4- biologie molÉculaire 4.2- outils et techniques de

Cours biochimie BTS_ABM1 4.2.3- ADN recombinant – / 8 –

4- BIOLOGIE MOLÉCULAIRE

4.2- OUTILS ET TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE

4.2.3- TECHNOLOGIES DE L’ADN RECOMBINANT

Les technologies de l’ADN recombinant regroupent les techniques relatives au clonage. L’ADN recombinant correspond à une molécule d’ADN créée en laboratoire composée de séquences nucléotidiques provenant de plusieurs origines créant ainsi des séquences qui n’existent pas dans les organismes vivants. Le génie génétique correspond à l’ensemble des outils et des techniques de biologie moléculaire permettant l’étude de la modification des gènes : isolement, clonage, séquençage, découpage,… dans un but de recherche fondamentale ou appliquée.

Le clonage est une technique de reproduction permettant la multiplication in vitro d’un organisme, d’une cellule souche ou d’un gène en un grand nombre d’exemplaires identiques. Le clonage consiste à insérer un fragment d’ADN étranger ou insert dans un vecteur afin d’obtenir un vecteur recombinant puis à introduire le vecteur recombinant dans une cellule hôte et à amplifier le vecteur recombinant par multiplication de la cellule recombinante (clone recombinant). On distingue : le clonage reproductif, le clonage thérapeutique et le clonage génétique (objet du cours).

1. Obtention d’un gène d’intérêt • À partir d’ADN génomique (difficile de séparer le fragment d’intérêt) • Par amplification d’un fragment d’ADN d’intérêt par PCR (moins de fragments, plus facile à isoler) • À partir d’ADN complémentaire (ADNc) obtenu par transcription inverse (réverse) d’ARNm

Exercice d’application : Calculer la probabilité de trouver un site Sau3A �GATC dans une séquence d’ADN composée de 25 % de A, 25 % de T, 25 % de C et 25 % de G ? 14 ×

14 ×

14 ×

14 =

1256

ORGANISME DONNEUR

VECTEUR

ORGANISME RECOMBINANT

Obtention du gène d’intérêt

Introduction et expression


Taille du site reconnu Taille moyenne des fragments (pb)

4 256 5 1024 6 4 096 7 16 384 8 65 536

Figure 1 : taille des fragments générés en fonction de la taille du site d’une enzyme de restriction

2. Insertion de l’ADN dans un vecteur 2.1. Définition On appelle vecteur, une petite molécule d’ADN qui possède son propre système de réplication et qui sert de véhicule pour le clonage génique. On distingue :

• vecteur de clonage qui permet d’isoler physiquement un fragment d’ADN et à amplifier en un grand nombre de copies. • vecteur d’expression qui permet de transférer un gène et de le faire exprimer dans une cellule hôte qui n’est pas sa cellule d’origine.

2.2. Caractéristiques des vecteurs • Molécule d’ADN de petite taille (pour permettre l’insertion d’un grand fragment d’ADN étranger et obtenir un vecteur recombinant stable) • Capable de se répliquer de manière autonome grâce à l’origine de réplication (ori) • Capable d’exprimer le gène d’intérêt grâce à la présence d’un promoteur • Comportant :

² un site de clonage multiple (MCS : Multiple Clonage Site ou polylinker) = ensemble des différents sites de restriction uniques

² un gène de sélection qui permet de sélectionner les organismes ayant intégré le vecteur

² un gène rapporteur qui permet de sélectionner les organismes ayant intégré le vecteur recombinant

2.3. Différents vecteurs de clonage

2.3.1. Les plasmides Un plasmide est une molécule d’ADN bicaténaire circulaire de petite taille1 (2 à 5 kb) possédant son propre système de réplication (séquence ori). Ils peuvent être présents en plusieurs centaines de copies au sein d’une même cellule. Ils possèdent des gènes de résistance aux antibiotiques, codant des toxines ou des antibiotiques, un site de clonage multiple. Une carte de restriction de plasmide correspond à la cartographie de l’emplacement des gènes et des sites de restriction dans la séquence plasmidique. La carte de restriction est obtenue par digestion par des enzymes de restriction isolées ou combinées. Les produits de digestion enzymatique sont déposés sur un gel d’agarose puis mis à migrer et révélés. Par comparaison des tailles des fragments obtenus, la carte de restriction est déduite.

1 Remarque : le chromosome bactérien d’E. coli comprend 4 700 kb


Figure 2 : carte de restriction du plasmide pUC19

Exercice d’application : élaboration d’une carte de restriction

Le plasmide pBM1 est digéré par les enzymes de restriction BamHI et EcoRI. Après migration et séparation des fragments d’ADN sur gel d’agarose puis révélation au bromure d’éthidium, on obtient les profils de restriction ci-contre. Construire la carte de restriction du plasmide recombinant pBM1.


2.3.2. Les (bactério)phages Les vecteurs phagiques présentent 2 avantages essentiels par rapport aux vecteurs plasmidiques :

• la taille de l’insert ou gène d’intérêt peut être plus grande (12 à 22 kb) • l’infestation (pénétration de l’ADN) des cellules bactériennes est spontanée.

L’obtention d’un phage recombinant nécessite plusieurs étapes : • destruction des protéines de capside et extraction de l’ADN phagique • encapsidation in vitro ou « packaging » :reconstitution in vitro de la dernière étape du cycle lytique avec de l’ADN recombinant. Par auto-assemblage, on obtient des phages recombinants.

2.3.3. Les cosmides Les cosmides sont des vecteurs totalement artificiels construits à partir d’un plasmide auquel on a ajouté les séquences cos du phage λ. Les séquences cos sont des séquences répétées, simple brin de 12 paires de bases cohésives qui permettent une circularisation de l’ADN. Cet ADN est ensuite encapsidé comme pour les vecteurs phagiques.

2.3.4. Les BAC Un BAC (Bacterial Artificial Chromosome) est un vecteur permettant de cloner de grands fragments d'ADN (100 à 300 kb) dans une cellule d’E. coli.

2.3.5. Les YACs Un YAC (Yeast Artificial Chromosome) est un vecteur permettant de cloner de grands fragments d’ADN (100 à 2 000 kb) dans une cellule eucaryote de type levure (yeast).

Type de vecteur Taille de l’ADN cloné (en kb) Aspect des clones

Plasmide 8 à 9 Colonies bactériennes

Phage lambda (l) 12 à 22 Plages de lyse

Cosmide 45 Plages de lyse

BAC (bacterial artificial chromosome) 100 à 300 Colonies bactériennes

YAC (yeast artificial chromosome) 100 à 2 000 Colonies de levures

Figure 3 : comparaison de la taille des fragments pouvant être insérés dans les différents types de vecteurs

Figure 4 : insertion d’un gène d’intérêt dans un vecteur par action d’une enzyme de restriction et d’une ADN ligase

� Digestion par des enzymes de restriction � Insertion du fragment à cloner dans le vecteur ouvert � Ligature par ADN ligase et obtention d’un vecteur recombiné


3. Obtention d’une cellule recombinante et multiplication • Perméabilisation de la paroi bactérienne ou de la membrane cellulaire :

² choc thermique (bref passage à 42°C) ² électroporation (bref et intense champ électrique). ² CaCl2

Figure 5 : perméabilisation de la membrane plasmique

http://ol.saulnier.free.fr/espace_travail/clonage.html

• Contact avec les vecteurs recombinés • Pénétration dans les cellules hôtes : transformation de cellule procaryote ou transfection de cellule eucaryote. • Mise en culture et sélection sur milieu + antibiotique

1- Préparation de l’ADN à cloner et du vecteur 2- Insertion de l’ADN à cloner dans le vecteur 3- Introduction du vecteur recombiné dans la cellule hôte 4- Mise en culture et sélection des cellules possédant le vecteur recombiné

Figure 6 : obtention et sélection d’un vecteur recombinant D’après « Travaux dirigés de biochimie, biologie moléculaire et bioinformatique ». Coutouly, Klein, Barbieri, Kriat


4. Sélection des cellules recombinantes 4.1. Exemple de sélection par le système blanc-bleu

Le système blanc/bleu est une technique permettant de repérer des clones d’intérêt parmi une population de clones différents. Ce système s’appuie sur les propriétés de la b-galactosidase de l’opéron lactose. L’opéron lactose est une unité de transcription constitué de 3 gènes codants chacun pour une enzyme différente dont la ß-galactosidase codée par le gène lacZ.

Figure 7 : opéron lactose et production des deux sous-unités de la b-galactosidase

La ß-galactosidase est une enzyme codée par le gène lacZ et est constituée de deux sous-unités : alpha et omega. Chaque sous-unité est codée par un fragment différent (lacZ-alpha et lacZ-omega) et chacune d’entre elles est nécessaire afin d’obtenir une ß-galactosidase active et fonctionnelle. Afin d’effectuer un repérage via le système blanc/bleu, il faut que la cellule hôte utilisée pour le clonage soit de génotype lacZΔM15 c’est-à-dire avec un fragment alpha du gène lacZ délété à son extrémité N-terminale par génie génétique. La souche synthétise une ß-galactosidase non fonctionnelle. On transforme ensuite notre souche hôte par un plasmide contenant le fragment alpha du gène lacZ. Par réassociation spatiale avec le peptide alpha codé par le plasmide, les deux fragments vont former une ß-galactosidase fonctionnelle, on parle d’alpha complémentation. En présence d’IsoPropyl ß-D-1-ThioGalactopyranoside (IPTG = inducteur) et de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside (X-Gal = substrat chromogène), les bactéries transformées non recombinées (plasmide natif) possèdent un gène lacZ-alpha fonctionnel. Par alpha-complémentation, la bactérie produit une ß-galactosidase fonctionnelle qui va hydrolyser le X-Gal en galactose + X. X est un chromophore insoluble qui va conférer une couleur bleue aux colonies non recombinées. Les bactéries transformées recombinées (plasmide avec insert) possèdent un gène lacZ-alpha inactivé par l’insertion du fragment d’intérêt dans le plasmide. Le fragment peptidique alpha n’est pas synthétisé ; la bactérie ne produit donc pas de ß-galactos idase fonctionnelle. Le X-Gal n’est pas hydrolysé, les colonies transformées recombinées sont donc blanches.

Figure 8 : système blanc-bleu


4.2. Exemple de sélection par 2 gènes de résistance aux antibiotiques Le plasmide pBR322 est un vecteur de clonage ; il a été construit (Bolivar et al., 1977) de toutes pièces en empruntant aux plasmides naturels certains de leurs éléments.

Figure 9 : carte de restriction du plasmide pBR322

http://nc2.neb.com/NEBcutter2/ Ce plasmide contient : - bla : gène de résistance à l’ampicilline, gène de sélection, indicateur de la présence du vecteur dans la cellule hôte. - tet : gène de résistance à la tétracycline, gène rapporteur de la présence du vecteur recombiné dans la cellule hôte. - ori : origine de réplication ; elle rend le plasmide capable de réplication autonome dans la cellule hôte. - plusieurs sites de restriction au niveau desquels peuvent être insérés les fragments d’ADN (digestion par différentes enzymes de restriction). La transformation est un transfert de matériel génétique, qui est fixé et absorbé par des bactéries réceptrices, dites en état de compétence. Lors de la transformation de bactéries réceptrices sensibles à l’ampicilline et à la tétracycline par pBR322, on va obtenir 3 types de bactéries :

- celles qui n’ont pas été transformées (50 à 90 %) qui restent sensibles à l’ampicilline ; - celles qui ont intégré un plasmide natif qui sont devenues résistantes à l’ampicilline et à la

tétracycline ; - celles qui ont reçu un plasmide recombiné qui sont devenues résistantes à l’ampicilline mais sont

restées sensibles à la tétracycline.


Cellule hôte Introduction du vecteur Résistance Croissance sur

ampicilline

Croissance sur ampicilline et tétracycline

bact [AmpS] aucun - - -

bact. [AmpS] pBR natif + + +

bact. [AmpS] pBR recombiné +/- + -

Figure 10 : distinction des différents types de bactéries En deux étapes, on va pouvoir repérer les bactéries transformées par le vecteur recombiné. Toutes les bactéries sont ensemencées sur un milieu contenant de l’ampicilline. On réalise une réplique sur milieu additionné d’ampicilline et sur un milieu additionné de tétracycline.

Figure 11 : sélection des bactéries transformées et repérage des bactéries portant un plasmide recombiné

http://www.edu.upmc.fr/sdv/masselot_05001/genes_et_genomes/vecteurs.html

5. Notion de banques d’ADN Une banque d’ADN (ou bibliothèque) est une collection de clones recombinants renfermant chacun un ADN étranger (insert) particulier. On distingue les banques d’ADN génomique et les banques d’ADNc :

• Les banques d’ADN génomique sont constitués de clones recombinants obtenus à partir de la totalité de l’ADN chromosomique d’un organisme. • Les banques d’ADNc sont constitués de clones recombinants obtenus à partir d’ADNc provenant de la reverse transcription des ARNm d’un même type cellulaire.

Par exemple, pour cloner le gène codant l’hormone de croissance humaine (GH Growth Hormone), 2 possibilités :

• clonage de l’ADN du génome de n’importe quelle cellule de l’individu. L’ADN cloné correspond au gène de la GH et contiendra introns + exons. • clonage d’ADNc obtenu à partir d’ARNm récoltés dans des cellules productrices de GH c’est-à-dire à partir de cellules adéno-hypophysaires. L’ADN cloné correspondant alors aux parties codantes c’est-à-dire aux exons.

Sources : http://www.chups.jussieu.fr/polys/biochimie/BGbioch/POLY.Chp.11.html http://step.ipgp.fr/images/8/8c/Cours_biomineraux4.pdf http://www.edu.upmc.fr/sdv/masselot_05001/introduction/introduction.html http://pageperso.lif.univ-mrs.fr/~michel.vancaneghem/optionBio1/documents/clonage.pdf

Colonie de bactéries transformées par pBR322 recombinant

4- biologie molÉculaire 4.2- outils et techniques de

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