SINCE 1994

3M™ Molecular Detection System (분자생물학적 방법을 이용한 신속 검출법)

-식육 가공 및 알가공 공정 중 살모넬라 검사를 위한 신속검사법-

서울시 서초구 서초동 1355-8 중앙빌딩 1602호 TEL.02-3473-5421 FAX.02-3474-7601

+

Isothermal DNA Amplification (등온의 DNA 증폭과정)

Bioluminescence Detection (ATP 검출 원리)

특정 병원성 미생물의 DNA 증폭 과정에 의한 신속, 실시간 검출가능 장비

3MTM MDS(Molecular Detection System)란?

=

신속,실시간 확인

3MTM MDS(Molecular Detection System)원리

LAMP 시험법 장점

1) 높은 DNA 증폭효율 →(1시간 증폭 시 기존PCR의 10³배 더 많음) 2) 검출한계(기존PCR의 10~100배 더 낮음) 3) 경제적인 장비사용

PCR VS LAMP법의 검출한계

① Salmonella 증균배지상에서의 LAMP법의 검출한계

● Comparison of the limits of detection of PCR and LAMP methods in 2 types of Salmonella cultures

5 - BPW배지에서 접종 후 0시간에서의 Salmonella 증균액 상에서의 LAMP와 PCR의 검출한계는 3.2x 10³CFU/mL 및 3.2x10 CFU/mL으로 LAMP법이 100배 더 민감함

② 검체시료 증균액에서의 LAMP 및 PCR의 검출한계

-12시간 증균 배양 후 LAMP의 검출한계는 3.2×10 CFU/mL이었고, PCR의 검출한계는 3.2×10¹ CFU/mL으로 LAMP가 10배 더 민감한 것으로 관찰되었다

0

-츨처: 등온유전자증폭기법을 이용한 Salmonella spp. 신속 고감도 검출 기법 연구 논문발췌-

①

②

●

Salmonella

Inclusivity 100%

Exclusivity 100%

Sensitivity and specificity of 2 different methods for detecting Salmonella spp. samples enriched in BPW for 6 h

●

- 초기의 오리도체시료에 이미 생장이 정지되었거나 혹은 표준배양법으로 생장이 복구되지 못할 정도의 손상을 받은 균체가 LAMP의 검출한계 이상 존재하여 양성으로 판단된 것으로 생각된다. BPW에 6시간 배양한 1차 증균액에 적용한 결과, 96%의 민감도 및 84%의 특이성를 나타내고 있음,Salmonella 신속 스크리닝 기법으로서 효과적으로 활용될 수 있음을 알 수 있음 -츨처: 등온유전자증폭기법을 이용한 Salmonella spp.

신속 고감도 검출 기법 연구 논문발췌-

3MTM MDS(LAMP법) Sensitivity & Specificity

Sensitivity & Specificity

전통배양방법(분말배지)

5~6일소요(114~144시간) 신속검출방법(3M MDS) 2일소요(20~26시간)

3MTM MDS 실험방법

1차 증균배양(Buffered Peptone Water)

36±1℃, 18~24hr 배양

36±1℃, 20~24hr 배양 42±0.5℃, 20~24hr 배양

분리배양 (XLD agar)

분리배양 (BG Sulfa agar)

36±1℃, 20~24hr 배양 36±1℃, 20~24hr 배양

확인시험: 의심집락 5colony 이상 (TSI agar)

37±1℃, 20~24hr 배양

순수분리(Nutrient agar)

35~37℃, 18~24hr 배양

2차 증균배양(TT broth)

2차 증균배양 (RV broth)

그람염색: 음성/간균 확인 – 생화학테스트(API Kit 외)

살모넬라 양성유무 최종판정

36±2℃, 18~24hr 배양

3MTM MDS vs PCR

MDS

vs

PCR

원리와특징 등온증폭과정(LAMP법) Bst DNA Polymerase Cyclling법 Taq DNA Polymerase

준비과정

1. 전배양 샘플 2. 3M Molecuar Detection Assay

3. 3M MDS

4. 노트북+Software

Simple

1.전배양 샘플 2.시약 3.원심분리기 4.PCR장비 5.컴퓨터

Complex

시간 총 20~26시간 소요 시료 전처리 시간 절약 및 노동력감소

총 28~32시간 소요

원심분리기 를 이용한 시료 전처리 과정이 반복적이며 복잡하고, Lysis후 변성,접합,신장과정을 모두 다른 온도에서 시행해야 하므로 소요시간이 길게 걸립니다.

감지방법 생체 발광(Bioluminescence dete

ction) 형광물질로 인한 간섭이 없음

Fluorescence(형광) 저해물질로 인한 간섭을 받음

정확도 알고리즘에 의한 양성 음성을 구별하므로 최소의 역과의 관계가 없이 정확한 결론 도출가능

민감도가 높다 저해물질의 간섭영향이 적다

양성 음성을 판단하는 오차가 생길 수 있다

축산물관리법 현황

① 식육가공 관리법현황

식품유형 일반세균수 대장균 대장균군 황색 포도상구균

살모넬라

11. 식육 또는 알가공품

가열 또는 살균제품

1g당

10이하 음성

알가공품 (살균제품)

1g당 10,000이하

식육가공품 음성

*3M MDS 살모넬라 검출한계

기존방법 개정안

② 알가공 관리법현황

라. 식품의약품안전처장이 필요하다고 인정하는 경우에는 식중독균 증균배양 후 PCR 등 분자생물학적 시험법을 활용한 스크리닝 시험을 통하여 불검출로 판정할 수 있다. 다만, 유전자가 확인된 경우 분리배양 후 생화학적 검사를 통하여 해당 식중독균으로 동정되면 검출로 판정한다. 2017년 12월 식품의 기준 및 규격 입안예고 발췌

3MTM MDS 국내사용기준

▶공전기재사항 및 식약처 질의 답변

3M MDS 사용관련 식약처 질의 문답

3MTM MDS 국제공인인증현황

3MTM MDS 국제공인현황(ISO)

3MTM MDS 사용현황

1. 국내 업체 사용현황

KCFresh

3MTM Molecular Detection System

3MTM Molecular Detection Assays

Summury

1. 정확성

-LAMP (Loop-mediated isothermal amplication) 기술을 적용, 높은 민감도와 검출한계가 높음.(PCR대비 10~100배 /Real –time PCR과 동일)

2. 편의성,신속성

-Bst Polymerase 적용 Matrix 간섭을 덜받으며, 반복적인 실험과정을 줄여 빠른 의사결정 -DNA Replication이 10~100배 빠른 신속성

3. 경제성

-일반 분말배지법 대비 유사 소모비용(Negative시) -API kit 사용시 비용 절감효과

4. 고시적용 및 인증관련

-AOAC 및 ISO인증확보 -유사기업 사용 현황 -국내고시법 적용가능