3. m za analizu h i p bh 2014

8/16/2019 3. M Za Analizu h i p BH 2014

1/58

Metode umolekularnoj

biologiji


2/58

Metode za analizuhromozoma


3/58

Hromozom

• Hromozom – χρώμα (hroma) - boja i σώμα (soma) – telo• Sposobnost bojenja hromozoma je bila osnov na kojoj su se

bazirale pionirske metode za analizu hromozoma


4/58

• Skup svih hromozoma u jednoj ćeliji, sa opisom njihovogbroja i morfologije, predstavlja kariotip

• Hromozomi sloeni po nekom sistemu, naj!e"će poveli!ini i morfologiji, !ine kariogram

• Shematski prikaz kariograma ozna!ava se kao idiogram


5/58

#etode kariotipiza$ije

• %dre&ivanje kariotipa• 'zor$i Sva tkiva !ije se ćelije

dele ili se mogu stimulisati nadeobu

• naliza hromozoma vr"i se umetafazi ćelijske deobe

• *ajjednostavnija metodakariotipiza$ije je odre&ivanje

kariotipa iz limfo$ita perifernekrvi – #orheadova metoda• naliza kori"ćenjem

svetlosnog mikroskopa


6/58

+ trake

• ojenje tripsinom ( razlae proteine i pravi trake.) / +imzom


7/58

0-trake – reverzna tehnika

• 0ezultat suprotan od tehnike + traka

• %ni regioni hromozoma koji su se bojili tamno., kori"ćenjem 0tehnike boje se svetlo. i obrnuto

• 1oristi vrući alkalni rastvor i +imzu


8/58

2 – trake

• 3ro$edura ista kao kod +banding metode samo "to se zabojenje koristi 4uinea$rine

• naliza fluores$entnimmikroskopom

• 1oristi se za marka$iju 5hromozoma i satelita naakro$entri!nim hromozomima


9/58

6 – trake

• 7ehnika za bojenje konstitutivnog heterohromatina

• 8a analizu stukturnih promena u okolini $entromera


10/58

naliza hromozoma metodamabojenja traka

• *umeri!ke i strukturne abera$ije hromozoma

• 9etek$ija hromozomskih rearanmana većih od : #b

http;;


11/58

Fluorescentna in situ hibridizacija - FISH

• 9etek$ija spe$ifi!nih regiona 9*1 u $itolo"kommaterijalu fiksiranom na mikroskopskim plo!i$ama

• 3reporuka je da se ova metoda primenjuje paralelno sametodom analize hromozoma + traka.


12/58


• 3ro$es sparivanja jednolan!anihpolinukleotida iz dva razli!itaizvora na osnovukomplementarnosti baza nazivase HC0C9C86CD

• ' mnogim tehnikama jedanpolinukleotid je definisanasekven$a ili hemijski sintetisanmolekul – 30% – EF'%0GS6G*7*%

%GFGG*G 30%G• In situ zna!i u mestu


13/58


• 9enatura$ija $iljne 9*1

• Hibridiza$ija probe sa $iljnom 9*1

http;;


14/58

7C3%KC 30% 8 ECSH

0azli!iti tipovi proba za fluores$entnu in situ hibridiza$iju (ECSH)

+en-spe$ifičnaproba

6entromernaproba

7elomernaproba

Hromozom-spe$ifična proba(Chromosome-

painting probe)3robe za repetitivne 9*1 sekven$e


15/58


metafazni hromozomi interfazna jedra

http;;


16/58


• *umeri!ke hromozomske abera$ije

• Strukturni hromozomski rearanmani

• #ikrodele$ije

• Cdentifika$ija ta!ke prekida na hromozomima• bera$ije na nivou pojedina!nih gena


17/58

1omparativna genomskahibridiza$ija

#etoda za ispitivanje- duplika$ija i dele$ija velikih hromozomskih regiona

- numeri!kih hromozomskih abera$ija

- genomskih promena tumorskih ćelija


18/58


• #etoda se bazira na kvantitativnom dvobojnom FISH-u• Simultana hibridiza$ija dva uzorka genomskih DNK koji

su obeleeni sa dve razli!ite genomske probe sa

normalnim metafaznim hromozomima• 'zor$i genomskih 9*1 – kontrolna genomska 9*1 igenomska 9*1 tumorskog tkiva


19/58

3riprema genomskih 9*1

• iotinom obeleene tumorske 9*1

• 9C+-om obeleene kontrolne 9*1

- KC9C* konugovan sa zelenom fluorobojom – EC76 za

detek$iju botinom obeleene tumorske 9*1- nti 9C+ antitelo konjugovano sa $rvenom bojom (0%9#C*om) za detek$iju 9C+-om obeleenekontrolne 9*1


20/58


• 0egioni metafaznih hromozoma koji jednakimintezitetom hibridizuju sa obe fluoro boje "to za rezultatima emitovanje ute boje daju informa$iju o delovimatumorskog genoma bez strukturnih ili numeri!kih izmena=


21/58


• ' slu!aju delecija hromozma tumorskog tkiva detektuje se boja kojom su Mbojeni uzor$i kontrolne 9*1(u prikazanom slu!aju to je $rvena boja)=


22/58


• Cstovremeno, regioni koji su dupliciranih utumorskom tkivu za rezultat imaju pojavu boje nametafaznih hromozomima kojom je obeleenagenomska 9*1 kontrolnog uzorka (u prikazanom slu!aju

to je zelena boja)=


23/58


• Karija$ije u intenzitetu boje !itavih normalnih metafaznihhromozoma odraavaju numeri!ke hromozomskeabera$ije, dok varija$ije u intenzitetu fluoroboja udelovima istih hromozoma reflektuju promene u broju

kopija delova hromozoma (duplika$ije ili dele$ije delovahromozoma)


24/58



25/58

#olekularno - biolo"ke metode zaanalizu proteina


26/58

• Cmunohistohemija• Nestern blot

• 1o-imunopre$ipita$ija

8DG9*CO1C 0G+G*S

*7C7GF%


27/58

ntitelo


28/58

C#'*%HCS7%HG#CD


29/58

Cmunohistohemija

Cmunohistohemijske metode omogućavaju vizueliza$ijudefinisanih antigena u tkivnim prese$ima, vezivanjemantitela za male, spe$ifi!ne regione antigena, antigenedeterminante ili epitope=

Imunohistohemija kao metoda zasniva se na kori"ćenjeobeleenih antitela kao spe$ifi!nih reagenasa zalokaliza$iju i detek$iju tkivnih konstituenata (antigena) insitu=

ntigen ntitelo! ntigen " ntitelo kompleks


30/58

3rimarno antitelo

Spe$ifi!no lo$ira antigen u tkivnom preseku

3%FC1F%*S1 *7C7GF

3rvootkrivena ili prvosintetisana antitela

• 3otrebno je bilo izolovati antigen

• 'raditi imuniza$iju ivotinje

• 9obro biohemijski okarakterisati g


31/58

3rimarno antitelo

#%*%1F%*S1 *7C7GF

• APIQ= godine - +eorge1ohler i 6esar #ilstein

• 0azvoja hibridomatehnologije – hibridiza$ijasomatskih ćelija - fuzijaspleno$ita (ćelije koje

stvaraju antitela) i ćelijamijeloma (ćelije koje sekontinuirano dele)


32/58

08FC1G 3oliklonska antitela #onoklonska antitela

3repoznaju na g-nu #ultiple epitope Krlo spe$ifi!na –prepoznaje

pojedina!ne epitope'kr"tena reaktivnost 3risutna !esto 8avisi od spe$ifi!nosti

epitopa, moe bitiprividno odsutna

*espe$ifi!no

(ba$kground) bojenje

Karira 3rividno odsutno

%setljivost Krlo osetljiva 0elativno niska,afinitet za epitopenizak

Sastav 0azli!ite klase isubklase Cg-na

3ojedina!ne klase ilisubklase Cg-na,uniformnih molekula

0eprodu$ibilitet Karira Hibridoma produkti sustabilni tokomvremena


33/58

Cmunohistohemijaa# $utinski% u para&in uklopljeni% tkivnih preseci

b# Krio ise'ci " nativni (zamrznuti) delovi tkiva

c# *elijski razmazi odnosno suspenzije


34/58

Cmuno$itohemija

Cmunohistohemija


35/58

Cmunohistohemija

DI$+K,N M+,D


36/58

Cmunohistohemija

INDI$+K,NI M+,D

.rimarno antitelo koje se vezuje za antigenSekundarno antitelo koje se vezuje za primarno antitelo

Sekundarno antitelo je Ig/ za animalnu vrstu iz koje je izlovano primano antitelo


37/58

Cmunohistohemija

Gnzim kao obeleiva! antitela

3eroksidaza – supstrat vodonik peroksid - razlaevodonik peroksid do vode, a oslobo&eni elektroni

polimerizuju hromogenu supstan$u koja se taloi namestu reak$ije antigen – antitelo=

7alog je nerastvoran i time je omogućena vizueliza$ijareak$ije – S7CF*, 70D* C KC9FDCK

SKG7F%S*C# #C10%S1%3%# lkalna fosfataza – supstrat naftol fosfati


38/58

Cmunohistohemija

9alji razvoj ovih tehnika i"ao je u prav$u povećanja broja primenjenihslojeva antitela i povećanju osetljivosti i spe$ifi!nosti bojenja.=33 kompleks 3eroksidaza anti - peroksidaza kao ter$ijerni sloj

33 kompleks lkalna fosfataza anti - alkalna fosfataza kao ter$ijerni sloj priimunohistohemijskim bojenjima. onih tkiva u kojima ja te"ko blokiratiaktivnost endogene peroksidaze


39/58

3riprema uzorka

• 'zimanje uzoraka tkiva – biopsija, hirur"ki materijal,tkiva oglednih ivotinja,===

• Eiksa$ija uzoraka

• 9ehidrata$ija, proimanje i kalupljenje odabranihuzoraka u parafin

• Se!enje parafinskih kalupa na mikrotomu na ise!kedebljine oko R-Qµ

• dhezija tkivnih ise!aka na staklene predmetneplo!i$e


40/58

3riprema uzorka

• 1rio ise!$i


41/58

Cmunohistohemijska pro$edura

• 9eparafiniza$ija i rehidrata$ija ako su uzor$i tkiva zaimunohistohemijsku analizu ukalupljeni u parafin

• Eiksa$ija

• 9emaskiranje. antigena

• Cmunuhistohemijska pro$edura

• ojenje

http://labtrader.com/equipment_images/VVS0803003_larger.jpg


42/58


43/58

3rimena imunohistohemije


44/58

Nestern blot analiza


45/58

Nestern blotting

• Cdentifika$ija proteina• %dre&ivanje koli!ine

ispitivanog proteina

• %dre&ivanje molekulsketeine polipeptida

• 3ro$ena efikasnostiekstrak$ije proteina

• 9etek$ija proteina

• 8a izolovanje ikarkateriza$iju antitela izpoliklonalnih seruma

E Color product

substrate

3 i k i l j t i i bi l "k t ij l


46/58

• 3riprema uzorka – izolovanje protein iz biolo"kog materijala

• 0azdvajanje uzorka proteina elektroforezom na gelu

• 7ransfer uzorka proteina sa gela na membranu

•lokiranje nespe$ifi!nog vezivanja antitela na membrani• Cnkuba$ija membrana sa antitelom za protein od interesa

• 9etek$ija kompleksa antigen - antitelo


47/58

3riprema uzorka

*aj!e"ći izvor proteina ćelijski lizati - *edenaturisani pufer - Fiza ćelija -

%sloba&anje proteina – Ouvanje uzoraka proteina


48/58

dre0ivanje koncentracije proteina

1olorimetrijskog odre&ivana kon$entra$ije proteina na osnovustandardne krive, konstruisane na osnovu asporban$ija uzoraka

poznate kon$entra$ije - 1oefi$ijent prav$a krive


49/58

/el za koncentrovanje12 akrilamid3N4N4-bis akrilamid

Nestern blotting

/el za razdvajanje562 akrilamid3N4N4-bis akrilamid

0azdvajanje

po molekulskoj tezini

SDS " ./+ elektro&oreza

kori78enjem poliakrilamidnog gelarazdvajanje po molekulskoj tezini


50/58

,rans&er uzorka proteinasa gela na membrane

a= nitro$elulozna membrana

b= aktivirana papirna membrana

$= aktivirana najlonska membrana

A= 3rosta difuzija

:= Kakum transfer

L= Glektroforetska elu$ija

(vlani i polusuvi)


51/58

Cmunobloting

• lokiranje nespe$ifi!nog vezivanjaantitela (obrano mleko ili S –albumin iz seruma gove!eta)

• Cnkuba$ija blotova primarnim

antitelom• %GFGG* *7C7GF – direktna

detek$ija

• *G%GFGG* *7C7GF –

indirektna detek$ija - kolorimetrijskaenzimska detek$ija ihemiluminis$en$ija


52/58

Nestern blot analize

utoradiogra&ski signali se skeniraju a trake se kvanti&ikuju kori78enjem so&tvera


53/58

Nestern blotting

• *C#6CDhttp;;


54/58

K - IM9N.$+:I.I,:I;

M+,D


55/58

1% - C#'*%30G6C3C76CD

• #etoda ko-imunoper$ipita$ije zasniva se na prin$ipupre$ipita$ije $iljnog proteina, kori"ćenjem primarnogantitela, iz rastvora nedenaturisanih totalnih proteina, uprisustvu protein + sefaroze - streptokokni protein sa

velikim afinitetom vezivanje za sve klase imunoglobulinarazli!itog porekla=


56/58

1% - C#'*%30G6C3C76CD

*akon pre$ipita$ije, u talogu se nalazi $iljni protein, kao isvi proteini koji su sa njim, u formi dimera, bili povezanislabim nekovalentnim vezama=


57/58

1%-C#'*%30G6C3C76CD

• *akon imunopref$ipita$ije prisustvo razli!itih proteina,analizira primenom Nester blotting metode (S9S-3+G)

Slede metode a anali


58/58

Slede metode za analizunukleinskih kiselina

3. m za analizu h i p bh 2014

Documents