3.3 la inmovilizacin celular y enzimtica

La Utilización Industrial de microorganismos recombinantes

La inmovilización celular y enzimática.

Inmovilización

• Confinamiento físico de una enzima o célula en una determinada región del espacio, de manera que su actividad catalítica se retenga, y pueda ser reutilizada.

• 1971, 1er Enzyme Engineering Conference, Henniker, New Hampshire, USA.

Biocatalizadores inmovilizados

• Enzimas, células u organelos celulares que se encuentran en un estado tal que se permite su reutilización.

• las enzimas y las células pueden transformarse en catalizadores heterogéneo.

• El biocatalizador se confina a una región determinada a través de la cual se pasa la solución del sustrato, que sale como un producto, libre de catalizador.

Homogéneo: uso único

Heterogéneo: uso continuo

‰

‰

Operación continua

Reutilización

COMPONTETESDE LOS

BIOCATALIZADORES INMOVILIZADOS

Enzimas Células vivasCélulas muertas

Durante la inmovilización

debe mantenerse la

estructura evitándose el

impedimento estérico del

sitio activo

Necesidad de mantener su

estructura organizada

Requisitos para poder caracterizar unbiocatalizador inmovilizado

1.- DESCRIPCIÓN GENERAL

1.1.- Esquema de reacción1.2.- Enzima y microorganismo1.3.- Tipo de soporte1.4.- Método empleado para la inmovilización


2.- PREPARACIÓN DEL CATALIZADOR INMOVILIZADO

2.1.- Método de inmovilización, condiciones de reacción.

2.2.- Rendimiento por peso seco, actividad del sobrenadante.


3.- CARACTERIZACION FISICO- QUIMICA

3.1.-Forma del biocatalizador3.2.-Diámetro medio de partícula húmeda3.3.-Capacidad de hinchamiento3.4.-Comportamiento en columnas 3.5.-Abrasión en reactores agitados3.6.-Abrasión en reactores de lecho fluidizado.


4.-CINETICA DEL BIOCATALIZADOR INMOVILIZADO.

4. 1.-Velocidad de reacción.

4.2.- Efecto del tipo de buffer y pH

4.3.- Estabilidad del biocatalizador en el almacenamiento

MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN:

RETENCIÓN QUÍMICA

• Enlaces covalentes• Adsorción• Reticulado (cross-linking)

RETENCIÓN FÍSICA

• Confinamiento en matrices– En geles o polímeros– Micelas reversas

• Confinamiento en membranas– En fibras huecas– En reactores de membrana

Prof. J.M.Sánchez Montero, Facultad de Farmacia, UCM, Madrid, España

MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN

Adhesión

AdsorciónUniónCovalente

X

1.- No específica2.- Intercambio iónico3.- Hidrofóbico4.- Pseudoafinidad5.- Afinidad

-+

O

HH

OH OH

OH

CH2OH

OLectina Ab

Ag

Colorante

Geles

Confinamiento

1.- Láminas2.- Fibras cóncavas o huecas3.- Encapsulación

Membranas

http://www.uned.es/fac-quim/quimi_inor1/INMOVILIZACION.htm

Métodos de Inmovilización

Retención física Inmovilización química

Adsorción EntrecruzamientoUnión covalenteAtrapamiento o inclusión

Con formación de enlaces covalentesSin formación de enlaces covalentes


Inmovilización por Adsorción

Interacción física, no específica (puentes de hidrógenointeracciones hidrofóbicas, interacciones iónicas, interacciones de van der Waals) entre la proteína enzimática y el soporte.

Alumina, carbón activo, vidrioResinas cambiadoras

El método más sencillo De aplicación general Coste moderado

Estabilidad limitada, se requiere un control riguroso de las condiciones de trabajo para evitar pérdidas de enzima por desorción.

UnionesReversiblesNo covalentes

Atrapamiento o inclusión en un gel, polímero o matriz porosa


Formación de un polímero altamente entrecruzadoen presencia de la enzima. Esta queda atrapada enlos poros de la matriz polimérica formada.

Se requiere controlar las condiciones de polimerización para que no se produzcan alteraciones en la molécula enzimática

Se puede perder proteína lentamente

Se pueden obtener membranas con enzimas inmovilizadas De aplicación general

Gel de poliacrilamidaPolímeros conductores

Atrapamiento por microencapsulación


Se atrapa la enzima en microcápsulas (1-100 µm diámetro) dentro de membranas semipermeables de polímeros que permiten la difusión de sustratos y productos pero no de la proteína.

Membrana polimérica obtenidaen un proceso de polimerizaciónen la interfase disolución orgánica-acuosa

Se requieren elevadas concentraciones de proteína en disolución acuosa (10 mg/L)

Métodos Químicos no polimerizantes- Unión covalente


Formación de enlaces covalentes entre el enzima y el soportepero no entre las moléculas de enzima. El tipo de soporte determina la química de la inmovilización

Asegurar que el centro activo de la enzima no se ve afectado por los reactivosempleados en el proceso de inmovilización.Se puede proteger el centro activo con un análogo del sustrato o un inhibidorcompetitivo durante el proceso de inmovilización.

Soporte Enzima

Grupo funcional Soporte

-CONH2

-COOH

-NH2

-OH

-Si(OH)3

Poliestireno, nylon

Carboxymetilcelulosa

Poliacrilamida

Celulosa, agarosa, sephadex

Vidrio poroso

Activación para obtener grupos funcionales reactivos

Unión a través de las cadenas lateralesde los aminoácidos de la secuencia polipeptidica de la proteína

-NH2 Lisina

-OH-Ph Tirosina

-COOH Aspartato Glutamato

-SH Cisteina

-OH Serina

-Nimidazol Histidina

Métodos de Inmovilización – Unión Covalente

1. Método de la acyl-azida para unión a soporte con grupos ácido

OCH2COOHCH3OH

HClOCH2COOCH3

NH2NH2OCH2CONHNH2

OCH2CONHNH2NaNO2

HClOCH2CON3

OCH2CON3 + NH2-ENZIMA OCH2CONH-ENZIMA

Activación de soporte para obtener un grupo acil-azida

Ataque nucleófilo a la acil-azida para dar lugar a un enlace amida

Son más reactivas las aminas primarias (lisina), aunque tambiénreaccionan residuos de cisteina, serina y tirosina.


2. Método de la carbodiimida para unión a soporte con grupos ácido

COOH COOC+ C

N

N

R

R´

NH

NH

R

R

La selectividad de la reacción mejora si se añade un derivado de N-hidroxisuccinimida durante la etapa de activación del soporte.Se forma un ester de N-hidroxisuccinimida que forma selectivamenteenlace amida con residuos de Lisina

Activación del soporte para darun derivado acilisourea por reaccióncon carbodiimida

Reaccionan lisina, tirosina, cisteina, serina y metionina

COOC

NH

NH

R

R

+ NH2-ENZIMA CONH-ENZIMA + C

NHR

O

NHR

+ H

Reacción con la enzima


3. Unión a través de enlace azo

R NH2

NaNO2

HClR N2 Cl

R N2 Cl HO Enzima R N N

HO

Enzima

+

Activación del soporte para obtener una sal de diazonio

Unión a la enzima a través de un residuo de tirosina

Inmovilización covalente selectiva a través de residuos de tirosina Evita entrecruzamiento enzima-enzima

Entrecruzamiento

N2N2


ICH2 CHN

O

CH2ICHN

O

(CH2)6

S OC

O(CH2)2 N

O

O

SO C (CH2)2

O

N

O

O

Formación de enlaces covalentes intermoleculares (entre moléculas de enzima) y entre estas y el soporte

Cantidades altas de proteína inmovilizada resistentes a condiciones extremas de pH y temperatura

Las redes de moléculas entrecruzadas que se forman dificultan el acceso del sustrato al centro activo Pérdidas de actividad tras la inmovilización altas

Reactivos bifuncionales más utilizados

Diazobenzidina Hexametileno-bis(iodoacetamida)

Bis(N-hidroxysuccinimidyl)ditiopropionato

(CH2)3

CHO

CHO

Glutaraldehido

Ejemplo- Entrecruzamiento con glutaraldehido

Métodos de Inmovilización- Entrecruzamiento

Método simple y sencillo Se verifica en condiciones de pH neutro

(CH2)3

CHO

CHONH2-ENZIMA

NH2-ENZIMA+ (CH2)3

CH

CHN- Enzima

N-Enzima

Para minimizar las pérdidas de actividad enzimática se puede optar por un método de co-reticulado: entrecruzamiento de la enzima con una proteína sin actividad enzimática y rica en lisina, ej. albúmina bovina.

Propiedades de las Enzimas InmovilizadasLas propiedades de las enzimas inmovilizadas difierende las de las enzimas en disolución debido a efectos delmaterial soporte y a cambios conformacionales de la enzima

Inmovilización Efectos sobre la estabilidadEfectos en las propiedades cinéticas

1. Efectos en la Estabilidad

Estabilización conformacional de la enzima por uniones multipuntuales enzima-soporte

Mayor resistencia a desactivación térmica o química

Alteración del microentorno de la enzima

Por ejemplo mayor estabilidad en medios orgánicos sobre soportes hidrofílicos

[S1]

[S2]

0 Distancia a la Superficie del soporte

1

[S]

[S]dis.

Propiedades de las Enzimas Inmovilizadas2. Efectos de la inmovilización sobre las propiedades cinéticas

Capa de difusiónDisolución

SK

Svv

M

max

Los valores de KM y vmax para las enzimas inmovilizadas son aparentes (K’M y v’max)

[S]superficie < [S]disolución

K´M suele ser mayor que KM

4 6 8 10

100

pH

%Actividadrelativa

Propiedades de las Enzimas InmovilizadasEfectos de microentorno Cambio del pH óptimo de la enzima

Quimotripsina en disoluciónQuimotripsina/portador catiónico

Quimotripsina/portador aniónico

Sobre soportes catiónicos:[OH-]superficie>[OH-]disolución

pHsuperficie> pHdisolución

Sobre soportes aniónicos:[H+]superficie>[H+]disolución

pHsuperficie< pHdisolución

Enzimas inmovilizadas

ACOPLAMIENTOACTIVACIÓN

Estrategias para la unión covalente de un enzima a un soporte

Enzima

xxx

Soporte Lavado

x

x

Enzima

Lavado

Soporte

Lavado

x

x

ConjugadoInmovilizado

Ejemplos de enzimas inmovilizadas

Principales características de los métodos de inmovilización:

Características Adsorción Enlacecovalente

Inclusión en matrices

Retención porMembranas

Preparación Simples dificil dificil Simples

Costo bajo elevado moderado elevado

Fuerza de ligación

variable fuerte flaca fuerte

Liberación de enzima

si no si no

Aplicabilidad amplia selectiva amplia Muy amplia

Problemas en la utilización

elevados bajos elevados elevados

Efectos de la matriz

si si si no

Restricciones difucionales

no no si si

Protección microbiana

no no si si

REACTORES

Tanque en agitación

REACTORES

Tanque de alimentación y agitación continua (CSTR)

REACTORES

REACTORES

Lecho compacto

REACTORES

REACTORES

Láminas

REACTORES

REACTORES

Lecho Fluido

REACTORES

Tanque en agitación Tanque de alimentación y agitación continua (CSTR)

Lecho Fluido

Lecho compacto

Láminas

REACTORES

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