีอ้อกมาโดยวิธี PCR ดังรายละเอียดที่จะไดกลาวในการทดลองตอไป 1 50 cDNA AU058193 (1) ATGTATCCCTCCGCCCCTCCCGACGCGTATAACAAGTACAGCGCCGGTGC AP005002.3 (1) ATGTATCCCTCCGCCCCTCCCGACGCGTATAACAAGTACAGCGCCGGTGC Consensus (1) ATGTATCCCTCCGCCCCTCCCGACGCGTATAACAAGTACAGCGCCGGTGC 51 100 cDNA AU058193 (51) TCCACCGACGGCGCCGCCGCCGGCAACGTACCAGCTGCCGACGATGAACA AP005002.3 (51) TCCACCGACGGCGCCGCCGCCGGCAACGTACCAGCTGCCGACGATGAACA Consensus (51) TCCACCGACGGCGCCGCCGCCGGCAACGTACCAGCTGCCGACGATGAACA 101 150 cDNA AU058193 (101) CCCCACGCACCGGCGGCGGGCTGACGCGATGGTCCACCGGCCTTTTCCAC AP005002.3 (101) CCCCACGCACCGGCGGCGGGCTGACGCGATGGTCCACCGGCCTTTTCCAC Consensus (101) CCCCACGCACCGGCGGCGGGCTGACGCGATGGTCCACCGGCCTTTTCCAC 151 200 cDNA AU058193 (151) TGCATGGACGATCCCGGAAACTGT-------------------------- AP005002.3 (151) TGCATGGACGATCCCGGAAACTGTAAGTCCTTCAGTCAGTCAGTTTTCCC Consensus (151) TGCATGGACGATCCCGGAAACTGT 201 250 cDNA AU058193 (175) -------------------------------------------------- AP005002.3 (201) ACATGTTCTTCAGAGTTCAGAGTTCAGAGCAATAGATGGTTGCCGGCCCA Consensus (201) 251 300 cDNA AU058193 (175) ---------------------------------------CTCATCACATG AP005002.3 (251) TGGTTGCTCAATCACACCTGTCGTTTCTCTCATGCAGGTCTCATCACATG Consensus (251) CTCATCACATG 301 350 cDNA AU058193 (186) CGTGTGCCCCTGCATCACCTTTGGGCAGGTCGCTGACATCGTGGACAAGG AP005002.3 (301) CGTGTGCCCCTGCATCACCTTTGGGCAGGTCGCTGACATCGTGGACAAGG Consensus (301) CGTGTGCCCCTGCATCACCTTTGGGCAGGTCGCTGACATCGTGGACAAGG 351 400 cDNA AU058193 (236) GCACCTGCC----------------------------------------- AP005002.3 (351) GCACCTGCCGTGAGTTCTCCCTTCTTCTCCTTCTTACCAGCGAAAGATTT Consensus (351) GCACCTGCC 401 450 cDNA AU058193 (245) -------------------------------------------------- AP005002.3 (401) TGGTCCATTCACCAGCTTGTTCGTTGATTCGGTGCGTGTGAAACTGTGAT Consensus (401) 451 500 cDNA AU058193 (245) -----------CATGCCTCGCGAGCGGGACGGCTTACGCGCTCCTCTGCG AP005002.3 (451) CGATTTTGCAGCATGCCTCGCGAGCGGGACGGCTTACGCGCTCCTCTGCG Consensus (451) CATGCCTCGCGAGCGGGACGGCTTACGCGCTCCTCTGCG 501 550

43

cDNA AU058193 (284) CGTCGGGGATGGGGTGCCTGTACTCGTGCTTCTACCGGTCCAAGATGAGG AP005002.3 (501) CGTCGGGGATGGGGTGCCTGTACTCGTGCTTCTACCGGTCCAAGATGAGG Consensus (501) CGTCGGGGATGGGGTGCCTGTACTCGTGCTTCTACCGGTCCAAGATGAGG 551 600 cDNA AU058193 (334) GCTCAGTTCGACCTGGACGAAGGGGATTGCCCCGATTTCCTCGTCCATTT AP005002.3 (551) GCTCAGTTCGACCTGGACGAAGGGGATTGCCCCGATTTCCTCGTCCATTT Consensus (551) GCTCAGTTCGACCTGGACGAAGGGGATTGCCCCGATTTCCTCGTCCATTT 601 650 cDNA AU058193 (384) CTGCTGCGAGTACTGCGCGCTGTGCCAGGAGTACCGGGAGCTCAAGAACC AP005002.3 (601) CTGCTGCGAGTACTGCGCGCTGTGCCAGGAGTACCGGGAGCTCAAGAACC Consensus (601) CTGCTGCGAGTACTGCGCGCTGTGCCAGGAGTACCGGGAGCTCAAGAACC 651 700 cDNA AU058193 (434) GCGGCTTCGACTTGGGGATCGGT--------------------------- AP005002.3 (651) GCGGCTTCGACTTGGGGATCGGTAGGTGCAAGCACTGAAGCACAGTAGAT Consensus (651) GCGGCTTCGACTTGGGGATCGGT 701 750 cDNA AU058193 (457) -------------------------------------------------- AP005002.3 (701) TCTTCGCTTGCAAGCAAGAAATATCTTCTACTAGTACTACTTTTTTGAGG Consensus (701) 751 800 cDNA AU058193 (457) -------------------------------------TGGGCTGCCAATG AP005002.3 (751) AGCACTCGAACTGACGAATAGTGTTTTCTGGTAAGGTTGGGCTGCCAATG Consensus (751) TGGGCTGCCAATG 801 850 cDNA AU058193 (470) TGGACAGGCAGAGGCGAGGCGTCACCGGAGCGTCGGTGATGGGAGCTCCT AP005002.3 (801) TGGACAGGCAGAGGCGAGGCGTCACCGGAGCGTCGGTGATGGGAGCTCCT Consensus (801) TGGACAGGCAGAGGCGAGGCGTCACCGGAGCGTCGGTGATGGGAGCTCCT 851 900 cDNA AU058193 (520) GGCGTCCCGGTCGGCATGATGAGGTAGACGAAGATGGCGAACGCGAAATG AP005002.3 (851) GGCGTCCCGGTCGGCATGATGAGGTAGACGAAGATGGCGAACGCGAAATG Consensus (851) GGCGTCCCGGTCGGCATGATGAGGTAGACGAAGATGGCGAACGCGAAATG 901 950 cDNA AU058193 (570) GTGCGCTTTTGTGTTCTTGTGTTGCAATATGTTCTCTGTGGTTTTCATTT AP005002.3 (901) GTGCGCTTTTGTGTTCTTGTGTTGCAATATGTTCTCTGTGGTTTTCATTT Consensus (901) GTGCGCTTTTGTGTTCTTGTGTTGCAATATGTTCTCTGTGGTTTTCATTT 951 1000 cDNA AU058193 (620) GGAGATCACTGCCTATTTCATGTATCGTATACTCCTATTTAGCTTGATTT AP005002.3 (951) GGAGATCACTGCCTATTTCATGTATCGTATACTCCTATTTAGCTTGATTT Consensus (951) GGAGATCACTGCCTATTTCATGTATCGTATACTCCTATTTAGCTTGATTT 1001 1030 cDNA AU058193 (670) GTTGGGTTTCAAAAAAAAAAAAAAAAA--- AP005002.3 (1001) GTTGGGTTTCATGTAATATATGACGCATTC Consensus (1001) GTTGGGTTTCA AA A A A A

ภาพที่ 17 การทํา sequence alignment ระหวางลําดับนวิคลิโอไทดที่สมบูรณของยีนทีไ่ด

จาก EST clone AU058193 ในรูปของ cDNA กับ AP005002.3 โดยใช Vector NTI Suite 6

44

1 ATGTATCCCT CCGCCCCTCC CGACGCGTAT AACAAGTACA GCGCCGGTGC 51 TCCACCGACG GCGCCGCCGC CGGCAACGTA CCAGCTGCCG ACGATGAACA 101 CCCCACGCAC CGGCGGCGGG CTGACGCGAT GGTCCACCGG CCTTTTCCAC 151 TGCATGGACG ATCCCGGAAA CTGTAAGTCC TTCAGTCAGT CAGTTTTCCC 201 ACATGTTCTT CAGAGTTCAG AGTTCAGAGC AATAGATGGT TGCCGGCCCA 251 TGGTTGCTCA ATCACACCTG TCGTTTCTCT CATGCAGGTC TCATCACATG 301 CGTGTGCCCC TGCATCACCT TTGGGCAGGT CGCTGACATC GTGGACAAGG 351 GCACCTGCCG TGAGTTCTCC CTTCTTCTCC TTCTTACCAG CGAAAGATTT 401 TGGTCCATTC ACCAGCTTGT TCGTTGATTC GGTGCGTGTG AAACTGTGAT 451 CGATTTTGCA GCATGCCTCG CGAGCGGGAC GGCTTACGCG CTCCTCTGCG 501 CGTCGGGGAT GGGGTGCCTG TACTCGTGCT TCTACCGGTC CAAGATGAGG 551 GCTCAGTTCG ACCTGGACGA AGGGGATTGC CCCGATTTCC TCGTCCATTT 601 CTGCTGCGAG TACTGCGCGC TGTGCCAGGA GTACCGGGAG CTCAAGAACC 651 GCGGCTTCGA CTTGGGGATC GGTAGGTGCA AGCACTGAAG CACAGTAGAT 701 TCTTCGCTTG CAAGCAAGAA ATATCTTCTA CTAGTACTAC TTTTTTGAGG 751 AGCACTCGAA CTGACGAATA GTGTTTTCTG GTAAGGTTGG GCTGCCAATG 801 TGGACAGGCA GAGGCGAGGC GTCACCGGAG CGTCGGTGAT GGGAGCTCCT 851 GGCGTCCCGG TCGGCATGAT GAGGTAGACG AAGATGGCGA ACGCGAAATG 901 GTGCGCTTTT GTGTTCTTGT GTTGCAATAT GTTCTCTGTG GTTTTCATTT 951 GGAGATCACT GCCTATTTCA TGTATCGTAT ACTCCTATTT AGCTTGATTT 1001 GTTGGGTTTC ATGTAATATA TGACGCATTC

ภาพที่ 18 ลําดับนิวคลิโอไทดที่สมบูรณของยีนที่ไดจาก EST clone AU058193 ในรูปของ genomic DNA ที่มีขนาด 1030 bp ที่ไดจากการทํานาย 1.2. การโคลนยีนในรปู genomic DNA นํา genomic DNA ที่สกัดจากตนออนขาวอาย ุ2 สัปดาหเปนสายดีเอ็นเอแมแบบ (DNA template) มาเพิ่มปรมิาณดีเอน็เอดวยไพรเมอรที่จําเพาะ 1 คู คือ ORFX Forward ซ่ึงมีลําดับนิวคลิโอไทด 5’ATG TAT CCC TCC GCC CCT 3’ รวมกับ ORFX Reward primer ซ่ึงมีลําดับ นิวคลิโอไทด คือ 5’ TAG GCA GTG ATC TCC AAA TG 3’ และเพิ่มปริมาณดวยเอนไซม Taq DNA Polymerase (บริษัท Fermentas สหรัฐอเมริกา) เมื่อนําเอา PCR product ที่ไดจากการเพิ่มปริมาณโดยใช annealing temperature ที่ 58 องศาเซลเซียสและรอบการทําปฏิกิริยา 30 รอบ มาแยก

45

โดยเทคนิค gel electrophoresis บน agarose gel ความเขมขนเทากับ 1% พบแถบ (band) ของ PCR product ขนาดประมาณ 600- 700 bp เมื่อใช TA plasmid ที่มี cDNA ที่สมบูรณของ EST AU058193 เปนดีเอ็นเอแมแบบ (lane1 และ 2) และ มแีถบขนาดประมาณ 1000 bp เมื่อใช genomic DNA ที่สกัดไดจากตนออนขาวเปนแมแบบ (lane 3 และ 4) ดังแสดงในภาพที่ 19 เมื่อนําผลการทดลองที่ไดไปเปรียบเทยีบกับขนาดของยีนที่ไดทํานายไวดังแสดงในภาพที่ 17 พบวา มีขนาดทีส่อดคลองกันจึงไดสกัด PCR product (lane 3 และ 4) ออกจากแผนวุนอะกาโรส แลวนําไปเชื่อมตอ (ligate) กับ cloning vector เพื่อหาลําดับนิวคลิโอไทดตอไป M 1 2 3 4 (Kb) ภาพที่ 19 Gel electrophoresis ของ PCR product ที่ไดจากการทํา PCR โดยใช annealing temperature เปน 58 องศาเซลเซียส บน 1% agarose gel; lane 1 และ 2 คือ PCR product ที่ไดจากการใช TA plasmid ที่มี cDNA ที่สมบูรณของ EST AU058193 เปนดีเอน็เอแมแบบ; lane 3 และ 4 คือ PCR product ที่ไดจากการใช genomic DNA ที่สกัดไดจากตนออนขาวเปนดเีอ็นเอแมแบบ; M คือ 1 Kb DNA ladder marker 1.3 การหาลําดบันิวคลิโอไทดท่ีสมบูรณของยีนท่ีไดจาก EST clone AU058193 ในรูปของ genomic DNA เมื่อไดขนาดดีเอ็นเอที่สนใจแลว นํามา ligation เขาไปใน pGEM-T Easy Vector จากนั้นจึงทําการถายโอน (transform) เขาสูแบคทีเรีย E. coli สายพันธุ DH5α หลังจากนั้นจงึทาํการคัดเลือกโคโลนีที่ขึ้นบน LB agar plate ที่มียาปฏิชีวนะ ampicillin ความเขมขน 100 μg/ml และนํามาตรวจ หาดีเอ็นเอที่สอดแทรกอยูบน pGEM-T Easy Vector ดวยวิธีการตดัดวยเอนไซมตัดจาํเพาะซึ่งเปน

0.5

1.0

3.0 10

46

วิธีที่สามารถตรวจสอบ transformant ที่มี insert ไดอยางรวดเรว็ เอนไซมตัดจําเพาะทีใ่ชในการตรวจสอบโคลนคือ EcoRI และจากการคดัเลือกโคโลนีมาทั้งหมด 12 โคโลนีที่ไดทําการถายโอนยีนมาสกัดพลาสมิดและตัดดวยเอนไซมตดัจําเพาะดังกลาวเพื่อตรวจสอบชิ้นสวนดเีอ็นเอที่สนใจ ที่แทรกอยูในพลาสมิด ผลปรากฏวา พลาสมิดที่สกัดไดจากโคโลนีที ่ 1, 2, 3, 5, 8, 9 และ 10 มีแถบดีเอ็นเอหรือ genomic DNA ที่สนใจแทรกอยูในพลาสมิด โดยมีขนาด 1000 bp เกดิขึ้น สวน พลาสมิดที่สกัดไดจากโคโลนีที่ 4, 6, 7, 11และ 12 ไมพบแถบดีเอ็นเอหรือ genomic DNA ที่สนใจแทรกอยูในพลาสมิดเกิดขึ้นบนแผนอะกาโรสเจล (แสดงในภาพที ่20)

(Kb)

ภาพที่ 20 Gel electrophoresis ของพลาสมิดจาก transformants ที่ไดรับการถายโอนยีนเมื่อตดัดวยเอนไซมตัดจําเพาะ EcoRI บน 1% อะกาโรสเจล; M คือ 1 Kb DNA ladder marker; lane 1, 2, 3, 5, 8, 9 และ 10; transformants ที่มีแถบดีเอ็นเอหรือ genomic DNA ที่สนใจขนาด 1000 bp แทรกอยูใน พลาสมิด lane 4, 6, 7, 11 และ 12; transformants ที่ไมมีแถบดีเอ็นเอหรอื genomic DNA ที่สนใจแทรกอยูในพลาสมิด ดังนั้นจึงเลือกโคโลนีที่ 2, 3, 9 ซ่ึงพบแถบดีเอ็นเอหรือ genomic DNA ที่สนใจแทรกอยู ชัดเจนในพลาสมิดมาทําการเพิ่มปริมาณดเีอ็นเอโดยใชเทคนิค PCR และใชพลาสมิดที่สกัดไดเปน ดีเอ็นเอตนแบบและเพิ่มปรมิาณดีเอน็เอดวยไพรเมอรที่จําเพาะ คือ ORFX Forward รวมกับ ORFX Reward primer เมื่อนําเอา PCR product ที่ไดจากการเพิม่ปริมาณโดยใช annealing temperature ที่

0.5 1.0

3.0 10

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

47

58 องศาเซลเซียส และรอบการทําปฏิกิริยา 30 รอบ นํามาตรวจสอบดีเอ็นเอโดยเทคนิค gel electrophoresis บนอะกาโรสเจล 1 % (w/v) ผลที่ไดแสดงดังภาพที่ 21 (Kb) ภาพที ่21 Gel electrophoresis ของ PCR product ที่ไดจาก transformants ที่คาดวามยีีนที่สนใจสอดแทรกอยู และเพิ่มปริมาณยนีดวยเทคนิค PCR โดยใช annealing temperature เปน 58 องศา-เซลเซียส และรอบการทําปฏิกิริยา 30 รอบ ตรวจสอบบน 1% อะกาโรสเจล; M คือ 1 Kb DNA ladder marker; lane 1-3 คือ PCR product ของ plasmid ที่สกัดจากโคโลนีที่ 2, 3 และ 9 ตามลําดับ จากภาพที ่21 พบวามีแถบของ PCR product ของพลาสมิดที่สกัดจากโคโลนีที่ 3 และ 9 ขนาด 1000 bp เกิดขึ้น สวนโคโลนีที่ 2 พบเพียงแถบของดีเอ็นเอที่ใชเปนตนแบบในการเพิ่มปริมาณยีนเหลืออยู (แถบดีเอ็นเอที่เปนสวนของพลาสมิดขนาด 3000 bp) แตไมพบแถบดีเอ็นเอของ genomic DNA ที่สนใจแทรกอยูในพลาสมิด ซ่ึงเกิดจากดีเอ็นเอที่ใชเปน template นัน้ไมมียนีหรือgenomic DNAที่เราสนใจแทรกอยูในพลาสมิด ดังนั้นจากผลการทดลองนี้ซ่ึงพบวา PCR product ของพลาสมิดที่สกัดจากโคโลนีที่ 3 เกิดแถบดีเอ็นเอที่ชัดเจนที่สุด จึงทําการคัดเลือกพลาสมิดที่สกัดจากโคโลนีที่ 3 สงไปหาลําดับนิวคลีโอไทดที่สมบูรณตอไป เนื่องจากยนีที่เราสนใจ มีขนาดประมาณ 1000 bp ซ่ึงเปนขนาดที่ไดจากการทํานายไวดงัแสดงในภาพที่ 18

0.5 1.0

3.0 10

M 1 2 3

48

1.4. ศึกษาการเรียงลําดับนิวคลิโอไทดของยีนท่ีไดจาก EST clone AU058193 ในรูปของ genomic DNA

นําพลาสมิดที่สกัดจากโคโลนีที่ 3 ไปหาลําดับนิวคลิโอไทดที่สมบูรณ แลวนําผลของลําดับนิวคลิโอไทดที่ไดมาวเิคราะห โดยนาํมา alignment กับลําดับนิวคลิโอไทดที่สมบูรณของยีนในรูป genomic DNA ที่ทํานายไวไดผลดังแสดงในภาพที ่22 จากนั้นนาํผล consensus ซ่ึงเปนลําดับนิวคลิ-โอไทดของยนีที่ใหช่ือในภายหลังวา OsORFX (ยีนที่โคลนไดจาก EST clone AU058193 ในรูป genomic DNA) ที่ไดแสดงในภาพที่ 23 มาเปรียบเทียบความเหมือนกับ genomic DNA sequence ที่ทํานายไวและ cDNA sequence ที่สมบูรณของ EST AU058193 ไดผลดังแสดงในภาพที่ 24

1 50 ORFXpredict (1) ATGTATCCCTCCGCCCCTCCC-GACGCGTATAACAAGTACAGCGCCGGTG T_7comp (1) ATGTATCCNTCCGCCCCTCCCCGACGCGTATAACAAGTACAGCGCCGGTG T_SP6 (1) ATGTATCCCTCCGCCCCTCCC-GACGCGTATAACAAGTACAGCGCCGGTG Consensus (1) ATGTATCCCTCCGCCCCTCCC GACGCGTATAACAAGTACAGCGCCGGTG 51 100 ORFXpredict (50) CTCCACCGACGGCGCCGCCGCCGGCAACGTACCAGCTGCCGACGATGAAC T_7comp (51) CTCCACCGACGGCGCCGCCGCCGGCAACGTACCAGCTGCCGACGATGAAC T_SP6 (50) CTCCACCGACGGCGCCGCCGCCGGCAACGTACCAGCTGCCGACGATGAAC Consensus (51) CTCCACCGACGGCGCCGCCGCCGGCAACGTACCAGCTGCCGACGATGAAC 101 150 ORFXpredict (100) ACCCCACGCACCGGCGGCGGGCTGACGCGATGGTCCACCGGCCTTTTCCA T_7comp (101) ACCCCACGCACCGGCGGCGGGCTGACGCGATGGTCCACCNGCCTTTTCCA T_SP6 (100) ACCCCACGCACCGGCGGCGGGCTGACGCGATGGTCCACCGGCCTTTTCCA Consensus (101) ACCCCACGCACCGGCGGCGGGCTGACGCGATGGTCCACCGGCCTTTTCCA 151 200 ORFXpredict (150) CTGCATGGACGATCCCGGAAACTGTAAGTCCTTCAGTCAGTCAGTTTTCC T_7comp (151) CTGCATGGACGATCCCGGAAACTGTAAGTCCTTCAGTCAGTCAGTTTTCC T_SP6 (150) CTGCATGGACGATCCCGGAAACTGTAAGTCCTTCAGTCAGTCAGTTTTCC Consensus (151) CTGCATGGACGATCCCGGAAACTGTAAGTCCTTCAGTCAGTCAGTTTTCC 201 250 ORFXpredict (200) CACATGTTCTTCAGAGTTCAGAGTTCAGAGCAATAGATGGTTGCCGGCCC T_7comp (201) CACATGTTCTTCAGAGTTCAGAGTTCAGAGCAATAGATGGTTGCCGGCCC T_SP6 (200) CACATGTTCTTCAGAGTTCAGAGTTCAGAGCAATAGATGGTTGCCGGCCC Consensus (201) CACATGTTCTTCAGAGTTCAGAGTTCAGAGCAATAGATGGTTGCCGGCCC 251 300 ORFXpredict (250) ATGGTTGCTCAATCACACCTGTCGTTTCTCTCATGCAGGTCTCATCACAT T_7comp (251) ATGGTTGCTCAATCACACCTGTCGTTTCTCTCATGCAGGTCTCATCACAT T_SP6 (250) ATGGTTGCTCAATCACACCTGTCGTTTCTCTCATGCAGGTCTCATCACAT Consensus (251) ATGGTTGCTCAATCACACCTGTCGTTTCTCTCATGCAGGTCTCATCACAT 301 350 ORFXpredict (300) GCGTGTGCCCCTGCATCACCTTTGGGCAGGTCGCTGACATCGTGGACAAG T_7comp (301) GCGTGTGCCCCTGCATCACCTTTGGGCAGGTCGCTGACATCGTGGACAAG T_SP6 (300) GCGTGTGCCCCTGCATCACCTTTGGGCAGGTCGCTGACATCGTGGACAAG Consensus (301) GCGTGTGCCCCTGCATCACCTTTGGGCAGGTCGCTGACATCGTGGACAAG 351 400 ORFXpredict (350) GGCACCTGCCGTGAGTTCTCCCTTCTTCTCCTTCTTACCAGCGAAAGATT T_7comp (351) GGCACCTGCCGTGAGTTCTCCCTTCTTCTCCTTCTTACCAGCGAAAGATT T_SP6 (350) GGCACCTGCCGTGAGTTCTCCCTTCTTCTCCTTCTTACCAGCGAAAGATT Consensus (351) GGCACCTGCCGTGAGTTCTCCCTTCTTCTCCTTCTTACCAGCGAAAGATT 401 450 ORFXpredict (400) TTGGTCCATTCACCAGCTTGTTCGTTGATTCGGTGCGTGTGAAACTGTGA T_7comp (401) TTGGTCCATTCACCAGCTTGTTCGTTGATTCGGTGCGTGTGAAACTGTGA T_SP6 (400) TTGGTCCATTCACCAGCTTGTTCGTTGATTCGGTGCGTGTGAAACTGTGA Consensus (401) TTGGTCCATTCACCAGCTTGTTCGTTGATTCGGTGCGTGTGAAACTGTGA

49

451 500 ORFXpredict (450) TCGATTTTGCAGCATGCCTCGCGAGCGGGACGGCTTACGCGCTCCTCTGC T_7comp (451) TCGATTTTGCAGCATGCCTCGCGAGCGGGACGGCTTACGCGCTCCTCTGC T_SP6 (450) TCGATTTTGCAGCATGCCTCGCGAGCGGGACGGCTTACGCGCTCCTCTGC Consensus (451) TCGATTTTGCAGCATGCCTCGCGAGCGGGACGGCTTACGCGCTCCTCTGC 501 550 ORFXpredict (500) GCGTCGGGGATGGGGTGCCTGTACTCGTGCTTCTACCGGTCCAAGATGAG T_7comp (501) GCGTCGGGGATGGGGTGCCTGTACTCGTGCTTCTACCGGTCCAAGATGAG T_SP6 (500) GCGTCGGGGATGGGGTGCCTGTACTCGTGCTTCTACCGGTCCAAGATGAG Consensus (501) GCGTCGGGGATGGGGTGCCTGTACTCGTGCTTCTACCGGTCCAAGATGAG 551 600 ORFXpredict (550) GGCTCAGTTCGACCTGGACGAAGGGGATTGCCCCGATTTCCTCGTCCATT T_7comp (551) GGCTCAGTTCGACCTGGACGAAGGGGATTGCCCCGATTTCCTCGTCCATT T_SP6 (550) GGCTCAGTTCGACCTGGACGAAGGGGATTGCCCCGATTTCCTCGTCCATT Consensus (551) GGCTCAGTTCGACCTGGACGAAGGGGATTGCCCCGATTTCCTCGTCCATT 601 650 ORFXpredict (600) TCTGCTGCGAGTACTGCGCGCTGTGCCAGGAGTACCGGGAGCTCAAGAAC T_7comp (601) TCTGCTGCGAGTACTGCGCGCTGTGCCAGGAGTACCGGGAGCTCAAGAAC T_SP6 (600) TCTGCTGCGAGTACTGCGCGCTGTGCCAGGAGTACCGGGAGCTCAAGAAC Consensus (601) TCTGCTGCGAGTACTGCGCGCTGTGCCAGGAGTACCGGGAGCTCAAGAAC 651 700 ORFXpredict (650) CGCGGCTTCGACTTGGGGATCGGTAGGTGCAAGCACTGAAGCACAGTAGA T_7comp (651) CGCGGCTTCGACTTGGGGATCGGTAGGTGCAAGCACTGAAGCACAGTAGA T_SP6 (650) CGCGGCTTCGACTTGGGGATCGGTAGGTGCAAGCACTGAAGCACAGTAGA Consensus (651) CGCGGCTTCGACTTGGGGATCGGTAGGTGCAAGCACTGAAGCACAGTAGA 701 750 ORFXpredict (700) TTCTTCGCTTGCAAGCAAGAAATATCTTCTACTAGTACTACTTTTTTGAG T_7comp (701) TTCTTCGCTTGCAAGCAAGAAATATCTTCTACTAGTACTACTTTTTTGAG T_SP6 (700) TTCTTCGCTTGCAAGCAAGAAATATCTTCTACTAGTACTACTTTTTTGAG Consensus (701) TTCTTCGCTTGCAAGCAAGAAATATCTTCTACTAGTACTACTTTTTTGAG 751 800 ORFXpredict (750) GAGCACTCGAACTGACGAATAGTGTTTTCTGGTAAGGTTGGGCTGCCAAT T_7comp (751) GAGCACTCGAACTGACGAATAGTGTTTTCTGGTAAGGTTGGGCTGCCAAT T_SP6 (750) GAGCACTCGAACTGAC---------------------------------- Consensus (751) GAGCACTCGAACTGACGAATAGTGTTTTCTGGTAAGGTTGGGCTGCCAAT 801 850 ORFXpredict (800) GTGGACAGGCAGAGGCGAGGCGTCACCGGAGCGTCGGTGATGGGAGCTCC T_7comp (801) GTGGACAGGCAGAGGCGAGGCGTCACCGGAGCGTCGGTGATGGGAGCTCC T_SP6 (766) -------------------------------------------------- Consensus (801) GTGGACAGGCAGAGGCGAGGCGTCACCGGAGCGTCGGTGATGGGAGCTCC 851 900 ORFXpredict (850) TGGCGTCCCGGTCGGCATGATGAGGTAGACGAAGATGGCGAACGCGAAAT T_7comp (851) TGGCGTCCCGGTCGGCATGATGAGGTAGACGAAGATGGCGAACGCGAAAT T_SP6 (766) -------------------------------------------------- Consensus (851) TGGCGTCCCGGTCGGCATGATGAGGTAGACGAAGATGGCGAACGCGAAAT 901 950 ORFXpredict (900) GGTGCGCTTTTGTGTT-CTTGTGTTGCAATATGTTCT-CTGTGGTTTT-C T_7comp (901) GGTGCGCTTTTGTGTTGCTTGTGTTGCAATATGTTCTNCTGTGGTTTTNC T_SP6 (766) -------------------------------------------------- Consensus (901) GGTGCGCTTTTGTGTT CTTGTGTTGCAATATGTTCT CTGTGGTTTT C 951 1000 ORFXpredict (947) ATTTGGAGATCACTGCCTATTTCATGTATCGTATACTCCTATTTAGCTTG T_7comp (951) ATTTGGAGAT---------------------------------------- T_SP6 (766) -------------------------------------------------- Consensus (951) ATTTGGAGAT

50

1001 1034 ORFXpredict (997) ATTTGTTGGGTTTCATGTAATATATGACGCATTC T_7comp (961) ---------------------------------- T_SP6 (766) ---------------------------------- Consensus (1001)

ภาพที่ 22 ผลการเปรียบเทยีบลําดับนิวคลิโอไทดในรูปของ genomic DNA (ORFX predict) ที่ไดมีการทํานายโดยใช Vector NTI Suite 6 กับลําดับนิวคลิโอไทดที่ไดจากการสงพลาสมิดไปทํา sequencing เมื่อใช T7 เปน forward primer (T_7comp) และ SP6 เปน reward primer (T_SP6)

1 ATGTATCCCT CCGCCCCTCC CGACGCGTAT AACAAGTACA GCGCCGGTGC

51 TCCACCGACG GCGCCGCCGC CGGCAACGTA CCAGCTGCCG ACGATGAACA

101 CCCCACGCAC CGGCGGCGGG CTGACGCGAT GGTCCACCGG CCTTTTCCAC

151 TGCATGGACG ATCCCGGAAA CTGTAAGTCC TTCAGTCAGT CAGTTTTCCC

201 ACATGTTCTT CAGAGTTCAG AGTTCAGAGC AATAGATGGT TGCCGGCCCA

251 TGGTTGCTCA ATCACACCTG TCGTTTCTCT CATGCAGGTC TCATCACATG

301 CGTGTGCCCC TGCATCACCT TTGGGCAGGT CGCTGACATC GTGGACAAGG

351 GCACCTGCCG TGAGTTCTCC CTTCTTCTCC TTCTTACCAG CGAAAGATTT

401 TGGTCCATTC ACCAGCTTGT TCGTTGATTC GGTGCGTGTG AAACTGTGAT

451 CGATTTTGCA GCATGCCTCG CGAGCGGGAC GGCTTACGCG CTCCTCTGCG

501 CGTCGGGGAT GGGGTGCCTG TACTCGTGCT TCTACCGGTC CAAGATGAGG

551 GCTCAGTTCG ACCTGGACGA AGGGGATTGC CCCGATTTCC TCGTCCATTT

601 CTGCTGCGAG TACTGCGCGC TGTGCCAGGA GTACCGGGAG CTCAAGAACC

651 GCGGCTTCGA CTTGGGGATC GGTAGGTGCA AGCACTGAAG CACAGTAGAT

701 TCTTCGCTTG CAAGCAAGAA ATATCTTCTA CTAGTACTAC TTTTTTGAGG

751 AGCACTCGAA CTGACGAATA GTGTTTTCTG GTAAGGTTGG GCTGCCAATG

801 TGGACAGGCA GAGGCGAGGC GTCACCGGAG CGTCGGTGAT GGGAGCTCCT

851 GGCGTCCCGG TCGGCATGAT GAGGTAGACG AAGATGGCGA ACGCGAAATG

901 GTGCGCTTTT GTGTTGCTTG TGTTGCAATA TGTTCTNCTG TGGTTTTNCA

951 TTTGGAGAT ภาพที่ 23 ลําดับนิวคลิโอไทดที่สมบูรณของยีนที่ไดจาก EST clone AU058193 ในรูปของ genomic DNA (OsORFX) ที่ไดจากการโคลนยีนที่มีขนาด 959 bp

51

1 50 cDNA AU058193 (1) ATGTATCCCTCCGCCCCTCCCGACGCGTATAACAAGTACAGCGCCGGTGC ORFXpredict (1) ATGTATCCCTCCGCCCCTCCCGACGCGTATAACAAGTACAGCGCCGGTGC OsORFX genomic DNA (1) ATGTATCCCTCCGCCCCTCCCGACGCGTATAACAAGTACAGCGCCGGTGC Consensus (1) ATGTATCCCTCCGCCCCTCCCGACGCGTATAACAAGTACAGCGCCGGTGC 51 100 cDNA AU058193 (51) TCCACCGACGGCGCCGCCGCCGGCAACGTACCAGCTGCCGACGATGAACA ORFXpredict (51) TCCACCGACGGCGCCGCCGCCGGCAACGTACCAGCTGCCGACGATGAACA OsORFX genomic DNA (51) TCCACCGACGGCGCCGCCGCCGGCAACGTACCAGCTGCCGACGATGAACA Consensus (51) TCCACCGACGGCGCCGCCGCCGGCAACGTACCAGCTGCCGACGATGAACA 101 150 cDNA AU058193 (101) CCCCACGCACCGGCGGCGGGCTGACGCGATGGTCCACCGGCCTTTTCCAC ORFXpredict (101) CCCCACGCACCGGCGGCGGGCTGACGCGATGGTCCACCGGCCTTTTCCAC OsORFX genomic DNA (101) CCCCACGCACCGGCGGCGGGCTGACGCGATGGTCCACCGGCCTTTTCCAC Consensus (101) CCCCACGCACCGGCGGCGGGCTGACGCGATGGTCCACCGGCCTTTTCCAC 151 200 cDNA AU058193 (151) TGCATGGACGATCCCGGAAACTGT-------------------------- ORFXpredict (151) TGCATGGACGATCCCGGAAACTGTAAGTCCTTCAGTCAGTCAGTTTTCCC OsORFX genomic DNA (151) TGCATGGACGATCCCGGAAACTGTAAGTCCTTCAGTCAGTCAGTTTTCCC Consensus (151) TGCATGGACGATCCCGGAAACTGTAAGTCCTTCAGTCAGTCAGTTTTCCC 201 250 cDNA AU058193 (175) -------------------------------------------------- ORFXpredict (201) ACATGTTCTTCAGAGTTCAGAGTTCAGAGCAATAGATGGTTGCCGGCCCA OsORFX genomic DNA (201) ACATGTTCTTCAGAGTTCAGAGTTCAGAGCAATAGATGGTTGCCGGCCCA Consensus (201) ACATGTTCTTCAGAGTTCAGAGTTCAGAGCAATAGATGGTTGCCGGCCCA 251 300 cDNA AU058193 (175) ---------------------------------------CTCATCACATG ORFXpredict (251) TGGTTGCTCAATCACACCTGTCGTTTCTCTCATGCAGGTCTCATCACATG OsORFX genomic DNA (251) TGGTTGCTCAATCACACCTGTCGTTTCTCTCATGCAGGTCTCATCACATG Consensus (251) TGGTTGCTCAATCACACCTGTCGTTTCTCTCATGCAGGTCTCATCACATG 301 350 cDNA AU058193 (186) CGTGTGCCCCTGCATCACCTTTGGGCAGGTCGCTGACATCGTGGACAAGG ORFXpredict (301) CGTGTGCCCCTGCATCACCTTTGGGCAGGTCGCTGACATCGTGGACAAGG OsORFX genomic DNA (301) CGTGTGCCCCTGCATCACCTTTGGGCAGGTCGCTGACATCGTGGACAAGG Consensus (301) CGTGTGCCCCTGCATCACCTTTGGGCAGGTCGCTGACATCGTGGACAAGG 351 400 cDNA AU058193 (236) GCACCTGCC----------------------------------------- ORFXpredict (351) GCACCTGCCGTGAGTTCTCCCTTCTTCTCCTTCTTACCAGCGAAAGATTT OsORFX genomic DNA (351) GCACCTGCCGTGAGTTCTCCCTTCTTCTCCTTCTTACCAGCGAAAGATTT Consensus (351) GCACCTGCCGTGAGTTCTCCCTTCTTCTCCTTCTTACCAGCGAAAGATTT 401 450 cDNA AU058193 (245) -------------------------------------------------- ORFXpredict (401) TGGTCCATTCACCAGCTTGTTCGTTGATTCGGTGCGTGTGAAACTGTGAT OsORFX genomic DNA (401) TGGTCCATTCACCAGCTTGTTCGTTGATTCGGTGCGTGTGAAACTGTGAT Consensus (401) TGGTCCATTCACCAGCTTGTTCGTTGATTCGGTGCGTGTGAAACTGTGAT 451 500 cDNA AU058193 (245) -----------CATGCCTCGCGAGCGGGACGGCTTACGCGCTCCTCTGCG ORFXpredict (451) CGATTTTGCAGCATGCCTCGCGAGCGGGACGGCTTACGCGCTCCTCTGCG OsORFX genomic DNA (451) CGATTTTGCAGCATGCCTCGCGAGCGGGACGGCTTACGCGCTCCTCTGCG Consensus (451) CGATTTTGCAGCATGCCTCGCGAGCGGGACGGCTTACGCGCTCCTCTGCG 501 550 cDNA AU058193 (284) CGTCGGGGATGGGGTGCCTGTACTCGTGCTTCTACCGGTCCAAGATGAGG ORFXpredict (501) CGTCGGGGATGGGGTGCCTGTACTCGTGCTTCTACCGGTCCAAGATGAGG OsORFX genomic DNA (501) CGTCGGGGATGGGGTGCCTGTACTCGTGCTTCTACCGGTCCAAGATGAGG Consensus (501) CGTCGGGGATGGGGTGCCTGTACTCGTGCTTCTACCGGTCCAAGATGAGG 551 600 cDNA AU058193 (334) GCTCAGTTCGACCTGGACGAAGGGGATTGCCCCGATTTCCTCGTCCATTT ORFXpredict (551) GCTCAGTTCGACCTGGACGAAGGGGATTGCCCCGATTTCCTCGTCCATTT OsORFX genomic DNA (551) GCTCAGTTCGACCTGGACGAAGGGGATTGCCCCGATTTCCTCGTCCATTT Consensus (551) GCTCAGTTCGACCTGGACGAAGGGGATTGCCCCGATTTCCTCGTCCATTT 601 650 cDNA AU058193 (384) CTGCTGCGAGTACTGCGCGCTGTGCCAGGAGTACCGGGAGCTCAAGAACC ORFXpredict (601) CTGCTGCGAGTACTGCGCGCTGTGCCAGGAGTACCGGGAGCTCAAGAACC OsORFX genomic DNA (601) CTGCTGCGAGTACTGCGCGCTGTGCCAGGAGTACCGGGAGCTCAAGAACC Consensus (601) CTGCTGCGAGTACTGCGCGCTGTGCCAGGAGTACCGGGAGCTCAAGAACC 651 700 cDNA AU058193 (434) GCGGCTTCGACTTGGGGATCGGT--------------------------- ORFXpredict (651) GCGGCTTCGACTTGGGGATCGGTAGGTGCAAGCACTGAAGCACAGTAGAT OsORFX genomic DNA (651) GCGGCTTCGACTTGGGGATCGGTAGGTGCAAGCACTGAAGCACAGTAGAT Consensus (651) GCGGCTTCGACTTGGGGATCGGTAGGTGCAAGCACTGAAGCACAGTAGAT 701 750 cDNA AU058193 (457) -------------------------------------------------- ORFXpredict (701) TCTTCGCTTGCAAGCAAGAAATATCTTCTACTAGTACTACTTTTTTGAGG

52

OsORFX genomic DNA (701) TCTTCGCTTGCAAGCAAGAAATATCTTCTACTAGTACTACTTTTTTGAGG Consensus (701) TCTTCGCTTGCAAGCAAGAAATATCTTCTACTAGTACTACTTTTTTGAGG 751 800 cDNA AU058193 (457) -------------------------------------TGGGCTGCCAATG ORFXpredict (751) AGCACTCGAACTGACGAATAGTGTTTTCTGGTAAGGTTGGGCTGCCAATG OsORFX genomic DNA (751) AGCACTCGAACTGACGAATAGTGTTTTCTGGTAAGGTTGGGCTGCCAATG Consensus (751) AGCACTCGAACTGACGAATAGTGTTTTCTGGTAAGGTTGGGCTGCCAATG 801 850 cDNA AU058193 (470) TGGACAGGCAGAGGCGAGGCGTCACCGGAGCGTCGGTGATGGGAGCTCCT ORFXpredict (801) TGGACAGGCAGAGGCGAGGCGTCACCGGAGCGTCGGTGATGGGAGCTCCT OsORFX genomic DNA (801) TGGACAGGCAGAGGCGAGGCGTCACCGGAGCGTCGGTGATGGGAGCTCCT Consensus (801) TGGACAGGCAGAGGCGAGGCGTCACCGGAGCGTCGGTGATGGGAGCTCCT 851 900 cDNA AU058193 (520) GGCGTCCCGGTCGGCATGATGAGGTAGACGAAGATGGCGAACGCGAAATG ORFXpredict (851) GGCGTCCCGGTCGGCATGATGAGGTAGACGAAGATGGCGAACGCGAAATG OsORFX genomic DNA (851) GGCGTCCCGGTCGGCATGATGAGGTAGACGAAGATGGCGAACGCGAAATG Consensus (851) GGCGTCCCGGTCGGCATGATGAGGTAGACGAAGATGGCGAACGCGAAATG 901 950 cDNA AU058193 (570) GTGCGCTTTTGTGTT-CTTGTGTTGCAATATGTTCT-CTGTGGTTTT-CA ORFXpredict (901) GTGCGCTTTTGTGTT-CTTGTGTTGCAATATGTTCT-CTGTGGTTTT-CA OsORFX genomic DNA (901) GTGCGCTTTTGTGTTGCTTGTGTTGCAATATGTTCTNCTGTGGTTTTNCA Consensus (901) GTGCGCTTTTGTGTT CTTGTGTTGCAATATGTTCT CTGTGGTTTT CA 951 1000 cDNA AU058193 (617) TTTGGAGATCACTGCCTATTTCATGTATCGTATACTCCTATTTAGCTTGA ORFXpredict (948) TTTGGAGATCACTGCCTATTTCATGTATCGTATACTCCTATTTAGCTTGA OsORFX genomic DNA (951) TTTGGAGAT----------------------------------------- Consensus (951) TTTGGAGATCACTGCCTATTTCATGTATCGTATACTCCTATTTAGCTTGA 1001 1033 cDNA AU058193 (667) TTTGTTGGGTTTCAAAAAAAAAAAAAAAAA--- ORFXpredict (998) TTTGTTGGGTTTCATGTAATATATGACGCATTC OsORFX genomic DNA (960) --------------------------------- Consensus (1001) TTTGTTGGGTTTCA AA A A A A

ภาพที่ 24 ผลการเปรียบเทยีบลําดับนิวคลิโอไทดในรูปของ genomic DNA (ORFX predict) ที่ไดมีการทํานายโดยใช Vector NTI Suite 6 กับลําดับนิวคลิโอไทดที่ไดจากการสงพลาสมิดไปทํา sequencing (OsORFX) และ cDNA sequence ที่สมบูรณของ EST AU058193 (cDNA AU058193)

2. การศึกษาคุณลักษณะตางๆ ของยีนในรปู genomic DNA 2.1 การวิเคราะห Sequence 2.1.1 การหาสวนของ intron และ exon ของยีนในรูป genomic DNA เมื่อนําลําดับนิวคลิโอไทดในรูปของ genomic DNA มาทํา sequence alignment กับลําดับนิวคลิโอไทดที่ไดจาก EST clone AU058193 ในรูปของ cDNA โดยใชโปรแกรม Vector NTI Suite 6 เพื่อหาสวนของ intron และ exon ของยีนพบวา สามารถทราบขนาดของยีนในรูปของ genomic DNA (OsORFX genomic DNA) ไดเทากับ 959 bp ประกอบดวย 4 exons (แสดงดวยตัวอักษรสีแดงแถบสีเทา) และ 3 introns (แสดงดวยตวัอักษรสีดํา) ดังรายละเอียดในภาพที่ 25

53

1 50 CDNA AU058193 (1) ATGTATCCCTCCGCCCCTCCCGACGCGTATAACAAGTACAGCGCCGGTGC OsORFX genomic DNA (1) ATGTATCCCTCCGCCCCTCCCGACGCGTATAACAAGTACAGCGCCGGTGC Consensus (1) ATGTATCCCTCCGCCCCTCCCGACGCGTATAACAAGTACAGCGCCGGTGC 51 100 CDNA AU058193 (51) TCCACCGACGGCGCCGCCGCCGGCAACGTACCAGCTGCCGACGATGAACA OsORFX genomic DNA (51) TCCACCGACGGCGCCGCCGCCGGCAACGTACCAGCTGCCGACGATGAACA Consensus (51) TCCACCGACGGCGCCGCCGCCGGCAACGTACCAGCTGCCGACGATGAACA 101 150 CDNA AU058193 (101) CCCCACGCACCGGCGGCGGGCTGACGCGATGGTCCACCGGCCTTTTCCAC OsORFX genomic DNA (101) CCCCACGCACCGGCGGCGGGCTGACGCGATGGTCCACCGGCCTTTTCCAC Consensus (101) CCCCACGCACCGGCGGCGGGCTGACGCGATGGTCCACCGGCCTTTTCCAC 151 200 CDNA AU058193 (151) TGCATGGACGATCCCGGAAACTGT-------------------------- OsORFX genomic DNA (151) TGCATGGACGATCCCGGAAACTGTAAGTCCTTCAGTCAGTCAGTTTTCCC Consensus (151) TGCATGGACGATCCCGGAAACTGT 201 250 CDNA AU058193 (175) -------------------------------------------------- OsORFX genomic DNA (201) ACATGTTCTTCAGAGTTCAGAGTTCAGAGCAATAGATGGTTGCCGGCCCA Consensus (201) 251 300 CDNA AU058193 (175) ---------------------------------------CTCATCACATG OsORFX genomic DNA (251) TGGTTGCTCAATCACACCTGTCGTTTCTCTCATGCAGGTCTCATCACATG Consensus (251) CTCATCACATG 301 350 CDNA AU058193 (186) CGTGTGCCCCTGCATCACCTTTGGGCAGGTCGCTGACATCGTGGACAAGG OsORFX genomic DNA (301) CGTGTGCCCCTGCATCACCTTTGGGCAGGTCGCTGACATCGTGGACAAGG Consensus (301) CGTGTGCCCCTGCATCACCTTTGGGCAGGTCGCTGACATCGTGGACAAGG 351 400 CDNA AU058193 (236) GCACCTGCC----------------------------------------- OsORFX genomic DNA (351) GCACCTGCCGTGAGTTCTCCCTTCTTCTCCTTCTTACCAGCGAAAGATTT Consensus (351) GCACCTGCC 401 450 CDNA AU058193 (245) -------------------------------------------------- OsORFX genomic DNA (401) TGGTCCATTCACCAGCTTGTTCGTTGATTCGGTGCGTGTGAAACTGTGAT Consensus (401) 451 500 CDNA AU058193 (245) -----------CATGCCTCGCGAGCGGGACGGCTTACGCGCTCCTCTGCG OsORFX genomic DNA (451) CGATTTTGCAGCATGCCTCGCGAGCGGGACGGCTTACGCGCTCCTCTGCG Consensus (451) CATGCCTCGCGAGCGGGACGGCTTACGCGCTCCTCTGCG 501 550 CDNA AU058193 (284) CGTCGGGGATGGGGTGCCTGTACTCGTGCTTCTACCGGTCCAAGATGAGG OsORFX genomic DNA (501) CGTCGGGGATGGGGTGCCTGTACTCGTGCTTCTACCGGTCCAAGATGAGG Consensus (501) CGTCGGGGATGGGGTGCCTGTACTCGTGCTTCTACCGGTCCAAGATGAGG 551 600 CDNA AU058193 (334) GCTCAGTTCGACCTGGACGAAGGGGATTGCCCCGATTTCCTCGTCCATTT OsORFX genomic DNA (551) GCTCAGTTCGACCTGGACGAAGGGGATTGCCCCGATTTCCTCGTCCATTT Consensus (551) GCTCAGTTCGACCTGGACGAAGGGGATTGCCCCGATTTCCTCGTCCATTT 601 650 CDNA AU058193 (384) CTGCTGCGAGTACTGCGCGCTGTGCCAGGAGTACCGGGAGCTCAAGAACC OsORFX genomic DNA (601) CTGCTGCGAGTACTGCGCGCTGTGCCAGGAGTACCGGGAGCTCAAGAACC Consensus (601) CTGCTGCGAGTACTGCGCGCTGTGCCAGGAGTACCGGGAGCTCAAGAACC 651 700 CDNA AU058193 (434) GCGGCTTCGACTTGGGGATCGGT--------------------------- OsORFX genomic DNA (651) GCGGCTTCGACTTGGGGATCGGTAGGTGCAAGCACTGAAGCACAGTAGAT Consensus (651) GCGGCTTCGACTTGGGGATCGGT 701 750 CDNA AU058193 (457) -------------------------------------------------- OsORFX genomic DNA (701) TCTTCGCTTGCAAGCAAGAAATATCTTCTACTAGTACTACTTTTTTGAGG Consensus (701) 751 800 CDNA AU058193 (457) -------------------------------------TGGGCTGCCAATG OsORFX genomic DNA (751) AGCACTCGAACTGACGAATAGTGTTTTCTGGTAAGGTTGGGCTGCCAATG Consensus (751) TGGGCTGCCAATG 801 850 CDNA AU058193 (470) TGGACAGGCAGAGGCGAGGCGTCACCGGAGCGTCGGTGATGGGAGCTCCT OsORFX genomic DNA (801) TGGACAGGCAGAGGCGAGGCGTCACCGGAGCGTCGGTGATGGGAGCTCCT Consensus (801) TGGACAGGCAGAGGCGAGGCGTCACCGGAGCGTCGGTGATGGGAGCTCCT 851 900 CDNA AU058193 (520) GGCGTCCCGGTCGGCATGATGAGGTAGACGAAGATGGCGAACGCGAAATG OsORFX genomic DNA (851) GGCGTCCCGGTCGGCATGATGAGGTAGACGAAGATGGCGAACGCGAAATG Consensus (851) GGCGTCCCGGTCGGCATGATGAGGTAGACGAAGATGGCGAACGCGAAATG

54

901 950 CDNA AU058193 (570) GTGCGCTTTTGTGTT-CTTGTGTTGCAATATGTTCT-CTGTGGTTTT-CA OsORFX genomic DNA (901) GTGCGCTTTTGTGTTGCTTGTGTTGCAATATGTTCTNCTGTGGTTTTNCA Consensus (901) GTGCGCTTTTGTGTT CTTGTGTTGCAATATGTTCT CTGTGGTTTT CA 951 1000 CDNA AU058193 (617) TTTGGAGATCACTGCCTATTTCATGTATCGTATACTCCTATTTAGCTTGA OsORFX genomic DNA (951) TTTGGAGAT----------------------------------------- Consensus (951) TTTGGAGAT 1001 1030 CDNA AU058193 (667) TTTGTTGGGTTTCAAAAAAAAAAAAAAAAA OsORFX genomic DNA (960) ------------------------------ Consensus (1001)

ภาพที่ 25 intron และ exon ของ OsORFX genomic DNA จากการทํา sequence alignment ระหวางลําดับนิวคลิโอไทด OsORFX genomic DNA และ cDNA sequence ที่สมบูรณของ EST AU058193 โดยใช Vector NTI Suite 6 Program

2.1.2 การเปรียบเทียบความเหมือนของลําดับนิวคลิโอไทดของยีนท่ีโคลนไดกับขอมูลของยีนอ่ืนใน GenBank นําลําดับนวิคลิโอไทดทีส่มบูรณของยนีที่โคลนไดจาก EST clone AU058193 ในรูปของ genomic DNA (OsORFX genomic DNA)ไปเปรียบเทียบความเหมือนลําดับนวิคลิโอไทดอ่ืนใน GenBank โดยใช Blastn ผาน http://www.ncbi.nih.gov. พบวาลําดบันิวคลีโอไทดที่สมบูรณของยีนที่ไดจาก EST clone AU058193 ในรูปของ genomic DNA (OsORFX genomic DNA) ที่มีขนาด 959 bp มีความเหมือนกับลําดับเบสของ AP008208, AP004817 และ AP005002 100% ดังแสดงในภาพที่ 26

55

ภาพที่ 26 ผลของการนําลําดบันิวคลิโอไทดที่สมบูรณของยีนที่ไดจาก EST clone

AU058193 ในรูปของ genomic DNA (OsORFX genomic DNA)ไปเปรียบเทียบความเหมือนลําดบันิวคลิโอไทดอ่ืนใน GenBank โดยใช Blastn ผาน http://www.ncbi.nih.gov.

2.2 การตรวจสอบคุณลักษณะของยนี OsORFX โดยใชเทคนคิ Southern blotting ในการทดลองนี้ไดนํา เทคนิค Southern blotting มาทําการวิเคราะหจาํนวน copy number ของยนีที่โคลนได ซ่ึงนําดีเอ็นเอที่สกัดไดจากตนออนขาวอายุ 2 สัปดาห มาตัดดวยเอนไซมตัดจําเพาะ 8 ชนิด คือ PvuII, SacII, EcoRV, EcoRI, ,BamHI, PstI และ HindIII มา hybridize กับ genomic DNA ของยีน OsORFX ที่ติดฉลากดวย digoxigenin (DIG) เปนยีนติดตาม(gene probe) จากผลการทดลองพบวา genome ของขาวที่ตัดดวยเอนไซมตัดจําเพาะ PvuII และ SacII เมื่อตรวจสอบดวยยีนติดตาม OsORFX ที่อยูในรปู genomic DNA จะเกดิแถบดีเอ็นเอสองชิ้น(ดังแสดงในภาพที่ 26) โดยที่ Lane 1 ที่ตัดดวยเอนไซม PvuII จะเกิดแถบดีเอ็นเอชิน้แรกที่มีขนาดประมาณ 10,000 bp และแถบที่สองมีขนาดประมาณ 400-500 bp, Lane 2 ที่ตัดดวยเอนไซม SacII ทั้งสองแถบดีเอ็นเอนั้นมีขนาดมากกวา 9000 -10,000 bp สวน Lane 3- 7 ที่ตัดดวยเอนไซม EcoRV, EcoRI, BamHI, PstI และ HindIII นั้น พบแถบดีเอ็นเอเพยีงชิ้นเดยีวที่มขีนาดมากกวา 10,000 bp

56

ในขณะทีพ่บแถบดีเอ็นเอขนาดใหญเพียงแถบเดียวใน lane 8 ซ่ึงแถบดังกลาวแสดงใหเห็นวามียีน OsORFX ใน genome ขาวจริง ซ่ึงจากผลการทดลองที่ไดสามารถวิเคราะหและบงชี้จํานวน copy number ของยีน OsORFX ใน genome ของขาวไดวามี 1 copy เทานั้น

ภาพที่ 27 Southern blot analysis ของ OsORFX M1 : 1 Kb DNA ladder marker Lane 1: ดีเอ็นเอที่ตัดดวยเอนไซมตัดจําเพาะ PvuII Lane 2: ดีเอ็นเอที่ตัดดวยเอนไซมตัดจําเพาะ SacII Lane 3: ดีเอ็นเอที่ตัดดวยเอนไซมตัดจําเพาะ EcoRV Lane 4: ดีเอ็นเอที่ตัดดวยเอนไซมตัดจําเพาะ EcoRI Lane 5: ดีเอ็นเอที่ตัดดวยเอนไซมตัดจําเพาะ BamHI

Lane 6: ดีเอ็นเอที่ตัดดวยเอนไซมตัดจําเพาะ PstI Lane 7: ดีเอ็นเอที่ตัดดวยเอนไซมตัดจําเพาะ HindIII Lane 7: ดีเอ็นเอขาวที่ไมไดตัดดวยเอนไซมตัดจําเพาะ

M2 : VC Lambda / Hind III Marker

57

3. การศึกษาการแสดงออกของยีน 3.1 การศึกษาการแสดงออกของยีนโดยวิธี Semi – Quantitative RT-PCR เพื่อตรวจสอบวา cDNA ที่ใชในการตดิตามการแสดงออกของยีนที่เตรียมไดมาจากอาร- เอ็นเอเริ่มตนมคีวามเขมขนเทากันหรือไม จึงไดวิเคราะหการแสดงออกของยีนที่มีการแสดงออกตลอดเวลากอน ซ่ึงในการทดลองนี้จะตรวจสอบการแสดงออกของยีนที่ถอดรหัสให 18s rRNA โดยนํา RT-PCR product หรือ first stranded cDNA มาทาํการเพิ่มปริมาณยนีดวยวิธี PCR โดยใช primer ที่จําเพาะตอยีน 18s rRNA และใชจาํนวนรอบของการทําปฏิกิริยา 28 รอบ ไดผลการทดลองดังแสดงในภาพที่ 28 (ดานลาง) จากภาพพบวาผลิตภัณฑที่ไดจากการทาํ PCR ของยีน 18s rRNA ในตัวอยางตางๆ มีความเขมของแถบเทากนั ซ่ึงแสดงใหทราบถึงปริมาณอารเอ็นเอเริ่มตนที่ใชในการสังเคราะห cDNA มีปริมาณเทากนัทุกตวัอยาง ซ่ึงจากผลการทดลองที่ไดนี้ บงชีว้าสามารถนํา เอา cDNA ที่สังเคราะหไดจากตัวอยางตางๆ นี้ไปเปนแมแบบในการวิเคราะหระดับการแสดงออกของยีน OsORFX ตอไปได OsORFX

18s rRNA ภาพที่ 28 การแสดงออกของยีน OsORFX ในขาวระยะกอนออกรวง (before heading stage) และ ในระยะหลังออกรวง (after heading stage) (ดานบน) และการแสดงออกของยีน 18s rRNA (ดานลาง) Lane 1 : ใบแกกอนออกรวง Lane 2 : ใบธงกอนออกรวง Lane 3 : รวงกอนออกรวง Lane 4 : ใบแกหลังออกรวง Lane 5 : ใบธงหลังออกรวง Lane 6 : รวงหลังออกรวง

58

จากการศกึษาการแสดงออกของยีนในระยะกอนออกรวง (before heading stage) 1 วันและ ในระยะหลังออกรวง (after heading stage) 1 วันโดยใชเทคนิค semi- quantitative RT- PCR ซ่ึงเริ่มจากการเพิ่มปริมาณดเีอ็นเอของ cDNA โดยการทาํ PCR แลวนําไปแยกบนแผนอะกาโรสเจล จากนั้นยายแถบดีเอ็นเอไปไวบนแผนไนลอนเมมเบรนดวยเทคนิค Southern blotting และนําแผนไนลอนที่ไดไป hybridize กบั gene probe ที่เปนยีน OsORFX ในรูป cDNA ที่ปริมาณ 900 นาโน-กรัมไดผลการทดลองดังแสดงในภาพที่ 28 (ดานบน) ซ่ึงจากภาพพบวาการแสดงออกของยีนจะ แสดงออกมากในใบแกกอนออกรวงชัดกวาในใบแกหลังออกรวง สวนการแสดงออกของยีนในระดับรองลงมาจะพบวาการแสดงออกของยีนในสวนของรวงในระยะหลังออกรวงมากกวาในระยะกอนออกรวง และสุดทายพบวาการแสดงออกของยีนในสวนของใบธงในระยะกอนออกรวงชัดกวาในระยะหลังออกรวง ซ่ึงจากผลการทดลองเมื่อพิจารณาเฉพาะสวนของรวงพบวาผลการทดลองไดสอดคลองกับงานวิจัยของ Ngampanya ในป 2003 ที่ไดกลาวรายงานถึงระดับการแสดง ออกของยีน OsORFX จะแสดงออกในสวนของรวงหรือเมล็ดในระยะหลังออกรวงหรือเมล็ดในระยะหลังผสมเกสรและจะมกีารลดระดับการแสดงออกของยีนดังกลาวลงเรื่อยๆ เมื่อเมล็ดหรือรวงพัฒนาไปเปนเมล็ดที่สมบูรณ นอกจากนีจ้ากผลการทดลองยังพบขอมูลเพิ่มเติมวามีการแสดงออกของยีน OsORFX มากในสวนของใบธงในระยะกอนออกรวงและจะลดลงในระยะหลงัออกรวง ซ่ึงตรงกับขอมูลของ International Rice Research Institute, 2000 ที่ไดกลาวไววาสวนของใบธงมีหนาที่สําคัญมากในการปรุงอาหารในระยะที่ขาวสรางรวง ดังนั้นในการศกึษาครั้งนี้ผูวจิยัจึงสนใจศึกษาการแสดงออกของยีน OsORFX ที่แสดงออกมากในสวนที่เปนรวงขาวหรือดอกขาวในระยะหลังออกรวงจนไปถึงการพัฒนาเปนเมล็ดขาวที่สมบูรณอยางละเอียด โดยแบงเปน 6 ระยะการศึกษาคือ ระยะขณะดอกบานหรือเมลด็ที่ 0 วัน, ระยะเมล็ดหลังดอกบานที่ 1 วัน (หลังการผสมเกสร), ระยะพัฒนาเปนเมล็ดที่ 3 วัน, ระยะพัฒนาเปนเมล็ดที่ 10 วัน,ระยะพัฒนาเปนเมล็ดที่ 15 วันและระยะพัฒนาเปนเมล็ดที่ 30 วัน ซ่ึงไดผลดังแสดงในภาพที่ 29 (ตรงกลาง) จากการทดลองพบวาการแสดงออกของยีน OsORFX ในขาวระยะดอกบานพบการแสดงออกของยีนดังกลาว และตอมาในขาวระยะหลังที่ดอกไดเกิดการผสมเกสรพบวามีการแสดงออกของยีน OsORFX ที่ชัดเจนมากที่สุด และจะลดระดับการแสดงออกของยีนลงเร่ือยๆ จากผลการทดลองดังกลาว พบวาสอดคลองและตรงกับรายงานของ Ngampanya ในป 2003ที่กลาวไววายนี OsORFX จะมีบทบาทสําคัญตอการผสมเกสร ปฏิสนธิ และการพัฒนาเปนเมล็ดของขาว

59

ลักษณะเมล็ดขาว ท่ีระยะตาง ๆ

OsORFX

18s rRNA ภาพท่ี 29 การแสดงออกของยีน OsORFX ในขาวระยะระหวางการออกดอกและการพัฒนาเปนเมล็ดขาว (grain filling stage) (กลาง) และ การแสดงออกของยีน 18s rRNA (ลาง)และลักษณะเมล็ดขาวที่กําลังพัฒนาในระยะตางๆ (บน) Lane 1 : เมล็ดขณะดอกบานหรือเมล็ดหลังดอกบานที่ 0 วัน(ระยะกอนผสมเกสร) Lane 2 : เมล็ดหลังดอกบานที่ 1 วัน (ระยะหลังผสมเกสร) Lane 3 : เมล็ดหลังดอกบานที่ 3 วัน Lane 4 : เมล็ดหลังดอกบานที่ 10 วัน Lane 5 : เมล็ดหลังดอกบานที่ 15 วัน Lane 6 : เมล็ดหลังดอกบานที่ 30 วัน (ระยะเมล็ดขาวที่สมบูรณ) เนื่องจากเพื่อใหทราบความสําคัญและบทบาทการแสดงออกของยีน OsORFX ใหครอบคลุมมากยิ่งขึ้นนอกจะศึกษากับขาวชนิด japonica ผูวิจัยจึงไดสนใจศึกษาการแสดงออกของยีนดังกลาวในขาวขาวดอกมะลิ 105 ซ่ึงเปนขาวชนดิ Indica เพิ่มเติมซ่ึงเปนขาวที่นยิมปลูกในประเทศไทยเพื่อนําไปเปนความรูในการศึกษาและพัฒนาใหเมลด็ขาวมีความสมบรูณมากยิ่งขึน้ โดยผูวิจยัไดศกึษาการแสดงออกของยีน OsORFX ในระยะและชวงเวลาเดียวกันกับการศึกษาในขาวชนิด japonica ซ่ึงในการศึกษาการแสดงออกของยีนในระยะกอนออกรวง (before heading stage) และ ในระยะหลังออกรวง (after heading stage) โดยใชเทคนิค semi- quantitative RT- PCR ซ่ึงเริ่มจากการเพิ่มปริมาณดเีอ็นเอของ cDNA โดยการทาํ PCR แลวนําไปแยกบนแผนอะกาโรสเจล

60

จากนั้นยายแถบดีเอ็นเอไปไวบนแผนไนลอนเมมเบรนดวยเทคนิค Southern blotting และนําแผนไนลอนที่ไดไป hybridize กบั gene probe ที่เปนยีน OsORFX ในรูป cDNA ที่ปริมาณ 900 นาโน-กรัมได ผลการทดลองดังแสดงในภาพที่ 30 (ดานบน) ซ่ึงจากภาพพบวาการแสดงออกของยีนจะแสดงออกมากในระยะหลังออกรวงมากกวาในระยะกอนออกรวง โดยที่ยีนจะแสดงออกมากที่สุดในสวนของรวง ใบธง และใบแก ตามลําดบั เมื่อพิจารณาการแสดงออกของยีนเฉพาะในสวนของรวงพบวาการแสดงออกของยีนดังกลาวเหมือนกับขาวชนิด Japonica พันธุ Nipponbare โดยที่มีการแสดง ออกของยีนมากในสวนของรวงในระยะหลังออกรวงเชนกนั แตเมื่อพจิารณาในสวนของใบแกและใบธงของขาวชนิด Indica พันธุ ขาวดอกมะลิ 105 พบวามีการแสดงออกของยีนที่แตกตางกันกบัขาวชนิด Japonica พันธุ Nipponbare โดยพบวาในขาวชนิด Indica พันธุ ขาวดอกมะลิ 105 มีการแสดงออกของยีน OsORFX มากในสวนของใบธงและใบแกในระยะหลังออกรวง ตามลําดับ ซ่ึงในขาวชนิด Japonica พันธุ Nipponbare จะมีการแสดงออกของยีนดงักลาวมากในสวนของใบแกและใบธงในระยะกอนออกรวงมากกวาในระยะหลังออกรวง แตอยางไรก็ตามไมวาจะเปนขาวชนิด Japonica หรือขาวชนิด Indica จากผลการทดลองพบวายนี OsORFX จะแสดง ออกมากในระยะระหวางการออกดอกหรอืผสมเกสรและยังมีผลตอการพัฒนาเปนเมล็ดอีกดวย OsORFX 18s rRNA ภาพที่ 30 การแสดงออกของยีน OsORFX ในขาวหอมมะลิ 105 ในชวงระยะกอนออกรวง (Before heading stage) และ ในระยะหลังออกรวง (After heading stage) (ดานบน) และ การแสดงออกของยีน 18s rRNA (ดานลาง) Lane 1 : ใบแกกอนออกรวง Lane 2 : ใบธงกอนออกรวง Lane 3 : รวงกอนออกรวง Lane 4 : ใบแกหลังออกรวง Lane 5 : ใบธงหลังออกรวง Lane 6 : รวงหลังออกรวง

61

จากขอมูลการรายงานของ Ngampanya ในป 2003 ที่ไดพบวา predicted amino acid sequence ของยีน EST clone AU058193 ดังกลาวนั้นคลายกับยนีที่เกีย่วของกับชวงแรกของ การออกดอกในพิทูเนยี (Guyon et al., 2000) และมะเขือเทศ (Frary et al., 2000) เปนอยางมากและ ยังพบวายีนจาก EST clone AU058193 (Ngampanya, 2003) ที่แสดงความเหมือนกับยนี ORFX ของมะเขือเทศคอนขางมาก โดยยีน ORFX เกี่ยวของกับการแบงเซลลของคารเปลและมีความ สัมพันธกับขนาดใหญและเล็กของผลมะเขือเทศ ตรวจพบการแสดงออกในระยะแรกที่มกีารพฒันาของดอกและมีโครงสรางคลายกับ human oncogene (Frary et al., 2000) ซ่ึงตรวจพบระดับการแสดงออกที่สูงของ ORFX และ rice EST AU058193 ในสวนของ maternal tissue ในมะเขือเทศและขาวตาม ลําดับทําใหเกดิการตั้งสมมุตฐิานวา เปนไปไดหรือไมวา rice EST AU058193 เปนสวนหนึ่งของยีนที่มีบทบาทและหนาทีเ่ชนเดยีวกับ ORFX ในมะเขือเทศ ฉะนั้นจากผลการทดลองการแสดงออกของยีน OsORFX (ยีนที่โคลนไดจาก EST clone AU058193 (Ngampanya, 2003)) ที่ศึกษาในระยะระหวางการออกดอกจนถึงการพัฒนาเปนเมล็ดที่สมบูรณ จึงพบวาผลการทดลองเปนไปตามสมมติฐานที่ตัง้ไวที่กลาวไววายนี OsORFX นั้นจะมีบทบาทและหนาที่เชนเดยีวกับ ยีน ORFX ในมะเขือเทศกลาวคือยีน OsORFX ของขาวนัน้จะมกีารแสดงออกและเกี่ยวของกับกระบวนการผสมเกสรและการปฏิสนธิในดอก ซ่ึงผลที่ไดพบจากการทดลองที่ยีน OsORFX จะแสดงออกมากในรวงที่อยูในระยะกอนออกรวง นอกจากนีย้ีน OsORFX ยังอาจเกี่ยวของกับการแบงเซลลในระหวางการสรางเมล็ดโดยทราบไดจากผลการทดลองที่ยีน OsORFX จะแสดงออก ในระยะที่เมลด็กําลังพัฒนาเปนเมล็ดที่สมบูรณและยีนดงักลาวนี้จะลดการแสดงออกลงเมื่อเมล็ดขาวพัฒนาเปนเมล็ดที่สมบูรณ

62

บทที่ 5

สรุปผลการทดลอง

1. ลําดับนิวคลีโอไทดที่สมบูรณของยีน OsORFX (ยีนที่โคลนไดจากจาก EST clone AU058193) ในรูป genomic ประกอบดวย 959 bp มี 4 exons และ 3 introns และสามารถตรวจพบจํานวน copy number ของยีน OsORFX ใน genome ของขาว มี 1 copy number 2. เมื่อนําลําดับนิวคลีโอไทดที่สมบูรณของยีน OsORFX ในรูป genomic ทําการเปรียบเทียบขอมูลใน GenBank พบวาลําดับนิวคลีโอไทดของยีน OsORFX อยูในโครโมโซมที่ 2 ของขาว 3. การแสดงออกของยีน OsORFX ในตนขาวระยะกอนและหลังออกรวง 1 วันของขาว japonica พันธุ Nipponbare จะมากในสวนของรวงระยะหลังออกรวงมากกวารวงในระยะกอนออกรวง 4. การแสดงออกของยีน OsORFX ในระยะระหวางการออกดอกและพัฒนาเปนเมล็ดที่สมบูรณของขาว japonica พันธุ Nipponbare จะแสดงออกสูงมากในสวนของรวงหรือดอกขาวระยะหลังออกรวงหรือดอกบาน 1 วัน (หลังผสมเกสร) และจะมีปริมาณการแสดงออกของยีน OsORFX ลดลงเรื่อยๆ จนดอกขาวพัฒนากลายเปนเมล็ดขาวที่สมบูรณ ดังนั้น จึงสามารถบงชี้ไดวายีน OsORFX มีความสําคัญตอการผสมเกสรของขาวและระยะเริ่มแรกของการสรางเมล็ดขาวที่สมบูรณ 5. การแสดงออกของยีน OsORFX ในตนขาวระยะกอนและหลังออกรวง 1 วันขาว Indica พันธุ ขาวขาวดอกมะลิ 105 จะแสดงออกสูงมากในสวนของรวงระยะหลังออกรวง จึงสามารถบงชี้ไดวายีน OsORFX มีความสําคัญตอการผสมเกสรของขาวและระยะเริ่มแรกของการสรางเมล็ดขาวที่สมบูรณเชนกัน

63

บรรณานุกรม

Champagne, E. T. 1996. Rice starch: composition and characteristrics. Cereal Food

World 41(1): 833-838.

Chen, W., Tang, D., Suo, J., Zhang, Y. and Xue, Y. 2001. Expressional profiling of

genes related to pollination and fertilization in rice. Life Sciences 324; 1- 6.

Eisen, M. B. and Brown, P. O. 1999. DNA arrays for analysis of gene expression.

Methods Enzymology 303; 179- 205.

Frary, A., Nesbitt, T. C., Frary, A., Grandillo, S., van der Knaap, E., Cong, B., Liu, J.,

Meller, J., Elber, R., Alpert, K. B. and Tanksley, S. D. 2000. fw2.2: A quantitive trait

locus key to the evolotion of tomato fruit size. Science 289; 85- 88.

Goff, S. A., Ricke, D., Lan, T- H., Presting, G., Wang, R., Dunn, M., Glazebrook, J.,

Sessions, A., Oeller, P., Varma, H., Hadley. D., Hutchison, D., Martin, C.,

Katagiri, F., Lange, B. M., Moughamer, T., Xia, Y., Budworth, P., Zhong, J.,

Miguel, T., Paszkowski, U., Zhang, S., Colbert, M., Sun, W- L., Chen, L.,

Cooper, B., Park, S., Wood, T. C., Mao, L., Quail, P., Wing, R., Dean, R., Yu,

Y., Zharkikh, A., Shen, R., Sahasrabudhe, S., Thomas, A., Cannings, R.,

Gutin, A., Pruss, D., Reid, J., Tavtigian, S., Mitchell, J., Eldredge, G., Scholl,

T., Miller, R. M., Bhatnagar, S., Adey, N., Rubano, T., Tusneem, N.,

Robinson, R., Feldhaus, J., Macalma, T., Oliphant, A., Briggs, S. 2002. A

draft sequence of the rice genome (Oryza sativa L. ssp. Japonica). Science

296; 92- 100.

Guyon, V. N., Astwood, J. D., Garner, E. C., Dunker, K. and Taylor, L. P. 2000.

Isolation and characterization of cDNAs expressed in the early stages of

flavonol- induced pollen germination in petunia. Plant Physiology 123; 699-

710.

Henry, R. J. and P.S. Keltlewell. 1996. Cereal Grain Quality. Chapman & Hall,

London.

Hoseney, R. C. 1986. Principles of Cereal Science and Technology. The American

Assoiation of Chemists, Inc., St. Paul Minnesots.

64

Hoshikawa K. The growing rice plant an anatomical monograph. 1st ed.

Nobunkyo Tokyo, 1989.

International Rice Research Institute. 2002.Growth and Morphology of The Rice

Plant [online]. accessed 17 November 2007. Available from http://www.

knowledgebank .irri.org/pu_growthMorph.htm

Julino, B.O. 1985. Criteria and tests for rice grain qualities.Rice : Chemistry and

Technology 2nd ed. The American Assoiation of cereal chemistry, Inc., St.

Paul, Minnesota.443-542.

Julino, B.O. 1993. Rice in Human Nutrition. FAO Food and Nutrition Series.The

International Rice Research Institute (IRRI) No 26.

Mascarenhas, J. P. 1990. Gene activity during pollen development. Annu Rev Plant

Physiol Plant Mol Biol 41; 317- 338.

Mazur, B., Krebbers, E. and Tingey, S. 1999. Gene discovery and product

development for grain quality traits. Science 285; 372- 375.

McDonald, D. J. 1979. Rice. Chepter 3. Australian field crop Vol 2 : Tropical cereals,

Oil seeds, grain legumes and the other crops. Angus and Robertson, London;

70-94.

Mo, Y- Y., Nagel, C. and Taylor, L. P. 1992. Characterization of a pollen- expressed

receptor- like kinase gene of Petunia inflata and the activity of its encoded

kinase.Plant Cell 6; 709- 721.

Modenhauer, K. A. K., Gibbons, J. H. 2003. Rice Morphology and Development.

Chepter 2.1: CW Smith, RH. Dilday, eds. Rice. Origin, History, Technology

And Production. John Wiley and Sons, Inc., Hoboken, New jersey. 103-127.

Ngampanya, B. 2003. Molecular genetics characterization of sugar transporters and

related genes during flowering, grain filling and seed germination in rice

(Oryza sativa L.).Ph.D. Thesis, Mahidol University,Bangkok, Thailand.169pp.

Oka, H. I. 1988. Origin of cultivated of rice.Elsevier.Amsterdam.

Ruuska, S. A., Girke, T., Benning, C. and Ohlrogge, J. B. 2002. Contrapuntal

networks of gene expression during Arabidopsis seed filling. Plant Cell 14;

1191- 1206.

Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd ed.

Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Habor Laboratory Press, 1989.

65

Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W. and Brown, P. O. 1995. Quantitative monitoring

of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science

270; 368-69.

Taylor, L. P. and Hepler, P. K. 1997. Pollen germination and tube growth. Annu Rev

Plant Physiol Plant Mol Biol 48; 461- 491.

USDA.1982. Rice Inspection Hand book. FGIS, U.S Department of Agriculture,

Washington, DC.

Wang Yonghong and Li Jiayang. 2005. The plant architecture of rice (Oryza sativa).

Plant Mol Biol 59; 75-84.

Willing, R., Bashe, D. and Mascarenhas, J. P. 1988. An analysis of the quantity and

diversity of messenger RNAs from pollen and shoots of Zea mays. Theor Appl

Genet 75; 751- 753.

Willing, R. P. and Mascarenhas, J. P. 1984. Analysis of complexity and diversity of

mRNAs from pollen and shoots of Tradescantia. Plant Physiol 75; 865- 868.

Wolter- Art, M., Lush, W. M., Mariani, C. 1998. Lipids are required for directional

pollen- tube growth. Nature 392; 818- 821.

Ye, X., Al- Babili, S., Kloti, A., Zhang, J., Lucca, P., Beyer, P. and Potrykus, I. 2000.

Engineering the provitamin A (beta- carotene) biosynthetic pathway into

(carotenoid- free) rice endosperm. Science 287; 303- 305.

Ylstra, B., Busscher, J., Franken, J., Hollman, P. C. H., Mol, J. N. M. and van Tunen,

A. J. 1994. Flavonols and fertilization in Petunia hybrida: localization and

mode of action during pollen tube growth. Plant Journal 6; 201- 212.

Zhu, T., Budworth, P., Chen, W., Provart, N., Chang, H-S., Guimil, S., Su, W., Estes,

B., Zou, G. and Wang, X. 2003. Transcriptional control of nutrient partitioning

during rice grain filling. Plant Biotechnology Journal 1; 59- 70.

บุญหงษ จงคิด. 2547. ขาวและเทคโนโลยีการผลิต. กรุงเทพฯ: มหาวิทยาลัยธรรมศาสตร อรอนงค นัยวกิุล. 2550. ขาววิทยาศาสตรและเทคโนโลยี. กรุงเทพฯ : มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร.

ภาคผนวก ก การเตรียมอาหารเลี้ยงเชื้อและสารเคมีที่ใชในการทดลอง

1. อาหารเลี้ยงเชื้อ Luria Bertani (LB) Medium 1. Luria Bertani broth ประกอบดวย - Bacto tryptone 10 g/l - Bacto Yeast Extract 5 g/l - NaCl 10 g/l ขั้นตอนการเตรียม (ปริมาตร 100 ml) 1. ช่ังสารตาง ๆ ดังตอไปนี้ ใสลงใน flask - Bacto tryptone 10 g/l = 1.0 g - Bacto Yeast Extract 5 g/l = 0.5 g - NaCl 10 g/l = 1.0 g 2. เติม milli Q water ปริมาตร 100 ml ใสลงใน flask ผสมสารละลายใหเขากนั 3. นําไป autoclave ที่ความดนั 15 psi, 121oC นาน 15 นาที 4. ในกรณีที่ตองเติม ampicillin ควรเติมใหมีความเขมขนสุดทายในอาหารเทากับ 100 μg/ml

โดยจากตัวอยางตองเติม ampicillin ปริมาตร 100 μl (เมื่อใช ampicillin ความเขมขนเทากับ 100 mg/ml)

2. Luria Bertani Agar ประกอบดวย - Bacto tryptone 10 g/l - Bacto Yeast Extract 5 g/l - NaCl 10 g/l - agar 14 g/l

67

ขั้นตอนการเตรียม (ปริมาตร 100 ml) 1. ช่ังสารตาง ๆ ดังตอไปนี้ ใสลงใน flask - Bacto tryptone 10 g/l = 1.0 g - Bacto Yeast Extract 5 g/l = 0.5 g - NaCl 10 g/l = 1.0 g - agar 14 g/l = 1.4 g 2. เติม milli Q water ปริมาตร 100 ml ใสลงใน flask ผสมสารละลายใหเขากนั 3. นําไป autoclave ที่ความดนั 15 psi, 121oC นาน 15 นาที แลวปลอยใหเย็นลงประมาณ 50oC 4. ในกรณีที่ตองเติม ampicillin ควรเติมใหมีความเขมขนสุดทายในอาหารเทากับ 100 μg/ml โดยจากตัวอยางตองเติม ampicillin ปริมาตร 100 μl (เมื่อใช ampicillin ความเขมขนเทากับ 100 mg/ml) 5. เทอาหารลงบน plate ที่ sterile แลว plate ละประมาณ 15 ml โดยทําในตูปลอดเชื้อ ทิ้งไวใหเย็น 2. อาหารเลี้ยงตนขาว (Murashing and Skoog, 1962) 2.1 การเตรียมสารตนตอ (MS stocks)

Macronutrients mg/l Iron mg/l NH4NO3 1,650 Sodium EDTA 37.25 KNO3 1,900 FeSO4. 7H2O 27.85 CaCl2.2H2O 440 MgSO4. 7H2O 370 Organic components mg/l KH2PO4 170 Glycine 2

Micronutrients mg/l Nicotinic acid 0.5 H3BO3 6.2 Pyridoxine 0.5 MnSO4. H2O 6.9 Thiamine 0.1 ZnSO4. H2O 6.14 KI 0.83 Na2MoO4 0.25 pH 5.8 CuSO4. 5H2O 0.025 CoCl2. 6H2O 0.025

68

2.2 การเตรียม mannitol MW = 182.18 เตรียม 0.25 M mannitol 1 ลิตร ช่ัง D-mannitol = 182.18 x 0.25 = 45.545 กรัม น้ํา 1 ลิตร 2.3 การเตรียมอาหารเลี้ยงตนขาว นําสารละลายตนตอมาตามปริมาตรดังตอไปนี้เพื่อเตรียมอาหาร 1 ลิตร Stock Macro Micro Organic Fe manitol I (10X) II(100X) III(1000X) IV(100) V(100X) ml ของstock/L 100 10 10 100 10 เทสาระลายทั้งหมดตามปริมาตรดังกลาว ลงในบีกเกอร ปรับ pH 5.8 แลวเติมน้ํากลั่นจนครบ 1 ลิตร เมื่อนําไปเพาะเลี้ยงตนขาวทาํการเจือจางอาหาร MS ใหมีความเขมขนเปน 1/10 X กอนนําไปใชงาน 3. สารเคมี 1. Extraction buffer ประกอบดวย - 1 M Tris-HCl pH 8.0 - 0.5 M EDTA pH 8.0 - 5 M NaCl - CTAB - β-mercaptoethanol ขั้นตอนการเตรียม 1. ตวงสารตาง ๆ ใหไดปริมาตรดังตอไปนี ้

- 1 M Tris-HCl pH 8.0 ปริมาตร 10 ml - 0.5 M EDTA pH 8.0 ปริมาตร 4 ml - 5 M NaCl ปริมาตร 28 ml - CTAB 2 g - β-mercaptoethanol ปริมาตร 2 ml

2. ปรับปริมาตรใหได 100 ml โดยใช miili Q water ที่ sterile แลว

69

2. สารละลาย 1 M Tris base ขั้นตอนการเตรียม 1. ช่ังสาร Tris base เทากับ 12.114 g 2. ละลายในน้าํกลั่นใหไดปริมาตรสุดทายเทากับ 100 ml 3. นําสารละลายที่เตรียมไดทําการฆาเชื้อโดยการ autoclave ที่ความดัน 15 psi, 121oC นาน 15

นาที 3. สารละลาย 0.1 N HCl

.)(10

MWdx = C (normality ของ HCl)

stock มีความเขมขนเทากับ 12.08 N จาก C1V1 = C2V2 (12.08 N)V1 = (0.1 N)(100 ml) V1 = 8.278 ml

ตวง conc. HCl 8.278 ml แลวคอย ๆ เทใสลงในน้ํา miili Q ที่ sterile แลว 91.722 ml 4. สารละลาย 1 M Tris-HCl pH 8.0 ขั้นตอนการเตรียม

1. ตวง Tris base ปริมาตร 50 ml ผสมกับ 0.1 N NaCl ปริมาตร 29.2 ml 2. ปรับปริมาตรใหไดเทากับ 100 ml ดวยน้ํา miili Q ที่ sterile แลว และทําการปรบั pH ให

ไดเทากับ 8.0 5. สารละลาย 0.5 M EDTA pH 8.0 ขั้นตอนการเตรียม 1. ช่ังสาร EDTA เทากับ 18.164 g 2. ละลายในน้าํ miili Q ที่ sterile แลวปริมาตร 100 ml และทําการปรับ pH ใหไดเทากับ 8.0 6. สารละลาย 5 M NaCl ขั้นตอนการเตรียม 1. ช่ังสาร NaCl เทากับ 29.2 g 2. ละลายในน้าํกลั่นใหไดปริมาตรสุดทายเทากับ 100 ml 3. นําสารละลายที่เตรียมไดทําการฆาเชื้อโดยการ autoclave ที่ความดัน 15 psi, 121oC นาน 15

นาที

70

7. สารละลาย 20%SDS (sodium dodecyl sulfate) ขั้นตอนการเตรียม 1. ช่ัง SDS 10 g ละลายในน้ํากล่ันปริมาตร 25 ml 2. ปรับปริมาตรใหได 50 ml ดวยน้ํา miili Q ที่ sterile แลว 8. สารละลาย chloroform : isoamyl alcohol (24:1) ขั้นตอนการเตรียม

1. ตวง chloroform ปริมาตร 96 ml และ isoamyl alcohol ปริมาตร 4 ml ดวยกระบอกตวงที่ sterile แลว ใสขวดที่ sterile แลว

2. ผสมสารละลายใหเขากัน 9. 70% ethanol ขั้นตอนการเตรียม 1. ตวง 95%ethanol ปริมาตร 737 ml และ น้ํา miili Q ที่ sterile แลวปริมาตร 263 ml ดวย

กระบอกตวงที่ sterile แลว ใสขวดที่ sterile แลว 2. ผสมสารละลายใหเขากัน 10. สารละลาย 0.1 M CaCl2 ขั้นตอนการเตรียม 1. ช่ังสาร CaCl2 0.56 g ละลายในน้ํากลั่นปริมาตร 30 ml 2. ปรับปริมาตรใหได 50 ml ดวยน้ํากลั่น 3. นําสารละลายที่เตรียมไดทําการฆาเชื้อโดยการ autoclave ที่ความดัน 15 psi, 121oC นาน 15

นาที 11. สารละลาย 3 M sodium acetate pH5.6 ขั้นตอนการเตรียม 1. ช่ังสาร sodium acetate 12.3 g ละลายในน้ํากลั่นปริมาตร 30 ml 2. ปรับ pH ของสารละลายดวย glacial acetic acid ให pH สุดทายเทากับ 5.6 3. ปรับปริมาตรสุดทายใหได 50 ml ดวยน้ํากลั่น 4. นําสารละลายที่เตรียมไดทําการฆาเชื้อโดยการ autoclave ที่ความดัน 15 psi, 121oC นาน 15 นาท ี

71

12. สารละลาย 100 mg/ml ampicillin ขั้นตอนการเตรียม 1. ช่ังยา ampicillin 200 mg ละลายในน้ํา miili Q ที่ sterile แลวปริมาตร 2 ml 2. นําสารละลายที่เตรียมไดมาฆาเชื้อโดยวิธี filter sterile แลวนําไปเกบ็ที่อุณหภูมิ -20 oC 13. สารละลาย TE solution pH 8.0 ขั้นตอนการเตรียม 1. เตรียมสารละลาย 10 mM Tris-HCl pH 8.0 และ 1 mM EDTA 2. ปรับ pH ของสารละลายดวย glacial acetic acid ให pH สุดทายเทากับ 8.0 3. ปรับปริมาตรสุดทายใหได 50 ml ดวยน้ํากล่ัน 4. นําสารละลายที่เตรียมไดทําการฆาเชื้อโดยการ autoclave ที่ความดัน 15 psi, 121oC นาน 15

นาที เก็บสารละลายที่อุณหภูมิ 4oC 14. สารละลาย 0.4 M NaOH/2% SDS (ควรเตรียมใหมทุกคร้ัง) ขั้นตอนการเตรียม 1. เตรียมสารละลาย 0.4 M NaOH และ 2% SDS 2. ผสมสารทั้งสองในอัตราสวน 1:1 โดยปริมาตร 15. สารละลาย 0.4 M NaOH ขั้นตอนการเตรียม 1. ช่ังสาร NaOH 0.8 g ละลายในน้ํากลั่นปริมาตร 30 ml 2. ปรับปริมาตรใหได 50 ml ดวยน้ํากลั่น 3. นําสารละลายที่เตรียมไดทําการฆาเชื้อโดยการ autoclave ที่ความดัน 15 psi, 121oC นาน 15 นาท ี 16. สารละลาย phenol : chloroform (1:1) ขั้นตอนการเตรียม 1. ตวง chloroform และ phenol ในอัตราสวน 1:1 โดยปรมิาตรดวยกระบอกตวงที่ sterile แลว 2. ผสมสารละลายใหเขากัน 17. สารละลาย 10X TAE buffer ขั้นตอนการเตรียม 1. ช่ังสาร Tris base 48.46 g แลวตวงสารตาง ๆ ใหไดปริมาตรดังตอไปนี้

- glacial acetic acid ปริมาตร 10.22 ml - 0.5 M EDTA pH 8.0 ปริมาตร 20 ml

72

2. ผสมสารตาง ๆ ใหเขากัน แลวปรับ pH ของสารละลายดวย glacial acetic acid ให pH สุดทายเทากับ 8.0

3. นําสารละลายที่เตรียมไดทําการฆาเชื้อโดยการ autoclave ที่ความดัน 15 psi, 121oC นาน 15 นาที

18. 1.2% agarose ขั้นตอนการเตรียม ช่ัง agarose 0.6 g ละลายในสารละลาย 1X TAE buffer ที่ sterile แลวปริมาตร 50 ml 19. 6X agarose gel-loading buffer ขั้นตอนการเตรียม 1. เตรียมสารเคมีตาง ๆ ดังตอไปนี ้

- 0.25% bromophenol blue - 40%(w/v) sucrose in water

2. ละลาย sucrose ในน้าํกลั่น จากนั้นจึงละลาย bromophenol blue ลงไป 3. ผสมใหเขากันแลวทําใหปลอดเชื้อโดยการกรองผานตัวกรองขนาด 0.2 μm ใสลงในขวดแกวท่ีผานการฆาเชื้อแลวในตูปลอดเชื้อ

73

ภาคผนวก ข วิธีการทํา agarose gel eletrophoresis และแถบของดีเอ็นเอ Marker

การเตรียมแผนเจล 1. ช่ัง agrose ใสลงใน eletrophoresis buffer (1X TAE buffer) ใหไดความเขมขนทีเ่หมาะสม โดยในการทดลองนี้เตรียมทีค่วามเขมขน 0.8% และ 1.2% 2. ทําการหลอม agarose ในขอ 1 โดยการตมใน microwave 3. เมื่อ agarose หลอมหมดแลว ทําใหเย็นลงจนมีอุณหภูมิประมาณ 50% จากนั้นจึงเติมethidium bromide ลงไปไดใหความเขมขนสุดทาย 0.5 μg/ml ผสมใหเขากัน แลวเทเจลดังกลาวลงใน chamber ของชุด electrophoresis วางหวี (comb) สําหรับทําชองลงในเนื้อเจลโดยใหปลายลางของซ่ีหวีอยูเหนือผิวถาดประมาณ 1 มม. 4. ทิ้งใหแผนเจลแข็งตัวเปนเวลาประมาณ 15-20 นาท ีการทํา eletrophoresis 1. คอย ๆ ดึงหวีออกจากเนื้อเจลอยางระมัดระวัง ไดเปนหลุมเล็ก ๆ บนแผนเจล นําถาดวางในชองวางถาดของชุดเจล eletrophoresis เท eletrophoresis buffer ลงไปจนทวมแผนเจล 2. ผสมสารละลาย DNA ตัวอยางและสารละลาย DNA มาตรฐาน กับ 10X loading buffer ในอัตราสวน 5:2 โดยปริมาตรและมีปริมาตรรวมไมเกนิความจุของหลุมแตละหลุม 3. ใช autopipette ดูดสารละลายผสมจากขอ 2 ใสลงในหลุมแตละหลุม สารละลายจะไหลลงหลุมอันเนื่องมาจากความหนาแนนของ glycerol แลวบันทึกวาหยอดสารละลาย DNA ชนิดใดลงไปที่หลุมใด 4. ตอสายไฟระหวางขั้วของชุด electrophoresis กับขั้วของเครื่องจายไฟกระแสตรง โดยใหขั้วที่อยูดานเดียวกับหลุมเจลเปนดานลบ เปดเครื่องจายไฟฟาแลวปรับแรงเคลื่อนไฟฟาใหได 80 Volt 5. ปดเครื่องจายไฟฟาเมื่อสีน้ําเงินของ bromophenol blue เคล่ือนที่ไปไดจนมีระยะทางเปน 4/5 ของแผนเจล การยอมและถายภาพแผนเจล วางแผนเจลลงบนแผนฉายแสงของเครื่อง Gel document แลวดูผลจากเครื่อง gel documentation

74

1. 1 kb DNA Ladder (New England BioLab)

ท่ีมา : http://www.neb.com/nebecomm/products/productN3232.asp

75

2. 1 kb DNA Ladder (Fermentas)

ท่ีมา : http://www.fermentas.com/catalog/electrophoresis/generulers.htm#1kb

76

3. VC Lambda / Hind III Marker

ท่ีมา : http://www.vivantis.com/main/wfdetailssumm.aspx?pgID=29

77

ภาคผนวก ค ลําดับนิวคลีโอไทดที่ไดจากการสงไปทํา sequencing เมื่อใช Primer เปน T7 และ SP6

79

ภาคผนวก ง ลําดับนิวคลีโอไทดจีโนมของขาว

1 GGTACGAGTA GTACTGTAGT TAACAGTTGC CTTAAAAGTT TACAAGTGAT CCATGCTCAT CATGACATCA ATTGTCAACG GAATTTTCAA ATGTTCACTA 51 ATTACTCCAA CGGCTAGACA ATGAAGTGTG AATGATGAGT ACGCCCTATA TAATGAGGTT GCCGATCTGT TACTTCACAC TTACTACTCA TGCGGGATAT 101 TGTGCTGGCC GCTGAGGTAT ACAGTATATG GGCCAACGGC CACATGACGA ACACGACCGG CGACTCCATA TGTCATATAC CCGGTTGCCG GTGTACTGCT 151 AAATATTTAT TGACTTGAAT TGGTTCCTAC ACTTCATACC AACTTGTTGC TTTATAAATA ACTGAACTTA ACCAAGGATG TGAAGTATGG TTGAACAACG 201 TTCAATTATC CAGCTTTGGA AACTCGCTGT TTGTTTCTTG GTTCGATTAA AAGTTAATAG GTCGAAACCT TTGAGCGACA AACAAAGAAC CAAGCTAATT 251 TAATGAGCCC GACGGTTCGA CGTACTGGAG CTGGAGAATC CTTTAAAGCA ATTACTCGGG CTGCCAAGCT GCATGACCTC GACCTCTTAG GAAATTTCGT 301 CAACAAGGTA AGGAGAACCA GGTCTTGCCT TCCGCTTTAG CAGAGGCATA GTTGTTCCAT TCCTCTTGGT CCAGAACGGA AGGCGAAATC GTCTCCGTAT 351 AACAAAGGTC TGTATTCCCA AGCAATGTAT CCCTCCGCCC CTCCCGACGC TTGTTTCCAG ACATAAGGGT TCGTTACATA GGGAGGCGGG GAGGGCTGCG 401 GTATAACAAG TACAGCGCCG GTGCTCCACC GACGGCGCCG CCGCCGGCAA CATATTGTTC ATGTCGCGGC CACGAGGTGG CTGCCGCGGC GGCGGCCGTT 451 CGTACCAGCT GCCGACGATG AACACCCCAC GCACCGGCGG CGGGCTGACG GCATGGTCGA CGGCTGCTAC TTGTGGGGTG CGTGGCCGCC GCCCGACTGC 501 CGATGGTCCA CCGGCCTTTT CCACTGCATG GACGATCCCG GAAACTGTAA GCTACCAGGT GGCCGGAAAA GGTGACGTAC CTGCTAGGGC CTTTGACATT 551 GTCCTTCAGT CAGTCAGTTT TCCCACATGT TCTTCAGAGT TCAGAGTTCA CAGGAAGTCA GTCAGTCAAA AGGGTGTACA AGAAGTCTCA AGTCTCAAGT 601 GAGCAATAGA TGGTTGCCGG CCCATGGTTG CTCAATCACA CCTGTCGTTT CTCGTTATCT ACCAACGGCC GGGTACCAAC GAGTTAGTGT GGACAGCAAA 651 CTCTCATGCA GGTCTCATCA CATGCGTGTG CCCCTGCATC ACCTTTGGGC GAGAGTACGT CCAGAGTAGT GTACGCACAC GGGGACGTAG TGGAAACCCG 701 AGGTCGCTGA CATCGTGGAC AAGGGCACCT GCCGTGAGTT CTCCCTTCTT TCCAGCGACT GTAGCACCTG TTCCCGTGGA CGGCACTCAA GAGGGAAGAA 751 CTCCTTCTTA CCAGCGAAAG ATTTTGGTCC ATTCACCAGC TTGTTCGTTG GAGGAAGAAT GGTCGCTTTC TAAAACCAGG TAAGTGGTCG AACAAGCAAC 801 ATTCGGTGCG TGTGAAACTG TGATCGATTT TGCAGCATGC CTCGCGAGCG TAAGCCACGC ACACTTTGAC ACTAGCTAAA ACGTCGTACG GAGCGCTCGC 851 GGACGGCTTA CGCGCTCCTC TGCGCGTCGG GGATGGGGTG CCTGTACTCG CCTGCCGAAT GCGCGAGGAG ACGCGCAGCC CCTACCCCAC GGACATGAGC 901 TGCTTCTACC GGTCCAAGAT GAGGGCTCAG TTCGACCTGG ACGAAGGGGA ACGAAGATGG CCAGGTTCTA CTCCCGAGTC AAGCTGGACC TGCTTCCCCT 951 TTGCCCCGAT TTCCTCGTCC ATTTCTGCTG CGAGTACTGC GCGCTGTGCC AACGGGGCTA AAGGAGCAGG TAAAGACGAC GCTCATGACG CGCGACACGG 1001 AGGAGTACCG GGAGCTCAAG AACCGCGGCT TCGACTTGGG GATCGGTAGG TCCTCATGGC CCTCGAGTTC TTGGCGCCGA AGCTGAACCC CTAGCCATCC 1051 TGCAAGCACT GAAGCACAGT AGATTCTTCG CTTGCAAGCA AGAAATATCT ACGTTCGTGA CTTCGTGTCA TCTAAGAAGC GAACGTTCGT TCTTTATAGA 1101 TCTACTAGTA CTACTTTTTT GAGGAGCACT CGAACTGACG AATAGTGTTT AGATGATCAT GATGAAAAAA CTCCTCGTGA GCTTGACTGC TTATCACAAA 1151 TCTGGTAAGG TTGGGCTGCC AATGTGGACA GGCAGAGGCG AGGCGTCACC AGACCATTCC AACCCGACGG TTACACCTGT CCGTCTCCGC TCCGCAGTGG

80

1201 GGAGCGTCGG TGATGGGAGC TCCTGGCGTC CCGGTCGGCA TGATGAGGTA CCTCGCAGCC ACTACCCTCG AGGACCGCAG GGCCAGCCGT ACTACTCCAT 1251 GACGAAGATG GCGAACGCGA AATGGTGCGC TTTTGTGTTC TTGTGTTGCA CTGCTTCTAC CGCTTGCGCT TTACCACGCG AAAACACAAG AACACAACGT 1301 ATATGTTCTC TGTGGTTTTC ATTTGGAGAT CACTGCCTAT TTCATGTATC TATACAAGAG ACACCAAAAG TAAACCTCTA GTGACGGATA AAGTACATAG 1351 GTATACTCCT ATTTAGCTTG ATTTGTTGGG TTTCATGTAA TATATGACGC CATATGAGGA TAAATCGAAC TAAACAACCC AAAGTACATT ATATACTGCG 1401 ATTCAGAAGT GTTGTGACTT GTCAAGACAC AGTAATGGGA TTTGGTGAGA TAAGTCTTCA CAACACTGAA CAGTTCTGTG TCATTACCCT AAACCACTCT 1451 GATCGAATGA GCACATTGGA ATTAGGCTGT TATTCTTCCT CCTCCTTTCC CTAGCTTACT CGTGTAACCT TAATCCGACA ATAAGAAGGA GGAGGAAAGG 1501 CAACTAATAT ATCTCGCACG CACACACTTT ATAAACTGCT AAACGTCATT GTTGATTATA TAGAGCGTGC GTGTGTGAAA TATTTGACGA TTTGCAGTAA 1551 TTTTTAATAA CAATTTATAT GAAAGATGCT TTCAAAATAA TCGTATTAAT AAAAATTATT GTTAAATATA CTTTCTACGA AAGTTTTATT AGCATAATTA 1601 CTATTTTTCA TATGAATCTA TTATTTATGT GCTAATGAGT TACTCTGTTT GATAAAAAGT ATACTTAGAT AATAAATACA CGATTACTCA ATGAGACAAA 1651 TATGGATGGA TTAGTTTCCA TCCCAACCGA CGAACGCAGC CTAATTATTC ATACCTACCT AATCAAAGGT AGGGTTGGCT GCTTGCGTCG GATTAATAAG 1701 CTGCCAAGAA CAGAAAAGAG AAAATTCTTG AAGGTATCAA CTGCAAGTAG GACGGTTCTT GTCTTTTCTC TTTTAAGAAC TTCCATAGTT GACGTTCATC 1751 AGTGATTTCT GTTCTGCACT CCTGCAAATT TCTTCGCTGG GTGAGAAAAT TCACTAAAGA CAAGACGTGA GGACGTTTAA AGAAGCGACC CACTCTTTTA 1801 GGGAGGAAGG GAGAAGGCGA ACAGGCCAAT CCAACGCTGG TGCGGTCGGG CCCTCCTTCC CTCTTCCGCT TGTCCGGTTA GGTTGCGACC ACGCCAGCCC 1851 CCACCCCAAT CAACTCCCCG GGCCCACTAA ACAGCCCAAA CACGGTACTA GGTGGGGTTA GTTGAGGGGC CCGGGTGATT TGTCGGGTTT GTGCCATGAT 1901 GACCGACCAG ACCGCATGAA CTCGTAAGGA ATAAGTTCAC TTCATGACCC CTGGCTGGTC TGGCGTACTT GAGCATTCCT TATTCAAGTG AAGTACTGGG 1951 TCAAAAGTGA TCGAAATATA ATCCATGACC CCAAACCACA AAACCGGATA AGTTTTCACT AGCTTTATAT TAGGTACTGG GGTTTGGTGT TTTGGCCTAT 2001 TCTTGACTCC CAAACTCTTA ATACCGGTGC AATTTGACTC CTTGGACGGT AGAACTGAGG GTTTGAGAAT TATGGCCACG TTAAACTGAG GAACCTGCCA 2051 TTTGAAGGGC GGTTTCGCTG ACGTGGCGCC TACGTGGCAG TATTGACTCG AAACTTCCCG CCAAAGCGAC TGCACCGCGG ATGCACCGTC ATAACTGAGC 2101 GTCTTCTTTC TACGTGGCGT TGACGTGTCG CTAAGGTGGC ATTAGAAATA CAGAAGAAAG ATGCACCGCA ACTGCACAGC GATTCCACCG TAATCTTTAT 2151 AAAAATATGT GTGGGACCCA TCTGTTATTC ACACACAAAA TAAAAAGTGG TTTTTATACA CACCCTGGGT AGACAATAAG TGTGTGTTTT ATTTTTCACC 2201 GGCCCACTAA CATGTGGGCC CCACATATCA TCCTCTCTCT CACTACCCTT CCGGGTGATT GTACACCCGG GGTGTATAGT AGGAGAGAGA GTGATGGGAA 2251 CTTCCTCCTC TCTCCGTTGA CATGAGCCGC CGGCAAGAGG GGGCTTGAGT GAAGGAGGAG AGAGGCAACT GTACTCGGCG GCCGTTCTCC CCCGAACTCA 2301 GCCGGTGGTG GTGGGTGGGT GCCGGAGTGG TGGTGGACGG TGTACCTCCG CGGCCACCAC CACCCACCCA CGGCCTCACC ACCACCTGCC ACATGGAGGC 2351 GCGACAGGCG CGGGAGCAGC TCCTTCTACC ACACTAGGCC TCGGGCGACG CGCTGTCCGC GCCCTCGTCG AGGAAGATGG TGTGATCCGG AGCCCGCTGC 2401 GTGGGCGGTG GACGGTGGGG AGTATGGGCG GCGGGAGCTA AAGAGGCGGC CACCCGCCAC CTGCCACCCC TCATACCCGC CGCCCTCGAT TTCTCCGCCG 2451 GATAGACGGT GGGGAGCACG GGCGGCGGGA GCTAAAGAGG CGGCGGCGGC CTATCTGCCA CCCCTCGTGC CCGCCGCCCT CGATTTCTCC GCCGCCGCCG 2501 GACGGGCTGG ACCGTCCGGC TGCTGCCCGC CCCTTCTATC TCCTCCTCGT CTGCCCGACC TGGCAGGCCG ACGACGGGCG GGGAAGATAG AGGAGGAGCA 2551 AGTCGTCGGC GTCGACCTCC CCGACCATGC CGAGTACTAG ATCGAGACCA TCAGCAGCCG CAGCTGGAGG GGCTGGTACG GCTCATGATC TAGCTCTGGT 2601 GCCGTCCGCC GCCGCTCTCG TCTCTGACCT CATCGGCTGC CGGCAGGCGG CGGCGAGAGC AGAGACTGGA GTAGCCGACG

ภาคผนวก จ การเตรียมสารเคมีที่ใชในการทํา Southern blot analysis และ Hybridization

1. การเตรียมสารที่ใชในการทํา Southern blot analysis 1) Extraction buffer Gaunidium thiocyanate 50 กรัม Sodiumcitratedihydrate 0.74 กรัม N-lauroylsarcosine sodium salt 0.5 กรัม ปรับปริมาตรดวยน้ํากลั่นใหมีปริมาตรรวม 100 มิลลิลิตร นําไป autoclaved ที่ 121 องศาเซลเซียสนาน 40 นาที 2) Nucleic acid transfer buffer (20x SSC) Tri-sodium citrate 88.23 กรัม NaCl 175.32 กรัม เติมน้ํากลั่นลงไป 800 มิลลิลิตรแลวผสมใหเขากัน ปรับปริมาตรใหครบ 1,000 มิลลิลิตรดวยน้ํากล่ัน นําไป autoclaved ที่ 121 องศาเซลเซียสนาน 40 นาท ี 3) Depurination solution HCl 11 กรัม น้ํากลั่น 989 มิลลิลิตร ผสมสารละลายจนเปนเนื้อเดยีวกัน 4) Denaturation buffer NaCl 87.66 กรัม NaOH 20 กรัม เติมน้ํากลั่นลงไป 800 มิลลิลิตรแลวผสมใหเขากัน ปรับปริมาตรใหครบ 1,000 มิลลิลิตรดวยน้ํากลั่น นาํไป autoclaved ที่ 121 องศาเซลเซียสนาน 40 นาที

82

5) Neutralization buffer NaCl 87.66 กรัม Trizma base 60.5 กรัม เติมน้ํากลั่นลงไป 800 มิลลิลิตรแลวผสมใหเขากัน ทําการปรับ pH = 7.5 โดยใช conc. HClแลวปรับปริมาตรใหครบ 1,000 มิลลิตรดวยน้าํกลั่น นําไป autoclaved ที่ 121 องศาเซลเซียสนาน 40 นาท ี 2. DIG Hight Prime DNA Labeling and Detection starter Kit 1) EDTA

• 0.2 M ethylendiamino tetraacetic acid pH 8.0 2) vial 1 (DIG High Prime)

• 50 μl DIG High Prime • 5x conc.labelling mixture containing optical concentrations of random primers,

nucleotides, DIG-dNTP (alkali-label), Klenow enzyme and buffer components clear, viscous solution

3) vial 2 (DIG – labeled Control DNA)

• ปริมาตร 20 μl • 5 μg/ml pBR328 DNA (linearized with Bam HI), Clear solution

4) vial 3 (DNA Dilution Buffer)

• ปริมาตร 3 x 1ml • 50 μg/ml herring sperm DNA in 10 mM Tris-HCl • 1 mM EDTA ; pH 8.0 at 25 0C • Clear solution

5) vial 4 (Anti-Digoxigenin-AP Conjugate)

• ปริมาตร 100 μl มีความเขมขน 750 U/ml • จากแกะ, Fab-fragments, conjugated to alkaline phosphatase, clear solution

83

6) vial 5 (NBT-BCIP)

• ปริมาตร 6 x 1 ml • 50x conc. Stock solution (18.75 mg/ml nitroblue letrazolium chloride and 9.4

mg/ml 5-bromo-4-chlor0-3-indolyl-phosphate in 67% (v/v)DMSO) • Clear solution

7) vial 6 (Blocking solution)

• ปริมาตร 4 x 100 ml • 10x conc. Yellow, viscous solution

8) vial 7 (DIG Easy Hyb Granules)

• ปริมาตร 4 x 100 ml • Hybridization solution

9) washing buffer

• 0.1 M Maleic acid • 0.15 M NaCl • ปรับ pH ใหเทากับ 7.5 ที่ 20 oC

10) Malaic acid buffer

• 0.1 M Malaic acid • 0.15 M NaCl • ปรับ pH ดวย NaOH (solid) ใหเทากับ 7.5 ที่ 20 oC

11) Detection buffer

• 0.1 M Tris-HCl • 0.1 M NaCl • ปรับ pH ใหเทากับ 9.5 ที่ 20 oC

12) TE-buffer

• 10 mM Tris-HCl • 1 mM EDTA • ปรับ pH ใหเทากับ 8.0

13) Blocking solution (ควรเตรียมใหมทุกครั้ง) • เจือจาง 10x Blocking solution (vial 6) ในอตัราสวน 1:10 ดวย Malaic acid buffer

84

14) Antibody solution

• ทําการปนเหวีย่ง Anti-Digoxigenin-AP (vial 4) 5 นาที ที่ 10,000 rpm ดูดเอาสารละลายที่ผิว จากนั้นเจือจาง Anti-Digoxigenin-AP 1:5000 (150 U/ml) ดวย Blocking solution

15) Color substrate solution (ควรเตรียมใหมทุกคร้ังและเก็บในที่มืด)

• เติม 20 μl ของ NBT/BCIP stock solution (vial 5) ลงไปใน 2 ml ของ Detection buffer

16) DIG-labeled DNA probe นํา DIG-labeled DNA probe (ยีนตดิตามทีต่ิดฉลากดวย DIG) ความเขมขนประมาณ

25 ng/ml ไปตมนาน 5 นาที แลวใสในน้ําแข็งทันที

85

การนําสนอผลงานทางวิชาการที่เกี่ยวของกับวิทยานิพนธ

1. Pitsamai Chawankun, Uraiwan Pongpiriyajit, Anna Wattanasatcha, and Budsaraporn Ngampanya (2007) Cloning and characterization of gene with highly expressed in rice panicle at early stage of heading. The 19 th Annual meeting of the Thai society for biotechnology “TSB2007: Biotechnology for Gross National Happiness” . The LC. 5 Building, Faculty of Science and Technology,Thammasat University, Rangsit Center, Pathumthani, Thailand ; October 9-12, 2007

86

ประวัติผูวิจัย

1. ช่ือ - สกุล นางพิศมัย ชวาลกุล Mrs. Pitsamai Chawankun 2. วัน เดือน ปเกิด 17 พฤศจิกายน 2522 3. ที่อยูปจจุบนั 29/ 48 หมูบานชวนชืน่ปนเกลา-วงแหวน ถนนกาญจนาภิเษก

ต.ปลายบาง อ. บางกรวย นนทบุรี 11130 โทรศัพท (02) 9039704 4. ประวัติการศึกษา

วิทยาศาสตรบณัฑิต (วทบ.) (ชีววิทยาประยุกต) เกยีรตินยิมอันดับ 2 มหาวิทยาลัยราชภัฏเพชรบูรณ ปที่จบ 2544

วิทยาศาสตรมหาบัณฑติ (วทม.) (เทคโนโลยีชีวภาพ) มหาวิทยาลัยศลิปากร ปที่จบ 2550

7. วิทยานพินธระดับบัณฑติศึกษา (ช่ือเร่ือง/ ปที่ดําเนินการ ทั้งระดับปริญญาตรีและปริญญาโท) - ระดับปรญิญาตรี

เรือง การศึกษาลูกแปงขาวหมากจากภูมิปญญาชาวบานใน จ.เพชรบูรณ ปที่ดําเนินการ 2542-2543 เร่ือง Studies of Growth and Development of “Rum Pang Sri Chompoo” (Anthurium andraeanum Lind.) in vitro. ปที่ดําเนินการ 2543-2544

- ระดับปรญิญาโท เร่ือง Cloning and Molecular Genetic Characterization of Gene Related to Grain Filling in Rice

ปที่ดําเนินการ 2549- 2550

2550 ัมหาวิทยาลัิยศลปากร ·...

Documents