4-proteina [modo de compatibilidade] -...

Profª Eleonora – Slide de aula

ProteínasProteínas


Estruturas conformacionais

São resultantes das forças de ligação entre os diferentes segmentos da cadeia polipeptídica e freqüentemente envolvem grupamentos funcionais das cadeias laterais.

� Estrutura secundária

As rotações em torno das ligações adjacentes à ligação peptídica originam essencialmente dois tipos de estrutura: as hélices e as folhas pregueadas.

Proteínas

� Estabilização das conformações

Tanto as hélices como as folhas pregueadas são estabilizadas por pontes de hidrogênioque se estabelecem entre o oxigênio do grupo carbonila (＞C=O) de determinados aminoácidos e o hidrogênio do grupo amina (＞N-H) de outros aminoácidos.

Nas hélices, estes grupos pertencem à mesma cadeia polipeptídica (segmentos peptídicos adjacentes); nas folhas pregueadas estes grupos pertencem a cadeias diferentes (ou à mesma cadeia depois da cadeia ter se dobrado).

As estruturas dos diferentes aminoácidos influenciam a adoção, pela cadeia, de um determinado tipo de estrutura secundária, isto é, existe uma correlação entre seqüênciae conformação.


Para a formação de α hélices (a mais freqüente, com 3,6 resíduos de aminoácidos) a rotação ocorre no mesmo sentido; para a formação de folhas β pregueadas, os ângulos de torção têm sinal contrário.

As folhas β pregueadas são:

O ácido glutâmico, a alanina e a leucina dão principalmente origem à α hélices, enquanto a valina e a isoleucina originam folhas β pregueadas.

Prolina, glicina e asparagina causam reversões na cadeia, através das qual a cadeia polipeptídica dobra 180º.

Ligações por pontes de hidrogênio entre resíduos da mesma

� paralelas quando as cadeias polipeptídicas estão dispostas paralelamente no mesmo sentido;

� antiparalelas quando estão em sentidos opostos.

resíduos da mesma cadeia

Ligações por pontes de hidrogênio entre cadeias ou segmentos polipeptídicos diferentes

α hélice Folha β pregueada


Este nível de estrutura corresponde à conformação tridimensional das cadeias polipeptídicas e é fundamental para a atividade biológica.

� Estrutura terciária

Enquanto a estrutura secundária é determinada por interações de grupos R próximos entre si, a estrutura terciária é conferida pela interação a longa distância na seqüência de aminoácidos da cadeia.

Resíduos de aminoácidos muito distanciados uns dos outros, na seqüência, podem se encontrar próximos devido aos enrolamentos e formar, desse modo, regiões indispensáveis ao funcionamento da proteína - por exemplo, o centro ativo das enzimas.

Forças que estabilizam a estrutura terciária

� Pontes de hidrogênio entre grupos Rde resíduos pertencentes a alças adjacentes

� Atração iônica entre grupos R com cargas elétricas opostas

� Interações hidrofóbicas

� Ligações dissulfeto


� Estrutura quaternária

Corresponde a associações, quase sempre reversíveis, mantidas por ligações fracas (não covalente) entre várias cadeias polipeptídicas idênticas ou diferentes.

A estrutura quaternária designa o arranjo de subunidades polipeptídicas (monômeros).

A proteína é, portanto oligomérica sendo, por exemplo, um dímero se for constituída por duas subunidades ou um tetrâmero se for constituída por quatro subunidades.

Observação: O número de cadeias polipeptídicas de uma proteína oligomérica pode ser avaliado pela determinação do número de resíduos N-terminal existente na molécula de proteína.


Estrutura da toxina diftérica

Apresenta segmentos em α−hélice, em folha β-pregueada e sem estrutura regular.

Desnaturação

Na desnaturação não ocorre o rompimento das ligações covalentes do esqueleto da cadeia polipeptídica, ou seja, a estrutura primária da proteína é mantida. Entretanto, as alterações no seu arranjo espacial resultam na perda da atividade biológica.

A desnaturação pode ser provocada por:

� Calor � Solutos (ex: uréia, etc.)� Valores extremos de pH � Detergentes� Solventes orgânicos (ex: etanol, acetona, etc.) � Agitação vigorosa

As proteínas sofrem desnaturação em decorrência de alterações na sua estrutura conformacional.


Classificação das proteínas de acordo com a função biológica

Classe Exemplo

Enzimas RibonucleasesTripsina

Proteínas transportadoras HemoglobinaLipoproteínas

Proteínas nutritivas e de reserva Ovoalbumina (ovo)Caseína (leite)

Proteínas contráteis ou de movimento ActinaMiosinaTubulinaTubulina

Proteínas estruturais ColágenoElastinaQueratinaFibroína

Proteínas de defesa FibrinogênioTrombinaVeneno de serpenteToxinas bacterianas

Proteínas reguladoras InsulinaHormônio de crescimentoRepressores


Classificação das proteínas de acordo com a forma

Proteínas globulares

Com cadeia(s) polipeptídica(s) fortemente enrolada em forma globular ou esférica. Usualmente solúvel em sistemas aquosos e se difundem facilmente.

Proteínas globulares são quase todas as enzimas, as proteínas de transporte, os anticorpos e as proteínas de reserva nutritiva.nutritiva.

Proteínas fibrosas

Com cadeia(s) polipeptídica(s) estendida ao longo de um eixo. São insolúveis em água, compridas e filamentosas. A maioria tem função estrutural.

Proteínas fibrosas típicas são: a queratina, o colágeno e a fibroína. Incluem, também, as proteínas que participam de processos contráteis como a actina e miosina.


Composição em aminoácidos de duas proteínas

Os números representam resíduos de cada aminoácido, por molécula de proteína

Quimotripsinogênio bovino**

Citocromo humano*

Aminoácido

108Ile23His2313Gly58Glu102Gln102Cys83Asp155Asn42Arg226Ala

* proteína mitocondrial transportadora de elétrons. ** precursor inativo da enzima digestiva quimotripsina.

245104Total

45Tyr81Trp237Thr282Ser94Pro63Phe23Met1418Lys196Leu108Ile

233Val


Proteínas Conjugadas

Desidrogenase succínicaNucleotídeos de flavinaFlavoproteínas

HemoglobinaHeme (ferroporfirina)Hemoproteínas

Caseína do leiteGrupos fosfatoFosfoproteínas

γ-globulina do sangueCarboidratosGlicoproteínas

Lipoproteína do sangueLipídeosLipoproteínas

ExemploGrupo prostético*Classe

Desidrogenase alcoólicaZincoFerritinaFerroMetaloproteínas

* porção de uma proteína conjugada não constituída por aminoácidos.


Características moleculares de algumas proteínas

4*57464.500Hemoglobina (humana)

3*24122.600Quimotripsina (pâncreas bovino)

115316.890Mioglobina (coração eqüino)

112913.930Lisozima (clara de ovo)

112412.640Ribonuclease (pâncreas bovino)

2*515.733Insulina (bovina)

Nº. de Cadeias

Nº. de Resíduos

PesoMolecular

≈ 40*≈ 8.3001.000.000Desidrogenase glutâmica (fígado bovino)

4*≈ 1.250149.900γ - globulina (cavalo)

4*≈ 80096.000Hexoquinase (levedura)

1≈ 55068.500Albumina do soro (humana)

4*57464.500Hemoglobina (humana)

* proteínas oligoméricas (duas ou mais cadeias polipeptídicas).

Peso molecular (proteínas simples) ÷ 110 = ≈ Número de resíduos de aminoácidos

Observação:


Trabalhando com proteínas

Para estudar uma proteína é necessário em primeiro lugar separar esta proteína das demais. Uma preparação pura é essencial para que as propriedades e possíveis atividades possam ser determinadas.

A fonte de uma proteína é geralmente um tecido ou célula microbiana. O primeiro passo é romper a célula e liberar o material intracelular, numa solução chamada de extrato bruto.

Para o rompimento da célula são utilizadas técnicas como a homogeneização, sonicação (uso de ondas sonoras), ciclos de congelamento e descongelamento, detergentes (se a proteína em questão estiver solidamente acoplada a uma membrana), entre outras.

Após o rompimento, a centrifugação diferencial é utilizada para preparar frações sub-celulares ou para isolar organelas específicas.

A seguir são utilizadas técnicas preliminares de separação de proteínas. Essas técnicas em geral não resultarão em uma amostra pura, mas tem a importante tarefa de preparar o homogenato bruto para procedimentos mais eficientes.

Os métodos clássicos para separação de proteínas utilizam propriedades que variam de uma proteína para outra, como tamanho, carga e propriedades ligantes. Alguns métodos modernos incluem clonagem de DNA e seqüenciamento genômico.


600 rpm600 rpm

O tubo se move lentamente para cima e para baixo enquanto o pilão gira


pilão de teflonpilão de teflon

Homogenato de tecido e sacarose (moído em tampão de sacarose 0,25M)


Homogenato é peneirado para remover o tecido conjuntivo e os vasos sanguíneos


Centrifugar o homogenato a 600 g x 10 minutosCentrifugar o homogenato a 600 g x 10 minutos

600 rpm


pilão de teflon



Centrifugar o homogenato a 600 g x 10 minutos

Homogeneização e Centrifugação Diferencial

O homogeneizador é um tubo de ensaio de parede espessa através do qual passa um êmbolo bem ajustado.

A centrifugação diferencial é utilizada para separar componentes celulares.

A técnica leva em consideração as diferentes velocidades de sedimentação de várias organelas de

Separação e Purificação de Proteínas

Sobrenadante 1Sobrenadante 1Centrifugar sobrenadante 1 a 15.000 g x 5 minutosCentrifugar sobrenadante 1 a 15.000 g x 5 minutos

Núcleos e células não rompidasNúcleos e células não rompidas

Sobrenadante 2 Sobrenadante 2 Centrifugar sobrenadante 2 a 100.000 g x 60 minutos

Centrifugar sobrenadante 2 a 100.000 g x 60 minutosMitocôndrias,

lisossomos e corpúsculos

Mitocôndrias, lisossomos e corpúsculos

Sobrenadante 3: fração solúvel do citoplasma (citosol)


Ribossomos e microssomos, fragmentos do retículo

endoplasmático, complexo de Golgi e membrana

plasmática



plasmática

Sobrenadante 1Centrifugar sobrenadante 1 a 15.000 g x 5 minutos

Núcleos e células não rompidas

Sobrenadante 2 Centrifugar sobrenadante 2 a 100.000 g x 60 minutosMitocôndrias,

lisossomos e corpúsculos




plasmática

sedimentação de várias organelas de diferentes formatos, tamanhos e densidade em uma solução.

À medida que o homogenato celular é submetido a forças centrífugas (g) crescentes, diferentes componentes celulares são precipitados.

Se a proteína desejada não se encontra no precipitado, ele é descartado e o sobrenadante centrifugado a uma velocidade maior.

Se a proteína em questão for solúvel, ao final do procedimento já estará parcialmente purificada.


“Salting out”

As proteínas, contidas nas frações sub-celulares ou organelas, são freqüentemente submetidas a uma purificação bruta com base na solubilidade. A solubilidade de proteínas é geralmente diminuída em altas concentrações de sal, um efeito denominado “salting out” (adição de sal). A adição de certos sais em altas quantidades pode precipitar seletivamente algumas proteínas, enquanto outras permanecem em solução.

As proteínas apresentam solubilidades diferentes em compostos polares e iônicos, e permanecem solúveis por causa da sua interação com a água.

Técnicas preliminares de separação de proteínas

Quando o sulfato de amônio, (NH4)2 SO4, (reagente mais utilizado nesta etapa) é adicionado a uma solução de proteínas, uma parte da água é removida da proteína para formar ligações íon-dipolo com os sais. Com menos água disponível para hidratar as proteínas, elas começam a interagir entre si por meio de ligações hidrofóbicas. A uma quantidade definida de sulfato de amônio, um precipitado que contem proteínas é formado. Essas proteínas são centrifugadas e, se forem proteínas contaminantes, são descartadas.

A seguir, mais sal é adicionado e um conjunto diferente de proteínas, que pode conter a proteína em questão, precipitará. Este precipitado é coletado por centrifugação e guardado.

A quantidade de sulfato de amônio é normalmente medida em comparação com uma solução saturada a 100%. Um procedimento comum consiste em levar a solução a cerca de 40% de saturação e centrifugar o precipitado que se forma. Depois mais sal é adicionado ao sobrenadante, normalmente a um nível de 60% a 70% de saturação, e o novo precipitado formado é separado por centrifugação.


Uma membrana (tubo de diálise ou papel celofane) contendo a solução de proteína eoutros solutos permite que a água e solutos pequenos, como sais (NaCl; (NH4)2SO4;etc.) e açúcares (glicose; etc.), passem livremente através dela. Não permite, porém,a passagem de solutos grandes como as proteínas.

Diálise

O tubo de diálise contendo a mistura de moléculas de proteína (azul) e de moléculas pequenas (vermelhas) é imerso em um volume grande de solução tampão (a).

Como a membrana semipermeável permite a passagem apenas das moléculas pequenas, sua concentração dentro e fora do tubo tende a se igualar (b).

Após várias trocas de tampão (c), restam apenas as moléculas de proteína dentro do tubode diálise (d).


Coluna Cromatográfica - Diversos métodos de fracionamento de proteínas fazem uso de coluna cromatográfica, e exploram as diferenças de carga, tamanho, especificidade de ligação e outras propriedades das proteínas.

Os elementos padrões de uma coluna de cromatografia incluem um material sólido e poroso, a matriz, que preenche a coluna (fase estacionária); e uma solução, a fase móvel, que flui (ou elui) através da matriz.

A solução que atravessa a coluna é retirada na

Métodos cromatográficos utilizados para purificação de proteínas

A solução que atravessa a coluna é retirada na base, o efluente, e é constantemente reposta no topo a partir de um reservatório.

A solução de proteína a ser separada é assentada no topo da coluna e atravessa a matriz sólida por percolação. As proteínas migram através da coluna e são retardadas em diferentes graus de intensidade, de acordo com as diferentes interações com o material da matriz.

Diferentes tipos de proteínas (A, B e C) irão gradualmente se separando uma das outras, formando bandas. A migração é mais rápida ou mais devagar dependendo das propriedades individuais das proteínas.


Cromatografia de exclusão por tamanho

A matriz é composta de partículas de gel com ligações cruzadas contendo poros ou cavidades de tamanho específico.

As partículas, normalmente em forma de esferas, são polímeros de carboidratos, como a dextrana (Sephadex) e a agarose (Sepharose), ou de poliacrilamida (Bio-Gel)

A estrutura de ligação cruzada desses polímeros

Separa proteínas de acordo com o tamanho e é também chamada de filtração em gel ou peneira molecular.

A estrutura de ligação cruzada desses polímeros produz poros no material. A extensão das ligações cruzadas pode ser controlada para selecionar um tamanho de poro desejado.

Uma mistura de proteínas é aplicada na coluna . As proteínas com molécula pequena podem penetrar no interior das esferas, porém as proteínas maiores não o fazem.

À medida que o solvente flui pela coluna as moléculas pequenas de proteína penetram nas esferas e são retardadas.

As moléculas grandes de proteína emergem primeiro da coluna.


Cromatografia de troca iônica

A resina de troca iônica é um ligante que pode conter carga positiva ou negativa. Uma resina carregada negativamente é um trocador catiônico (+) e uma resina carregada positivamente é um trocador aniônico (-).

A coluna é equilibrada com tampão de pH e força iônica adequadas, desta forma, a resina de troca se liga a contra-íons. Uma resina de troca catiônica

Explora as diferenças e magnitudes da carga elétrica líquida de proteínas em um determinado pH. A matriz é constituída por um polímero sintético (resina).

se liga a contra-íons. Uma resina de troca catiônica normalmente se liga a íons Na+ ou K+ e um trocador aniônico normalmente se liga a íons Cl-.

Uma mistura de proteínas é assentada na coluna para eluir através dela.

As proteínas com carga líquida oposta à carga líquida do trocador ficarão na coluna, trocando de lugar com os contra-íons ligados. As proteínas sem carga líquida ou com carga líquida igual à do trocador irão eluir.

Depois que todas as proteínas não ligadas são eluídas, o eluente mudará para um tampão com um pH que remova a carga nas proteínas ou para um tampão com uma maior concentração de sal.


A mistura de proteínas (ou de aminoácidos) deve estar em solução ácida. Portanto, são cátions com carga líquida positiva, porém, com diferentes graus de ionização.

� Exemplo: Resina carregada com grupos sulfônicos � trocadora de cátions

SO3

SO3 Na+

Na+

sítios aniônicos

troca de cátions

+ NH3-CHR4-COOH

+ NH3-CHR3-COOH

+ NH3-CHR2-COOH

+ NH3-CHR1-COOH

Aminoácidos com maior carga positiva (lisina, arginina e histidina) deslocam, com mais facilidade, o Na+ da resina e são ligados mais fortemente.Aminoácidos com menor quantidade de carga positiva (ácidos glutâmico e aspártico) se ligam com a menor intensidade.Todos os demais aminoácidos têm quantidade intermediária de carga positiva.

2 Na+SO3

SO3+ NH3-CHR3-COOH

+ NH3-CHR1-COOH+partícula

de resina


Cromatografia de Afinidade

A característica diferenciadora é o polímero da matriz se unir de forma covalente a algum composto, chamado de ligante, que se une especificamente, também, à proteína desejada.

As outras proteínas da amostra, que não se ligam à matriz, podem ser facilmente eluídas com tampão.

A proteína ligada pode ser eluída da coluna ao serem adicionadas altas concentrações do ligante ao eluente, que compete pela ligação da proteína

Separa as proteínas por suas propriedades específicas de ligação.

ao eluente, que compete pela ligação da proteína com a fase estacionária. A proteína se une ao ligante na fase móvel e é recuperada no efluente. A interação proteína-ligante também pode ser interrompida por uma solução contendo alta concentração de sal, que enfraquece a ligação da proteína ao ligante da matriz, interferindo com as interações iônicas.

� Exemplo: Se a função biológica de uma proteína de interesse necessita de ATP, então, usando-se ATP como ligante cria-se uma afinidade com a matriz. Quando a solução de proteínas se move através da coluna, as proteínas dependentes de ATP (incluindo a proteína de interesse) se ligam à matriz.


Eletroforese

A eletroforese se baseia na movimentação de partículas em um campo elétrico, em direção a um eletrodo de carga oposta.

Eletroforese em acetato de celulose

Uma mistura de proteínas (A, B e C) é aplicada sobre uma tira de papel ou acetato de celulose, umedecida com tampão de pH conhecido. conhecido.

A tira é colocada em um equipamento apropriado e um campo elétrico é aplicado ao sistema (a).

As proteínas migram de sua posição inicial para os pólos, de acordo com a carga que apresentam no pH do tampão utilizado (b).

Depois de algum tempo, a eletroforese é interrompida e a posição das proteínas é revelada (c).


� Pontos isoelétricos de algumas proteínas

Proteínas pI Proteínas pI

Pepsina < 1,0 Hemoglobina 6,8

Ovoalbumina 4,6 Mioglobina 7,0

Soroalbumina 4,9 Quimotripsinogênio 9,5

Urease 5,0 Citocromo C 10,7Urease 5,0 Citocromo C 10,7

β-lactoglobulina 5,2 Lisozima 11,0

γ-globulina 6,6


Uma molécula se desloca em uma velocidade proporcional à sua densidade de carga total, tamanho e forma.

As amostras são aplicadas em poços na parte superior do gel. Moléculas carregadas negativamente migram através da matriz do gel em direção ao ânodo, em resposta ao campo elétrico aplicado. A mobilidade das moléculas pequenas é maior do que a das grandes com a mesma densidade de carga.

Após a eletroforese, as moléculas separadas são visualizadas por

Eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida

separadas são visualizadas por meio de técnicas de coloração, de fluorescência ou por técnicas radiográficas.

O pH no gel deve ser alto o suficiente de forma que praticamente todas as proteínas possuam carga líquida negativa e se movam em direção ao ânodo quando a voltagem é aplicada.


� Exemplo: Eletroforese em gel de poliacrilamida da purificação de uma proteína de Escherichia coli.

A amostra é aplicada e uma corrente elétrica atravessa o meio. Após a separação das proteínas, o gel é corado para revelar as posições das proteínas.

Diferentes amostras são aplicadas em depressões (poços) no topo do gel. As proteínas se movem no gel quando um campo elétrico é ligado.As proteínas podem ser visualizadas, após a eletroforese, visualizadas, após a eletroforese, por tratamento do gel com um corante (ex: Coomassie blue). Cada banda no gel representa uma proteína diferente, proteínas menores se movem mais rapidamente que as proteínas maiores e são localizadas próximo a base do gel.

A primeira raia mostra uma série de padrões de proteínas de massa conhecida, que servem de marcadores de peso molecular. As duas raias seguintes mostram a proteína antes e após a sua síntese ser induzida. A quarta raia mostra a proteína no extrato celular bruto. As raias subseqüentes mostram a proteína após sucessivas etapas de purificação. A proteína purificada é uma cadeia polipeptídica (Mr ∼ 38.000).

(a) (b)

4-proteina [modo de compatibilidade] -...

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