LANANA REAKCIJA POLIMERAZOM ILI SINTEZA

DNK IN VITRO

Lanana reakcija polimerazom (Polymerase chain reaction, PCR) je prototip amplifikacijske metode, gdje se upotrebom promjene temperature najprije denaturira, a zatim hibridizira DNK i pri tome se viestruko umnoi uz pomo enzima. Kary Mullis i sar. 1985. god u Science objavili tehniku specifinog umnoavanja fragmenta DNK in vitro kataliziranog enzima polimeraza porijeklom iz Escherichia coli. U istom asopisu isti tim naunika publicira rad u kojem prvi put uvode termostabilnu DNK polimerazu izolirana iz termofilne bakterije Thermus aquaticus

Osjetljiva metoda koja moe poeti od samo jedne molekule DNK, a nastaju milionske kopije DNK.

- Nobelova nagrada 1993. god za hemiju Dr. Kary Mullis primio je Nobelovu nagradu za otkrie ove metode. PCR je revolucionarna metoda u istraivanjima molekularne biologije koja je omoguila umnoavanje DNK molekula (npr. nekoga gena) in vitro. Najvanija prednost ove metode jeste da istoa i koliina DNK koja se umnoava ne mora biti visoka, uz uslov da reakcijska smjesa sadri barem jedan cijeli lanac DNK koja se umnoava. To je toliko osjetljiva metoda da umnoavanje moe zapoeti od doslovno jedne molekule DNK. Iz uzorka krvi uzete na EDTA izolira se DNK, a specifina regija ispitivanog gena umnoi se u vrlo veliki broj kopija (teoretski iz jedne jedine molekule DNK moe nastati 235 kopija). Dakle, rezultat PCR-a je eksponencijalno nakupljanje specifinih ciljnih DNK produkata.PCR se koristi i za odreivanje slijeda baza odsjeaka DNK iz dijelova kolonija bakterija faga, za umnoavanje i odreivanje koliine stanine RNK ili stvaranje jednolanane DNK. Osim ovih, PCR ima jo mnoge druge primjene. Zato je sasvim jasno da ne postoji jedinstven protokol koji bi zadovoljavao razliite potrebe. Prva DNK koja je na ovaj nain bila umnoena je gen za humani -globin. Uobiajeni nain izvoenja PCR

Iako je uobiajenim nainima izvoenja PCR mogue umnoiti veinu ciljnih DNK molekula, osnovnu je metodu esto potrebno prilagoditi specifinim uslovima. Glavni je, meutim, preduslov umnaavanja gena poznavanje nukleotidnog slijeda barem jedna njegova dijela. To omoguava odabir / konstrukciju poetnih oligonukleotidinih DNK odsjeaka (engl. primer) komplementarnih s graninim dijelovima poznate DNK-sekvence (ciljna DNK). Poetni oligonukleotidi (poslije razdvajanja DNK lanca) sparuju se sa komplementarnim, ali suprotno orijentisanim lancima ciljne DNK, tako da se sinteza nove DNK odvija u regiji izmeu njih. Uslovi za sintezu DNK su ovisni od duine fragmenata, sastava poetnih oligonukleotida i odnosa baza AT/GC u umnoenoj DNK. Za PCR reakciju potrebno je napraviti mjeavinu: genomske DNA, unutar koje se nalazi i gen koji elimo umnoiti (DNK sekvenca), pojedinanih nukleotida (adenina, guanina, citozina i timina, tzv. dNTP-dinukleotid trifosfata), te para poetnih oligonukleotida, Taq DNA polimeraze, pufera i magnezijuma Mg2+, sa optimalnom pH.PCR se sastoji iz tri dijela:1. Denaturacije: Pri temparaturi od 95C dolazi do cijepanja hidrolitikih veza u dvolananoj molekuli DNK uzorka koji ispitujemo, tako da je u njemu tog trenutka samo jednolanana DNK, sa kojom e se komplementarno spariti poetni oligonukleotidi. Najei uzrok neuspjele PCR je nepotpuno razgraivanje dvostrukog lanca ciljne DNK. Pri temperaturi od 95C ovaj proces obino traje 30 sekundi, a pri temperaturi od 97C samo 15 sekundi. Via temperatura koristi se kada je ciljna DNK bogata nukleotidima koji sadre baze citozin i guanin. Nepotpuno razgraivanje omoguava da se lanci DNK ponovno spare (renaturiraju), to smanjuje koliinu eljenog produkta. Ako je proces razgraivanja predug ili se vri na previsokoj temperaturi, dolazi do nepotrebnog gubitka aktivnosti Taq DNK polimeraze.2. Sparivanje poetnih oligonukleotida: Temperatura od 49C do 60C uvjetuje tano sparivanje poetnih oligonukleotidnih zaetaka s komplementarnim DNK lancem. Temperatura i vrijeme potrebno za sparivanje poetnih oligonukleotida s ciljnom DNK ovisi o sastavu baza, duini i koncentraciji poetnih oligonukleotida. Pri uobiajenoj koncentraciji poetnih nukleotida od 0,2 M sparivanje traje samo nekoliko sekundi. Poveavanje temperature sparivanja smanjuje mogunost netanog sparivanja poetnih nukleotida s ciljnom DNK, te nadovezivanje netanih nukleotida na slobodne hidroksilne skupine na 3' kraju poetnih nukleotida. Zato strogo kontrolisanje temperature, naroito za vrijeme prvih nekoliko ciklusa, pomae poveavanju specifinosti sparivanja. Da bi se postigao maksimum specifinosti za vrijeme prvog ciklusa, Taq DNA polimerazu mogue je dodati, u reakcijsku smjesu tek nakon prvog razgraivanja DNK, tj. za vrijeme prvog sparivanja3. Produavanje lanca: Temperatura od 72C je optimalna za produenje/rast poetnih oligonukleotida, odnosno sinteze komplementarnog lanca DNK odsjeka gena koji se umnoava, pomou enzima Taq DNK polimeraze. Vano je da polimeraza koja se upotrebljava u reakciji nije razgradiva na visokim temperaturama. Novi lanci DNK, koji nastaju produivanjem poetnih oligonukleotida, komplementarni su jedan drugom i sposobni su da u novom ciklusu za sebe veu takve poetne oligonukleotide. Svaki sljedei ciklus PCR-a udvostruava koliinu ciljne DNK. Vrijeme produivanja ovisi o duini i koncentraciji ciljne DNK i temperaturi. Pri temperaturi od 72C DNK lanac produuje se za otprilike 35100 nukleotida u sekundi, to ovisi i o vrsti medija, pH, koncentracijama soli, ali svakako i o prirodi ciljne DNK. Vrijeme produivanja od jedne minute pri temperaturi od 72C dovoljno je da bi nastao produkt veliine 2,0 kbp. Meutim, ako je koncentracija supstrata veoma niska, korisno je produiti vrijeme produivanja u prvih nekoliko ciklusa, ali isto i u zavrnim ciklusima, kada je koncentracija produkta znatno vea od koncentracije enzima. Produivanje pri niskim temperaturama, te visoka koncentracija deoksinukleotida olakavaju pogreno produavanje poetnog oligonukleotida.

Broj ciklusa:Optimalni broj ciklusa zavisi od poetne koncentracije ciljne DNK uz uslov da su ostali parametri standardizirani. Prevelikim brojem ciklusa poveava se koliina nespecifinih produkata, dok premali broj ciklusa dovodi do stvaranje premale koliine specifinog produkta. Kod PCR-a broj novosintetiziranih DNK poveava se eksponencijalno 2n (n = broj ciklusa). Prilikom 20 ciklusa od jedne molekule DNK proizvede se 1 048576 novih molekula.Dakle, ako u reakcijskoj smjesi imamo npr. 3x103 molekula ciljne DNK, dovoljno je dostii 25-30 ciklusa. Manji broj poetnih molekula DNK u reakcijskoj smjesi zahtijeva vei broj ciklusa.

Deoksinukleotidtrifosfati Specifinost i tanost PCR poveava se pri upotrebi niih koncentracija deoksinukleotrifosfata (dNTP) i nuno je da svaka radna smjesa sadri jednake koliine svakog pojedinanog dNTP-a (dATP-dinukleotid adenin trifosfata, dGTP-dinukleotid guanin trifosfata, dCTP-dinukleotid citozin trifosfata, dTTP-dinukleotid timin trifosfata). Njihova stabilnost tokom reakcije takva je da nakon 50 ciklusa preostaje oko 50% poetne koliine. Nie koncentracije dNTP smanjuju pogreno sparivanje i vjerovatnost ugradnje netanih nukleotida za vrijeme produivanja.

Tanost reakcije (sparivanje i produavanje) katalizirane Taq DNK polimerazom ovisi o mjeri i koncentraciji jona Mg2+. Isto tako vana je koncentracija monovaletnih jona koji djeluju na aktivnost Taq DNK polimeraze i to KCl i amonijevog acetata.Danas su konstruisani ureaji koji precizno mjenjaju ove temperature za PCR u eljenom vremenu (engl. ThermoCycler). Ovakvi ureaji su sve ei ne samo u istraivakim laboratorijima znanstvenih ustanova, nego i u pojedinim medicinskim ustanovama (mogunost ranog otkrivanja nekih bolesti kao npr. AIDS) ili u laboratorijima za kriminalistiku (npr. otkrivanje poinitelja kaznenih djela iz samo jedne vlasi kose naene na mjestu zloina).Znai PCR smjesa (mix) mora imati sljedee sastojke do konanog volumena 12,5 l ili 25 l:1. PCR pufer

2. MgCL23. dNTP

4. primer 1 ili oligonukleotidi5. primer 2 ili oligonukleotidi6. genomska DNK

7. Taq polimeraza

8. voda

Taq DNK polimeraza

U poetnom periodu, nakon otkria, lanana reakcija sinteze DNK (PCR) izvoena je pomou Klenowa fragmenta enzima DNK polimeraze Escherichia coli (E. coli). Zbog neotpornosti na visoke temperature enzim je dodavan tokom svakog ciklusa reakcije, nakon faze razgradnje dvolanane DNK, to je prilino oteavalo izvoenje metode. Stoga je otkrie termostabilne DNK polimeraze znatno unaprijedilo izvoenje reakcije i njezinu iru primjenu u molekularnoj biologiji.Termostabilna DNK polimeraza otkrivena je i izolirana iz nekoliko razliitih bakterijskih vrsta: archaebakterija, Bacillus stearothermophilus, te bakterija roda Thermus. Danas se najee koristi Taq DNK polimeraza izolirana iz termofilne bakterije Thermus aquaticus (Taq) koja naseljava izvore vrue vode nacionalnog parka Yellowstone u SAD. Ovaj enzim podnosi izlaganja visokoj temperaturi (do 30 minuta na 94-95C mada tada nema aktivnost ugradnje nukleotida u DNK lanac) pa se stavlja u reakcijsku smjesu ve na poetku prvog ciklusa PCR-a.

Ovisno o kalupu DNK, optimalna temperatura djelovanja ovog enzima iznosi 75-80C. U tom rasponu temperatura enzim katalizira ugradnju od ak 150 nukleotida u sekundi. Smanjenjem optimalne temperature aktivnost Taq DNK polimeraza takoer se smanjuje.

PRAKTINA PRIMJENA PCR-a

U dijagnostici PCR je prvi put koritena za prenatalnu dijagnozu anemije srpastih stanica, genetskog oboljenja uzrokovanog mutacijom nekih od nukleotida gena za -globin. Umnoavanje nukleotidnog odsjeka gena i njegova hibridizacija sa specifinim nukleotidnim nizovima omoguava razlikovanje normalnog od mutiranog alela.Na istom principu razvijene su do danas brojne jednostavne dijagnostike metode kojima je mogue detektirati poznate mutacije gena, tj. genetske poremeaje, kao to je na primjer -talasemija.U sluajevima gdje su oba roditelja nosioci gena za autosomalno recesivno oboljenje (heterozigoti koji nose jedan mutirani alel) ansa roenja bolesnog djeteta iznosi 1:4. Testiranjem amnionske tenosti ili analizom biopsija horionskih resica fetusa moe se otkriti da li je dijete bolesno ili samo nosilac gena za oboljenje. I ova testiranja znatno su pojednostavljena i skraena primjenom PCR-a. Osim za dijagnozu genetskih oboljenja primjena PCR-a znatno olakava analizu podlonosti oboljenju. U onkologiji, PCR se primjenjuje za identifikaciju hromosomalnih abnormalnosti i specifinih somatskih mutacija unutar onkogena i supresorskih gena. Hronina mijeloidna leukemija bila je prvo oboljenje u kojem je identificirana specifina genetska abnormalnost. Detekcija mutacija povezanih s nastankom razliitih tipova tumora takoer je omoguena primjenom PCR-a. PCR se koristi i za detekciju RNK i DNK virusa, uzronika raznih tumora. To su na primjer Eppstein-Barrov virus virus uzronika T stanine leukemije kod ljudi, virus hepatitisa B, humani papiloma virus itd. Detekcija virusa, nasljednih i somatskih mutacija, hromosomskih translokacija povezanih s nastankom specifinih tumora, pomou PCR-a daju vrijedne informacije za prognozu bolesti i dijagnozu.Osim klinike primjene, pomou PCR-a danas je mogue i ispitivanje DNK u uzorcima starim nekoliko miliona godina.U sudskoj praksi PCR omoguava genetsko tipiziranje biolokih dokaza naenih na mjestu zloina. Tako se moe prouavati DNK iz razmaza ili mrlja krvi te korijena kose. Metodom PCR-a mogu se analizirati sasvim neznatne koliine DNK ak i kada je razgraena.Izolacijom DNK iz uzoraka tkiva uklopljenog u parafin omoguava se primjena PCR-a i u istraivanju arhivskog materijala u patologiji.Najimpresivnija je, meutim, primjena PCR-a u arheologiji. Uspjeno je, naime, umnoena DNK trinaest hiljada godina starih fosilnih nalaza ivotinja.Mogunost umnoavanja specifinog DNK odsjeka jednostavnom i automatiziranom reakcijom, kao to smo vidjeli, ima primjenu u mnogim podrujima znanosti i medicine. Vrlo je vjerojatno da kroz nekoliko godina gotovo nee postojati podruje znanosti gdje se u nekom obliku nee primjenjivati ova metoda._1203869069.bin