3중단위 요약

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약물대사기반연구사업단

한국인 특이 장내미생물

분석체계 구축


중단위 요약 한국인 특이 장내미생물 분석체계 구축중단위 요약 한국인 특이 장내미생물 분석체계 구축중단위 요약 한국인 특이 장내미생물 분석체계 구축중단위 요약 한국인 특이 장내미생물 분석체계 구축2009-2011. / 3 ( )2009-2011. / 3 ( )2009-2011. / 3 ( )2009-2011. / 3 ( )

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목 차목 차목 차목 차

제 중단위 연구과제제 중단위 연구과제제 중단위 연구과제제 중단위 연구과제< 3 >< 3 >< 3 >< 3 >

요약문요약문요약문요약문1.1.1.1. ·································································································· 3

중과제 연구개발 내용 및 방법1-1. 3 ··············································· 3

연구결과 고찰 및 결론1-2. ······························································· 9

연구개발 목표연구개발 목표연구개발 목표연구개발 목표2.2.2.2. ·················································································· 9

연구내용2-1 ···························································································· 9

기대성과2-2 ························································································ 10

표 세부과제별 연구목표와 내용. ····························································11

연구내용 및 방법연구내용 및 방법연구내용 및 방법연구내용 및 방법3.3.3.3. ········································································ 12

최종연구 결과최종연구 결과최종연구 결과최종연구 결과4.4.4.4. ··············································································· 18

연구결과 고찰 및 결론연구결과 고찰 및 결론연구결과 고찰 및 결론연구결과 고찰 및 결론5.5.5.5. ·································································· 19

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요약문요약문요약문요약문1.1.1.1.

중과제 연구개발 내용 및 방법중과제 연구개발 내용 및 방법중과제 연구개발 내용 및 방법중과제 연구개발 내용 및 방법1-1. 31-1. 31-1. 31-1. 3

가 연구내용가 연구내용가 연구내용가 연구내용....

○○○○ 한국인 특이적 장내 미생물 모델 개발 필요한국인 특이적 장내 미생물 모델 개발 필요한국인 특이적 장내 미생물 모델 개발 필요한국인 특이적 장내 미생물 모델 개발 필요

한국인의 식생활 습관은 다른 국가의 사람들 것과 차이를 보이고 있음 예를- .

들어 한국인은 짜고 매운 음식을 선호하고 젓갈과 장류와 같은 발효음식의 섭,

취율이 높아서 서구의 여러 나라에 비해 위장관 질환의 발병률이 높다는 특징

이 있음 이와 같은 식생활의 차이는 결국 소화관 내에 분포하는 장내세균총의.

분포도 외국인들과는 차이를 보일 것으로 예상됨.

한국인과 외국인의 장내 미생물 균총이 다를 것은 분명한 사실이지만 이제까-

지의 장내 미생물 다양성연구와 미생물 분리는 외국에서 주로 이루어졌음 오늘.

날 장내 미생물 독성평가를 위한 한국인 특유 장내 미생물 표준모델을 제시하

지 못하고 있음 따라서 한국인의 장내 세균에 의한 약물대사 기반연구를 위해.

서는 한국인 특유의 장내 미생물 표준모델을 개발하여야 하며 이를 위해서는

혐기성 세균에 초점을 맞출 필요가 있음.

본 연구를 통해 한국인에서 분리된 혐기성 장내 미생물로 이루어진 모델을 제-

시할 수 있다면 기존의 외국인에 적합한 대사체 분석 기술을 탈피할 수 있을,

뿐만 아니라 한국인에게 존재하는 혐기성 장내미생물을 통한 의약품 등의 대사,

체 평가기술의 기초 기반 구축에 좋은 정보를 제공할 수 있을 것으로 전망함.

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○○○○새로운 분석기술의 개발 필요새로운 분석기술의 개발 필요새로운 분석기술의 개발 필요새로운 분석기술의 개발 필요

인체 미생물체 장내 피부 점막 등 연구는 전통적으로 배양법에 의존하여- ( , , )

진행되어 왔지만 자연을 흉내 낸 가상의 환경에서 자라지 않는 미생물이 다수

존재하기 때문에 배양법만으로는 인체 미생물의 다양성을 정확하게 밝힐 수 없

음 최근 여 년 동안 분자 생물학적 분석기술의 발달로 인하여 인체에 서식하. 20

는 미배양 미생물의 다양성을 비교적 정확하게 확인할 수 있는 여러 기법들이

등장하였음 이들 분자생물학적 기법들은 대부분 에 의존적인 방법으로서. PCR

인체에 존재하는 소량 미생물의 유전자도 증폭시켜 분석할 수 있는 반면 증폭

과정에서 오는 왜곡현상으로 실제 미생물 다양성이 정확하게 표현되지 못하는

단점이 있음.

비 의존적인 방법으로는 미생물의 특정 유전자 혹은 몇십 몇백 길- PCR - base

이의 뉴클레오타이드만을 혼성화 시켜 미생물의 다양성을 확인(hybridization)

하는 이 있음DNA chip .

은 고집적으로 배열된 유전정보를 바탕으로 한 번에 수백 수천종의- DNA chip

미생물을 확인 할 수 있는 가장 강력한 기술 중의 하나지만 조차도DNA chip

환경에 미량으로 존재하는 미생물의 유전정보를 확인 할 수가 없고 이나, PCR

여타 다른 종류의 증폭 과정을 피하기는 힘들기 때문에 대규모로 진행되는 최근

의 인체 미생물연구를 수행하기 위해서는 좀 더 진보된 형태의 기술DNA chip

개발이 필요함.

○○○○ 한국인의 고유의 장내 미생물 다양성 확보 필요한국인의 고유의 장내 미생물 다양성 확보 필요한국인의 고유의 장내 미생물 다양성 확보 필요한국인의 고유의 장내 미생물 다양성 확보 필요

인간 몸 안에 있는 세포의 만이 인간의 세포이고 나머지 는 미생물로- 10% 90%

이루어졌을 정도로 장내에는 많은 수의 미생물이 서식하고 있지만 장내 미생물

중 배양 가능한 미생물은 전체의 정도 밖에 되지 않으므로 기존의 배20-30%

양법으로 장내 미생물의 조성을 파악하는 것에는 한계가 있음 따라서 한국인.

특이 장내미생물 조성을 정확하게 규명하기 위해서는 배양에 의존하지 않는 분

자생태학적인 분석방법이 필요함.

장내 미생물 균총은 인종 민족 지역 가계 생활습관 섭식양태 등에 따라 달- , , , , ,

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리 존재하며 나이 건강상태 영양조건 등에 따라 변화가 많은 것으로 밝혀져, ,

있음 한국인의 식이 및 문화는 외국의 그것과 상이하게 다르기 때문에 장내 미.

생물의 균총 또한 상이하게 다를 것으로 예측됨 하지만 현재까지 한국인 장내.

미생물의 조성을 전체 균종에 대해 광범위하게 조사한 연구는 없음.

인간 체내에서 일어나는 대사는 인간과 미생물 대사의 합이라고 할 수 있으므-

로 장내 미생물은 인간의 건강에 중요한 역할을 함 개인의 장내미생물 조성은.

현재와 미래의 건강상태를 파악할 수 있는 중요한 지표가 될 수 있으며 장내미,

생물에 의해 유발되는 독성을 정확하게 평가하기 위해서와 보건정책을 수립하

는데 있어서 한국인의 장내 미생물의 조성을 정확하게 파악하는 것이 필요함.

나 연구방법나 연구방법나 연구방법나 연구방법....

한국인 특이 장내미생물 분리 동정 등을 통한 표준화 연구한국인 특이 장내미생물 분리 동정 등을 통한 표준화 연구한국인 특이 장내미생물 분리 동정 등을 통한 표준화 연구한국인 특이 장내미생물 분리 동정 등을 통한 표준화 연구o ,o ,o ,o ,

서울대병원에 내원한 건강 검진자 및 환자를 대상으로 분변시료를 확보함-

동시에 대장내시경을 통해 장생검 조직 시료를 확보함-

이를 위해 서울대 병원에 임상시험심사위원회- (Institutional Review Board,

허가서를 신청함IRB)

장내 혐기성 미생물의 분리배양법을 확립하고 확보된 시료를 바탕으로 한국인- ,

장내미생물을 분리 배양하여 종의 장내미생물 자원을 확보한다 또한 신규50 .

미생물을 분리하여 이들의 특성을 규명하고 추후 응용 방향을 검토했음, ,

장내미생물 신속검출 및 정량을 위한 첨단 분석 기술 연구장내미생물 신속검출 및 정량을 위한 첨단 분석 기술 연구장내미생물 신속검출 및 정량을 위한 첨단 분석 기술 연구장내미생물 신속검출 및 정량을 위한 첨단 분석 기술 연구oooo

을 이용한 혼성화 기법 확립 메타지놈 메타지놈 혼성화 반응을 이- DNA chip : -

용하여 실제적인 메타지놈 어레이의 장내 미생물 분석능 파악함.

메타지놈 추출 및 정제기법 확립 메타지놈 어레이를 제작하기 위해서- DNA :

순도 높은 를 추출하고 정제하는 기술의 개발하고 질병인 및 정상인의DNA

여개 샘플을 수집하고 이들에서 메타지놈을 추출 정제함100 , , .

메타지놈 개발 여개의 샘플을 이용하여 개인의 미생물체의- DNA chip : 100

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변화를 거시적으로 관찰할 수 있는 국내 최초의 미생물체 마이크로 어레이의

개발함.

메타지놈 의 확립 메타지놈 어레이의 특이성과 민감성- DNA chip stringency :

을 확인하기 위한 기본적인 정보를 조사하고 한국인 특이적 미생물체 분석용

어레이 제작에 사용함.

설계 및 확보 장내에 다수 존재하거나 혹은 중- Group specific linker probe :

요한 역할을 하는 것으로 알려진 Bacteroides, Clostridium, Fecalibacterium

의 를 설계하여 대량 샘플에서 이들 미생물의 정량group specific linker probe

적 분석을 할 수 있는 미생물 검색 기술을 개발함.

배 이상의 신호 증폭기술 개발 메타지놈 를 제작하여 그 검출- 100 : microarray

효용을 높이는 방법으로서 의 각 를 으로linker probe probe photobiotin

하거나 와 방법을 개발하여 낮labeling , multi-linker probe photobiotin-TSA

은 수준의 유전자 후보물질을 검출할 수 있는 기술을 개발 하려 함.

을 이용한 배photobiotin-TSA (tyramide straptavidin-amplification) 100

이상의 신호 증폭기술 개발함

장내 박테리오파지 메타지놈 분석 한국인 분변 중 장내 박테리오파지 메타지- :

놈 확보 기술을 확립하고 분리된 샘플을 대용량 염기서열 분석법, DNA

을 통해 메타지놈을 분석하여 장내박테리아와 바이러스 간(pyrosequencing) ,

의 상관성을 밝힘

연령 식이 및 비만도에 따른 한국인 장내미생물 다양성 조사연령 식이 및 비만도에 따른 한국인 장내미생물 다양성 조사연령 식이 및 비만도에 따른 한국인 장내미생물 다양성 조사연령 식이 및 비만도에 따른 한국인 장내미생물 다양성 조사o ,o ,o ,o ,

한국인 분변 시료로부터 메타지놈 추출- DNA : 16S rDNA pyrosequencing

분석을 수행하기 위해 순도 높은 를 추출하는 기술을 개발하여 한국인의DNA

성별 연령 및 식이 비만도 등에 따른 개 장내미생물 메타지놈 샘플, , , 372 DNA

을 확보함

을 통한 장내미생물 다양성 분석 중- 16S rDNA pyrosequencing : 16S rDNA

미생물간 변이를 부위의 염기를 합성하기 위한 를 제작하고primer

을 통해 장내미생물의 부위의 염기서열을 확보 비교pyrosequencing V1~V3 ,

하여 장내미생물의 다양성을 분석함.

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1-21-21-21-2.연구결과 고찰 및 결론연구결과 고찰 및 결론연구결과 고찰 및 결론연구결과 고찰 및 결론

○○○○ 세부과제세부과제세부과제세부과제3-1 :3-1 :3-1 :3-1 :

다양한 혐기성 장내 미생물의 분리 및 배양을 통해 현재까지 적용되고 있는 배

양 기술은 다방면으로 축적하고 있음 이는 추후 장내 미생물의 생리학적 기. ,

능을 규명하고 이를 바탕으로 장관 내 생태학적 역할을 유추할 수 있는 기반,

을 마련했다고 판단함 당초 제안한 한국인에게 다량 존재하는 종 이상의 장. 50

내 혐기성 미생물 분리 및 배양 동정은 이미 목표치를 초과한 상태임 분리된, .

고유의 장내미생물은 추후 한국인 장내 생태를 연구하는 중요한 자원으로 사용

될 것이며 선진국과 독립적인 생물 자원 및 데이터를 구축함으로써 독자적인, ,

연구가 가능할 것으로 기대됨 현재까지 종의 신규 장내 미생물을 분리 및 동. 5

정 계통분류학회지 를 통해 보고 및 등록하였으며 종 이상의 신규, (IJSEM) , 3

미생물로 추정되는 장내 미생물의 특성을 지속적으로 규명할 계획임.

○○○○ 세부과제세부과제세부과제세부과제3-2 :3-2 :3-2 :3-2 :

당초 제안한 메타지놈의 순수 균질화 기법을 연구 기간 내 확립하였으며 이를-

토대로 메타지놈 칩을 개발할 준비를 마쳤음 개의 한국인 장내 메타지DNA . 51

놈과 로서 개의 토양 환경 메타지놈 그리고 의 을 이reference 2 E.coli genome

용하여 장의 메타지놈 칩을 개발하였음 개발된 메타지놈 칩은100 DNA . DNA

과 과정을 거쳐 암소에 보관하였으며UV cross linking post-treatment linker

를 이용한 한국인 장내 미생물 군집 분석에 이용되었음 장내에 중요미probe .

생물 검출용 로 와linker probe Bacteroides-prevotella, Roseburia

그룹 검출용 를 설계 및 제작하였으며 추후Faecalibacterium linker probe ,

장내 미생물 관여 질병에 따라 양적 변화를 보이는 미생물 그룹을 중심으로

개발 계획임 칩의 신호 증폭 기술을 개발하기 위해 개linker probe . DNA 68

의 미생물의 를 이용한 칩을 개발하였으며16S rRNA gene fragment DNA

기법으로 기존의 보다 배 이상의 신호 증폭biotin-TSA cy5 probe 10 , linker

와의 결합으로 배 이상의 신호 증폭 기술을 개발하였음 차년도에는probe 30 . 3

이나 등을 이용한 기술을 추가 개발하여 배 이상photobiotin Quantom dot 100

의 신호 증폭 기술개발을 시도 및 완성하려함 한국인 분변시료로부터.

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만을 분리 및 농축과정을 확립하였고 이들의 농도 단위 계virus-like particle ,

수법 형태학적 관찰법 역시 확립하였음 해당, . enriched virus-like particles

로부터 를 추출하고 를 통해 증폭하여virus genomic DNA , phi29 polymerase

다량의 를 확보하였음 또한 대용량 기술에 적용하여 장내DNA . , sequencing ,

박테리오파아지의 가 담고 있는 유전적 특성을 분석하였으며genomic DNA ,

바이러스의 분류학적 정의를 바탕으로 박테리오파지인 dsDNA Podo-,

와 가 장내 바이러스의 우점군으로Sipho-, Myophages ssDNA microphages

밝혀졌음 하지만 에 가까운 바이러스 유래 염기서열의 가 확인되. , 90% identity

지 않았으며 특히 장내 박테리아의 우점군인 에서, Firmicutes-Bacteroidetes

분리된 박테리오파지에 대한 정보가 부족한 실정임 따라서 장내 바이러스의. ,

분리 배양을 통한 접근과 메타지놈을 통한 분석이 꾸준히 동반되어야 할 것임.

의 경우 를 통해Single-stranded DNA Microviridae , Viral metagenomics

새롭게 주목받고 있는 바이러스 그룹으로 해양이나 토양 등 광범위한 환경에,

분포하는 것으로 밝혀지고 있으며 이들의 다양성 또한 이전에 보고된, ssDNA

에 비해 폭넓은 유전적 형태를 가지고 있는 것으로 알려져 있음 본 연phages .

구를 통해 장내 환경 또한 가 우점하고 있는 환경으로 밝혀졌으microphages

며 이들의 생태학적 역할에 대한 관심이 필요함, .

장내 우점균인 의 유전체에 포함된Bacteroides & Prevotella strains

의 높은 유사도를 보이는 것으로 보아Prophage-like elements Bacteroides

가 장내 환경에 의 숙주로 판단됨 현재까지& Prevotella microphages . , viral

를 통해 알려진 의 높은 다양성과 양적 존재에도metagenomics microphages

불구하고 그들의 숙주나 진화 형태 유전적 특징 등이 뚜렷이 밝혀지지 않았,

음 본 연구를 통해 장관 내 의 숙주를 유추할 수 있는 증거를 도. microphage

출하였으며 이는 추후 의 생태학적 특징을 이해하는데 주요한 관, microphage ,

점으로 작용할 것으로 기대됨.

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연구개발 목표연구개발 목표연구개발 목표연구개발 목표2.2.2.2.

최신 혐기성 장내미생물 배양기술 확립o .

종 이상의 한국인 특이 장내 미생물 분리 및 종 이상의 신규 미생물 동o 50 15

정.

한국인에게 존재하는 혐기성 장내미생물에 의한 식품 의약품 등의 대사체 독성o

평가기술의 기초 기반을 구축.

한국인 미생물체 게놈을 개 이상 획득하여 한국인 미생물체 분석용 차세대o 50

개발DNA chip .

메타지놈 내 여러 미생물 그룹을 검출하기 위한 수 있는 새로운 형태의 탐침자o

및 신호증폭 기술 개발.

을 이용한 대규모 서열 분석 방법을 통하여 개 이상의 한o pyrosequencing 200

국인 장내 메타지놈 분석 및 한국인 고유의 장내 미생물상 확립.

연구내용연구내용연구내용연구내용2-12-12-12-1

최신 혐기성 장내미생물 배양 기술의 확립을 통하여 한국인의 분변 시료 및 조o

직 시료에서 한국인에게 특이적으로 존재하는 장내 혐기성 미생물을 분리 및

배양 동정함,

온도 산소 내성 배양 조건 등 특성 분석을 통해 혐기성 장내미생물에 대o , pH, ,

한 독성 물질 평가방법 개발 및 표준작업 수순서 작성

메타지놈간의 비교를 위한 메타지놈 어레이 개발o (metagenome array) .

메타지놈 상에서 여러 미생물 그룹을 한 번에 검출할 수 있는 새로운 형o chip

태의 프로브 개발 및 포토 바이오틴 등을 이용한 신규(probe) -TSA DNA

신호증폭 기술 개발함chip .

메타지놈 분석을 위한 과 생물정보학 기술을 이용한 대규모o pyrosequencing

서열 분석 방법을 확립하고 한국인의 장내미생물 균총 조사를 통해 한국인의

성별 연령 및 식이 비만도 등에 따른 장내미생물의 다양성 및 변화를 밝힘, , , .

장내에 존재하는 박테리아 외에 장내미생물 생태에 영향을 미치는 장내 박테리o

오파지의 메타지놈을 분석함.

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기대성과기대성과기대성과기대성과2-2.2-2.2-2.2-2.

한국인 고유의 장내미생물 다양성 정보를 확보함으로써 식이 및 비만도에 따른o

한국인 건강 유지 질병 예방 및 치료를 위한 지표를 확보할 수 있음, .

한국인의 장내에 고유하게 존재하는 미생물을 분리 동정함으로서 한국인의 인o

체건강에 유익한 의 개발을 가능하게 할 수 있음probiotics .

고속으로 다량의 샘플에서 미생물의 다양성을 확인할 수 있는 새로운 형태의o

인체미생물체 탐색 기술을 개발함으로서 인체 미생물 상호작용 분석기술에서-

외국에 비해 우위를 점할 수 있음.

인체 장내 미생물의 다양성은 개인의 유전적 면역적 소인과 연관되어 있으o ( ) ,

며 암과 같은 질병이나 비만 시에도 미생물 분포가 변화하므로 각종 질병이나

비만을 구분 및 판단하는 마커 로 사용될 수 있음(marker) .

개 이상의 한국인 장내 메타게놈 시료 분석을 통하여 한국인 장내 미생물o 200

의 특이성을 밝힘으로서 한국인 특이의 장내 미생물이 인체 건강에 미치는 영,

향을 예측할 수 있는 기반을 마련할 수 있음.

한국인 고유 장내미생물 분석 체계 구축을 통한 학술적 연구성과 확대o

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구분구분구분구분 목표목표목표목표 연구 내용연구 내용연구 내용연구 내용

세부과제3-1한국인 특이 장내미생물분리 동정 등을 통한 표,준화 연구

정상인의 분변 및 내시경 조직 수집

장염 환자의 분변 및 내시경 조직 수집

한국인 장내미생물 분리 및 배양 동정,

세부과제3-2

배 이상의 신호 증폭100기술 개발

및 을 이용하여photobiotin Q-dot칩 상에서 기존의metagenome DNA를 이용한 것보도cy-fluorescence dye

배 이상의 신호를 증폭할 수 있는 기100술을 개발함.

메타지놈 칩을 이용한 한국인 장내 미생물체 분석

칩과 를metagenome DNA linker probe이용하여 한국인 장내에 존재하는 주요미생물군 분석함.

세부과제3-2

메타지놈 메타지놈 반응-을통한 군집변이 분석

한국인의 메타지놈과 metagenome DNA칩 기술을 이용하여 장내 미생물 군집의개인 특이성과 안정성을 밝힘.

장내 박테리오파지 군집분석

장내박테리오파지 분석기술을 대단위에 적용하여 장내박테리오파sequencing ,

지의 군집 분석.

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연구내용 및 방법연구내용 및 방법연구내용 및 방법연구내용 및 방법3.3.3.3.

연구개발 내용연구개발 내용연구개발 내용연구개발 내용1)1)1)1)

한국인 분변 시료 및 조직 시료에서 한국인에게 다량 존재하는 장내 혐기성-

미생물 분리 및 배양 동정과 동시에 한국인 특이 혐기성 장내 미생물을 분리,

함으로써 식품 의약품 등의 안전성 평가를 위한 한국인 장내 미생물 표준모델,

제시하고자 함.

분리배양한 장내 혐기성 미생물을 이용하여 식품 의약품 등의 안전성 평가-

를 위한 독성 평가방법의 개발을 위한 기초자료를 제공함과 동시에 표준작업

수순서 제시하고자 함.

메타지놈 를 제작하여 그 검출 효용을 높이는 방법으로서- microarray

와 방법을 개발함 인체에 다수 존재하multi-linker probe photobiotin-TSA .

는 혹은 중요한 역할을 하는 미생물의 유전정보들로도 프로브를 만든 후 대량,

샘플에서 이들 미생물의 정량 정성적 분석이 가능하게 함

장내 미생물 균총은 사람마다 다르며 질병이 있는 사람의 경우 미생물 균총-

이 변화하는 것으로 보고되었음 이에 메타지놈 메타지놈 혼성화를 이용하여. -

정상인의 장내 미생물 균총 변화를 조사하고 질병 및 비질병 샘플간의 차이점,

을 분석할 수 있는 메타지놈 혼성화 기법을 확립함microarray .

대단위 염기서열 분석방법인 기술을 이용하여 한국인의 성- Pyrosequencing

별 연령 및 식이 비만도 등에 따른 분변 시료 월 초 현재 개 시료의, , , 11 340

장내미생물의 다양성 및 변화를 모니터링함.

분변으로부터 장내 박테리오파지를 분리하기 위한 최적의 방법을 개발하고- ,

장내 박테리오파지의 를 추출하여 을 통해 박테리오파지gDNA pyrosequencing

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의 메타지놈을 분석함.

연구방법연구방법연구방법연구방법2)2)2)2)

한국인 특이 장내미생물 분리 동정 등을 통한 표준화 연구한국인 특이 장내미생물 분리 동정 등을 통한 표준화 연구한국인 특이 장내미생물 분리 동정 등을 통한 표준화 연구한국인 특이 장내미생물 분리 동정 등을 통한 표준화 연구,,,,○○○○

분변 시료 및 조직 시료 확보분변 시료 및 조직 시료 확보분변 시료 및 조직 시료 확보분변 시료 및 조직 시료 확보(1)(1)(1)(1)

서울대병원에 내원한 건강 검진자 및 환자를 대상으로 분변시료를 확보함- .

동시에 대장내시경을 통해 장생검 조직 시료를 확보함-

이를 위해 서울대 병원에 임상시험심사위원회- (Institutional Review Board,

허가서를 신청할 예정임IRB)

혐기성 균 배양을 위한 시료 처리혐기성 균 배양을 위한 시료 처리혐기성 균 배양을 위한 시료 처리혐기성 균 배양을 위한 시료 처리(2)(2)(2)(2)

분변 시료A.

분변 시료는 에 저장함-70① ℃

분변 시료 을 의 로 희석1 gram 10 ml anaerobic peptone water②

희석 샘플을 를 배양 배지에 접종50 l③ μ

장생검 조직 시료B.

장조직 검체는 의4 ml anaerobic transport medium (Wilkins-Chalgren①

가 포함된 멸균된 에 넣어 실험실로 운반broth) Bijoux bottle

조직검체를 멸균된 로 분쇄glass tissue homogenizer②

의 분쇄물 을 로 배 비율로1 ml (homogenate) anaerobic peptone water 10③

희석

희석 샘플을 를 배양 배지에 접종50 l④ μ

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혐기성균 배양혐기성균 배양혐기성균 배양혐기성균 배양(3)(3)(3)(3)

속 속 속 선택배지Ruminococcus , Bacteroides , Enterococcus (BHI)①

선택배지Cellulolytic bacteria (BC medium)②

속 속 선택배지Lactobacillus , Roseburia (YCFA medium)③

속 선택배지Bacteroides (Supplemented Brain Heart Infusion Medium,④

BHIS)

선택배지Bifidobacterium (Bifidobacterium Selective Medium, BSM)⑤

변화에 따른 장내 미생물 배양 조건 확립YCFAGSC medium: pH⑥

장내 미생물 생장에 필요한 물질이 포함된Minimal Medium + addition:⑦

배지에 다양한 첨가물을 통해 특정 미생물만을 할 수 있을 것으로screening

판단

일본학자들에 꾸준히 사용되는 배지로GAM (Gifu anaerobic medium): ,⑧

특이 균주의 발견 배지로 인식됨.

에서 일 이상 배양37 anaerobic chamber 2-3⑨ ℃

위에 기술한 배지를 기본으로 하고 를 비롯한 배양 조건을 변, supplement⑩

화시킨 뒤 성장여부 등과 같은 특성 분석,

분리된 혐기성균 동정분리된 혐기성균 동정분리된 혐기성균 동정분리된 혐기성균 동정(4)(4)(4)(4)

및 을 이용API 20A, rapid ID32A API ZYM①

신종균으로 추정되는 분리균②

기존에 보고된 혐기성균 에 있는 에 대한16S RNA house keeping geneⓐ

를 시행하여 확인molecular assay , DNA sequence

기법을 이용한 신규 균주의 확인Genomic DNA-DNA hybridizationⓑ

독성물질 평가방법 개발 체내에 들어온 식품 또는 의약품이 장내 혐기성독성물질 평가방법 개발 체내에 들어온 식품 또는 의약품이 장내 혐기성독성물질 평가방법 개발 체내에 들어온 식품 또는 의약품이 장내 혐기성독성물질 평가방법 개발 체내에 들어온 식품 또는 의약품이 장내 혐기성(5) :(5) :(5) :(5) :

미생물에 의해 분해되어 독성화할 수 있는지의 여부를 평가할 수 있는 기술은

총괄사업단 내의 각 세부과제와 연계하여 아래와 같이 진행함.

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검사 대상 식품 또는 의약품 선정①

장내에서 분리한 혐기성균 배양 특성 구축 장내미생물의 증식 대사산D/B : ,②

물 생산 등의 특성에 대한 주요 배양조건의 영향을 파악하고 상세 배양 data

확보base

장내 미생물에 의한 대사반응을 통하여 생성된 독성 대사물의 분석③

미생물 배양 시료 전처리 조건 확립 시료에서 대사체를 추출할 수 있는 전:ⓐ

처리 조건 확립

을 이용한 분석조건 확립 시료 추출물에 대한 최적의 분석 조건 확GC/MS :ⓑ

립

개발된 최적의 분석 조건하에서 시료 대사체의 분석 최적의 분석 조건하에:ⓒ

서 대사체를 분석하여 구축DB

대사체 의 대사체 의 다양한DB chemometric analysis: GC-MS DBⓓ

수행chemometric analysis

장내 혐기성균의 독성대사 경로 및 대사체 분석 기술 개발 대사체 의: DB④

및 등의 를 수행하여 장내미생물의 독성PCA PLS-DA chemometric analysis

대사 경로 및 대사체 분석 기술 개발

장내미생물 신속검출 및 정량을 위한 첨단 분석 기술 연구장내미생물 신속검출 및 정량을 위한 첨단 분석 기술 연구장내미생물 신속검출 및 정량을 위한 첨단 분석 기술 연구장내미생물 신속검출 및 정량을 위한 첨단 분석 기술 연구○○○○

설계 및 확보설계 및 확보설계 및 확보설계 및 확보Group specific linker probeGroup specific linker probeGroup specific linker probeGroup specific linker probe

장내에 다수 존재하거나 혹은 중요한 역할을 하는 것으로 알려진-

Bacteroides, Clostridium, Fecalibacterium 의group specific linker probe

를 설계하여 대량 샘플에서 이들 미생물의 정량적 분석을 할 수 있는 미생물

검색 기술을 개발.

배 이상의 신호 증폭기술 개발배 이상의 신호 증폭기술 개발배 이상의 신호 증폭기술 개발배 이상의 신호 증폭기술 개발100100100100

메타지놈 를 제작하여 그 검출 효용을 높이는 방법으로서- microarray linker

의 각 를 으로 하거나 와probe probe photobiotin labeling , multi-linker probe

방법을 개발하여 낮은 수준의 유전자 후보물질을 검출할 수photobiotin-TSA

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있는 기술을 개발 하려 함. photobiotin-TSA (tyramide

을 이용한 배 이상의 신호 증폭기술 개발straptavidin-amplification) 100 .

메타지놈 추출 및 정제기법 확립메타지놈 추출 및 정제기법 확립메타지놈 추출 및 정제기법 확립메타지놈 추출 및 정제기법 확립DNADNADNADNA

메타지놈 어레이를 제작하기 위해서 순도 높은 를 추출하고 정제하는- DNA

기술의 개발하고 질병인 및 정상인의 여개 샘플을 수집하고 이들에서 메100 ,

타지놈을 추출 정제함, .

메타지놈 개발메타지놈 개발메타지놈 개발메타지놈 개발DNA chipDNA chipDNA chipDNA chip

여개의 샘플을 이용하여 개인의 미생물체의 변화를 거시적으로 관찰- 100

할 수 있는 국내 최초의미생물체 마이크로 어레이의 개발.

메타지놈 의 확립메타지놈 의 확립메타지놈 의 확립메타지놈 의 확립DNA chip stringencyDNA chip stringencyDNA chip stringencyDNA chip stringency

메타지놈 어레이의 특이성과 민감성을 확인하기 위한 기본적인 정보를 조-

사하고 한국인 특이적 미생물체 분석용 어레이 제작에 사용

을 이용한 혼성화 기법 확립을 이용한 혼성화 기법 확립을 이용한 혼성화 기법 확립을 이용한 혼성화 기법 확립DNA chipDNA chipDNA chipDNA chip

메타지놈 메타지놈 혼성화 반응 이용하여 실제적인 메타지놈 어레이의 장- -

내 미생물 분석능 파악

연령 식이 및 비만도에 따른 한국인 장내미생물 다양성 조사연령 식이 및 비만도에 따른 한국인 장내미생물 다양성 조사연령 식이 및 비만도에 따른 한국인 장내미생물 다양성 조사연령 식이 및 비만도에 따른 한국인 장내미생물 다양성 조사,,,,○○○○

� 한국인 분변 시료로부터 메타지놈 추출DNA

과 분석을 수행하기 위해- 16S rDNA pyrosequencing Real-Time QPCR

순도 높은 를 추출하는 기술을 개발하여 한국인의 성별 연령 및 식이DNA , , ,

비만도 등에 따른 약 개369 의 장내미생물 메타지놈 샘플을 확보함DNA .

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� 을 통한 장내미생물 다양성 분석16S rDNA pyrosequencing

중 미생물간 변이가 심하게 나타나는 부위인- 16S rDNA 부위의 염V1~V3

기를 합성하기 위한 바코드 를 제작primer 하고 을 통해 장내pyrosequencing

미생물의 부위V1~V3 의 염기서열을 확보 비교하여 장내미생물의 다양성을 분,

석함.

� 장내 박테리오파지 메타지놈 분석

한국인 분변 중 장내 박테리오파지 메타지놈 샘플을 확보하여- DNA

을 통해 메타지놈을 분석함pyrosequencing .

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최종연구 결과최종연구 결과최종연구 결과최종연구 결과4.4.4.4.

구분 목표 연구개발 수행내용

세부과3-1

제

정상인 및 장염 환자로부터

분변과 내시경 조직 수집하

여 장내 미생물 분리 배양,

및 동정

총 종의 장내 미생물 분리 및 배양o 71

총 종의 신규 추정 장내 미생물 분o 22

리하였으며 종의 신규미생물이 발표, 5

되었으며 종에 대한 동정을 진행 중, 3

임.

세부과3-2

제

종 이상 메타지놈 확o 50

보 및 순수 균질화 기-

법 확립

종 이상 메타지놈 탑o 50

재 칩 장 제작DNA 100

종의 미생물 그룹 링o 10

커 프로브 제작

메타지놈 메타지놈 반응o -

을 이용 미생물 군집변

이 추적

칩 신호증폭 기술o DNA

개발

장내박테리오파지 분석o

기술 개발

종의 한국인 장내 미생물 메타지놈을o 51

획득하였으며 순수 균질화 기법을 확립-

하였음.

종의 한국인 장내 미생물 메타지놈과o 51

개의 환경샘플 개의2 , 1 E.coli

지놈을 이용하여 장의reference 100

칩을 제작하였음DNA .

용o Bacteroidetes-prevotella group

를 제작하여 메타지놈linker probe

칩을 이용 의 효용성DNA linker probe

을 확인하였으며, Clostridium cluster

의 을IV Faecalibacterium group target

으로 하는 와linker probe

을Eubacterium faecies group target

으로 하는 를 설계하였음linker probe .

메타지놈 칩을 이용하여 명의 한o DNA 8

국인 장내 미생물 군집이 숙주에 따라

고유하게 존재하고 시간이 지나도 안정

적으로 유지됨을 밝혔음.

포토 바이오틴 기법을 이용하여o -TSA

기존의 칩 시그날보다 배 이상DNA 30

신호를 증폭시킬 수 있는 신규 DNA

신호증폭 기술을 개발하였음chip .

분변시료로부터o enriched virus-like

을 분리하고 를particle , genomic DNA

추출할 수 있는 기술 개발하였음.

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연구결과 고찰 및 결론연구결과 고찰 및 결론연구결과 고찰 및 결론연구결과 고찰 및 결론5.5.5.5.

� 다양한 혐기성 장내 미생물의 분리 및 배양을 통해 현재까지 적용되고 있는

배양 기술은 다방면으로 축적하고 있음 이는 추후 장내 미생물의 생리학적. ,

기능을 규명하고 이를 바탕으로 장관 내 생태학적 역할을 유추할 수 있는,

기반을 마련했다고 판단함.

� 본 연구에서 당초 제안한 한국인에게 다량 존재하는 종 이상의 장내 혐50

기성 미생물 분리 및 배양 동정은 이미 목표치를 초과한 상태임 분리된 고, .

유의 장내미생물은 추후 한국인 장내 생태를 연구하는 중요한 자원으로 사

용될 것이며 선진국과 독립적인 생물 자원 및 데이터를 구축함으로써 독자, ,

적인 연구가 가능할 것으로 기대됨 현재까지 종의 신규 장내 미생물을 분. 5

리 및 동정 계통분류학회지 를 통해 보고 및 등록하였으며 종 이, (IJSEM) , 3

상의 신규 미생물로 추정되는 장내 미생물의 특성을 지속적으로 규명할 계

획임.

� 한 미생물 집합체인 장내 미생물의 특성으로 계통분류학적Heterogenous

정의가 쉽지 않음 최근 보고한. , Ruminococcus 의 경우 해당 균sp. nov. ,

주가 속해 있는 그룹 내 다양한 가 포함되Clostridial cluster XIVa genera

어 있고 임에도 불구하고 같은 그룹 내 속한 다른 와, species novel , genus

의 비교를 동반해야 한다는 이유로 되었음 이는 추후 신규 미생물로reject .

추정되는 균주 중 계통분류학적 위치 및 특징이 비교적 뚜렷한 균주만 동정

이 가능할 것으로 판단됨 이는 당초 예상했던 인력과 비용을 웃도는 노력. ,

과 시간이 필요할 것으로 판단됨.

� 본 연구에서 당초 제안한 메타지놈의 순수 균질화 기법을 연구 기간 내 확-

립하였으며 이를 토대로 메타지놈 칩을 개발할 준비를 마쳤음 개의DNA . 51

한국인 장내 메타지놈과 로서 개의 토양 환경 메타지놈 그리고reference 2

의 을 이용하여 장의 메타지놈 칩을 개발하였음 개E.coli genome 100 DNA .

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발된 메타지놈 칩은 과 과정을 거쳐DNA UV cross linking post-treatment

암소에 보관하였으며 를 이용한 한국인 장내 미생물 군집 분석linker probe

에 이용되었음.

� 장내에 중요미생물 검출용 로linker probe Bacteroides-prevotella,

와 그룹 검출용 를 설계 및 제작Roseburia Faecalibacterium linker probe

하였으며 추후 장내 미생물 관여 질병에 따라 양적 변화를 보이는 미생물,

그룹을 중심으로 개발 계획임linker probe .

� 칩의 신호 증폭 기술을 개발하기 위해 개의 미생물의DNA 68 16S rRNA

를 이용한 칩을 개발하였으며 기법으로 기gene fragment DNA biotin-TSA

존의 보다 배 이상의 신호 증폭 와의 결합으로cy5 probe 10 , linker probe

배 이상의 신호 증폭 기술을 개발하였음 차년도에는 이나30 . 3 photobiotin

등을 이용한 기술을 추가 개발하여 배 이상의 신호 증폭Quantom dot 100

기술개발을 시도 및 완성하려함.

� 한국인 분변시료로부터 만을 분리 및 농축과정을 확립virus-like particle

하였고 이들의 농도 단위 계수법 형태학적 관찰법 역시 확립하였음 해당, , .

로부터 를 추출하고enriched virus-like particles virus genomic DNA ,

를 통해 증폭하여 다량의 를 확보하였음 또한 대phi29 polymerase DNA . ,

용량 기술에 적용하여 장내박테리오파아지의 가sequencing , genomic DNA

담고 있는 유전적 특성을 분석하였으며 바이러스의 분류학적 정의를 바탕,

으로 박테리오파지인 와dsDNA Podo-, Sipho-, Myophages ssDNA

가 장내 바이러스의 우점군으로 밝혀졌음 하지만 에 가microphages . , 90%

까운 바이러스 유래 염기서열의 가 확인되지 않았으며 특히 장내identity ,

박테리아의 우점군인 에서 분리된 박테리오파지Firmicutes-Bacteroidetes

에 대한 정보가 부족한 실정임 따라서 장내 바이러스의 분리 배양을 통한. ,

접근과 메타지놈을 통한 분석이 꾸준히 동반되어야 할 것임.

� 의 경우 를 통해Single-stranded DNA Microviridae , Viral metagenomics

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새롭게 주목받고 있는 바이러스 그룹으로 해양이나 토양 등 광범위한 환경,

에 분포하는 것으로 밝혀지고 있으며 이들의 다양성 또한 이전에 보고된,

에 비해 폭넓은 유전적 형태를 가지고 있는 것으로 알려져ssDNA phages

있음 본 연구를 통해 장내 환경 또한 가 우점하고 있는 환경. microphages

으로 밝혀졌으며 이들의 생태학적 역할에 대한 관심이 필요함, .

� 장내 우점균인 의 유전체에 포함된Bacteroides & Prevotella strains

의 높은 유사도를 보이는 것으로 보아Prophage-like elements

가 장내 환경에 의 숙주로 판단됨Bacteroides & Prevotella microphages .

현재까지 를 통해 알려진 의 높은 다양성, viral metagenomics microphages

과 양적 존재에도 불구하고 그들의 숙주나 진화 형태 유전적 특징 등이 뚜,

렷이 밝혀지지 않았음 본 연구를 통해 장관 내 의 숙주를 유추. microphage

할 수 있는 증거를 도출하였으며 이는 추후 의 생태학적 특징, microphage

을 이해하는데 주요한 관점으로 작용할 것으로 기대됨, .

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3중단위 요약

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