4-(n-methylhydrazino)-7-nitro-2,1,3-benzooxadiazole (mnbdh): a novel fluorogenic peroxidase...

3
COMMUNICATIONS Angew. Chem. Int. Ed. 2000, 39, No. 8 WILEY-VCH Verlag GmbH, D-69451 Weinheim, 2000 0570-0833/00/3908-1453 $ 17.50+.50/0 1453 4-(N-Methylhydrazino)-7-nitro-2,1,3- benzooxadiazole (MNBDH): A Novel Fluorogenic Peroxidase Substrate** Jörg Meyer, Andrea Büldt, Martin Vogel, and Uwe Karst* Enzymes are characterized by a range of attractive features for applications in analytical chemistry. Low analyte detection limits, even in complex matrices, are realized by their high catalytic activity and substrate selectivity. In this context, peroxidases are of special interest because of the possibility of coupling H 2 O 2 detection with reactions yielding H 2 O 2 . In addition to the type and activity of the peroxidase, the lower detection limit of the enzymatic reaction is influenced by the chromogenic or fluorogenic substrate used, as the properties of the detected reaction product play a crucial role. A variety of organic compounds are used as chromogenic substrates, for example, aromatic amines like o-phenylenediamine (OPD), [1] 3,3'-5,5'-tetramethylbenzidine (TMB), [2] and also 2,2'-azino- bis(3-ethylbenzothiazolin)-6-sulfonate as the diammonium salt (ABTS) [3] . In case of the more sensitive fluorogenic methods the p-hydroxyphenylcarboxylic acids, especially p- hydroxyphenylacetic acid (pHPA), have found widespread application. [4] The main disadvantage of the p-hydroxyphenylcarboxylic acids and other fluorogenic substrates is the difference between the optimum pH for the enzymatic reaction, which lies in a moderately acidic range, [5] and for fluorescence detection of the products, where alkaline media are re- quired. [4] A second drawback is the short wavelengths for the excitation maxima of the fluorophores. Furthermore, oxida- tion of the known fluorogenic substrates yields, in most cases, a mixture of reaction products rather than one well defined fluorophore [6] and, in some cases, not even the exact structure of the fluorescent compounds obtained could be elucidated. Hydrazine reagents are the most popular group of deriva- tising reagents for carbonyl compounds. [7] In this work, we describe the use of a hydrazine reagent as a fluorogenic peroxidase substrate. Surprisingly, the nonfluorescent 4-(N- methylhydrazino)-7-nitro-2,1,3-benzooxadiazole (MNBDH), which was recently introduced as reagent for the determi- nation of carbonyl groups [8] and nitrite ions, [9] is oxidized by H 2 O 2 in presence of peroxidase (POD) to the intensively fluorescing 4-(N-methylamino)-7-nitro-2,1,3-benzooxa- diazole (MNBDA) [Eq. (1)]. The identity of the reaction product was verified by NMR, UV/Vis, and fluorescence spectroscopy, mass spectrometry, and HPLC. The enzymatic reaction and fluorescence detection are carried out in a mildly [1] a) R. M. J. Palmer, D. S. Ashton, S. Moncada, Nature 1988, 333, 664 ± 666; b)P. W. Shaul, E. J. Smart, L. J. Robinson, Z. German, I. S. Yuhanna, Y. Ying,R. G. W. Anderson, T. Michel, J. Biol. Chem. 1996, 271, 6518 ± 6522. [2] a) E. G. Shesely, N. Maeda, H. S. Kim, K. M. Desai, J. H. Krege, V. E. Laubach, P. A. Sherman, W. C. Sessa, O. Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93, 13176 ± 13181; b) P. L. Huang, Z. H. Huang, H. Mashimo, K. D. Bloch, M. A. Moskowitz, J. A. Bevan, M. C. Fishman, Nature 1995, 377 , 239 ± 242. [3] a) R. D. Rudic, E. G. Shesely, N. Maeda, O. Smithies, S. S. Segal, W. C. Sessa, J. Clin. Invest. 1998, 101, 731 ± 736; b) T. Murohara, T. Asahara, M. Silver, C. Bauters, H. Masuda, C. Kalka, M. Kearney, D. Chen, D. Chen, J.F. Symes, M.C. Fishman, P. L. Huang, J. M. Isner, J. Clin. Invest. 1998, 101, 2567 ± 2578. [4] a) D. S. Bredt, S. H. Snyder, Annu. Rev. Biochem. 1994, 63, 175 ± 195 ; b) C. Nathan, Q. Xie, J. Biol. Chem. 1994, 269, 13 725 ± 13 728; c) S. Moncada, A. Higgs, New Engl. J. Med. 1993, 329, 2002 ± 2012; d) P. W. Shaul in Advances in Pediatrics (Hrsg.: L. Barnes), Mosby Year Book, Chicago, IL, 1995, S. 367 ± 414. [5] a) J. T.Dunphy, M. E. Linder, Biochim. Biophys. Acta 1998, 245 ± 261; b) M. D. Resh, Biochim. Biophys. Acta 1999, 1 ± 16. [6] a) G. García-Carden Äa, P. Oh, J. Liu, J. E. Schnitzler, W. C. Sessa, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93, 6448 ± 6453; b) P. W. Shaul, E. J. Smart, L. J. Robinson, Z. German, I. S. Yuhanna, Y. Ying, R. G. W. Ander- son, T. Michel, J. Biol. Chem. 1996, 271, 6518 ± 6522; c) R. G. W. Anderson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993, 90, 10 909 ± 10 913 ; d) M. P. Lisanti, P. E. Scherer, Z. Tang, M. Sargiacomo, Trends Cell Biol. 1994, 4, 231±235; e) E. J. Smart, Y. S. Ying, R. G. W. Anderson, J. Cell Biol. 1995, 131, 929 ± 938. [7] a) J. Liu, W. C. Sessa, J. Biol. Chem. 1994, 269, 11 691 ± 11 694; b) J. Liu, G. García-Carden Äa, W. C. Sessa, Biochemistry 1995, 34, 12 333 ± 12 340. [8] L. J. Robinson, T. Michel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995, 92, 11 776 ± 11 780. [9] For a review, see: D. Kadereit, J. Kuhlmann, H. Waldmann, Angew. Chem. , submitted; Angew. Chem. Int. Ed. , submitted. [10] For an isolated attempt, see: M. Joseph, R. Nagaraj, Bioorg. Med. Chem. Lett. 1993, 3, 1025 ± 1028. [11] H. Waldmann, T. Pohl, Angew. Chem. 1996, 108, 1829 ± 1832 ; Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1996, 35, 1720 ± 1723. [12] a) H. Kunz, H. Waldmann, Angew. Chem. 1984, 96, 49±50; Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1984, 23, 71 ± 72; b) A. Cotte Â, B. Bader, J. Kuhlmann, H. Waldmann, Chem. Eur. J. 1999, 5, 922 ± 953. [13] H. Kunz, J. März, Angew. Chem. 1988, 100, 1424 ± 1425 ; Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1988, 27 , 1375 ± 1377. [14] a) J. Lalonde, CHEMTECH 1997 , 27 , 38 ± 45; b) D. Haring, P. Schreier, Curr. Opin. Chem. Biol. 1999, 3, 35 ± 38; c) T. Zelinski, H. Waldmann, Angew. Chem. 1997 , 109, 746 ± 748 ; Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1997 , 36, 722 ± 724. [15] K. Barlos, D. Gatos, J. Kallitsis, G. Papaphotiu, P. Sotiriu, Y. Wenquing, W. Schäfer, Tetrahedron Lett. 1989, 30, 3943 ± 3950. [16] B. Bader, K. Kuhn, D. Owen, H. Waldmann, A. Wittinghofer, J. Kuhlmann, Nature 2000, 403, 223 ± 226. [*] Priv.-Doz. Dr. U. Karst, Dipl.-Chem. J. Meyer, Dipl.-Chem. M. Vogel Anorganisch-chemisches Institut Westfälische Wilhelms-Universität Münster Wilhelm-Klemm-Strasse 8, 48149 Münster (Germany) Fax: ( 49) 251-83-33169 E-mail: [email protected] Dr. A. Büldt BASF AG, Ludwigshafen (Germany) [**] The authors would like to thank the Fonds der Chemischen Industrie (Frankfurt/Main) for financial support.

Upload: joerg-meyer

Post on 06-Jun-2016

212 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

Page 1: 4-(N-Methylhydrazino)-7-nitro-2,1,3-benzooxadiazole (MNBDH): A Novel Fluorogenic Peroxidase Substrate

�������������

������ ���� ��� � � ����� ��� ��� � � ���� �� ����� ����� ������� ���� ���� !""" "�#"�"�$$%""%$�"�����$ & �#��"'��"%" ���$

���������� ������������ ����������������������� �������� � �� ��!�"� �#���$ %� �����&� '"�&� ���((()�� *�+��� ,�-��� ./�-0� *��0�� ����� ��-12� 3��405

�6+��4 ��� 7 ���70���6�- �+ � ����� �8 �00��70�9� 8��0:��48�� �;;��7�0���4 �� ����+0�7�� 7 ���40�+� �2 ����+0� -�0�70�������04� �9�� �� 7��;��< ��0��7�4� ��� �����6�- �+ 0 ��� �� 7�0��+0�7 �70�9�0+ ��- 4:�40��0� 4���70�9�0+� �� 0 �4 7��0�<0�;���<�-�4�4 ��� �8 4;�7��� ��0���40 ��7�:4� �8 0 � ;�44�����0+ �87�:;���� �!=! -�0�70��� 2�0 ���70���4 +���-��� �!=!� ���--�0��� 0� 0 � 0+;� ��- �70�9�0+ �8 0 � ;���<�-�4�� 0 � ��2��-�0�70��� ����0 �8 0 � ��6+��0�7 ���70��� �4 ��8�:��7�- �+ 0 �7 ��������7 �� 8�:�������7 4:�40��0� :4�-� �4 0 � ;��;��0��4�8 0 � -�0�70�- ���70��� ;��-:70 ;��+ � 7�:7��� ����� , 9����0+�8 ������7 7��;�:�-4 ��� :4�- �4 7 ��������7 4:�40��0�4� 8���<��;��� �����0�7 �����4 ��>� ��; ��+����-������ ?=@�A�B�C

$�$�������0�0����0 +����6�-��� ?D*.A�B!C ��- ��4� !�!���6������4?$��0 +����6�0 ��6����A���4:�8���0� �4 0 � -�������:�4��0 ?,.DEAB$C � �� 7�4� �8 0 � ���� 4��4�0�9� 8�:�������7��0 �-4 0 � �� +-��<+; ��+�7����<+��7 �7�-4� �4;�7����+ �� +-��<+; ��+��7�0�7 �7�- ?;�@,A� �9� 8�:�- 2�-�4;���-�;;��7�0����B�C

D � ���� -�4�-9��0��� �8 0 � �� +-��<+; ��+�7����<+��7�7�-4 ��- �0 �� 8�:�������7 4:�40��0�4 �4 0 � -�88����7���02��� 0 � �;0��:� ;� 8�� 0 � ��6+��0�7 ���70���� 2 �7 ���4 �� � ��-���0��+ �7�-�7 ������B�C ��- 8�� 8�:���47��7�-�0�70��� �8 0 � ;��-:704� 2 ��� ��>����� ��-�� ��� ���F:���-�B�C , 4�7��- -��2��7> �4 0 � 4 ��0 2�9�����0 4 8�� 0 ��<7�0�0��� ��<��� �8 0 � 8�:���; ���4� G:�0 ������� �<�-��0��� �8 0 � >��2� 8�:�������7 4:�40��0�4 +���-4� �� ��40 7�4�4�� ��<0:�� �8 ���70��� ;��-:704 ��0 �� 0 �� ��� 2��� -�8���-8�:���; ���B�C ��-� �� 4��� 7�4�4� ��0 �9�� 0 � �<�70 40�:70:���8 0 � 8�:���47��0 7��;�:�-4 ��0����- 7�:�- �� ��:7�-�0�-��+-��6��� ������04 ��� 0 � ��40 ;�;:��� ���:; �8 -���9��

0�4��� ������04 8�� 7�����+� 7��;�:�-4�B#C �� 0 �4 2��>� 2�-�47���� 0 � :4� �8 � +-��6��� ������0 �4 � 8�:�������7;���<�-�4� 4:�40��0�� E:�;��4����+� 0 � ���8�:���47��0 ��?����0 +� +-��6���A�#���0���!���$����6��<�-��6��� ?*�.��A�2 �7 2�4 ��7��0�+ ��0��-:7�- �4 ������0 8�� 0 � -�0�������0��� �8 7�����+� ���:;4B�C ��- ��0��0� ���4�B�C �4 �<�-�6�- �+�!=! �� ;��4��7� �8 ;���<�-�4� ?@=�A 0� 0 � ��0��4�9��+8�:���47��� ��?����0 +������A�#���0���!���$����6��<��-��6��� ?*�.�,A BF� ?�AC� D � �-��0�0+ �8 0 � ���70���;��-:70 2�4 9���8��- �+ �*H� 1 % �4� ��- 8�:���47��7�4;�70��47�;+� ��44 4;�70����0�+� ��- �@�� D � ��6+��0�7���70��� ��- 8�:���47��7� -�0�70��� ��� 7�����- �:0 �� � ���-�+

B�C �A H� *� (� @������ �� E� ,4 0��� E� *��7�-�� ������ �)**� ���� ��� I���J �A @� �� E �:�� � (� E���0� � (� H����4��� K� ������� �� E��: ����� �� ����� H� �� �� ,�-��4��� D� *�7 ��� �� ����� ���� �))+����� ���� I ��!!�

B!C �A � �� E �4��+� �� *��-�� �� E� 3��� 3� *� ��4��� (� �� 3����� � ��:��7 � @� ,� E ������ �� �� E�44�� =� E��0 ��4� ����� ����� ��� ����� �� �))+� ��� �$�#� I �$���J �A @� � �:���� K� �� �:���� ��*�4 ���� 3� �� .��7 � *� ,� *�4>�2�06� (� ,� .�9��� *� �� G�4 ���������� �)),� ���� !$� I !�!�

B$C �A H� �� H:-�7� � �� E �4��+� �� *��-�� =� E��0 ��4� E� E� E����� �� ��E�44�� �� ����� �!�"�� �))*� �#�� #$� I #$�J �A D� *:�� ���� D� ,4� ����*� E��9��� �� .�:0��4� �� *�4:-�� �� 3��>�� *� 3�����+� �� � ��� ��� ��� (� G� E+��4� *� �� G�4 ���� @� � �:���� (� *� �4���� �� ������!�"�� �))*� �#�� !��# I !�#��

B�C �A �� E� .��-0� E� �� E�+-��� ����� $�!� ������� �))�� %�� �#� I ���J�A �� ��0 ��� L� M��� �� ����� ���� �))�� �%�� �$#!� I �$#!�J 7A E�*��7�-�� ,� ����4� ��� ����� �� &� � �))�� ���� !""! I !"�!J -A @� ��E �:� ��� !����" �� �� ������" ?��4��N � .����4A� *�4�+ ���� .��>�� �7���� �� �)),� E� $�# I ����

B�C �A (� D� �:�; +� *� � ��-��� ������� �����'"� ���� �))*� !�� I !��J�A *� �� H�4 � ������� �����'"� ���� �)))� � I ���

B�C �A �� ���7O�����-��P �� @� = � (� �:� (� � E7 ��06���� �� �� E�44�� ���������� ��� � ���� �� �))+� ��� ���� I ���$J �A @� �� E �:�� � (� E���0�� (� H����4��� K� ������� �� E� �: ����� �� ����� H� �� �� ,�-���4��� D� *�7 ��� �� ����� ���� �))+� ���� ���� I ��!!J 7A H� �� ��,�-��4��� ����� ����� ��� � ���� �� �))�� �#� �"�"� I �"��$J-A *� @� �4��0�� @� � E7 ����� K� D���� *� E�����7���� (��� " ��������� �))�� )� !$� I !$�J �A � (� E���0� �� E� ����� H� �� �� ,�-��4����� ���� ����� �)),� ���� �!� I �$��

B#C �A (� �:� �� �� E�44�� �� ����� ���� �))�� �%�� ����� I �����J �A (��:� �� ���7O�����-��P �� �� �� E�44�� �������"��' �)),� �)� �!$$$ I�!$�"�

B�C � (� H����4��� D� *�7 ��� ����� ����� ��� � ���� �� �)),� �����##� I ��#�"�

B�C G�� � ��9��2� 4��N �� 3�-����0� (� 3: ������ �� ���-����� ���������� � 4:���00�-J ������ ���� ��� � � � 4:���00�-�

B�"C G�� �� �4���0�- �00��;0� 4��N *� (�4�; � H� ������Q� ������� &� ����� *���� �))�� �� �"!� I �"!��

B��C �� ���-����� D� @� �� ������ ���� �))+� �#+� ��!� I ��$!J ���������� ��� � � ����� �))+� �,� �#!" I �#!$�

B�!C �A �� 3:�6� �� ���-����� ������ ���� �)*�� �%� �� I �"J ���������� ��� � � ����� �)*�� ��� #� I #!J �A ,� ��00�R� .� .�-��� (�3: ������ �� ���-����� ���� ���� �� �)))� ,� �!! I ��$�

B�$C �� 3:�6� (� *S�6������� ���� �)**� �##� ��!� I ��!�J������ ������� � � ����� �)**� ��� �$#� I �$##�

B��C �A (� ����-���-�&(��- �))�� ��� $� I ��J �A �� ������� @� E7 ����������� .���� ���� ����� �)))� �� $� I $�J 7A D� K����4>�� �� ���-����������� ���� �))�� �#�� #�� I #��J ������ ���� ��� � � ����� �))���%� #!! I #!��

B��C 3� .����4� �� ��0�4� (� 3����04�4� �� @�;�; �0�:� @� E�0���:� �����F:���� �� E7 S8��� (������ ��� *���� �)*)� �#� $��$ I $��"�

B��C .� .�-��� 3� 3: �� �� =2��� �� ���-����� ,� ��00��� �8��� (�3: ������ ������ ����� )#�� !!$ I !!��

B5C @��9����6� ��� 1� 3��40� ��;���� ��� (� *�+��� ��;���� ��� *� ����,�������47 �7 ���47 �4 ��40�0:0��408S��47 � ��� ���4�1��9��4�0S0 */�40����� ����3�����E0��44� �� ����� */�40�� ?������+AG�<N ?���A!����$�$$�������� N :2��>��40T:����:��40���-�

��� ,� ./�-0.,EG,�� :-2��4 �8�� ?������+A

B55C D � �:0 ��4 2�:�- ��>� 0� 0 ��> 0 � G��-4 -�� � ���47 �� ��-:40���?G���>8:�0%*���A 8�� 8����7��� 4:;;��0�

Page 2: 4-(N-Methylhydrazino)-7-nitro-2,1,3-benzooxadiazole (MNBDH): A Novel Fluorogenic Peroxidase Substrate

�������������

���� � ���� �� ����� ����� ������� ���� ���� !""" "�#"�"�$$%""%$�"������ & �#��"'��"%" ������ ���� ��� � � ����� ��� ��� �

�7�-�7 ��-�:� ?;� ���A� �� 7�4� �8 *�.��� 4������ ;��;0��� 8�� 7��9��4��� �8 0 � 4:�40��0� ��- -�0�70��� �8 0 �;��-:70 ��� ��4��9�-� D � �@� �<;������04� 2�0 1 % �4-�0�70��� �8 0 � ���70��� ��<0:��� 4 �2 ���+ ��� �--�0�����;��> �� 0 � 7 ����0�����J �04 ��0��0��� 0��� ��- 1 % �44;�70�:� ��07 0 �0 �8 ;:�� *�.�,� ��0 8�:���47��7�-�0�70��� ?�<7�0�0��� 2�9�����0 N �#" ��� ���44��� 2�9������0 N ��# ��A ���+ 0 � *�.�, ;��> �;;���4 �� 0 �7 ����0������ �� �0 �� ���70��� ;��-:704 7�:�- �� ��4��9�-�+ ��F:�- 7 ����0����; +�G�� 0 � -�0������0��� �8 �!=!� ��4�- �� 0 � ;��7�-:��

-�47����- ����2� 0 � ����0 �8 -�0�70��� ?=�A �4 !�!� �"�����- 0 � ����0 �8 F:��0�8�7�0��� ?=LA �4 #��� �"���� D �4�9��:�4 ��� 4:;����� �+ � 8�70�� �8 0 ��� 7��;���- 0� 0 �4���0����- 8�� ;�@,� �� �--�0���� 0 � 4���70�9�0+ �4 ��;��9�-:4��� *�.�� ��7�:4� �8 0 � ��-�4 �80�- �<7�0�0��� ��-���44��� ��<����D � *�.�� ��0 �- 2�4 9���-�0�- �+ 7��;���4�� 2�0

02� �40����4 �- ;���<�-�4� 4:�40��0�4� ,.DEB�"C ��- ;�@,�B��C

0 ��:� 0 � -�0������0��� �8 ��:7�4� �� 8�:� -�88����0��9�����4� ��:7�4� �4 �<�-�6�- �+ ������ �<+��� �� 0 �;��4��7� �8 ��:7�4� �<�-�4�� ��- 8���4 +-����� ;���<�-��D � ��00�� �4 -�0�70�- �� � ;���<�-�4��7�0��+6�- ���70��� ��4�-�� ��� �8 0 � 4:�40��0�4 ���0����- ���9��D � ����+0�7�� 8��:��4 �8 ����0 �8 0 � 0 ��� ��0 �-4 ���

��40�- �� D���� �� D � ; �0���0��7 ��0 �- �- 0 � 4�����40����0�9� 40��-��- -�9��0��� �:0 �0 �4 �� ��-�� �8 �����0:-� ��444��4�0�9� 0 �� 0 � 8�:�����0��7 0�7 ��F:�4� D � =� ��-=L 2�0 *�.�� ��� ��2�� �+ � 8�70�� �8 0 ��� 7��;���-0� ;�@,� G:�0 �� �-9��0���4 �8 *�.�� ��� 0 � ��-�4 �80�-�<7�0�0��� ��- ���44��� ��<��� ?4�� ��4� 0 � 8�:���47��7�4;�70�:� -�;�70�- �� G��:�� �A ��- �� ��;��9�- 4�����40�����0+ ?G��:�� !A� ,-9��0���4 8�� ;�@, ��� 0 � ��00��2�0�� 4��:����0+ ��- � �� �� ���70��� ��0��D � ��4:�04 �8 0 � -�0������0��� �8 ������:7�4� �� 4�80

-���>4 ��� ;��4��0�- �� D���� !� ,;��0 8��� 0 � -�0� 8�� 7�����- ������8��9���- ��40��0 0�� ��0����- �+ :4��� ;�@,� �����4:�04 7����4;��- 2����D � *�.�� ������0 ��+ 0 ���8��� �� 4��� �4 ;��0�0+;�

�8 � ��2 ��- ;�2��8:� 7��44 �8 ;���<�-�4� 4:�40��0�4 8�� 2 �7

G��:�� �� G�:���47��7� 4;�70�:� �8 *�.�,�

G��:�� !� D������4�- -�9���;���0 8�� 0 � ���70��� �8 *�.�� ��-;�@, 2�0 ;���<�-�4� ��- �!=!�

-���70�- �;0���6�0��� 4 �:�- +���- 4:�40��0�4 2�0 ��7���4�-;�0��0����

�/��������� �������

������7��� 4��;��4 ��9�40���0�- �� 0 �4 40:-+ 2��� �;;�� Q:�7�� ������Q:�7�� 7���� ��- ������8��9���- ��40��0 0��� �F:�- 4��;��4 2��� -��:0�--���70�+ ?�+ � 8�70�� �8 �"""" 8�� -�0�70��� 2�0 ,.DE �� ;�@,� ��- �+ �

D���� �� @�����0��4 8�� 0 � -�0������0��� �8 ��:7�4� :4��� 0 � ;���<�-�4� 4:�40��0�4 ,.DE� *�.��� ��- ;�@,�

*�0 �- ���0 �8 ���0 �8 ,9�����- E�����40%�����40 �����-�0�70��� B�CB�C F:��0�8�7�0��� B�CB�C 40��-��- -�9��0��� BUCB7C 40��-��- -�9��0��� BUCB-C ����� B�C

,.DE�"�B�C �� �"�# !� �"�� !�# ��#%"�$ !� �"�� I !� �"��

,.DE��� �� �"�� $� �"�� !�� #�$%"�� $� �"�� I !� �"��

,.DE#$! �� �"�# !� �"�� ��� ��!%"�� !� �"�� I !� �"��

*�.�� �� �"�� !� �"�# $�� ���%!�# !� �"�# I !� �"��

;�@, !� �"�# �� �"�# ��$ ���%!�# �� �"�# I !� �"��

B�C ���7:��0�- �4 0 � 0��;�� 40��-��- -�9��0��� �8 0 � ����>� B�C ���7:��0�- �4 0 � 0��8��- 40��-��- -�9��0��� �8 0 � ����>� B7C H���0�9� 40��-��- -�9��0��� �8��� 0 4�;���0� -�0������0���4� �9�����- 8�� 0 � ������ ������ B-C H���0�9� 40��-��- -�9��0��� �8 ��� 0 4�;���0� -�0������0���4� 4�����40 ��- �����40 9��:� �80 � ������ ������ B�C E:�47��;04 7����4;��- 0� 0 � 2�9�����0 4 ?�� ������0��4A :4�- 8�� ; �0���0��7 ���4:�����04�

D���� !� H�4:�04 8�� 0 � -�0������0��� �8 ��:7�4� �� 4�80 -���>4� ,�� 9��:�4��8�� 0� 0 � 7��0��0 �8 ������:7�4��B�C

*�0 �- ,;;�� Q:�7� =����� Q:�7� ���� B���C ��40��0 0��B���C B���C B���C BU22��C

,.DE�"� !"��� "�� !���� ��� ����� "�� !"��� ��",.DE��� !"��� "�� !��"� ��� �!��� "�� !"��� ��$,.DE#$! !��"� "�� !��"� ��" �!�#� "�� !"�$� ��"*�.�� !!�"� "�� !���� "�� ���!� !�� !"�"� ��!;�@, !"��� !�� !���� ��� �"�"� ��# ���$� ���

B�C ��9��0���4 ��� 7��7:��0�- �4 0 � 40��-��- -�9��0��� �8 0 � ���� 9��:� �8��� 0 4�;���0� -�0������0���4�

Page 3: 4-(N-Methylhydrazino)-7-nitro-2,1,3-benzooxadiazole (MNBDH): A Novel Fluorogenic Peroxidase Substrate

�������������

������ ���� ��� � � ����� ��� ��� � � ���� �� ����� ����� ������� ���� ���� !""" "�#"�"�$$%""%$�"������ & �#��"'��"%" ����

����-�$��."#����� �� /$��$��� % �� ����������0���$��� /�����&1� 222 � ���� 3��#�&� � 4((3�� <����5 .����0 ���V����� ����� ��47 ��-0�(/���� ����6�� *��8��- 3������ D ���4 .���+�@�9�� .�-����>� ��- ���40 @���6��7 5

?;;A�����Q:��0���� 0 � ���70��� -���7���6�0��� ��02���7�������� ;�����0��4� �4 � ���-������ 7�4� 8�� 0 � 0 ���+ �87 ���7�� ���-����B�C �0 �77:�4 �88�7���0�+ ���+ �� 7��;�:�-4-�88�7:�0 0� 4+�0 �4�6� ��- 2�0 4;�7�8�7 40���7%40�������70����7;����F:�4�0�4� *�>��� :4� �8 7����8�<�- 7+7���:0���4 � ?M��� ?�4�A;���-���4A� �8 ;�������0�- -����4 � ?M��� ?�4�A�;���-�-����4%?4�7�A-�-�7� �-��-����4A� ��- ��4-��6���4%��4-��6���0�0��<�-�4 � ?M��� �=A� 0 � �88�70�9� �� ����7��Q:��0��� �� ����4 ��������0�7�0+ �� $�%$?!A� 7�0���4 �?M��A�B!C �� ��?�A%$?!A� 7�0���4 / ?M��� �=A�B$� �C ��- ����%�?�A� �����4 / ?M��AB�C �9� ���� ��4��9�-� ����� 2�

8�70�� �8 �"""" 8��*�.��A� D � ��40��0 0�� 2�4 2��� �- ��- -�44��9�- ����-�40����- 2�0�� ?"�� � �� �" � 2�0��A ��- -��:0�- �� 0 � 4��� 2�+�

,�� ���4:�����04 2��� 7�����- �:0 :4��� ��7��;��0� ���-��4�

��:7�4� �<�-�4� ?�=�A ���70��� ?�AN �" � �8 � 4��:0��� �8 �=� ?�� ��A�� �7�0�0� �:88�� ?�" �J ;�� ���J "�"��A 2��� �--�- 0� �"" � �8 ���:7�4� 4��:0���� ,80�� ��<��� 0 ���:� �+� 0 � 4��:0��� 2�4 ��7:��0�- 8���� ��� �0 $# ���

�=� ���70��� ?��AN �4 �� �:0 !" � �=� 4��:0��� ��- �" � ��:7�4�4��:0��� 2��� :4�-�

�=� ���70��� ?���AN �4 �� �:0 0 � �=� 4��:0��� 2�4 ;��;���- 2�0 ; �4; �0� �:88�� ?;� ���J "�"��A�

��:7�4� -�0������0��� :4��� @=� ��- ,.DEN �" � �8 � 4��:0���7��0������ @=� ?"�� ��A ��- ,.DE ?��� ��A �� �7�0�0� �:88�� ?�" �J;� ���J "�"��� 2��� ;�;�00�- 0� 0 � ��<0:�� �8 ���70��� �� ,80�� 0 � 4��;�� �- ���� ��<�- 0 ���:� �+ ��- ��7:��0�- 8�� �" ��� �0 ���� 0��;���0:���0 � ��4�����7� �8 0 � 4��;��4 2�4 ���4:��- �0 �"�� ���� ��- #$! ���

��:7�4� -�0������0��� :4��� @=� ��- ;�@,N �" � �8 � 4��:0���7��0������ @=� ?!�� ��A ��- ;�@, ?#�� ��A �� ������:� �:88��?�" �J ;� ���J "�"��� 2��� ;�;�00�- 0� 0 � ��<0:�� �8 ���70��� ��� ,80��0 � 4��;�� �- ���� ��<�- 0 ���:� �+ ��- ��7:��0�- 8�� �� ��� �0 ����0��;���0:��� 0 � 8�:���47��7� �8 0 � 4��;��4 2�4 ���4:��- �0 �<7�0�0�����- ���44��� 2�9�����0 4 �8 $!" ��- �"� ��� ��4;�70�9��+�

��:7�4� -�0������0��� :4��� @=� ��- *�.��N � �� *�.�� 2�4-�44��9�- �� �" � �7�0���0����� =8 0 �4 4��:0���� ��� � ��� �--�- 0� �4��:0��� 7��0������ @=� ?!�� ��A �� ; �4; �0� �:88�� ?�" �J ;� ���J"�"��A� G��� 0 �4 ��<0:��� �" � 2��� ;�;�00�- ��0� 0 � ��<0:�� �8���70��� ���� ,80�� 0 � 4��;�� �- ���� ��<�- 0 ���:� �+ ��- ��7:��0�-8�� �" ��� �0 ���� 0��;���0:��� 0 � 8�:���47��7� �8 0 � 4��;��4 2�4���4:��- �0 �<7�0�0��� ��- ���44��� 2�9�����0 4 �8 �#" ��- ��� �����4;�70�9��+�

H�7��9�-N ��7����� �� ���� BK��$��C

B�C �A �� �����0�� �� .��-��7>� �� ����� ���� ����� ������� �)*)� �#�!!� I !!�J �A @� (� D��7 �� � @� � :� �� � �00���� ����� ������� �)*���%,� !$" I !$$�

B!C �A E� *:����04:� �� D�>�4�>�� *� 17 �+���� �� 3���>�0�� ��D���>�� �� D�>� ���� �� ����""�' �))+� ��� �$ I !#J �A � ,�*��F:�6� �� .� �:�8��-� �������"��' �))�� �%� �$�� I �$���

B$C �A 3� 3� *S>����� (� D���9:�� ����� ������� �)*�� ��%� �"" I �"�J�A H� � � ��-4� �� �� .��-4��+� ������� �� �)�,� �),� �$ I �"$�

B�C �A 3� K��04:� �� = >:��� ����� ������� �)*�� �#�� �"� I ��$J �A �� ���:����:�0� @� (� .�����7� *� (:���:� ����� ���� �)+*� )#� �!�� I �!�$�

B�C �� �2���� @� 3� ��4�:;0�� ����� ���� ���� �)*,� ��#� $�# I $�!�B�C �A � ��4����� E� @���� *� �:��00�� �� E��9������� D� .���� ����� ,�

*��7 �4���� �������"��' �))�� ��� �$## I �$��J �A H� ����� 3:�0 ���44��0�0���� D�7 ��47 � 1��9��4�0S0 */�7 ��� �))��

B#C H� 3� .��4��+� �� � ��88����� *� � H:�;;��� (� �� �����+� ��������� �)*�� ,�� ���" I �����

B�C ,� ./�-0� 1� 3��40� ����� ���� �)))� ��� ���$ I �����B�C ,� ./�-0� 1� 3��40� ����� ���� �)))� ��� $""$ I $""#�B�"C ,.DE �4 �<�-�6�- 0� �� ��0��4��+ ����� ��-�7�� 7�0��� ��- 4 �24 1 %

�4 ��4��;0��� ��<��� �0 �"�� ���� ���� #$!� ��- ��� ���B��C D � ; ���� -���9�0�9� ;�@, �4 -�����6�- �� 0 � ;���<�-�4��7�0��+6�-

���70��� 0� 8��� 0 � 7����4;��-��� ��; ����� 2 �7 8�:���47�4 ����>����� ��-�� ?;� ���A 2�0 �<7�0�0��� ��- ���44��� ��<��� �8 $!$��- �"$ ��� ��4;�70�9��+�

B5C ��� 3� <���� @��8� ��� �� @���6��7 � ��� *� 3�������40�0:0 8/� =�����47 � � ���� :�- .��7 ���� -�� 1��9��4�0S0G����:��,����040��44� !�� #��"� G����:�� ?������+AG�<N ?���A#���!"$����#����� N ��40�;���6��7 T������>�7 �����:���8����:���-�

��� .� ���V����� @��8� ��� (� ����6���40�0:0 8/� @ +4�>���47 � � ���� -�� 1��9��4�0S0 G����:��,����040��44� !�� #��"� G����:�� ?������+A

@��9����6� ��� �� ��47 ��-0��40�0:0 8/� @ +4�>���47 � � ���� -�� 1��9��4�0S0 .�4��3����������40��44� �"� �"�� .�4�� ?E2�06�����-A

@��8� ��� D� .���+� ��;���� ��� @� .�-����>��40�0:0 8/� @ +4�>���47 � � ����� 1��9��4�0S0 G����:��@������4� �#"" G����:�� ?E2�06�����-A

B55C D �4 ;��Q�70 �4 ���� 4:;;��0�- �+ 0 � ��:047 � G��47 :��4�������47 �80� 0 � G��-4 -�� � ���47 �� ��-:40��� ��- .,EG,�� �� 0 ��>��;���� ��� � @���� ��- .� ���4�� 8�� 0�7 ��7�� �44�40��7��

E:;;��0��� ��8����0��� 8�� 0 �4 ��0�7�� �4 �9������� �� 0 ����:�-�� 00;N%%222�2���+�97 �-�% ���%����2��-0�% �� 8��� 0 � �:0 ���