38ème colloque national des biologistes des hôpitaux n° 100 … · 38ème colloque national des...
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+38ème Colloque Nationaldes Biologistes des HôpitauxMontpellier – 28/09 au 02/10/2009
ACNBH
Agrément FMCN° 100 168
DECLARATION D’INTERETDANS LE CADRE DE MISSIONS DE FORMATION
REALISEES POUR L’ACNBH
Dr. Alain Gravet exerçant au CH de Mulhouse déclare sur l’honneurne pas avoir d'intérêt, direct ou indirect (financier) avec les entreprisespharmaceutiques, du diagnostic ou d’éditionsen relation avec le DMDIV et/ou le sujet présenté.
+
Spectrométrie de masse etidentification bactérienne
Dr. Alain Gravet
Laboratoire de Microbiologie
Centre Hospitalier de Mulhouse
+L’identification bactérienneidentification phénotypique (1)
L’identification d’un micro-organisme est une étapeimportante dans le diagnostic d’une maladie infectieuse
Orientation famille bactérienne, un genre, voire une espèce :
Morphologie des colonies, morphologie après coloration,caractéristiques de croissance, pigmentation, odeur, caractèrecaractéristiques de croissance, pigmentation, odeur, caractèrehémolytique sur gélose au sang, catalase, oxydase
Pour une identification plus précise : utilisation de galeriesd’identification biochimique manuelles ou pouvant être luessur automates
Des tests d’agglutination peuvent également être utiliséspour l’identification bactérienne
+L’identification bactérienneidentification phénotypique (2)
Galeries biochimiques d’identification
Miniaturisation des tests : Système Api® de bioMérieux
Etude du métabolisme (incubation de 18-24h, éventuellement 48h)
Recherche d’activités enzymatiques (pas de croissance nécessaire,inoculum plus important)inoculum plus important)
Automates
utilisation de substrat chromogénique, fluorescent oufluorogéniques lecture colorimétrique, tubidimétrique oufluorométrique. Méthode dépendant du fabricant
Systèmes Vitek®, Phoenix®,Walk-away®,
Taxons +/- différents selon le fabricant, différentes cartes oucartouches (BG-…)
Certains taxons absents : anaérobie… en développement
+Identification moléculaire desmicro-orgnismes
Bouleversement de l’identification, mises en évidence des erreurs et desinsuffisances de l’identification phénotypique
Analyse de la séquence du gène de l’ARN 16S pour les bactéries etcomparaison avec les banques électroniques de séquences (GenBank,MBL…)
99% de similarité identifie à l’espèce, 97-99 le genre, < 97% possiblenouvelle espèce
Autres possibilités : séquençage du gène rpoB, puce à ADN
Utilité: Identification des bactéries fastidieuses
Les mycobactéries (PCR, hybridation)
Lorsque identification peu performante (Acinetobacter)
Discordance identification et antibiogramme par exemple
Isolement dans une circonstance inhabituelle
+Identificationphénotypique/moléculaire
Méthode Rapidité Sensibilité Spécificité Universalité Côut
Immuno +++ ++ + - +/-
API + ++ ++ +/- +
Automates ++ ++ ++ +/- ++
ARN16S +/- +/- +++ ++ +++
Puces àADN
+/- +/- ++ ++ ++
+Spectrométrie de masse et temps devol (TOF)
1897,Thompson, séparation de particules en fonction de leurcharge et de leur masse, découverte de l’élection, calcul duratio m/z
1919, Ashton, premier spectromètre de masse 1919, Ashton, premier spectromètre de masse
Source Analyseur Détecteur
Particuleschargées
EnregistrementSystème de
vide
+Spectrometrie de masse et temps devol (TOF)
1946, Stephen application du temps de vol à la spectrométrie demasse
Accélération de molécules chargée
Vitesse dépend de la charge et de la masse (m/z)
Séparation en fonction du poids et de la charge
Source Accélérateur Vide Détecteur
V 1,2,3
+Spectrométrie de masse (MS)
1968 première utilisation de la Spectrométrie de masse pourclassification et identification bactérienne (acide acétique)
1977 à 1994, développement de plusieurs
Techniques MS, analyse de molécules chargées Techniques MS, analyse de molécules chargées
GC/MS, Pyrolysis MS, FAB MS
+Maldi-Tof
Technique MALDI (matix assisted laser desorptionionisation)
Ionisation de biomolécules (peptides, protéines)
Ionisation douce
Utilisation en routine de la technique pour l’analyse debiomolécules
Analyse sur de cellules entières
+Spectromètres
Microflex®
Bruker
Première commercialisation : juin 2005
Fréquence du Laser : 60 Hz
Longueur trajet jusqu’au détecteur 1,05 m
Gamme de masses (m/z) : 50 à 300 kDa
Dépôts : Étapes d’extraction (ethanol, acétonitrile)
Possibilité de « smear »
Plaques 96 positions
Logiciel : Biotyper® Spectres
+Spectromètres
Axima®
Shimadzu
Première commercialisation : décembre 2007
Fréquence du Laser : 50 Hz
Longueur trajet jusqu’au détecteur : 1,2 m
Gamme de masses (m/z) : 1 à 500 kDa
Dépôt :
direct d’une partie de la colonies
extraction pour certains microorganismes
Plaques : 48 x 4 positions
Logiciel : Saramis® (AnagnosTec)
Superspectres
Spectres
+Différences
Technique de dépôts
Bases taxonomiques
Nombre absolu plus important de taxons pour Biotyper® (maispas de superspectres)
La grande majorité des micro-organismes d’intérêt médical dansles deux bases, quelques différences (début 2009)
Présents dans la base Biotyper®
Candida incospicua, Campylobacter lari, Campylobacter fetus,
Corynebacterium
Présents dans la base Anagnotec®
Abiotrophia defectiva, Candida guillermondii,Candida lusitaniae
Mycobacterium spp,Aspergillus, Filamenteux
+Choix Microbiologie de Mulhouse
Solution spectromètre de masse Axima® Shimatzu
Base taxonomique Saramis® Anagnostec
Solution informatique avec SIL SirWeb® - I2ASolution informatique avec SIL SirWeb® - I2A
Arrivée fin mai 2009
Utilisation en routine
+Saramis® AnagnosTec
Spectral ARchive And Microbial IdentificationsSystem
Superspectres : « spectre moyen d’environs 15 souches d’une même « spectre moyen d’environs 15 souches d’une même
espèce, exclusions des identifications faussement positives
Spectres de référence : comparaison en deuxième intention
Superspectres et spectres validées par le goldStandards : ARN16S, MLST et méthodes biochimiques
Centres de référence et laboratoires de diagnostic
+Saramis® AnagnosTec
SARAMIS Premium Comparaisons avec Superspectres et spectres Visualisation des spectres Génération de dendrogramme
Génération de superspectres Génération de superspectres
Mai 2009 2160 superspectres, représentant 130 genres, 462
espèces de bactéries, 39 genres et 125 espèces delevures et champignons
40.000 spectres : 235 genres, 1110 espècesbactériennes, 73 genres et 235 espèces dechampignons
+Base taxonomiques actuelle
Adaptation et évolutionconstante
Diversité des isolats cliniqueshumainshumains
Inclus des microorganismesrares et atypiques
Spectres
Pantoea agglomerans
Acinetobacter lwoffi4000 m /z 8000
4000 m/z 8000
Burkholderia cepacia
Raoultella ornithinolytica
Staphylococcus aureus
Escherichia coli
+Choix de matrice
DHB • Formation de longs cristaux de la périphérievers le centre• Peu de cristaux au centre• Convient au dépôt directe de la majorité destaxons• Nécessite plus de tirs de laser• Obtention de 100 à 200 pics par spectre
HCCA
• Obtention de 100 à 200 pics par spectre• Nombreux signaux avec m/z > 10 kDa
• Acide Alpha 4-cyano-4-hydroxycinnamice•Formation de petits cristaux sphérique• Distribution homogène• Ne convient pas au dépôt direct pour certainstaxons• Nécessite moins de tirs laser• Obtention de 80-150 pics par spectre• peu de signaux avec m/z < 10 kDa
+Choix de la matrice :Clostridium speticum
DHB ~150 pics
0
20
40
60
80
100
%Int.
3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 11000 12000 13000m/z
CHCA ~100 pics
+Préparation de l’échantillon
direct
ajout1 µL de matrice
Ac. formique 25%
dépôt1 µL, sécher
direct Évaporation du sovlant(T° ambiante)
Analyse automatiquedu spectre
Plaque Maldi
Dépôt simple mais exige :• matériel adapté• précision• un certain entrainement
Plaque Maldi avec44 positions
Préparation de l’échantillon
sélection et transfèred’une colonie ou dépôt
addition of 1 µl de matrice
d’une colonie ou dépôtD’une solution
Identification des bactéries, levures et champignons filamenteux
Utilisation d’un contrôle
+Le dépôt
Dépôt d’une petitequantité de colonieavec un cône ou unInoclic®
Ajout de la matrice (0,5ou 1µL), mélanger parde petits mouvementscirculaires
Formation des cristaux
+
Acquisition automatique ~30-60sec
Acquisition
<<C:\Dokumente und Einstellungen\m.erhard\Eigene Dateien\AnagnosTec-dc\Zwischenablage\Dokument Banner.tx t>> Spec [BP = 3
37
75
3000 5000 7000 9000 11000 13000
Mass (m/z)
1648.1
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
%In
ten
sit
y
37
75
70
75
80
74
87
44
10
93
9
94
53
99
94
79
80
10
34
7
50
15
78
63
11
57
2
70
92
59
31
96
54
35
81
68
37
93
30
73
67
10
22
6
84
50
10
60
8
11
90
6
Spectre de masse des Enterobacteriaceae :famille, genre, et espèces
Signaux retrouvés pourdifférents taxons
(ex m/z 4365 :Protéine ribosomale L36)
Escherichia coli
Hafnia alvei
Leclercia adecarboxylata
37
Possibilité dereconnaitre familles de
bactéries
> 50 espècesd‘entérobactéries
identifiées
3000 5000 7000 9000 11000 13000m/z
Leclercia adecarboxylata
Klebsiella pneumoniae
Proteus mirabilis
Enterobacter aerogenes
Klebsiellapneumoniae
Klebsiellaoxytoca
30 40percent matching masses
50 60 70 80 90
*
*
82
56
87
09
946
3
10
229
10
809
73
62
79
02
71
11
613
85
691
54
08
33
95
41
22
47
30
8256
9463
8843
10229
12282
73627111
6254
5691
3395
4122
4730
consensusspectrum:Klebsiella
oxytoca
SuperSpectrum:
type 9
Klebsiellaoxytoca
SuperSpectra: Klebsiella species
Enterobacteraerogenes
*
3000 mass m/z 15000
82
56
87
09
946
3
10
229
10
809
73
62
79
02
71
11
613
85
691
54
08
33
95
41
22
47
30
#A006528-1:Klebsiella
oxytoca
type 9
family
speciesgenus
multiple mass spectra of a species
similar ity dendrogramof mass fingerprints
Le superspectre inclut les spectres de masses spécifiques de l‘espèce
Identification d‘une souche par recherche d‘uneconcordence avec superspectres
Comparaison desspectres de 2 souches
d’isolats cliniques
nte
nsit
y
3685
3256
4404
5145
5535
6139
6820
7975
8577
8161
9109
8813
9634
1049
661
65
7371
539
Trichophyton_rubrum_1Superspectrum
Meilleure similarité avec
39
3000 4600 6200 7800 9400 11000
rela
tiv
ein 539
582
m/z
Les deux échantillons sontidentifiés
Trichophyton rubrumAvec une confiance de
99%
from Erhard et al. 2007, Exp. Dermatol.
Meilleure similarité avecT. rubrum SuperSpectre
+Approche : identification
Identification de spectres analysés avec des spectres validésde la base
Famille genre espèce
Possibilité d’identification séquentielles par des signaux communs àUne famille, un genre, une espèce
+
3000 5000 7000 9000 11000 13000
Mass (m/z)
1648.1
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
%In
ten
sit
y
<<C: \ Dokum ent e und Einst ellungen\ m . er har d\ Eigene Dat eien\ AnagnosTec- dc\ Zwischenablage\ Dokum ent Banner . t xt >> Spec [ BP = 3
3775
7075
8074
8744
10939
9453
9994
7980
10347
5015
7863
11572
7092
5931
9654
3581
6837
9330
7367
10226
8450
10608
11906
Comparaison avec lesSuperSpectra™ selonalgorithme propre
Etape 3 – Identification avec Saramis
algorithme propre
+
3000 5000 7000 9000 11000 13000
Mass (m/z)
1648.1
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
%In
ten
sit
y
<<C: \ Dokum ent e und Einst ellungen\ m . er har d\ Eigene Dat eien\ AnagnosTec- dc\ Zwischenablage\ Dokum ent Banner . t xt >> Spec [ BP = 3
3775
7075
8074
8744
10939
9453
9994
7980
10347
5015
7863
11572
7092
5931
9654
3581
6837
9330
7367
10226
8450
10608
11906
Etape 4 – Comparaison du spectreaux spectres de la base si nécessaire
Obtention d’unObtention d’undendrogrammeComparaison simple
+
AXIMA™
Identification – Intégration dans lelaboratoire
dépôt
(1)
AXIMA™Acquisitiondes spectres
SARAMIS™identification
Transfert identification
3000 5100 7200 9300 11400 13500
Mass (m/z)
1.0E+4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
%In
ten
sit
y
Vo y a g e r Sp e c # 1 M C= > Ad v BC( 3 2 , 0 . 5 , 1 . 0 ) = > NF0 . 7 [ BP = 9 7 4 0 . 9 , 1 0 2 6 9 ]
9741
7173
7200
9537
4365
6255
7186
9065
7158
8327
5381
5565
7871
6316
5096
9555
8851
8285
10923
9194
12225
4869
7706
3410
6858
10302
3204
5459
4611
6111
5723
3636
10697
8394
11741
(5)(3 +/- 4)
(2)
+Organisation LaboratoireMicrobiologie Saramis
SpectrométreServeurSirWeb®
Hémocultures Urines DiversExpectorationsCoprocultures
SIL
+Laboratoire de Microbiologie
Personnel
3 biologistes
22 techniciens – 1 cadre
Identifications avant
Galeries Api®
Utilisation de milieuxchromogènes
Tests immunologiques
Envoi à l’extérieur pourséquençage ARN 16S
Antibiogrammes sur boites
Utilisation AutoScan
+Passage de contrôles qualités
Identification d’une souche d’Enterobacter gergoviae (99,9%superspectre)
Identification également donné à 99% par Api20E
Identication d’une souche d’Acinetobacter ursingii (99,9% Identication d’une souche d’Acinetobacter ursingii (99,9%superspectre)
Identification galerie Api NE : Acinetobacter lwoffi/junii
Identification d’une souche de Staphylococcus caprae (94,6%superspectre, utilisation d’acide formique)
Galerie Api Staph : 1. Staphylococcus capitis, 2. Staphylococcuscaprae (faible pourcentage)
+Contrôles qualités annéesantérieures
Référence Maldi-Tof Commentaires
Eikennella corodens Eikennella corodens 99,9% SSp
Bacillus cereus Bacilluscereus/mycoides/thuringie
99,9% SSpcereus/mycoides/thuringiensis/anthracisBacillus cereus
86,1% SSp
Escherichia hermannii Escherichia hermannii 90,0% SSp
Escherichia vulneris Escherichia vulneris 99,9% SSp
Pseudomonas fluorecens Pseudomonas fluorecens 99,9% SSp
Acinetobacter junii Acinetobacter ursingii 84,6% SSp
Acinetobacter baumannii Acinetobacter baumannii 99,9% SSp
Pasteurella mutocida Pasteurella multocida 99,9% SSp
+Contrôles qualités annéesantérieures
Référence Maldi-Tof Commentaires
Streptococcus pyogenes Streptococcus pyogenes 82,9% SSp
Streptococcus sanguis Streptococcus sanguis 70,2% SSp
Staphylococcus hominis Staphylococcus hominis 99,9% SSpStaphylococcus hominis Staphylococcus hominis 99,9% SSp
Enterococcus gallinarum Enterococcus gallinarum 92,0% SSp
Enterococcus faecium Enterococcus faecium 99,99% SSp
Erysipelothrix rhusiopathiae Erysipelothrixrhusiopathiae
99,9% SSp
Oligella urethralis ???? 3 sp
+Contrôles qualités annéesantérieures
Référence Maldi-Tof Commentaires
Candida paraspilosis Candida parapsilosis 99,9% SSp
Candida krusei Issatchenkia orietalis 99,8% SSp
Candida albicans Candida 99,9% SSpCandida albicans Candidaafricana/albicans/dublinensisCandida african/albicansCandida albicansCompare:Candida albicans
99,9% SSp
92,3% SSp88,3% SSp
25 Sp (49-32)%
Candida dublinensis Candidaafricana/albicans/dublinensisCompare :Candida dublinensis
92,5% SSp
SP
+Résultats sur 1000 identifications
Souches de routine
Certaines souches identifiées non passées :
Souches identifiées sur milieux chromogènes
Escherichia coli, Proteus mirablis (ECBU) Escherichia coli, Proteus mirablis (ECBU)
Staplylococcus aureus (test d’agglutination)
Candida albicans (milieux chromogènes)
Streptococcus pneumoniae
Haemophilus influenzae
Pseudomonas aeruginosa
+Répartitions des microorganismesidentifiés
134
20
52
6
Entérobactéries
Autres BactériesGram-Staphylocoques
571
93
126
Staphylocoques
Autres Gram+
Bactéries anaérobies
Champignons
Non identifiés
+Entérobactéries n = 569
E. coli46%K. oxytoca
3%
S. marcencens3%
M. morganii3%
C. koseri2%
C. freundii1%
autres3%
K. pneumoniae16%
E. cloacae14%
P. mirabilis5%
E. aerogenes4%
3%
+Autres bacilles Gram – (n = 91)
Bactéries Nbr Bactéries Nbr
Pseudomonas aeruginosa 38 Pseudomonas stutzeri 1
Acinetobacter baumanii 22 Neisseria subflava 1
Stenotrophomonas maltophilia 13 Neisseria meningitidis 1Stenotrophomonas maltophilia 13 Neisseria meningitidis 1
Haemophilus influenzae 6 Haemophilus parahaemoliticus 1
Achromobacter xylosidens 4 Campylobacter jejunii 1
Rothia mucilanogenes 1 Bulkhoderia cenocepacia 1
+Staphylocoques (n = 126)
Bactéries nombre
Staphylococcus epidermidis 70
Staphylococcus aureus 15
Staphylococcus hominis 12
Staphylococcus capitis 12
Staphylococcus intermedius 5
Staphylococcus simulans 3
Staphylococcus lugdunensis 3
Staphylococcus haemolyticus 3
Staphylococcus warnerii 1
Staphylococcus sciuri 1
Staphylococcus saprophyticus 1
+Autres Gram+ (n = 134)
Bactéries nombre
Enterococcus faecalis 104
Streptococcus agalactiae 7
Streptococcus anginosus 6
Enterococcus facium 4
Streptococcus bovis 3
Streptococcus sanguis 2
Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis 1
Streptococcus dysgalactiae dysgalactiae 3
Corynebacterium pseudodiphtericum 2
Rothia mucilaginosa 1
Micrococcus luttae 1
+Bactéries anaérobies (n = 20)
Bactéries nombre
Bacteroides fragilis 9
Clostridium difficile 6
Clostridium bifermentens 2
Fusobacterium necrophorum 1
Bacteroides thetaiotaomicron 1
Bacteroides distiasonis 1
+Champignons (n = 52)
Bactéries nombre
Candida glabrata 25
Candida albicans 20
Candida tropicalis 2
Candida kefyr (Kluyveromyces marxianus) 2
Candida krusei (Issatchenkia orientalis) 2
Candida lusitaniae 1
+Microorganismes non identifiés
Prélèvement IdentificationMaldi-Tof
Identification sortie
Hémoculture Acinetobacter sp Acinetobacter sp
Urines Acinetobacter sp Acinetobacter sp
Hémoculture Acinetobacter sp Streptococcus spHémoculture Acinetobacter sp Streptococcus sp
Plaie Bacillus Bacillus sp
Crachats - BK IdentificationMatches < 22%
Contaminant
Hémoculture Ochrobacter En cours
+Simplicité de l’identification,multiplication des identifications
Faible coût en réactif
Identification en répliquât
Identification en dupliquât
Hémocultures : Hémocultures :
identification de tous les flacons
Identification des souillures (arguments en faveur)
Gestion des problèmes de contamination
+Conclusions (1)
Prise en main
Importance de la qualité du dépôts (maitrise et répétabilité)
Rôle des biologistes et techniciens préservé
Garder techniques simples d’identification
Expertise de l’antibiogramme, de interprétation clinique
Résultats d’identification très satisfaisants
Quelques lacunes qui se combleront
Streptocoques, corynebactéries…
Système très ouvert, possible intégration de « spectre maison »après confirmation par S16
Echange possible avec autres laboratoires
+Conclusion (2)
Parfaite intégration dans le laboratoire, avec l’informatique
Validation avec accès au dossier du patient (antériorités…)
Gain de temps à la validation des antibiogrammes, à l’envoi surl’informatique du laboratoire
Perspectives, développement
Identification sur flacons d’hémoculture
Utilisation du module de comparaison des spectres pour étudierles souches dans le cadre de surveillance des BMR
Possibilité de reconnaître en fonction du spectre, de la présenceou non de certains pics ÷
Des résistances ou profils de résistance particuliers (SARM)
La production de toxines