3èmes journées de formation du réseau des centres commun de microscopie
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3èmes Journées de formation du Réseau des Centres Commun de Microscopie Université de Rouen- Maison de l’université 3 et 4 Juin 2004. Utilisation du Cryo-SEM pour l’étude du fonctionnement hydraulique des plantes Hervé Cochard, Christian Bodet UMR-PIAF, INRA, Clermont-Ferrand. - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
Utilisation du Cryo-SEM pour l’étude du fonctionnement hydraulique des plantes
Hervé Cochard, Christian Bodet UMR-PIAF, INRA, Clermont-Ferrand
3èmes Journées de formation du Réseau des Centres Commun de Microscopie
Université de Rouen- Maison de l’université3 et 4 Juin 2004
Le Cryo-SEM en qqes mots:• SEM classique (Philips SEM 505)• Étage cryogénique T < -80°C (Hexland CT 100)
– Observation – Métallisation
• En dessous du point de sublimation de la glace• Observation d’échantillons hydratés mais congelés
• Hypothèse: le mode préparatoire des échantillons ne perturbe pas leur observation (méthode directe)
Utilisation du Cryo-SEM dans le domaine végétal
Photos: C BodetÉpiderme d’une feuille
Photos: C BodetCoupe d’une feuille (cryo-fracture)
Utilisation du Cryo-SEM dans le domaine végétal
Utilisation du Cryo-SEM dans le domaine végétal
Anatomie d’une aiguille de Pin
Circulation des sèves dans l’arbre
CO2
Sève élaboréeRiche en sucresDescendantePhloème
H2O
Sève bruteEauAscendanteXylème
Croissancede l’arbre
Deux phénomènes à mettre en évidence
Présence de bulles d’air dans les vaisseaux
conducteurs (embolie) NormalCollapsé
Déformation de la paroi des vaisseaux (collapse)
From: Piquemal et al 1998
Observation du xylème au SEMÉchantillons prélevés et déshydratés
Observation du xylème au cryo-SEMRisques de sublimation de la glace
(cryo-décapage ou métallisation)
Betula platyphylla, Utsumi et al 1998
Observation du xylème au cryo-SEMÉchantillons prélevés puis congelés
LN2
Cryo-fracture
Cryo-microtome
La nombre de vaisseaux embolisés dépend du point d’observation
No
mb
re d
e v
ais
seau
x e
mb
olis
és
Distance à la coupemillimètres
Pétiole de Noyer
Tyree, Cochard, Cruiziat PCE 2003.
Circulation de la sève bruteÉvaporation
Sol : Eau diluée
Xylème: Tubes Parois rigides
Feuilles: Surface poreuse
Feuilles :Pompe
aspirante
Un système vasculaire sous tension (dépression)
Sol : Eau diluée
• La sève brute est aspirée par dépression
• La « pompe aspirante » se désamorce
• L’appareil vasculaire s’embolise
Photo: C Bodet, INRA-PIAF
L’appareil vasculaire est constitué de conduits de dimensions
variables mais finies
vaisseau
Terminaison de vaisseau
La sève se retire sur toute la longueur des vaisseaux
Perturbation du contenu des vaisseaux lors du prélèvement des échantillons
Cochard et al Plant Physiol 2000
Cryo-SEM
LN2
Observation du xylème au cryo-SEMÉchantillons congelés sur l’arbre puis prélevés
Observation du xylème au cryo-SEMÉchantillons congelés sur l’arbre puis prélevés
-0.7 MPa
10 µ
m
>-0.03 MPa!
-0.7 MPa
Le paradoxe du Cryo-SEM
Les mesures de tension de sève sont-elles erronées ?
Les observations au cryo-SEM sont-elles erronées ?
Cryo-SEM
LN2
Importance du mode préparatoire des échantillons
Water
Échantillons recoupés sous eau puis congelés
Solar Time
0 6 12 18 24 30 36 42 48
0
5
10
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20
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30
Solar Time
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Per
cent
em
bolis
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cent
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duct
ance
Water
LN2
+
Variations journalières d’embolie dans un pétiole de noyer
Vitesse de congélation des échantillons par LN2
LN2
T,°C
Artéfact de congélation
Collapsus des Collapsus des paroisparois
Étude des phénomènes de collapse
LN2Cochard et al, Plant Physiol 2004
Mise en évidence du phénomène de collapse par cryo-SEM dans des
aiguilles de Pinus cembra
Aiguille bien hydratée
Pinus cembra -4 MPa
Aiguille fortement déshydratée
Pinus cembra -4.6 MPa
Aiguille très fortement déshydratée
Eau 2 min
Importance du mode préparatoire des échantillons
LN2
LN2
Conclusions
• Pour le xylème: la fiabilité des observations est très dépendante de la préparation des échantillons.
• Possibilités d’artéfacts et d’interprétations erronées des observations.– Embolie : recouper sous eau– Collapse : ne pas recouper sous eau !
• Hypothèse: le mode préparatoire des échantillons ne perturbe pas leur observation ?