3/7/2007 - pfigueiredo.org
TRANSCRIPT
3/7/2007
1
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
nos alimentos proteínas podem estar combinadas com lípidos e hidratos de carbono
na maioria dos alimentos conteúdo de proteína dado por N x 6.25%
procedimento mais comum para determinar proteínas:
determinação de um elemento ou grupo pertencente à proteína
elementos – C ou N
grupos – aminoácidos e ligações peptídicas
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
análise pode ser dificultada pela presença de N não proteico:
aminoácidos livres
pequenos peptídeos
ácidos nucleicos
fosfolídos
açúcares aminados
porfirinas
algumas vitaminas
alcalóides
ácido úrico
ureia
NHŸ
3/7/2007
2
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
análise de proteínas importante para:
rotulagem
investigação de propriedades funcionais
determinação de actividade biológica
conteúdo proteico total
teor de uma dada proteína
teor proteico durante isolamento e purificação de proteínas
determinação de azoto não proteico
composição em aminoácidos
valor nutricional de uma proteína
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Análise de carbono
digestão mais fácil que para N
menores erros no resultado
maior quantidade relativamente a N
factor de correcção mais constante que para N
maior dificuldade em separar os C proteicos dos restantes
3/7/2007
3
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Análise de azoto
mais utilizada
proteínas têm em média 16% N
transformação de azoto para proteína – 6.25
16 g N ––––– 100 g proteínas
n g N ––––– x g proteínas
erros quando teor em N ʌ 16%
tabelas com factores de conversão específicos
n x 100x = = n x 6.25
16
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Análise de azoto
3/7/2007
4
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Método de Kjeldahl – determinação através do N total
mais utilizado na determinação de proteína
diversas modificações ao longo do tempo
método determina N orgânico total
proteico e não proteico
na maioria dos alimentos, N não proteico em muito pequena quantidade
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
procedimentoamostra triturada e homogeneizadaaquecimento da amostra com H2SO4
digestão converte N (excepto o que está em forma de NO3 ou NO2) em amónia
amónia está na forma de NHŸ ligado a SO‚permanece em solução
restantes compostos orgânicos convertidos em CO2 e H2O
Amostra (N orgânico) + H2SO4 ↓ (NH4)2SO4
3/7/2007
5
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
procedimentoadiciona-se NaOH conc.
converte sulfato de amónio em amónia gasosaaquece-se para libertar amónia num volume conhecido
de ácido bóricoforma borato de amónio
(NH4)2SO4 + NaOH ↓ NH3
NH3 + H3BO3 ↓ (NH4)3BO3
(NH4)3BO3 doseado com HClindicador usado para determinar ponto de
viragem
(NH4)3BO3 + HCl ↓ NH4Cl + H3BO3
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
procedimentoconcentração de H+ necessária para alcançar ponto de
viragem é equivalente à concentração de N no alimento
usa-se um brancosubtrair N do reagente do N da amostracálculo:
s bv - vx
%N = x x 14 x 1001000 m
m – peso da amostra (g)x – HCl (mol)vs – vol. titulação da amostra (cm3)vb – vol. titulação branco (cm3)14 – PM azoto (g/mol)
3/7/2007
6
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Método de Kjeldahl
vantagens:
universal
muito preciso
boa reprodutibilidade
barato
micro Kjeldahl para determinar g
desvantagens:
não mede apenas proteína
diferentes factores de conversão
risco de utilização de H2SO4 conc. a temperatura elevada
risco de utilização de catalisadores
demorado (pelo menos 2 h)
menos preciso que método do biureto
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
modificações do métodoadição de óxidos de metais para acelerar a digestão da
misturamistura de Hg, Cu, Se
Hg mais eficazadição de sulfato de potássio
aumenta ponto de ebulição da mistura na digestãoacelera o processo
adição de sulfito ou tiossulfato de sódio ao hidrolisado diluídoajuda a libertar azoto do Hg
adição de ácido bóricorecolha da amónia libertada em excesso de ácido bóricoborato de amónio formado titulado com um ácido
padronizado
3/7/2007
7
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
modificações do métodomicro Kjeldahl
permite determinar g de N
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Método de Kjeldahl
reagentes
carbonato de sódio
alaranjado de metilo 0.1%
HCl 0.1 N
NaOH 0.02 N
NaOH conc.
ác. bórico 2%
fenolftaleína
verde de bromocresol 0.1% em álcool
HCl conc.
mistura de catalisadores
96% K2SO4, 4% CuSO4.5H2O
H2SO4 conc.
3/7/2007
8
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
procedimento:
digestão da amostra
juntar num balão de microkjeldahl de 100 mL
200 mg amostra
1.5 g mistura de catalisadores
3 mL H2SO4 conc.
colocar balão no digestor
digerir 20 min
tirar balão e arrefecer até temperatura ambiente
juntar 5 mL H2O2
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
digestão da amostra
repor balão no digestor
aquecer devagar até se tornar translúcido e não haver resíduos carbonizados
arrefecer 15-20 min à temperatura ambiente
arrefecer em água da torneira
juntar devagar, com agitação, 40 mL H2O
3/7/2007
9
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
procedimento:
destilação da amostra
amostra transferida para destilador
adicionar excesso NaOH
NH4HSO4 passa a NH3 (volátil)
colocar ~7 g NaOH num Erlenmeyer de 50 mL
juntar 11 mL H2O
agitar até dissolver NaOH
arrefecer sob água corrente
colocar ~10 mL ác. bórico num erlenmeyer
adicionar 4 gotas vermelho de metilo e 6 gotas verde de bromocresol
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
destilação da amostra
erlenmeyer com ác. bórico e indicadores colocado à saída do destilador
recolher ~⅔ do destilado no erlenmeyer
3/7/2007
10
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
procedimento:
titulação da amostra
titular o destilado com solução padronizada de HCl 0.1 N
nº equivalentes de ácido consumido igual a nº equivalentes de amónia
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Método de Dumas
determinação de N total, após combustão da amostra
700 – 800 ºC
medida volumétrica do N gasoso
GC com detector de condutividade térmica (TCD)
N determinado convertido em teor de proteína
3/7/2007
11
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Método de Dumas
procedimento:
amostra de massa conhecida (100-500 mg) levada a combustão na presença de O2
libertação de CO2, H2O e N2
CO2 e H2O removidos por absorção em colunas
teor de N medido após passagem dos gases restantes por outra coluna
equipada com detector de condutividade térmica
detector calibrado com EDTA ou outro composto puro com concentração de N conhecida
necessário converter concentração de N em teor proteico
factores de conversão variam com composição da proteína
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Método de Dumas
vantagens:
mais rápido que Kjeldahl
< 4 min por medida; Kjeldahl 1-2 h
não requer compostos tóxicos nem catalisadores
permite automatização (até 150 amostras)
aplicável a todos os tipos de alimentos
desvantagens:
custo inicial elevado
mede N proteico e não proteico
requer amostras pequenas
difícil obter amostras representativas
3/7/2007
12
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Métodos que utilizam espectroscopia de absorção electrónica
exigem curvas de calibração com diversas proteínas
mede-se absorção ou turbidez
amostra medida ao mesmo comprimento de onda
obtém-se concentração proteica da amostra
diferentes métodos divergem nos grupos químicos responsáveis pela absorção ou turbidez
ligações peptídicas
grupos aromáticos
grupos alcalinos
agregados proteicos
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Método do biureto
substâncias com 2 ou mais ligações peptídicas formam um complexo roxo com sais de cobre (Cu2+) em soluções alcalinas
proteína misturada com reagente do biureto
reagente contém sulfato de cobre, NaOH e tartarato de sódio e potássio
após 15-30 min, mede-se absorvância a 540 nm
intensidade da cor proporcional à quantidade de proteína
3/7/2007
13
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Método do biureto
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Método do biureto
procedimento:
5 mL reagente biureto misturado com 1 mL solução de proteína
1-10 mg proteína/mL
mistura estabiliza à temperatura ambiente 15-30 min
se não estiver transparente requer filtração ou centrifugação
absorvância lida a 540 nm contra branco do reagente
fazer curva de calibração com albumina de soro bovino (BSA)
3/7/2007
14
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Método do biureto
vantagens:
bastante específico
não tem problemas de interferentes
simples, rápido (< 30 min) e mais barato que Kjeldahl
determina proteína
desvantagens:
requer curva de calibração
cor não é idêntica para todas as proteínas
desvios causados menores que noutros métodos colorimétricos
menos sensível que outros métodos espectrofotométricos
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Método de Lowry (fenol)combina reagente do biureto com reagente de Folin-Ciocalteauinteracção das proteínas com fenol e cobre em condições
alcalinasreacção colorimétrica
oxidação (catalisada por cobre) de aminoácidos aromáticos por um reagente heteropolifosfatocor azul, medida entre 500-750 nm e comparada
com curva padrãopequeno pico a ~500 nm
determinação de concentrações proteicas elevadas
pico maior a ~750 nmdeterminação de menores concentrações
3/7/2007
15
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Método de Lowryprocedimento:
amostra diluídaadição de tartarato de sódio e potássio/Na2CO3
incubar à temperatura ambiente 10 minadição de CuSO4/tartarato Na K/NaOH
incubr 10 min à temperatura ambienteadicionar reagente de Folin
misturar e incubar a 50 ºC, 10 minler absorvância
curva de calibração com BSA para calcular teor proteico
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Método de Lowryvantagens:
10-20 vezes mais sensível que determinação por UV100 vezes mais sensível que método do biuretorelativamente rápido (1-1.5 h)bastante específico
poucos interferentessacarose, em elevada concentração, lípidos, tampão
fosfato, ...
3/7/2007
16
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Método de Lowrydesvantagens:
intensidade da cor pode variar com composição em aminoácidos e com condições analíticas
não é completamente proporcional à concentração proteica
destrói a amostramúltiplas operaçõesnecessita período de incubação entre adição de reagentesrequer curva padrão
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Método espectrofotométrico directomaioria das proteínas absorve a 280 nm
presença de tirosina, triptofano e fenilalaninaaminoácidos aromáticosteor nos alimentos é relativamente constante
absorvância permite calcular a concentração proteicaproteínas solubilizadas num tampão ou base
3/7/2007
17
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Método espectrofotométrico directovantagens:
rápido e simplesrelativamente sensível
mais que método do biuretonão destrutivopoucas interferências
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Método espectrofotométrico directodesvantagens:
resultados com imprecisãodependem da concentração dos 3 a. a. na composição da
proteínasais de amónio não interferemácidos nucleicos podem interferir
problema reduzido por medição da absorvância a 2 280 nm, 260 nm
preparação da amostra muito longafunciona melhor em proteínas purificadas ou extraídas
3/7/2007
18
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Método espectrofotométricodeterminação pode ser feita por fluorescência
triptofano é fluorescentemétodo inicialmente desenvolvido para leite e lacticínios
também utilizado em produtos cárneos e vegetais
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Métodos turbidimétricosmedida baseada na turbidez causada pela proteína precipitada
por um agente precipitanteácido tricloroacético, ferricianeto de potássio, ácido
sulfosalicílicovantagens:
rápidosimples para amostras líquidas
proteína está em soluçãodesvantagens:
não aplicável em amostras sólidasproteína tem que ser extraída para uma solução
resultados variam com tipo de proteínapode haver precipitação de outras substânciasrequer calibração com padrões
3/7/2007
19
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Método dye-bindingutilização tem aumentado
grãos de cereais, sementes de oleaginosas, lacticínios e outros produtos animais e vegetais
amostra tratada com excesso de corante aniónicoazul brilhante de Coomassie
pH da proteína ajustado (< pI)proteínas carregadas positivamente
corante e proteína reagem quantitativamentecorante liga-se aos grupos catiónicos dos resíduos His, Arg,
Lys e aos grupos terminais amina livrescorante muda de vermelho para azul
max passa de 465 nm para 595 nmformação de complexo insolúvel, separável por filtração ou
centrifugação
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Método dye-bindingexcesso de corante em solução medido colorimetricamente
diferença dá indirectamente teor de proteínateor de proteína na amostra proporcional à quantidade
de corante complexado
Corantecomplex = Coranteinit – Corantelivre
para cada alimento constrói-se uma tabela de conversãopermite obter % de proteína
3/7/2007
20
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Método dye-bindingprocedimento:
corante dissolvido em 95% EtOHacidificado com ácido fosfórico 85%
amostras com 1-100 g/mL proteína e BSA adicionadas ao reagente
ler absorvância a 595 nm contra branco do corantecalcular concentração da proteína a partir da curva de
calibração
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Método dye-bindingcorantes utilizados:
laranja G, laranja 12, vermelho A, preto búfalo, preto amino 10B
boa correlação com método de Kjeldahlequipamentos fazem:
reacção colorimétricafiltração do complexo insolúvelmedida colorimétrica da solução filtrada
3/7/2007
21
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Método dye-bindingvantagens:
simplicidaderapidez (2 min)menos interferências que método de Lowrymais sensível que método de Lowryexactidãoreprodutibilidadepreço
desvantagens:dependência do equipamentocor varia com tipo de proteína
dificuldade na escolha do padrãocomplexo pode ligar-se a cuvetes d quartzo
usar vidro ou plástico
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Método do ácido bicinchoninico (BCA)proteínas reduzem iões Cu2+ a Cu+ em condições alcalinasCu+ complexa com reagente BCA (verde) tornando-o púrpuraprocedimento:
misturar solução de proteínas com reagente BCApH 11.25
incubar 30 min a 37 ºC, ou 2 h à temperatura ambiente, ou30 min a 60 ºC
escolha depende da sensibilidade pretendidatemperatura mais elevada dá melhor resposta
ler absorvância a 562 nm contra branco do reagentecurva padrão com BSA
3/7/2007
22
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Método do ácido bicinchoninicovantagens:
sensibilidade semelhante a método de Lowrymétodo micro BCA mais sensível que Lowry
um único passo de misturareagente mais estável que o de Lowrypoucas interferências
desvantagens:cor instável com tempoqualquer composto capaz de reduzir Cu2+ a Cu+ interfereaçúcares redutores interferem mais que no método de Lowryconcentrações elevadas de (NH4)2SO4 interferem
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Métodos que utilizam espectroscopia de absorção electrónica
vantagens:
rápidos
simples
sensíveis a baixas concentrações
desvantagens:
requerem soluções transparentes e diluídas
maioria das amostras exigem preparação complexa
homogeneização
extracção por solventes
centrifugação ou filtração
em alimentos processados pode ser difícil extrair as proteínas
absorvância depende das sequências de aminoácidos
3/7/2007
23
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Outros métodos instrumentaismedição de propriedades físicas brutasmedição da adsorção de radiaçãomedição da dispersão de radiação
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
medição de propriedades físicas brutasdensidade
densidade das proteínas superior à da maioria dos componentes dos alimentosaumento do teor proteico provoca aumento da
densidadeteor proteico determinado através da medição da
densidadeíndice de refracção
índice aumenta com aumento do teor proteicoteor proteico determinado por medição do índice de
refracção
3/7/2007
24
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
medição da adsorção de radiaçãoUV-VisIV
grupos químicos no esqueleto polipeptídico possuem vibrações características6.47 m, 3300-3500 nm, 2080-2220 nm,
1560-1670 nmabsorção de radiação IV a determinados
comprimentos de onda usada para quantificar concentração proteica numa amostra
permite análise rápida e on-linenão destrutivonão necessita muita preparação de amostraelevado custo incialrequer calibração demorada
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
medição da adsorção de radiaçãoNMR
usado para determinar concentração total de proteínasmedição da área dos picos correspondentes à fracção
proteica permite determinar o teor proteico
3/7/2007
25
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
medição da dispersão de radiaçãodispersão de luz
turbidez de uma solução directamente proporcional à concentração de agregados de proteínas presentes
dispersão de ultra-sonsvelocidade e absorção de ultra-sons proporcionais à
concentração de agregados proteicos presentes
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Outros métodos instrumentaisvantagens:
não destrutivospouca preparação de amostramedidas rápidas e precisas
desvantagens:requerem curvas de calibraçãodependem do tipo de proteína e do alimentoválidos apenas para analisar alimentos com composições
simples
3/7/2007
26
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Métodos físicospouco utilizados
índice de refracçãodensidade específicaviscosidadetensão superficialcondutividadepolarização
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Comparação dos métodosaplicações oficiais
métodos Kjeldahl e Dumas e em alguns casos UV-Viscontrolo de qualidade
métodos rápidos e simplesIV
estudos fundamentais em laboratóriométodos rápidos, precisos e sensíveis a baixas concentrações
UV-Vis
3/7/2007
27
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Comparação dos métodosfactores a ter em conta:
métodos Kjeldahl, Dumas e IV requerem pouca preparação de amostra
métodos de UV-Vis requerem muita preparaçãométodos Dumas e Kjeldahl medem N orgânico totalmétodo do biureto mede ligações peptídicasmétodo de Lowry mede ligações peptídicas e aminoácidos
aromáticosIV é um método indirectométodos UV-Vis são mais sensíveismétodos de Lowry, dye-binding, BCA e UV mais sensíveis que
Kjeldahl, Dumas e biureto
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Comparação dos métodosfactores a ter em conta:
métodos IV são rápidos (< 1 min)método de Dumas é automatizado e rápido (< 5 min)métodos UV-Vis permitem analisar diversas amostras
simultaneamentedisponibilidade de equipamentorigor da medidatécnica destrutiva ou nãofacilidade de operaçãoprocessamento do alimento (aquecimento,...) pode reduzir a
eficácia da extracção de proteínas
3/7/2007
28
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
proteínas separadas com base em:diferentes propriedades físico-químicas
tamanhocargaadsorçãosolubilidadeestabilidade térmica
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
métodos de purificação mais comuns:precipitaçãocromatografia de permuta iónicacromatografia de afinidadecromatografia de exclusão molecular
3/7/2007
29
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
escolha da técnica de separação depende de:objectivo da análisequantidade de amostra disponívelpureza desejadaequipamento disponíveltipo de proteínas presentepreçoter em conta que estrutura tridimensional da proteína pode ser
alterada durante separaçãoefeito das condições ambientais sobre a estrutura da proteína e
suas interacçõespHforça iónicasolventetemperatura...
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Métodos baseados em características de solubilidadesolubilidade determinada pela sequência de aminoácidos
condiciona tamanho, forma, hidrofobicidade e carga eléctricaproteínas solubilizadas ou precipitadas selectivamente por
alteração de:pHforça iónicaconstante dielétricatemperatura
usados quando grandes quantidades de amostra disponíveisrápidosbaratosnão influenciáveis por outros componentes dos alimentos
frequentemente usados como 1º passo em processos de separação
3/7/2007
30
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Salting outproteínas, em solução aquosa, precipitadas quando concentração
salina excede um valor críticoágua “liga-se” ao sal, deixando de estar disponível para
hidratar as proteínas(NH4)2SO4, NaCl, KCl
procedimento:sal adicionado, em concentração ligeiramente inferior à
necessária para precipitar a proteína de interessesolução centrifugada
remoção de proteínas menos solúveisadição de sal em concentração ligeiramente superior à
necessária para precipitar a proteínaproteína precipita
separada por centrifugação
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Salting outconcentrações elevadas de sal contaminam a solução
remoção por diálise ou ultrafiltração
3/7/2007
31
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Precipitação isoeléctricaproteínas têm carga 0 no ponto isoeléctrico (pI)
proteínas agregam e precipitam devido à não existência de repulsão electrostática
diferentes sequências de aminoácidos originam diferentes pIajuste do pH da solução permite separar proteínas por
precipitação selectiva
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Fraccionamento por solventesolubilidade de proteínas depende da constante dielétrica do
solventea pH e força iónica constantesdiferentes interacções electrostáticas entre grupos carregados
quando constante dieléctrica diminui, aumentam interacções electrostáticas entre grupos carregadossolubilidade das proteínas diminui
constante dieléctrica de soluções aquosas diminui quando se adicionam solventes orgânicosEtOH, acetonadiferentes proteínas requerem diferentes quantidades de
solvente orgânicoseparação proteica
3/7/2007
32
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Fraccionamento por solventetrabalhar a ≤ 0 ºC para impedir desnaturação proteica
aumento de temperatura quando se misturam solventes orgânicos com água
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Desnaturação de proteínas contaminantesproteínas desnaturam e precipitam quando:
temperatura muito elevadapH muito ácido ou muito básicoseparação baseada na resistência de proteínas a condições
extremadas
3/7/2007
33
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Métodos baseados em características de adsorçãocromatografia de afinidade ou de permuta iónica
proteínas possuem diferentes afinidades para fase estacionária ou eluente
coluna aberta ou HPLCmétodos comuns em laboratório para separar proteínas e
aminoácidospouco comuns a nível comercial
caros e não permitem separação rápida de grandes quantidades
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Cromatografia de permuta iónicamais usadaadsorção reversível das proteínas carregadas a um suporte sólido
carregadopara proteínas usam-se mais resinas aniónicas
condições (pH e força iónica) ajustadas para favorecer ligação da proteína de interesseoutras proteínas ligam-se menos fortemente e eluem mais
rapidamenteproteína de interesse eluída com outra solução tampão
diferente pH ou força iónica
3/7/2007
34
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Cromatografia de permuta iónicaaplicações:
separação de proteínas no laboratórioquantificação de aminoácidos
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Cromatografia de afinidadefase estacionária consiste numa molécula ligada covalentemente
a um suporte sólido ligando possui afinidade específica e reversível para uma
dada proteínacondições tampão que favorecem afinidade
outras proteínas ligam-se menos fortemente e eluem mais rapidamente
proteína de interesse eluída com outra soluçãotécnica mais eficaz para separar proteínas
cara, devido a necessidade de colunas com ligandos específicos
optimização do método requer ajuste de muitas variáveis
3/7/2007
35
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Cromatografia de afinidadeaplicações:
aplicações laboratoriaispurificação de glicoproteínas
utilização de lectinas como ligantes
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Métodos baseados em diferença de tamanhoPM de proteínas variam entre 104 – 106 Dseparação não depende do PM mas do raio de Stokes
raio médio de uma proteína em soluçãodepende da estrutura tridimensional
para proteínas com mesmo PM, raio de Stokes:proteína globular compacta < proteína enrolada flexível
< proteína rígidaseparação por:
diáliseultrafiltraçãocromatografia de exclusão molecular
3/7/2007
36
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Diáliseutiliza membranas semi-permeáveis
permitem passagem de moléculas abaixo de uma certa dimensão
solução de proteínas colocada num tubo de diálise seladotubo colocado num grande volume de água ou tampão
lentamente agitadosolutos de baixo PM saem do tubo; restantes ficammétodo lento (até 12 h)mais usado em laboratóriofrequentemente usado para remoção de sais de soluções usadas
em salting-outtambém usada em permuta de tampões
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Diálise
3/7/2007
37
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Ultrafiltraçãoutiliza membranas semi-permeáveis sob pressão
permitem passagem de moléculas abaixo de uma certa dimensão
solução de proteínas colocada numa célula contendo a membranaaplica-se pressão
solutos de baixo PM atravessam membrana; restantes ficam
diversas membranas disponíveismais rápido que diáliseusada em laboratório e em escala comercialutilizada para concentrar soluções de proteínas, remover sais,
trocar tampões ou fraccionar proteínasnanofiltração pode ser usada para mesmos fins
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Cromatografia de exclusão molecularsepara proteínas por PMsolução de proteína atravessa coluna empacotada com material
polimérico porosodextrano, agarosemoléculas maiores que os poros excluídas
atravessam rapidamente a colunarestantes moléculas retardadas
moléculas eluídas por ordem decrescente de tamanhoexistem diversos empacotamentos, para separar proteínas com
diferentes PM
3/7/2007
38
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Cromatografia de exclusão molecularusada para:
remoção de saistrocar tampõesfraccionar proteínascálculo do PM
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Cromatografia de exclusão molecularPM de proteínas desconhecidas determinadas por comparação
dos seus volumes de eluição com os de proteínas de PM conhecidográfico de volume de eluição vs. log(PM) dará uma rectaPM não está directamente relacionado com raio de Stokes
3/7/2007
39
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Separação por electroforeseseparação baseada no tamanho, forma e cargamigração de moléculas carregadas através de um campo eléctricoelectroforese de zona é a mais usada com proteínas
proteínas de uma mistura separadas por migração num gelgel de poliacrilamida mais comum
alternativas – amido e agarose
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Electroforese não desnaturantesolução tamponizada de proteínas colocada num gel poroso
poliacrilamida, amido, agarosevoltagem aplicada ao gel
proteínas deslocam-se no gel numa direcção que depende do sinal da sua carga e a uma velocidade que é função da grandeza da cargadeslocamento também depende da fricção
relação entre tamanho da molécula e tamanho dos poros do gel
voltagem aplicada x carga molecularmobilidade =
fricção molecular
3/7/2007
40
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Electroforese não desnaturantequanto mais alta a voltagem ou a carga da proteína, mais
esta se movequanto mais pequena a molécula ou maior o tamanho dos
poros do gel, mais rapidamente ela se moveseparação baseada numa combinação da carga, tamanho e forma
da proteína
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Electroforese desnaturante (SDS-PAGE)sodium dodecyl sulfate – polyacrylamide gel electrophoresisproteínas separadas segundo PMproteínas desnaturadas antes da análise
misturadas com mercaptoetanol e dodecil sulfato de sódio (SDS)
mercaptoetanol quebra ligações bisulfitoSDS forma ligações hidrofóbicas com proteínas
desdobramento da estrutura, devido a repulsão entre grupos com carga negativa do SDS
cada proteína liga-se aproximadamente à mesma quantidade de SDS por unidade de comprimento
carga por unidade de comprimento e conformação idêntica em todas as proteínas
Java applet
3/7/2007
41
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Electroforese desnaturantemovimento no gel depende do tamanho da proteína
proteínas mais pequenas movem-se mais rapidamenteadiciona-se um corante à solução da proteína
azul de bromofenol, …pequena molécula crregada que migra à frente das
proteínasno fim da electroforese, gel tratado com corante
permite visualizar proteínas
distância percorrida pela proteínamobilidade relativa =
distância percorrida pelo corante
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Electroforese desnaturantemobilidade relativa comparada com curva de calibração
gráfico log(PM) vs. mobilidade relativa é linear
3/7/2007
42
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Electroforeseaplicações:
parte do processo de purificaçãocaracterização proteicaequipamentos comerciais permitem purificar grandes
quantidades de proteínadeterminação da composição proteica de um alimento
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Electroforese de focagem isoeléctricaum dos métodos de separação de proteínas com melhor
resoluçãomodificação da electroforeseproteínas separadas segundo carga, num gel com um gradiente
de pHproteínas migram para o local em que pH = pI
3/7/2007
43
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Electroforese de focagem isoeléctricagradiente de pH gerado por anfólitos
pequenos polímeros contendo simultaneamente grupos carregados positiva e negativamente
mistura de anfólitos tem milhares de polímeros com gama variada de valores de pH
anfólitos adicionados ao gel antes da polimerizaçãoapós formação do gel, aplica-se uma voltagem e anfólitos
migram segundo o seu pHgradiente de pH
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Electroforese bidimensionalutilização conjunta de focagem isoeléctrica e SDS-PAGE
melhora resolução de misturas complexas de proteínascapaz de separar >1000 proteínas
proteínas separadas numa direcção segundo cargafocagem isoeléctrica
depois separadas na direcção perpendicular segundo tamanhoSDS-PAGE
3/7/2007
44
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Electroforese capilarutilização de um tubo capilar em vez de um gel
fluxo electroosmótico no tubo influencia separação de proteínas
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Electroforese capilarprocedimento:
amostra introduzida no recipiente de entradaaplica-se baixa pressão ou voltagem através do capilar
carregar o volume pretendido de amostra na colunabandas de proteínas detectadas por detectores semelhantes
aos usados em HPLCUV-Vis, fluorescência, condutividade
3/7/2007
45
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Electroforese capilar
1. pre-albumin 2. Albumin 3. alpha 1-Acid-Glycoprotein 4. alpha 1-Antitrrypsin 5. Haptoglobin6. alpha2 macroglobulin 7. Hemopexin8. Transferrin9. Complement 10. Gamma
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Electroforese capilarutilização obretudo laboratorial3 variantes usadas em separação de proteínas:
electroforese de zona capilarelectroforese capilar em gelfocagem isoeléctrica capilar
3/7/2007
46
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Electroforese capilarelectroforese de zona capilar
semelhante a PAGEproteínas separadas em solução no interior do capilar
cheio com um tampão do pH pretendidouma única “corrida” capaz de separar moléculas
carregadas e não carregadasalterando pH ou força iónica do tampão
varia fluxo electroosmóticovariação da velocidade de migração das proteínas
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Electroforese capilarelectroforese capilar em gel
proteínas separadas por tamanhoproteínas desnaturadas e dissociadas na presença de SDS
e agente redutorseparação em capilares cheios com gel de poro específico
3/7/2007
47
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
Electroforese capilarfocagem isoeléctrica capilar
anfólitos formam gradiente de pH no capilarproteínas separadas com base no pI
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
determinação da composição em aminoácidos das proteínashidrólise da amostra com ácido forte
libertação dos aminoácidosaminoácidos separados por métodos cromatográficos
permuta iónicacromatografia de afinidadecromatografia de absorção
3/7/2007
48
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
hidróliseHCl 6N, 24 hdiferente comportamento dos aminoácidos durante hidrólise
triptofano destruídometionina, cisteína, treonina e serina progressivamente
degradadosduração da hidrólise influencia resultados
asparagina e glutamina convertidos em ácidos aspártico e glutâmico
não se conseguem quantificarisoleucina e valina hidrolisadas mais lentamente que
restantes aminoácidostirosina e metionina podem ser oxidados
procedimentos especiais de hidrólise necessários para evitar erros
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
hidrólisepercas de treonina e serina calculadas por hidrólise da
amostra em 3 períodos de tempo24, 48, 72 h
compensação para degradação de aminoácidosextrapolação para tempo zero, assumindo cinética de 1ª
ordemvalina e isoleucina calculadas a partir de um hidrolisado de
72 hcisteína e cistina convertidos em ácido cístico
mais estáveltriptofano sofre hidrólise alcalina
depois cromatografado
3/7/2007
49
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
hidrólisehidrólise de peptídeos e proteínas origina normalmente 16 a. a.fosfoaminoácidos requerem processos especiais
análise semi-quantitativa de PSer, PThr e PTyrHCl 6N; 1-4 h; 110 ºCderivatização pré ou pós-coluna
análise lenta e resultados frequentemente mausnão é uma análise de rotina
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
hidróliseHCl em fase de vapor
amostra seca sob vácuo, num tubo de ensaiotubo colocado num frasco com 200 L HCl 6N e um cristal de
fenoltapar frasco com válvuladesarejar 3 vezes com Ar
fechar válvulaaquecer frasco 1 h a 150 ºC
finda a hidrólise, abrir válvulatransferir tubos com amostra para outro recipiente
secar sob vácuoguardar a -20 ºC, sob Ar, até análise
3/7/2007
50
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
hidróliseHCl em fase líquida
amostra seca sob vácuo, num tubo de ensaioadicionar 100 L HCl 6N, contendo 4% ácido tioglicólicodesarejar sob vácuo e selar à chamaaquecer 22 h a 110 ºCarrefecer o tubo
abrir, secar sob vácuo e analizar
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
separação por permuta iónicaeluição com gradiente
tampões com aumento gradual de pH e força iónicaderivatização pós-colunaapós eluição, a. a. quantificados por reacção com nihidrina
nihidrina reage com grupo amina primária dos a. a.produto de cor púrpura
medição espectrofotométrica a 570 nmprolina a 440 nm
método automatizado e adaptado para utilização com HPLC
3/7/2007
51
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
separação por permuta iónica
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
separação por RP-HPLCa. a. hidrolisados e derivatizados antes da cromatografia
derivatização com feniltiocarbamil, ...quantificação por espectroscopia UV
detecção de quantidades picomolares de a. a.tempo de análise ≤ 30 min
3/7/2007
52
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
quantificaçãoutilização de padrão interno
a. a. não existente nos alimentosnorleucina
resultados expressos em % molesresíduos por 100 resíduos
dividir nº moles de cada resíduo pela soma de todos e multiplicar por 100
Análise de Proteínas e Azoto não proteico
utilização:quantificar peptídeos e proteínasdeterminação da qualidade nutricional de uma proteínacaracterizar ou identificar novas proteínas e peptídeos sintéticosdetectar a. a. não comunsdelinear estratégias de fragmentaçãocalcular PM de uma proteínadeterminar volume parcial específico de uma proteína