34 (! 012 screen printedijdld.tums.ac.ir/article-1-18-fa.pdf · (6˚ !ˆ )11 ˚ ˜1391 ˘ˇˆ - ....

و ليپيد ايران 516-527)6شماره(11؛ دوره 1391 شهريور-دو ماهنامه مرداد. مجله ديابت

بر-3طراحي بيوسنسور الكتروشيميايي براي تشخيص هيدروكسي بوتيرات مبتنيوهاي كوفاكتور تثبيت شده در سطح نانولوله الكترود نواريكربني عامل دار

)Screen Printed (با آناصالح شده

*1دفر كبري امي،1، مائده درزياني عزيزي1فهيمه خورسند،1زاده، زهرا ميرزايي1ارغوان گلباز حق

چكيده

مي-3:مقدمه در درتشخيص كتواسيدوز ديابتي مهم باشد كه شاخصي هيدروكسي بوتيرات، يكي از عمده اجسام كتوني بدن

و عملكرد سريع، هيدروكسي بوتيرات بخاطر دقت، سهولت-3بيوسنسورهاي طراحي شده براي رديابي. نظر گرفته شده است

ا به خود جلب كرده .ستتوجه زيادي را

بر:ها روش ب-3اين مطالعه سعي در توسعه بيوسنسورهاي مبتني از طوريه هيدروكسي بوتيرات دهيدروژناز است كه

تشكيل. بر سطح الكترود نواري استفاده شده است،+NAD براي تثبيت كوفاكتور،) SWCNT( هاي كربني تك ديواره نانولوله

و ميكروس+SWCNT-NADكونژوگه اي براي آناليز عملكردو از ولتامتري چرخه شدهكوپ الكتروني سنجيدهبا الكتروشيمي

و قابليت اطمينان بيوسنسور پيش با اين روش، عمر.ه استالكتروشيمي بيوسنسور استفاده گرديد نهادي براي آناليز نمونه مفيد

شديواقعي تأ .يد

هاي برجسته اين توان از ويژگيميرا- V15هبNADH كاهش قابل توجه پتانسيل اكسيداسيون الكتروشيمي:ها يافته

ازراهيدروكسي بوتيرات-3 تشخيصاين بيوسنسور قابليت. بيوسنسور مطرح كرد حدmM1/0-01/0 در يك دامنه خطي با

و. داردmM009/0ينيتشخيص پا ب باعث تمايز SWCNTاستفاده همزمان از الكترود نواري كه طوريه اين بيوسنسورشده

ا مي ندازهاي جديدي را براي تشخيص ديگر متابوليتچشم .كند هاي مهم باليني باز

پتانسيل پايين. هاي كربني تك ديواره بهره برده است هاي الكتروشيميايي نانولوله بيوسنسور پيشنهادي از مزيت:گيري نتيجه

و حد تشخيصي كمتر از طريق استفا، پايداري ذخيرهNADHاكسيداسيون هايي به دست آمده ده از چنين نانولولهسازي بيشتر

گيري نياز در هر اندازه، واكنشبه ازاي هر+NAD، اضافه كردن CNTبه+NADبا در نظر گرفتن مزيت پيوند كوواالني. است

.تر است به همين خاطر از لحاظ اقتصادي با صرفه. باشد نمي

هاي كربني تك ديواره، الكترود نواريههيدروكسي بوتيرات، نانولول-3 بيوسنسور،:واژگان كليدي

و متابوليسم، دانشگاه علوم پزشكي تهران/ مركز تحقيقات غدد-1 پژوهشكده علوم غدد

و متابوليـسم دانـشگاه : نشاني∗ تهران، خيابان كارگر شمالي، بيمارستان شريعتي، طبقه پنجم، مركز تحقيقات غـدد، پژوهـشكده علـوم غـدد

[email protected]:، پست الكترونيك021- 88220052:، نمابر021- 88220037-8:، تلفن1411413137: علوم پزشكي تهران، كدپستي

تاريخ پذيرش: 91/05/19 تاريخ درخواست اصالح: 91/04/25 91/03/15: تتاريخ درياف

Dow

nloa

ded

from

ijdl

d.tu

ms.

ac.ir

at 2

2:16

IRS

T o

n S

atur

day

Janu

ary

25th

202

0

http://ijdld.tums.ac.ir/article-1-18-fa.html

517 ...بر مبتني بوتيرات هيدروكسي-3 تشخيص براي الكتروشيميايي بيوسنسور طراحي:همكارانواميدفر

مقدمهب ويژه بيوسنسورهاي الكتروشيميايي توجهه بيوسنسورها

ب و حساسيت توانايي سريع در آناليز خاطره زيادي را آنالين

ب از. اند خود اختصاص دادهه باال خواص ويژه اجزاي زيستي

درو پروتئينها جمله آنزيم و امر ها ين همچن شناسايي

هاي الكتروشيميايي، باعث پيشرفت هاي روش مزيت

از.]1[بيوسنسورهاي الكتروشيميايي شده است استفاده

بيوسنسورها در پزشكي، همزمان با توسعه الكترود در

به.]2[باشدمي1960 گلوكز در دهه تشخيص از آن زمان

هاي بسياري براي توسعه انواع مختلف بيوسنسور بعد تالش

.]3[ها شده است مديريت بيماريبه منظور

هاي اخير، سالدر بيوسنسورتكنولوژي اهداف اصلي از

درو كنترل گلوكز . بيماران ديابتي است اجسام كتوني

تواند به عنوان يك روش مفيد براي آزمايش كتون خون مي

و كتواسيدوز خطرناك در نظر تشخيص هايپرگلسيمي ساده

از،)HB3-( بوتيراتهيدروكسي-3سطوح.گرفته شود يكي

در هايپرگلسيميmM3-1 تركيبات اصلي كتوني خون، بين

و با غلظت ) DKA( كتواسيدوز ديابتيدرmM3 بااليو

عالوه. در افراد سالم تعريف شده استmM1ازتر پائين

-و استواستاتهيدروكسي بوتيرات-3 براين، نسبت بين

مي DKAدر- جسم مهم كتوني خون ديگر 10:1زان باالي به

هيدروكسي بوتيرات-3 رو تعيين سطح از اين.رسد مي

هاي روش.]5،4[دارد DKAاهميت زيادي در مديريت

جملهازهيدروكسي بوتيرات-3 تشخيص مرسوم در

و سنجش هاي اسپكتروفتومتري كروماتوگرافي، ايزوتوپي

و تكنسين به وسايل گران نيازو گير بسيار وقت با قيمت هاي

و گرفتن روش با در نظر.]6-8[تجربه دارد هاي قبلي

در هاي چشم مزيت انواع مختلف تشخيصگير بيوسنسورها

به سمت تكنولوژي بيوسنسور شده ها، متابوليت توجه زيادي

تشخيصبيوسنسورهاي آمپرومتريك كه براي اكثر. است

بستگي،اند توسعه يافتههيدروكسي بوتيرات-3 الكتروشيمي

و هيدروكسي بوتيرات دهيدروژناز دارند-3اكنش آنزيمي به

بر همانند ديگر.]12-9[ دهيدروژناز، بيوسنسورهاي مبتني

[NAD(P+)]پيريدين- از كوآنزيمهيدروكسي بوتيرات-3

ميهب چنين. كند عنوان پذيرنده الكترون استفاده

هستند كه NADH آندي تشخيصبيوسنسورهايي مبتني بر

ا و ممانعت از دخالت باعث تخليه كسيژن در واكنش آنزيمي

تشخيص.]14،13[شوندميتشخيصاكسيژن در مراحل

به NADHاكسيداسيون غيرمستقيم بر سطح الكترود با

هاي شيميايي انتقال الكترون در فرايند واسط كاربردن حد

فعال الكتريكي با اين وجود، تداخل مواد. بيوسنسوري است

گرها از ديگر معايب توسط واسطهيو بازدارندگي آنزيم

تشخيصاز طرفي.]9،11[ غيرمستقيم استتشخيصروش

از طريق سنسور پروتوتايپ NADH مستقيم اكسيداسيون

اين حال، اين روشبا.]12[شد يافته، اجراتغييرايريديوم

و پرسنل هاي پيچيده، آزمايشگاه نياز به پردازش هاي مجهز

شده، فرم احيااز +NAD كوفاكتوراحيا موثر. متخصص دارد

NADH،شد اين. با پيشرفت بيوسنسور بيوآنزيمي سنجيده

بوتيرات دهيدروژناز بيوسنسور با تثبيت همزمان هيدروكسي

شد با سالسيالت هيدروكسيالز در الكترود كالرك ساخته

دويياز آنجا.]10[ آنزيم است، كه اين روش بر پايه كاربرد

س و ارزش نداشتن حساسيت. يستم افزايش يافتپيچيدگي

خاطر ناپايداري آنزيم در طول زمان، از معايب اين چنينهب

.هايي است سيستم

انواع مختلف براي توسعه وسايل بيوآناليتيكي تغيير يافته با

در.]15[ هاي بيشتري بايد صورت گيرد نانوذره، تالش

كترودهاي بيوسنسورهاي الكتروشيميايي، اتحاد نانوذرات با ال

مييكربني برهنه با قابليت هدايت پا باراتشخيصتواند ين،

و پايداري سيستم آسان كند .]16-18[ افزايش حساسيت

توجه زيادي براي بهبود عملكرد بيوسنسورهايي با

پراكسيدو NADH تشخيصدر ) CNT( هاي كربني نانولوله

و افزايش سيگنال با تشخيص. هيدروژن شده است وسيع

ازاس بر سطح الكترود باعث ايجاد سطح وسيع، CNT تفاده

مييولتاژ پا و كينتيك سريع الكترود اين وجودبا. شود ين

در حالل، استفاده از آن را گسترده كرده CNTينيحالليت پا

صورتهبCNT كردن دار عاملچندين روش براي. است

و غير بركه كوواالني معرفي شده كه عالوه بر اين كوواالني

باعث بهبود خواص چنين مشكالتي فائق گرديده،

اهميت است حائز.]19-21[ الكتروشيميايي هم شده است

درميدار عامل CNTكه تواند از تثبيت اجزاي زيستي

در اين.]22،16-23[هاي پايدارتر محافظت كند سيستم

با CNT هاي اسيدكربوكسيليك، مطالعه، عالوه بر ايجاد گروه

Dow

nloa

ded

from

ijdl

d.tu

ms.

ac.ir

at 2

2:16

IRS

T o

n S

atur

day

Janu

ary

25th

202

0


و ليپيد ايران )6شماره(11؛ دوره 1391 شهريور-دو ماهنامه مرداد. مجله ديابت 518

بتيمارهاي كردن، دار عاملعنوان روشي وسيع برايه اسيدي

با استفاده ازCNTبه +NADاتصال كوواالن.اكسيد شد

دي متيل آمينو-3(-3- اتيل-1اتصال عرضي معروف

تا]EDC(]22( كربوديميد-)پروپيل را+NADانجام شد

سپس.تثبيت كند)SPCE( برسطح الكترود نواري كربن

ب شدهيدروكسي بوتيرات .رروي الكترود تغييريافته گذاشته

SPCE يك سنسور مينياتوري است كه داراي الكترودهاي

و كمكي در يك چيپ واحد است كار، قيمت ارزان،.مرجع

و سهولت استفاده از ديگر هاي اين مزيت اندازه كوچك

.]24[ الكترود تغييريافته با تكنولوژي الكترود نواري است

امكان خواص برجسته اين نوع سنسور،اين از ديگر عالوه بر

و مولكول تغييرسطح الكترود با نانوذرات، هاي پليمرها

درو،زيستي است انتخاب خوبي براي ساخت بيوسنسور

براي]29[ مطالعه گذاشتهدر.]25-28[ اين مطالعه است

به همراه SPCE، از هيدروكسي بوتيرات-3 تشخيص

ب) SWCNT( هاي كربني تك ديواره نانولوله ه استفاده كرديم

وقباعث انت SWCNTكه طوري كاهش پتانسيل ال كربن

كارآمدي به منظور در اين مطالعه. شدNADH اكسيداسيون

اتصالدر +NADبراي نگهداري SWCNTاز بيشتر،

، اضافه لذا.ه است استفاده شدCNT هاي كوواالن مولكول

ض براي تمام تست +NAD كردن رورتي هاي الكتروشيميايي

ازشتهندا ، SWCNT كونژوگه با+NADو تنها اولين قطره

برسطح الكترود كاري، براي چندين تست الكتروشيميايي

را1 شكل.كافي است در ساخت بيوسنسور مراحل متوالي

.دهد نشان مي

ها روش

مواد شيميايي

با ضخامت ) SWCNT( هاي كربني تك ديواره نانولوله

nm2-1ازNeutrino هيدروكسي-3.يداري شدندخر

هيدروكسي-U/mg400(،NAD+،3( بوتيرات دهيدروژناز

-3- اتيل-1و)NHS( هيدروكسي سوكسيناميد-N بوتيرات،

از سيگما)EDC( كربودي ايميد-)دي متيل آمينوپروپيل-3(

.هاي معتبر تهيه شدند مواد شيميايي از شركتو ديگر

دار هاي عامل SWCNT تهيه

]29[در گزارش قبلي SWCN سازي دار عاملجزئيات كامل

mg5(SWCNTs(طور خالصه،هب. توضيح داده شده است

در5به مدت 653HNO% از محلول ml10 در ساعت

شدC°40 دماي با10محتوا به مدت. سونيكيت دقيقه

باو سانتريفوژ rpm 6000دور و آب مقطر به طور مرتب

شدشستش)7pH( بافر فسفات پتاسيم تا.و داده شستشو

ثابت ماند، 7pH درSWCNT زماني ادامه داشت كه بافر

و تا زمان استفاده ذخيره شد اين روند باعث. سپس خشك

و كربوكسيالسيون . شدSWCNTقطعه قطعه شدن

NAD+-SWCNTتهيه كونژوگه

به كمك NAD+-SWCNTكونژوگه با پيوندهاي كوواالن

ايميد كربودي)و پروپيل دي متيل آمين-3(-3-اتيل-1

)EDC ( وN-هيدروكسي سوكسين ايميد )NHS(آماده

دي دار عامل هاي SWCNTبه طور خالصه،.شد شده در

به مدت)DMF()mg/ml2( متيل فرماميد و 30پخش شد

هيدروكسي-mg 5N.دقيقه در دماي اتاق سونيكيت شد

دي متيل-3(-3-اتيل-1ازmg 1و) NHS( سوكسيناميد

محلولازlµ200به) EDC( كربودياميد) آمينو پروپيل

SWCNT و در3 اضافه شد يخچال تحت حركت ساعت

محلول ذكرشده با+mM30،NAD از محلول lµ300.بود

و شد20مخلوط شد به. ساعت تحت حركت قرار داده

به rpm13200، محلول با دور+NADمنظور حذف اضافي

دو سانتريفوژC°4 دقيقه در دماي10مدت و با شد مرتبه

-+NADكونژوگه ).5/7pH( بافرفسفات شستشو شد

SWCNTدر يخچال ذخيره شد .

هيدروكسي بوتيرات-3تهيه بيوسنسور

NAD+-SWCNT از كونژوگهµl4بيوسنسور با ريختن

برسطح الكترود ) 5/7pH( فسفات پراكنده شده در بافر

در. تهيه شد و سطح خشكC°4 الكترود حاصل شد

NAD+-SPF-SWCNT با U2/1هيدروكسي-3از

و در تاC°4 بوتيرات دهيدروژناز پوشانده قرار داده شد

µl2، دوباره+NADبراي اطمينان از آمادگي. خشك شود

. بر اليه آنزيمي قرار داده شدNAD+-SWCNTاز

Dow

nloa

ded

from

ijdl

d.tu

ms.

ac.ir

at 2

2:16

IRS

T o

n S

atur

day

Janu

ary

25th

202

0


519 ...بر مبتني تيراتبو هيدروكسي-3 تشخيص براي الكتروشيميايي بيوسنسور طراحي:همكارانواميدفر

و اندازه هاي الكتروشيميايي گيري ابزارها

Thermo Nicolet فتومتر با اسپكتروFTIRهاي طيف

Nexus 870FTIRو از دار عامل براي Eurosonic 4D ثبت

. استفاده شدSWCNTكردن صوتي شيميايي

DropSens400µpotentiostat و الكترودهاي نواري

DropSenseو اندازه هاي گيري با كامپيوتر كنترل

و ساختار بيوسنسور با الكترود كار گرافيتي الكتروشيميايي

)GE (كروي شكل )با ضخامتmm3(الكترود كار ،

Ag/AgClاز بافر.و الكترود كمكي گرافيتي صورت گرفت

براي ثبت پاسخ استفاده ) M1/0،5/7pH( فسفات پتاسيم

در+NADاي بدون افزودن محلول ولتامتري چرخه. شد

و سرعت اسكن-1تا1محدوده . اجراشدmV/sec 50 ولت

ال گيري تمام اندازه تكرار در دماي اتاق3كتروشيميايي با هاي

با. انجام شد ثبات پايداري بيوسنسور براي مدت طوالني،

طي-3يك غلظت از روز 180 هيدروكسي بوتيرات در

هر توسط ولتامتري چرخه و بعد از انجام اي بررسي شد

و در نگهداريC°4 آزمايش، سنسور با محلول بافر شسته

يافته در سلول الكتروشيميايي الكترود تغيير.]30[ شد

در منطقه)µl100-5با حجم(mm 5تفلوني با ضخامت

و از محلول استاندارد يا نمونه µl50 حسي قرار داده شد

به منظور بررسي سه الكترود را واقعي چكيده شد تا تمام

.الكتروشيميايي پوشش دهد

و بحثها يافته

+SWCNT-NADسازي كونژوگه آماده

ش هاي واكنشي روي براي ساختن گروه CNT يمياييتغيير

پيش نيازي براي تثبيت كوواالن هر مولكولي،سطح آن

دار به عنوان روش متداول عامل CNTsتيمار اسيدي. است

كه در بر گيرنده تركيبات كردن با پروتكل هاي مختلفي

مي متفاوت محلول باشد، صورت گرفته است هاي اسيدي

صوتي شيمياييه، براي تيمار در اين مطالع.]31[

SWCNTs شدنيتراز اسيد از FTIRطيف. يك استفاده

SWCNTs باندهايي)2شكل( يك نيترتيمار شده با اسيد

در. نشان داده استcm-13418 ،1380،1645در ظهور باند

cm-11645 هاي گروه تشكيلC=O را در انتهاي لوله ها

در. دهد نشان مي توانندمي1380تا3418باندهاي موجود

يا O-Hبه ترتيب به كشش هاي گروهدر اسيد كربوكسيليك

و اثر متقابل خمش هاي در گروه C-Oو كشش O-Hالكلي

وجود باندهاي مذكور عامل. فنلي نسبت داده شود

كه براي اتصال كوواالن SWCNTكربوكسيل را تأييد كرده

NAD+و ].33،32[ الزم است ضروري

روي الكترود NADH داسيون الكتروشيميايياكسي مزاياي

اكسيداسيون كاهش پتانسيل از جملهCNTتغيير يافته

NADH و عدم رسوب روي سطح الكترود، منجر به كاربرد

در بيوسنسورهاي مبتني بر دهيدروژناز شده CNTوسيع

مطالعات، فقط شكل آزاد اين اكثربنابراين،].34[ است

گزارشات.به كار گرفته استدر محلول را+NADوفعال

به اتصال مستقيم هاي كربنيبه نانولوله+NADمربوط

به+NADبسيار نادر است مثل اتصال غير كوواالن

Zhouتوسط)MWCNT(هاي كربني چند ديواره نانولوله

آن]35[و همكاران كه در به+NADو مطالعه اخير ديگر

به ي آميدي به با تشكيل باندها MWCNTطور كوواالني

از مطالعه اخير].36[ متصل شده بودNHSو EDCكمك

بر. دار سود برده است مزاياي استفاده از مواد كوآنزيم عامل

-SWCNTبراي بهبود كونژوگه اين اساس، ما اين روش را

NAD+غلبه بر پتانسيل باالي اكسايش ،NADH و همچنين

. برديمكارهب+NADهزينه باالي ناشي از مصرف اضافي

هاي عاملي داراي گروه SWCNT، بعد از تيمار اسيدي

كه از اين خاصيت ميOH–و COOH–همچون شود،

طبق مطالعات].38،37[ براي تثبيت استفاده شد

كه نوع ين توانايي را دارداSWCNT،الكتروشيميايي اخير

و فعاليتنشخاصي از واك هاي انتقال الكترون را تقويت

.يكي را بهبود بخشدالكتروكاتاليت

و سطح وسيع اثرات سودمندي همچون SWCNTشكل

ود را هدايت الكتريكي همراه با سطح افزايش يافته الكتر

داراي بار منفي SWCNTبعد از تخليص،. دهد نشان مي

مي].39[ شد به آساني روي سطح بنابراين، آنها توانند

NAD+به با توجه.كه داراي بار مثبت است جذب شوند

ها، بيومولكولSWCNTsتوانايي جذب باالي داده شده به

به طور ثابت جذب سطح آنها شوند مي .توانند

Dow

nloa

ded

from

ijdl

d.tu

ms.

ac.ir

at 2

2:16

IRS

T o

n S

atur

day

Janu

ary

25th

202

0



ميكروسكوپ الكتروني

و عاملSWCNTمورفولوژي دار عاملSWCNTدار

SEMبه وسيله ) +NAD+)SWCNT-NADكونژوگه با

كه نشان ميSEMتصاوير).3شكل( مشخص شد دهد

سطح بسيار NAD+،SWCNTهاي لكولبعد از معرفي مو

و قطر بزرگ خشن به عنوان نتيجه اصالح لوله تر ها تري

كه قبالً همان.دهد نمايش مي استفاده بحث شده بود،طور

هاي هاي كربني با مولكول براي جفت نانولولهEDCاز

تجمع آشكار].40[ها باشد تواند در اثر تجمع لوله ديگر مي

SWCNT-NAD+كهمينشان به عنوان عامل EDCدهد

هاي كربنيبه نانو لوله+NADتواند اتصال جفت كننده مي

.را تسهيل كند

بيوسنسور الكتروشيمياييدر مسير

در همان ، آنزيم است نشان داده شده1 شكلطور كه

هيدروكسي بوتيرات دهيدروژناز، براي طراحي-3شناسايي

سطح الكترود هيدروكسي بوتيرات روي-3 بيوسنسور

ما تعداد زيادي. چكانده شد+SWCNT-NADاصالح شده

كه از ارتباطات موثر را انتظار داشتيم، با وجود اين حقيقت

و)aمرحله(CNTهاي به مولكول+NADاتصال فيزيكي

مرحله(+SWCNT-NADاتصال نامناسب آنزيم به كونژوگه

-SWCNTهاي عالوه بر كونژوگه. اجتناب ناپذير بود)3

NAD+به كارگيري الكترودهاي نواري ،Screen-Printed ،

از نقطه قوت ديگري است كه باعث مي شود اين بيوسنسور

در مقايسه با انواع ديگر. گرددسودمند لحاظ اقتصادي

الكترودها به ويژه الكترودهاي اكسيژن، الكترودهاي نواري

Screen-Printedو پايد اري داراي قابليت استفاده آسان

از تنها يك الكترود اين شرايط استفاده. طوالني مدت هستند

.كند براي چندين آزمايش را فراهم مي

از هاي چرخه ولتاموگرام به ترتيب،a4شكل -3اي

از در محلول بافرmM3هيدروكسي بوتيرات با استفاده

نواري SWCNT-و)aمنحني(برهنه نواريالكترودهاي

ميرا)cمنحني( پس از استفاده متوالي از برنامه.دهد نشان

از-1و1پتانسيل مثلثي بين ولت، توده غير قابل تشخيصي

مشاهده برهنه نواريروي الكترود هيدروكسي بوتيرات-3

-، با استفاده از الكترودبا اين حال).bمنحني(گرديد

SWCNTنماينده دو پيك هيدروكسي بوتيرات-3، نواري

منحني(در ولتاموگرام با جريان باالتر است نشان داده شده

d.(هيدروكسي بوتيرات-3 كاهشي- زوج اكسايشيجريان

مي به طور چشم دهد گيري افزايش يافته است، كه نشان

با، تواندمي نواري روي الكترود SWCNTتثبيت برهمكنش

.سازدرا غني هيدروكسي بوتيرات-3هاي مختلف غلظت

ا ولتامتري چرخه هاي ين بيوسنسور در حضور غلظتاي

و هيدروكسي بوتيرات-3مختلف ، كارايي ارتباطات

ميعملكرد كاهش).b4شكل(كند خوب بيوسنسور را تأييد

كوآنزيم در نيمه سيكل كاتدي با پيك جرياني در حدود

در. ميلي ولت اتفاق افتاده است-65/0 -15/0 پيك جريان

است با غلظت NADH ولت كه مربوط به پتانسيل اكسايش

هيدروكسي بوتيرات در محلول در اثر تشكيل مقدار باالتري

كاهش پتانسيل باالي به منظور. افزايش يافتNADHاز

، در بيوسنسورهاي مبتني بر دهيدروژنازNADH اكسيداسيون

و هاي انتقال وسيعي از واسطهامنهدانواع مختلف الكترود

يداسيون اكسباالي پتانسيل. الكترون مورد بررسي قرار گرفت

NADH كه و واسطه،متغير است هاي انتقال به انواع الكترود

پتانسيل پيككه در حالي].34[وابسته است الكترون

اي اصالح نشده با الكترود كربني شيشهNADHاكسيداسيون

شد82/0 پيك اكسيداسيون الكتروده بود، ولت گزارش

و CNTاصالح شده با به چند ديواره تك ديواره به ترتيب

در مطالعه اخيراً].41[ بود تغيير يافتهولت+36/0و+33/0

CNTدار براي تشخيص عاملNADH كاهش پتانسيل ،

با].42[ گزارش شده بود-07/0به حدود NADHاكسايش

استفاده از اصالحات ديگر روي سطح الكترود كه نيازمند

و آزمايشگاه باشد، پتانسيلميهاي مجهز روند پيچيده

در مطالعات مختلف كاهش يافته NADHاكسيداسيون

.است

شكل تغيير در پيك پتانسيل اكسايش نشان مي كه دهد

در مقايسه با شكل اكسايشي ) NADH(كاهش يافته آنزيم

)NAD+(با واكنش قوي يياز آنجا.دهد ميSWCNTتري

فاده با استNADH كاهش-كه پيك پتانسيل انتقال اكسايش

كند، كينتيك انتقال تغيير نمي نواريSWCNT- از الكترود

. كند نميتغيير الكترود اصالح شدهي روي سطحهبار نامتنا

به ماهيت و هيدرو-3 گري ميانجيبا توجه كسي بوتيرات،

Dow

nloa

ded

from

ijdl

d.tu

ms.

ac.ir

at 2

2:16

IRS

T o

n S

atur

day

Janu

ary

25th

202

0



°Eهمچنين ارزش مثبت surf در مقايسه با ارزشE°

bulk،

و انفعاالت سطح ميانيجاذبه دروكسيهي-3و تجمع فعل

تواند بر جاذبه ميSWCNTهاي بازي، بين جفتبوتيرات

].12[الكترواستاتيك در درازمدت غلبه كند

كه از واكنش همان -3هاي آنزيمي كاتاليز شده توسط طور

غلظت،رفت هيدروكسي بوتيرات دهيدروژناز انتظار مي

NADH توليد شده از كاهشNAD+3با غلظت-

در نتيجه شدت پيك. يابد هيدروكسي بوتيرات افزايش مي

كه هاي چرخه طبق ولتاموگرام. آندي بايد افزايش يابد اي

با NADH غلظت بايد، نشان داده شده استb4در شكل

به غلظت هيدروكسي بوتيرات در محلول-3تر پائينتوجه

يبضر.افزايش يابدنواري SWCNT- روي سطح الكترود

نواريSWCNT- بايد در استفاده از الكترودNADHنفوذ

باقي طور همان)½C.D( كاهش يابد، زيرا محصول

كه فرايند انتقال ماده نبايد. ماند مي به اين حقيقت با توجه

توان چنين نتيجه به سطح هدف بستگي داشته باشد، مي

كه فرايند انتقال ماده با نفوذ در اليه باريك،گرفت

SWCNT سطح الكترود رخ داده است كه با توجهبر متورم

اين بدان.ي از محلول، ويسكوزيته باالتري داردبه بخش

، NADH با SWCNT در نتيجه اثر متقابل معناست كه

با محلول SWCNT در خط اتصال سطح NADHغلظت

SWCNT از طريق اليه مياني NADHو افزايش يافته است

به سمت مينواريسطحبه طور مستقيم .شود پخش

جذب SWCNT توان نتيجه گرفت كه احتماالً بنابراين مي

به عنوان واسطه نمينواريشده روي سطح الكترود تواند

به علت جذب. انتقال الكترون عمل كند از اين رو،

SWCNT هاي طريق گروهازCOOHو به پايه يا بيروني،

كه تحت تاث طور تصادفي جذب سطحي مي ير طول شوند

.است قرار گرفتهنواريسطح

موالر، سري ميلي0-3براي به دست آوردن غلظت نهايي

هاي شناخته هاي استاندارد توسط رقت غلظتي از محلول

هاي با نمونه هيدروكسي بوتيرات-3هاي شده از غلظت

-3هاي منحني استاندارد براي غلظت. سرم نرمال آماده شد

كه5 هيدروكسي بوتيرات در شكل نشان داده شده است

. موالر دارد ميلي1/0تا01/0منحني، افزايش خطي از

-3هاي پايين حساسيت باال براي تشخيص غلظت

هاي اين بيوسنسور هيدروكسي بوتيرات يكي از مزيت

Sb/k3حدود تشخيصي بيوسنسورها از طريق معادله. است

=Sbحساسيت بيوسنسور،=kكه طوريهب. محاسبه شد

هاي متوالي بالنك با استفاده گيري انحراف استاندارد اندازه

به علت].35[باشدمي هيدروكسي بوتيرات-3 فاقداز بافر

نمونه بالنك، محدوده تشخيصي8پاسخ بيوسنسور به

شد ميلي009/0 ,83.77 ,83.97 ,84 ,84.15(موالر محاسبه

83.56, 83.12, 82.9, 82.61µA.( مي با توجه تواند اين امر

هيدروكسي بوتيرات قبلي با محدوده-3به بيوسنسورهاي

هاي گيري براي اندازهµM14وµM9/3تشخيصي

].11،10[ مناسب باشد الكتروشيميايي كامالً

پايداري وقابليت تكرارپذيري بيوسنسور

از6شكل پايداري درازمدت اين بيوسنسور بعد

مي روز را نشا180سازي براي مدت ذخيره به عالوه. دهدن

تواند به عنوان شاهدي براي پايداري اتصال اين نمودار مي

SWCNT-NAD+به دنبال افزايش. در نظر گرفته شود

در پاسخ بيوسنسور در روز چهلم، مي تواند روند ثابتي

با. پاسخ بيوسنسور ديده شود بيوسنسور پيشنهاد شده

ميمدتسازي دراز قابليت ثبات ذخيره ماه6 بيش از تواند،

بدون از دست دادن قابل توجهي از حساسيتش مورد

صرف نظر از بيوسنسور طراحي شده. استفاده قرار گيرد

ديگر،]9[ ماه18و همكاران با نيمه عمر Forrowتوسط

هيدروكسي بوتيرات طراحي شده-3بيوسنسورهاي

و نمي مي توانند توانند براي كمتر از دو ماه استفاده شوند

.استفاده طوالني مدت قابل توجهي داشته باشند

براي بررسي قابليت تكرارپذيري اين بيوسنسور، پاسخ

mM(و باال)mM 1/0(هاي پايين در غلظتالكتروشيميايي

در-3از)3 روند آناليتيكالي مستقل8 هيدروكسي بوتيرات

شد اندازه كه. گيري اين بيوسنسور براي دو غلظت ذكر شده

هيدروكسي-3 تكرارپذيري خوبي براي تشخيصقابليت

به ترتيب درصد ضريب تغييراتي بوتيرات داشته است

)%CV (نمايش داده است%62/7و%75/4 معادل .

به منظور ارزيابي قابليت اطمينان از اين بيوسنسور، غلظت

نمونه سرم رقيق شده با بافر5در هيدروكسي بوتيرات-3

و كيت از طريق) بار20(فسفات بيوسنسور پيشنهاد شده

Dow

nloa

ded

from

ijdl

d.tu

ms.

ac.ir

at 2

2:16

IRS

T o

n S

atur

day

Janu

ary

25th

202

0



.شد سنجيده،Biovisionسنجش بتا هيدروكسي بوتيرات،

كه دو روش مذكور بر هم منطبق مقايسه نتايج نشان داد

و از اين بيوسنسور مي هم توان در نمونه بوده هاي واقعي

.)7شكل(استفاده كرد

اختصاصيت بيوسنسور

نيتواند در تعيميگر كه حضور تركيبات مداخلهيياز آنجا

دقيق آناليت هدف تأثيرگذار باشد، اين ويژگي بيوسنسور

و عدم حضور گر همچون برخي مواد مداخلهدر حضور

و مخلوطي از اسيد اسيد آسكوربيك، اسيد اوريك

پاسخ نمونه. مورد بررسي قرار گرفتLهاي نوع آمينه

آنهاي فاقد نمونه باLهاي نوع آمينه بالنك حاوي اسيد

mM 5/0وجود مخلوط اگرچه. مشابه بودنسبتاً

-3هاي مختلف در غلظتLهاي نوع اسيدآمينه

ولي شد،%5/2تا%1هيدروكسي بوتيرات باعث نوسان

به اثر مي روي پاسخ نهايي ناچيزشتوان آن را با توجه

و اسيد)mM1/0(تداخل اسيد آسكوبيك. ناديده گرفت

هيدروكسي-3 مختلف هاي غلظتبا)mM5/0(اوريك

در. مطالعه قرار گرفتبوتيرات به طور جداگانه مورد پاسخ

و همچنين در غلظت -3هاي مختلف نمونه بالنك

با توجه به اين. افزايش داشت%17هيدروكسي بوتيرات

كه حضور هيدروكسي بوتيرات-3اسيدها در نمونه مطلب

شود، بايد تواند باعث برخي اختالالت در نتايج نهايي مي

.بيشتر مطالعات در مورد چنين مشكالتي انجام شود

-3در اين مطالعه، بيوسنسور الكتروشيميايي براي تشخيص

بيوسنسور. هيدروكسي بوتيرات طراحي شده است

هاي كربني هاي الكتروشيميايي نانولوله پيشنهادي از مزيت

پتانسيل پايين اكسيداسيون. تك ديواره بهره برده است

NADHو، پايداري ذخيره حد تشخيصي كمتر سازي بيشتر

به دست آمده است از طريق استفاده از چنين نانولوله . هايي

، CNTبه+NADبا در نظر گرفتن مزيت پيوند كوواالني

براي واكنش سلول در هر+NADاضافه كردن بيشتر

به همين خاطر از لحاظ اقتصادي. باشد گيري نياز نمي اندازه

تطابق نتايج نشان داده شده اين بيوسنسور. تر است با صرفه

هيدروكسي بوتيرات، پتانسيل خوب-3با كيت تشخيصي

. را تأييد كرده استبيوسنسور براي اهداف تشخيصي

CNT وNAD+،و برسطح الكترود كار وا. قرار داده شدند به طور شيميايي به يكديگر متصل هيدروكسي-3فزودن آنزيم بر سطح الكترود پاشيده شد

به اندازه. بوتيرات باعث واكنش آنزيمي گرديد با NADHاجرا شد كه براساس اكسيداسيون potentiostatگيري الكتروشيميايي با اتصال الكترود

مي، ديگر اتصاالت ممكن نامناسب براي بيوسنسور3و1هاي نمايش داده شده در مرحله پيكان. تشكيل پيك در ولتاموگرام بود .دهد را نشان طرح شماتيك بيوسنسور-1شكل

Dow

nloa

ded

from

ijdl

d.tu

ms.

ac.ir

at 2

2:16

IRS

T o

n S

atur

day

Janu

ary

25th

202

0



شدن دار عاملاز) خط منقوط(و بعد) خط پيوسته( هاي كربني تك ديواره قبل نانولوله FTIR طيف-2شكل

و هاي كربني تك ديواره عامل نانولوله SEM تصاوير)a(-3شكل د هاي كربني تك ديواره عامل نانولوله)b( دار شده ر دار شده.60000؛ بزرگنمايي، kV15افزايش ولتاژ،: شرايط.+NADاتصال با

اي)a(-4شكل و SPCE هيدروكسي بوتيرات بر روي-3ولتامتري چرخه به ترتيب منطبق باbوa منحني.CNT/SPCE برهنهو حضور SPCEاي ولتامتري چرخه به ترتيب ولتاموگرامdوcكه منحني هيدروكسي بوتيرات است در حالي-3برهنه در غياب

CNT/SPCE و حضور مي-3را در غياب M اي بيوسنسور در بافر فسفات ولتاموگرام چرخه)b(.دهد هيدروكسي بوتيرات نشان1/0)5/7:pH (از با غلظت .mVs50-1سرعت اسكن،.)0،3،12وmM20( هيدروكسي بوتيرات-3هاي مختلف

Dow

nloa

ded

from

ijdl

d.tu

ms.

ac.ir

at 2

2:16

IRS

T o

n S

atur

day

Janu

ary

25th

202

0



از در حضور غلظتمنحني استاندارد بيوسنسور-5شكل دامنه خطي).mM1/0-01/0( هيدروكسي بوتيرات-3هاي مختلف.در داخل نمودار نمايان است)mM1/0-01/0( هيدروكسي بوتيرات-3تشخيص

بر روز40 در حدود1به2/0گذشت زمان اثر مثبتي بر جريان نسبي. مدت بيوسنسور بررسي شدهپايداري ذخيره دراز-6شكل.عنوان شده است) پاسخ حداكثر(I0،40 جريان حاصل در روز.داردور بيوسنس

Dow

nloa

ded

from

ijdl

d.tu

ms.

ac.ir

at 2

2:16

IRS

T o

n S

atur

day

Janu

ary

25th

202

0



و بيوسنسور سنجش هيدروكسي بوتيرات توسط كيت-3 مقايسه غلظت-7شكل هيدروكسي-3 بتا هيدروكسي بوتيراتخوتناسب. هاي مختلف بوتيرات در نمونه ب آنها را براي پاسخ كيت سنجش بتا هيدروكسي بوتيرات با بيوسنسور ما، عملكرد

مي اندازه رو از اين.حجم كل بود µl50ازµl5/2 مقدار سرم استفاده شده در هر سلول. دهد گيري سرم هيدروكسي بوتيرات نشانازهبهيدروكسي بوتيرات غلظت . شود20در بيوسنسور بايد ضربدست آمده

سپاسگزاري.بوليسم دانشگاه علوم پزشكي تهران انجام شده استو متاپژوهشكده علوم غددپژوهش حاضر با حمايت مالي

مأخذ1. Adam V, Kizek R. Utilization of

Electrochemical Sensors and Biosensors in Biochemistry and Molecular Biology. Sensors 2008; 8: 6125-6131.

2. Clark L.C, Lyons C, Ann N Y. Electrode systems for continuous monitoring in cardiovascular surgery. Acad Sci 1962; 102: 29-45.

3. Wang Y, Xu H, Zhang J, Li G. Electrochemical Sensors for Clinic Analysis. Sensors 2008; 8:2043-2081.

4. Wallace TM, Matthews DR. Recent advances in the monitoring and management of diabetic ketoacidosis. QJM, 97 (2004) 773-780

5. Laffel L. Ketone bodies: a review of physiology, pathophysiology and application of monitoring to diabetes. Diabetes Metab Res Rev 1999; 15:412-426.

6. Kiba N, Saegusa K, Furusawa M. Post-column enzyme reactors for chemiluminometric detection of glucose, 1,5-anhydroglucitol and 3-hydroxybutyrate in an anion-exchange chromatographic system. J Chromatogr B Biomed Sci Appl 1997; 689: 393-398.

7. Kimura M, Kobayashi K, Matsuoka A, Hayashi K, Kimura Y. Head-space gas-chromatographic determination of 3-hydroxybutyrate in plasma

after enzymic reactions, and the relationship among the three ketone bodies. Clin Chem 1985; 31: 596-598.

8. Tabata M, Totani M. A Chemiluminescence-Flow Injection Analysis of Serum 3-Hydroxybutyrate Using a Bioreactor Consisting of 3-Hydroxybutyrate Dehydrogenase and NADH Oxidase. Anal Biochem 1995; 229: 133-138.

9. Forrow NJ, Sanghera GS, Walters SJ, Watkin JL. Development of a commercial amperometric biosensor electrode for the ketone d-3-hydroxybutyrate. Biosens Bioelectron 2005; 20:1617-1625.

10. Kwan RCH, Hon PYT, Mak WC, Law LY, Hu J. Renneberg R. Biosensor for rapid determination of 3-hydroxybutyrate using bienzyme system. Biosens Bioelectron 2006; 21:1101-1106.

11. Li G, Ma NZ, Wang Y. A new handheld biosensor for monitoring blood ketones. Sensor Actuat B-Chemical, 109 (2005) 285-290.

12. Fang L, Wang SH, Liu CC. An electrochemical biosensor of the ketone 3-β-hydroxybutyrate for potential diabetic patient management. Sensor Actuat B-Chem 2008; 129: 818-825.

Dow

nloa

ded

from

ijdl

d.tu

ms.

ac.ir

at 2

2:16

IRS

T o

n S

atur

day

Janu

ary

25th

202

0



13. Zhou JL, Nie PP, Zheng HT, Zhang JM. Progress of Electrochemical Biosensors Based on Nicotinamide Adenine Dinucleotide (phosphate)-Dependent Dehydrogenases. Chinese J Anal Chem 2009; 37:617-623.

14. Lobo MJ, Miranda AJ, Tuñón P. Amperometric biosensors based on NAD(P)-dependent dehydrogenase enzymes. Electro-analysis 1997; 9: 191-202.

15. Omidfar K, Kia S, Kashanian S, Paknejad M, Besharatie A, Kashanian S, Larijani B. Colloidal nanogold-based immunochromatographic strip test for the detection of digoxin toxicity. Appl Biochem.Biotech 2010; 160: 843-855.

16. Hyun S, Park TH. Integration of biomolecules and nanomaterials: Towards highly selective and sensitive biosensors. Biotechnol J 2011; 6:1310-1316.

17. Omidfar K, Dehdast A, Zarei H, Sourkohi BK, Larijani B. Development of urinary albumin immunosensor based on colloidal AuNP and PVA. Biosens Bioelectron 2011; 26: 4177-4183.

18. Omidfar K, Zarei H, Gholizadeh F, Larijani B. A high-sensitivity electrochemical immuno-sensor based on mobile crystalline material-41-polyvinyl alcohol nanocomposite and colloidal gold nanoparticles. Anal Biochem 2012; 421: 649-656.

19. Endo M, Strano M, Ajayan P. Potential Applications of Carbon Nanotubes, in: Carbon Nanotubes. Springer Berlin/ Heidelberg 2008; pp. 13-61.

20. Jeykumari DRS, Narayanan SS. Fabrication of bienzyme nanobiocomposite electrode using functionalized carbon nanotubes for biosensing applications. Biosens Bioelectron 2008; 23: 1686-1693.

21. Xue CH, Zhou RJ, Shi MM, Wu G, Zhang XB, Wang M, Chen HZ. Electrochemistry of glucose oxidase immobilized on carbon nanotubes noncovalently functionalized by multihydroxyl and multicarboxyl groups. J Electroanal Chem 2010; 642: 92-97.

22. Gao Y, Kyratzis I. Covalent Immobilization of Proteins on Carbon Nanotubes Using the Cross-Linker 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carb-odiimide—a Critical Assessment. Bioconjugate Chemistry 2008; 19: 1945-1950.

23. Kim J, Grate JW, Wang P. Nanostructures for Enzyme Stabilization. Chem Eng. Sci 2006; 61: 1017-1026.

24. Hart JP, Crew A, Crouch E, Honeychurch KC, Pemberton RM. Some Recent Designs and Developments of Screen‐Printed Carbon Electrochemical Sensors/Biosensors for Biomedical, Environmental, and Industrial Analyses. Analytical Letters 2005; 37: 789-830.

25. Fanjul-Bolado P, Queipo P, Lamas-Ardisana PJ, Costa-García A. Manufacture and evaluation of carbon nanotube modified screen-printed electrodes as electrochemical tools. Talanta 2007; 74: 427-433.

26. Sharma MK, Agarwal GS, Rao VK, Upadhyay S, Merwyn S, Gopalan N, Rai GP,

Vijayaraghavan R, Prakash S. Amperometric immunosensor based on gold nanoparticles/ alumina sol–gel modified screen-printed electrodes for antibodies to Plasmodium falciparum histidine rich protein-2. Analyst 2010; 135: 608-614.

27. Silva Nunes G, Jeanty G, Marty JL. Procedures on screen-printed electrodes used for the detection of anticholinesterase pesticides Comparative study. Analytica Chimica Acta 2004; 523: 107-115.

28. Pellicer C, Gomez-Caballero A, Unceta N, Goicolea MA, Barrio RJ. Using a portable device based on a screen-printed sensor modified with a molecularly imprinted polymer for the determination of the insecticide fenitrothion in forest samples. Analytical Methods 2010; 2:1280-1285.

29. Khorsand F, Riahi S, EynollahiFard S, Kashanian S, Naeemy A, Larijani B, Omidfar K. IET Nanobiotechnol, (in press).

30. Omidfar K, Rasaee MJ, Zaraee AB, Amir MP, Rahbarizadeh F. Stabilization of penicillinase-hapten conjugate for enzyme immunoassay. JImmunoassay Immunochem 2002; 23: 385-398.

31. Osorio AG, Silveira ICL, Bueno VL, Bergmann CP. H"2SO"4/HNO"3/HCl-Functionalization and its effect on dispersion of carbon nanotubes in aqueous media. Appl Surf Sci 2008; 255: 2485-2489.

32. Chakraborty S, Raj CR. Mediated electrocatalytic oxidation of bioanalytes and biosensing of glutamate using functionalized multiwall carbon nanotubes-biopolymer nanocomposite. Electroanal Chem 2007; 609: 155-162.

33. Kim UJ, Furtado CA, Liu X, Chen G, Eklund PC. Raman and IR Spectroscopy of Chemically Processed Single-Walled Carbon Nanotubes. JAm Chem Soc 2005; 127:15437-15445.

34. Kumar S, Chen SM. Electroanalysis of NADH Using Conducting and Redox Active Polymer/ Carbon Nanotubes Modified Electrodes-A Review. Sensors 2008; 8: 739-766.

35. Zhou H, Zhang Z, Yu P, Su L, Ohsaka T, Mao L. Noncovalent Attachment of NAD+ Cofactor on to Carbon Nanotubes for Preparation of Integrated Dehydrogenase-Based Electroche-mical Biosensors. Langmuir 2010; 26: 6028-6032.

36. Wang XS, Liu P, Zheng HT, Hu H, Zheng WJ, Suye SI. Preparation of Nicotinamide Adenine Dinucleotide Functionalized Multi-Walled Carbon Nanotube and its Application to Dehydrogenase Biosensor. Advanced Materials Research 2011; 298:121-127.

37. Wu BY, Hou SH, Yin F, Zhao ZX, Wang YY, Wang XS, Chen Q. Amperometric glucose biosensor based on multilayer films via layer-by-layer self-assembly of multi-wall carbon nanotubes, gold nanoparticles and glucose oxidase on the Pt electrode. Biosens Bioelectron 2007; 22: 2854-2860.

Dow

nloa

ded

from

ijdl

d.tu

ms.

ac.ir

at 2

2:16

IRS

T o

n S

atur

day

Janu

ary

25th

202

0



38. Zhang M, Smith A, Gorski W. Carbon Nanotube-Chitosan System for Electrochemical Sensing Based on Dehydrogenase Enzymes. Anal Chem 2004; 76: 5045-5050.

39. Xu Z, Gao N, Chen H, Dong S. Biopolymer and Carbon Nanotubes Interface Prepared by Self-Assembly for Studying the Electroche-mistry of Microperoxidase-11. Langmuir 2005; 21: 10808-10813.

40. Zhang R, Wang X, Shiu KK. Accelerated Direct Electrochemistry of Hemoglobin Based on

Hemoglobin-carbon Nanotube (Hb-CNT) Assembly. J Colloid Interface Sci 2007; 316: 517-522.

41. Musameh M, Wang J, Merkoci A, Lin Y. Low potential stable NADH detection at carbon-nanotube modifiedglassy carbon electrods. Electrochem. Commun 2002; 4: 743-746.

42. Wooten M, Gorski W. Facilitation of NADH Electro-oxidation at Treated Carbon Nanotubes. Anal Chem 2010; 82: 1299-1304.

Dow

nloa

ded

from

ijdl

d.tu

ms.

ac.ir

at 2

2:16

IRS

T o

n S

atur

day

Janu

ary

25th

202

0


34 (! 012 screen printedijdld.tums.ac.ir/article-1-18-fa.pdf · (6˚ !ˆ )11 ˚ ˜1391 ˘ˇˆ - ....

Documents