46. 新型 VEGF（血管内皮増殖因子）の構造と機能の解明

森田　隆司

Key words：VEGF-A，KDR，vammin，heparin 明治薬科大学 薬学部 生体分子学教室

緒　言

血管内皮増殖因子（以下VEGF）は血管新生・管腔形成に不可欠なタンパク質であり，ガンなどの病的な血管新生にも関与している．VEGF は内皮細胞上に 4 種存在する VEGF レセプター（VEGFR）に結合し，その生理作用を発現する．現在，VEGFR として 3 種のチロシンキナーゼ型受容体（VEGFR-1 ～ 3）と 1 種の非チロシンキナーゼ型の受容体（ニューロピリン-1, NP-1）の合計 4 種のレセプターが同定されている（図 1）．血管内皮細胞には VEGFR-1（Flt-1），VEGFR-2（KDR），ニューロピリン-1（NP-1）が，リンパ管内皮細胞には VEGFR-3（Flt-4）が発現しており，それぞれ血管形成およびリンパ管形成を担っている．VEGF ファミリータンパク質として，哺乳動物にはVEGF-A から VEGF-D およびPlGF の 5 種，ウイルス Parapoxvirus からは 1 種の VEGF サブタイプ（VEGF-E）が見出されており，それぞれ VEGFRに対する選択性が異なっている（図 1）．我々は最近，2 種のヘビ毒から強力な血圧降下作用を示す VEGF-A の相同タンパク質を見出している 1)．大変興味深いことに，ヘビ毒由来の VEGF は 4 種の VEGF receptor（VEGFR）のうちVEGFR-2（KDR）のみを特異的に認識し，既知のVEGF と比べて強力な生物活性を示すことを明らかにした．以上の事実から，我々が見い出した VEGF相同タンパク質は新型の VEGFであると結論し，7番目のサブタイプとして VEGF-F と命名した（図 1）．今回，外来性因子である VEGF-F の強力な生物活性の発現メカニズムを明らかにすることで，ヒト血管新生の分子メカニズムを解明することを目的とする．　　　　　　　　　　　　　　　　　　　

　上原記念生命科学財団研究報告集, 22(2008)

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方法、結果および考察

vammin, VR-1 のヘビ毒由来VEGF ホモログの VEGF レセプター結合性を Biacore を用いて解析したところ，これらの VEGF　

　図 1． 各種VEGF ホモログとそのレセプターとの相互作用．

内在性および外来性のVEGF ファミリーと 5 種の受容体に対する結合選択性についてまとめた．　　ホモログは VEGF レセプター 1 (Flt-1)には結合せず，VEGF レセプター 2（KDR）にのみに特異的に結合することが明らかになった（図 1）．この現象はヘビ毒VEGFが従来のVEGF のレセプターに対する結合活性とは明らかに異なるレセプター結合特異性を有することを示している 1)．VEGF-F の高いレセプター選択性を理解する為，VEGF-F（vammin と VR-1）の構造生物学的研究を行なった 2). VEGF-F は VEGFR-2 にのみ特異的に結合するリガンドである．我々は結晶構造解析から，VEGF-F は VEGF-A と比べてレセプター結合ループの構造と表面電荷が大きく異なっていることを明らかにした（図 2）．さらに，レセプターとの結合に重要な loop 3領域の配列を比較すると vammin 分子に一アミノ酸残基（Thr86a）が挿入されている（図 3 左）．このアミノ酸挿入によりloop 3 の一部の立体構造に顕著な影響を与えていた 2）．図 3右に VEGF-A165 と vammin のループ 3の部分のクローズアップ図を示した．Thr86a の挿入によりVEGF-A の His86 とそれに対応する vammin の Arg86 が全く逆方向に反転していることがわかる．ほんの 1 アミノ酸残基を vammin タンパク質に挿入することにより，loop 3 での立体構造変化をおこすことにより，そのレセプター結合特異性が著しく変化したのではないかと考えている 2)．一方，ごく最近 VEGF-F の C 末端ヘパリン結合領域のペプチドはヒト VEGF-A の生物活性を阻害することを明らかにした．これらのペプチドは新しいタイプの抗VEGF薬のシードになりうると考えている 3,4)．vammin は VEGF-A が結合するヘパリンと同様のヘパリン構造を認識していると考えられる．しかし，一次構造の大きな違いとヘビ毒タンパク質の加速進化を考えると，単にヘパリン結合領域としてのみ機能しているとは考えにくい．そこで，VEGF-A の C 末端ヘパリン結合領域を VEGF-F の C 末端領域と置換した組換えタンパク質を調製し，現在その生物活性および生化学的性質について検討中である．　また，当研究室で最近，KDR-結合タンパク質を見い出した 5 ～ 7)．現在、その生理的意義を解析している．　　本研究を遂行するに当たり，協力いただいた山﨑泰男博士および技術補助員の角野明子さん, 明治薬科大学大学院生の高荷孝治君, 德永優子さん, 中野裕太君, 松永幸子さん, 藤澤大輔君に深謝致します．

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　図 2． vammin と VEGF-A の表面荷電モデル．

vammin と VEGF-A の loop3 はタンパク質上部右に位置する．　　

　図 3． vammin とヒト VEGF-A165 のアミノ酸配列の比較（左図）と両者のループ 3領域の比較．

Loop3 の位置は図２を参照．　

文　献

1） Yamazaki, Y., Takani, K., Atoda, H. & Morita, T.: Snake venom vascular endothelial growth factors(VEGFs) exhibit potent activity through their specific recognition of KDR (VEGF receptor 2). J. Biol.Chem., 278: 51985-51988, 2003.

2） Suto, K., Yamazaki, Y., Morita, T. & Mizuno, H.: Crystal structures of novel vascular endothelialgrowth factors (VEGF) from snake venoms.: Insight into selective VEGF binding to kinase insertdomain-containing receptor but not to fms-like tyrosine kinase-1. J. Biol. Chem., 280: 2126-2131,2005.

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3） Yamazaki, Y., Tokunaga, Y., Takani, K. & Morita, T.: Identification of the heparin-binding region ofsnake venom vascular endothelial growth factor (VEGF-F) and its blocking of VEGF-A165.Biochemistry., 44: 8858-8864, 2005.

4） Tokunaga, Y., Yamazaki, Y. & Morita, T.: Localization of heparin- and neuropilin-1-recognition sitesof viral VEGFs. Biochem. Biophys. Res. Commun., 348: 957-962, 2006.

5） Yamazaki, Y., Matsunaga, Y., Nakano, Y. & Morita, T.: Identification of vascular endothelial growthfactor receptor-binding protein in the venom of eastern cottonmouth. J. Biol. Chem., 280:29989-29992, 2005.

6） Yamazaki, Y., Nakano, Y., Imamura, T. & Morita, T.: Augmentation of vascular permeability of VEGFis enhanced by KDR-binding proteins. Biochem. Biophys. Res. Commun., 355: 693-699, 2007.

7） Fujisawa, D., Yamazaki, Y., Lomonte, B. & Morita, T.: Catalytically inactive phospholipase A2homologue binds to vascular endothelial growth factor receptor-2 via a C-terminal loop region.Biochem. J., 411: 515-522, 2008.

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