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30 aprile 2009 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI EMANUELE SALIMBENI
CARATTERIZZAZIONE CARATTERIZZAZIONE ELETTROFISIOLOGICA DI ELETTROFISIOLOGICA DI
CARDIOMIOCITI CARDIOMIOCITI
DERIVATI DA CELLULE DERIVATI DA CELLULE STAMINALISTAMINALI
““IN GITA A FIRENZE!!!”IN GITA A FIRENZE!!!”
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30 aprile 2009 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI EMANUELE SALIMBENI
Università degli Studi di FirenzeUniversità degli Studi di Firenze
Dipartimento di Farmacologia Preclinica e Clinica
"Mario Aiazzi Mancini"
FACOLTA’ DI MEDICINA
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30 aprile 2009 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI EMANUELE SALIMBENI
IL CUBOIL CUBO
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30 aprile 2009 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI EMANUELE SALIMBENI
CENTRI OSPITATICENTRI OSPITATICentro Interdipartimentale di Servizi di Spettrometria di Massa (
C.I.S.M.)
Centro Interuniversitario di Medicina Molecolare e Biofisica Applicata (
C.I.M.M.B.A.)
Centro per i Servizi di Stabulazione degli Animali di Laboratorio (
Ce.S.A.L.)
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COSA FANNO NEL C.I.M.M.B.A?COSA FANNO NEL C.I.M.M.B.A?
LABORATORIO DI ELETTROFISIOLOGIA
CARDIACA
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Rimodellamento Elettrofisiologico e Molecolare della cellula e tessuto
cardiaco durante lo sviluppo fisiologico e durante alcune patologie cardiache
Studio di farmaci antiaritmici e delle sostanze che modulano la frequenza
cardiaca.
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30 aprile 2009 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI EMANUELE SALIMBENI
QUALI MODELLI?QUALI MODELLI? Cardiomiociti ex-vivo, isolati da campioni di Cardiomiociti ex-vivo, isolati da campioni di
cuore (umano o animale) patologico;cuore (umano o animale) patologico;
Cardiomiociti in vitro:Cardiomiociti in vitro: -cardiomiociti ottenuti dal differenziamento di -cardiomiociti ottenuti dal differenziamento di
cellule staminali embrionali cellule staminali embrionali -cardiomiociti immortalizzati;-cardiomiociti immortalizzati;
Cellule trasfettate per lo studio delle isoforme e Cellule trasfettate per lo studio delle isoforme e della regolazione dei canali HCN, che mediano della regolazione dei canali HCN, che mediano la corrente If.la corrente If.
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PER CAPIRCI: COSA HO FATTO IO?PER CAPIRCI: COSA HO FATTO IO?
ASSISTITO AD ALCUNI ESPERIMENTI DI
PATCH-CLAMP ESEGUTI CON DIVERSI SET-UP SU CARDIOMICITI DERIVATI DA CELLULE
STAMINALI EMBRIONALI, VOTLI A RACCOGLIERE DATI SU:
1. CORRENTI IONICHE;
2. POTENZIALI DI MEMBRANA;
3. POTENZIALI D’AZIONE;
4. EFFETI DI FARMACI E ALTRE SOSTANZE SU TALI GRANDEZZE.
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30 aprile 2009 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI EMANUELE SALIMBENI
L’iter delle cellule:
PRODOTTE IN AUSTRALLIA
DIFFERENZIATE IN SVIZZERA (GINEVRA)
FATTE INVECCHIARE E CARATTERIZZATE A FIRENZE
10.000 EURO
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30 aprile 2009 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI EMANUELE SALIMBENI
INVECCHIAMENTO
EARLY 15-40:
Più facile da mantenere.
LATE 50-110:
Più difficili da conservare.
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30 aprile 2009 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI EMANUELE SALIMBENI
EARLY:1. ICal;2. IKr;3. If sparisce;
LATE:1. Ito2. IK1;
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30 aprile 2009 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI EMANUELE SALIMBENI
PATCH -CLAMPPATCH -CLAMP
PRIMO PASSO: INVECCHIAMENTO
SECONDO PASSO: DIVISIONE (ENZIMA, VINCERE ELASTICITA’)
TERZO PASSO:PIASTRINE (SOSPESO ENZIMA, VETRO)
QUARTO PASSO: SOLUZIONI
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30 aprile 2009 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI EMANUELE SALIMBENI
INTRA (ELETTRODO):
1. FISIOLOGICA;
2. IONI DI SELZIONE;
3. EGTA.
•PH=7.2;
•PRESSIONE OSMOTICA PARI ESTERNA;
•UNICA.
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30 aprile 2009 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI EMANUELE SALIMBENI
EXTRA (PIASTRINA): TYRODE
1. NaCl 140 mM;2. KCl 5,4 Mm;3. MgCl2 1,2 mM;4. Glucosio;5. HEPES (Acido);
pH=7.3
Inseguito CaCl2 2mM;
DIFFERENZIATE
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Set-up: insieme di tutti gli elementi che permettono di fare la misura
1. microscopio;2. amplificatore Axon;3. multi canale;4. braccio e elettrodi;5. provette con dentro le
soluzioni extra-cellulari;6. perfusore per fare
entrare le soluzioni nei vetrini;
7. Aspiratore (occhio posizionamento);
8. Aspiratore per suzione9. Rilevatore temperatura.
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SEALSEAL
1. Elettrodo lontano Seal=200 MΏ;2. Elettrodo appoggiato Seal=3 MΏ;3. Suzione Seal=50 MΏ;4. Rottura Seal=80 MΏ;5. Perfusione e ulteriore suzione=100 MΏ.
Il GΏ E’ UN SOGNO!!!!!!!
•PROBLEMI DI PERFUSIONE (TROPPO, POCO…)
•TENUTA DELL’HOLDER.
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30 aprile 2009 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI EMANUELE SALIMBENI
PROTOCOLLO
I=V/Rseal Rseal sale I scende
PULSE 2 mV
PERFUSIONE: AIUTA LA FORMAZIONE DEL SEAL
DIFFICOLTA’: CELLULE PICCOLE E PIATTEINCUBAZIONE;
ROTTURA OVERLOAD
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POSSO ANCHE CALCOLAREPOSSO ANCHE CALCOLARE
Capacità di membrana (automatico);Capacità di membrana (automatico); Reisitenza di membrana;Reisitenza di membrana; Time costantTime costant Resistenza foro (apertura protocollo)Resistenza foro (apertura protocollo) capacità foro;capacità foro;
Se c’è del leakage si elimina inserendo una Se c’è del leakage si elimina inserendo una resistenza in serie al seal (set-up nuovo).resistenza in serie al seal (set-up nuovo).
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30 aprile 2009 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI EMANUELE SALIMBENI
STUDIO DELLE CORRENTI E DEI STUDIO DELLE CORRENTI E DEI POTENZIALIPOTENZIALI
1. Perfondere con la soluzione extra adatta;
2. Applicare un protocollo;
3. Registrare;
4. Fare esperimenti con protocolli e soluzioni extra diverse (perfusione, aspirazione);
5. Ricominciare;
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30 aprile 2009 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI EMANUELE SALIMBENI
IfIf
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ESPERIMENTOESPERIMENTO
ISOPRENALINA: ANTAGONISTA DEI RECETTORI BETA-ADRENERGICI (AUMENTA If) PER VEDERE COME VIENE MODULATA If NEL CORSO DELLA MATURAZIONE DELLE
CELLULE (CAMBIAMENTO CANALE)
REVERSIBILITA’ LAVAGGIO
ACETILCOLINA/CARBACOLO (ANALOGO STABILE):
CORRENTE DI POTASSIO, POICHE’ VENGONO ATTIVATI I RECETTORI MUSCARINICI CHE
AUMENTANO LA Gk
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30 aprile 2009 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI EMANUELE SALIMBENI
INaCaINaCa
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REGISTRAZIONIREGISTRAZIONI
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30 aprile 2009 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI EMANUELE SALIMBENI
THANKS TO THANKS TO ALL THE ALL THE CC33MIGersMIGers