5 プロテオミクス...• タンパク質のgo、cog、代謝経路解析 •...

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プロテオミクス

Ⅴ

プロテオームプロファイリング

定量プロテオミクス

ターゲットプロテオミクス

リン酸化プロテオーム

タンパク質同定

プロテオミクス5

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Ⅴ

プロテオームプロファイリング

製品概要プロテオームプロファイリング（タンパク質組成分析）は組織・血液などのペプチドやタンパク質の検出を目指す

技術です。液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法に基づき、タンパク質の混合物を質量分析法で同定し、デー

タ解析が行われます。トランスクリプトーム解析とともに、生体システムにおけるダイナミックな変化を網羅的に

解析できます。

技術特長 • 高解像度と高精度：解像度は 105 超、精度は 1ppm 未満 • 高同定率：3,000 種類以上のタンパク質を同定可能 • 無制限：理論的にはどんな生物種も解析可能

ワークフロー

タンパク質抽出

SDS-PAGE

酵素カット

酵素カット

HPLC

LC-MS/MS

MS と MS/MS スペクトル

ピークのリスト

データベースでの捜索

信頼できるタンパク質の同定

品質管理とデータのフィルタリング

データの統計と品質管理

タンパク質の同定

タンパク質の機能アノテーション • タンパク質の GO 解析• タンパク質の COG 解析• タンパク質の pathway 解析

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Ⅴ

データ解析 • データの統計と品質管理 • タンパク質同定の結果 • タンパク質の GO 解析 • タンパク質の COG 解析 • タンパク質の代謝経路解析

技術パラメーター

1.サンプル要件

サンプルタンパク質

サンプル量≧ 500µg

(濃度 ≧ 1mg/mL)

2. 解析：SDS-PAGE-LC-MS/MS ・ SCX-HPLC -LC-MS/MS

3. 質量分析プラットフォーム：Triple TOFTM 5600・LTQ OrbitrapVelosTM

納品物納品データ例

表 1 スペクトルマッチングの情報リスト

Querynumber

ChargePdeptide

massIonsscore

Homologyscore

Identityscore

EvaluePeptide

sequenceProtein ID Modification

Retentiontime

55 3 -0 48.14 28 38 0.006KTVTAM-DVVYALK

IPI00453473Oxidation

(M)@625.38

2089 2 -0 46.5 0 40 0.013 MLTELEK IPI00007047Oxidation

(M)@113.4

Charge

# of

que

ry

0

2

65.6876%

28.0031%

5.3306%0.8816% 0.0886% 0.0084%

3 4 5 6 7

1000

020

000

3000

040

000

5000

060

000

図 1 ペプチド分布のチャージ

significantnot significant

# of

frag

men

tions

Fragment lons Mass delta/Da

-0.5

368

-0.4

737

-0.4

105

-0.3

474

-0.2

842

-0.2

211

-0.1

579

-0.0

947

-0.0

316

0.03

160.

0947

0.15

790.

2211

0.28

420.

3474

0.41

050.

4737

0.53

680.

6000

7e+05

6e+05

5e+05

4e+05

3e+05

2e+05

1e+05

0e+00

図 2 二次イオンの質量誤差分布

納期約 40 営業日

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Ⅴ

定量プロテオミクス

製品概要定量プロテオミクスは、プロテオームを構成するすべてのタンパク質を精確に同定した上で、タンパク質の差異発現

をスクリーニングすることができ、細胞生理や細胞病理の機能解明に利用されています。研究方法は安定同位体標識

法（iTRAQ・SILAC・ICAT 他）と非標識定量法（label-free）があります。

技術特長 • 柔軟性：label-free と iTRAQ の二つの定量法を柔軟に選択可能 • 高解像度と高精度：LTQ Orbitrap VelosTM プラットフォームでは、解像度は 105 超、精度は 1ppm 未満 • ハイスループット：iTRAQ では 8 サンプルを 1 ランで、label-free では大規模サンプルを同時に解析可能

ワークフロー

タンパク質の機能アノテーション

・GO 解析・COG 解析・Pathway 解析・DEPs のクラスター分析

・DEPs の GO 解析・DEPs の pathway enrichment 解析

Differentially expressed proteins (DEPs) のスクリーニング

タンパク質の定量



MS と MS/MS スペクトル

LC-MS/MS

HPLC 分離

iTRAQ 標識標識なし

酵素カット


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データ解析

1.標準データ解析 • データ統計 • タンパク質同定の結果 • タンパク質定量の結果 • タンパク質の GO 解析 • タンパク質の COG 解析 • タンパク質の代謝経路解析 • 異なるタンパク質の GO 解析 • 異なるタンパク質の代謝経路解析 • マルチサンプルの発現パターンのクラスター分析

2.カスタマイズ（iTRAQ定量法のみ） • プロテオミクスとトランスクリプトームデータの比較分析

• プロテオミクスとトランスクリプトーム解析結果の比較分析

• 異なるタンパク質と遺伝子の比較分析 • プロテオミクスとトランスクリプトームのクラス

ター分析

• タンパク質相互作用ネットワークの解析 • お客様のご要望に合わせ、データ解析をカスタマイズします。




サンプル量≧ 500µg

(濃度 ≧ 1mg/mL)

2.解析：iTRAQ・Label-free

3.質量分析プラットフォーム：Triple TOFTM 5600・LTQ OrbitrapVelosTM


図 1 タンパク質のカバレッジ分布

Peptide ratios

Peptide Ratios(117/119)Distribution

Num

ber o

f pep

tides

-2 -1 -0 1

1400

1200

1000

800

600

400

200

0

図 2 ペプチドの比率分布図

70%-100%(0)

60%-70%(0)

50%-60%(2)

40%-50%(9)

30%-40%19)

20%-30%(41)

15%-20%(39)

10%-15%(63)

5%-10%(134)

0%-5%(252)

0%

45%

2%

24%

3%

7%

7%

11%

納期iTRAQ：約 40 営業日Label-free：約 60 営業日

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ターゲットプロテオミクス

製品概要ターゲットプロテオミクスでは、多重反応モニタリング（MRM：Multiple Reaction Monitoring）技術に基づき、特別な機能を持つタンパク質を相対定量と絶対定量の二つの方法で解析できます。ターゲットプロテオミクスは特異

性が高く高感度な質量分析法として、低濃度タンパク質の同定・翻訳後修飾されたタンパク質の同定・バイオマーカー

の検証・ファミリータンパク質とオルソロガスタンパク質の差異検出などの研究で利用されています。

技術特長 • 高解像度：オルソロガスタンパク質の高感度検出が可能 • ハイスループット：数十個のタンパク質を同時に定量可能 • 高再現性：MRM 技術に基づくターゲットプロテオミクスの結果は、異なる実験室で再現可能 • 短周期：抗体作成からの解析では半年必要だったものが、ターゲットプロテオミクスでは 10 週で解析可能 • 広検出範囲：検出範囲は 1,000 ～ 10 万

ワークフロー

• ターゲットタンパク質の同定• ターゲットタンパク質の定量

生データ

LC-MRM

トリプシン消化

タンパク質

サンプル解析MRM 技術開発

ターゲットタンパク質の情報

MRM トランジションのデザイン

MRM トランジションの最適化

データ解析

1.標準データ解析 • ターゲットタンパク質の選定 • トランジションの予測 • ターゲットタンパク質の同定 • ターゲットタンパク質の定量

2.カスタマイズ • お客様のご要望に合わせ、データ解析をカスタマイズします。

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Ⅴ




サンプル量 ≧ 500µg

(濃度 ≧ 1mg/mL)

2.解析：MRM

3.質量分析プラットフォーム：QTRAP® 5500


Inte

nsity

Retention Time

23.0

4000

3000

2000

1000

023.5 24.0 24.5 25.0

y11-1172.5906+ y7-758.4155+

Predicted 24.1

図 1 クロマトグラフィーのピーク

Replicate

Mea

sure

d Ti

me

sample1 sample2

24.6

24.4

24.2

24.0

23.8

23.6

23.4

23.2

y11 - 1172.5906+y5 - 558.2994+

y7 - 758.4155+y4 - 457.2518+

y6 - 657.3678

図 2 獲得したピークエリアの保持時間の比率


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Ⅴ

リン酸化プロテオーム

製品概要リン酸化プロテオーム解析では、タンパク質のリン酸化修飾情報を網羅的に解析できます。リン酸化部位の識別と

機能分析はもちろんのこと、iTRAQ や Label-free などの相対定量法を併用して、リン酸化されたタンパク質の解析もできます。この技術はリン酸化部位の同定率を高めるだけでなく、細胞内シグナル伝達ネットワーク中のリン酸

化タンパク質も迅速に解析できます。リン酸化プロテオーム解析は既にシグナル伝達ネットワークの研究・疾患研究・

環境応答などの研究領域で利用されています。

技術特長 • 高解像度：リン酸化されたアミノ酸部位を精確に同定可能 • 高効率：1 ランで何千ヶ所ものリン酸化部位を同定可能 • ハイスループット：iTRAQ では、8 サンプルのリン酸化タンパク質を同時に同定可能 • 複数の断片化モデル：Collision-induced dissociation (CID)・electron-transfer dissociation (ETD)・ Higher-energy C-trap dissociation (HCD) などのフラグメンテーションモデルを提供

• 複数のスキャンモデル：MS2 や MS3 などのスキャンモデルを提供

ワークフロー


酵素カット

リン酸化タンパク質の濃縮

LC-ESI-MS/MS

ピークのリスト




タンパク質の機能アノテーション

・タンパク質 GO 解析・タンパク質 COG 解析・タンパク質 Pathway 解析

リン酸化タンパク質の Enrichment 解析・GO Enrichment 解析・Pathway Enrichment 解析

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Ⅴ

データ解析

1.標準データ解析 • データベースの検索 • データベース検索結果の統計解析 • データベース検索結果の品質管理 • リン酸化タンパク質の検出と同定 • タンパク質の GO、COG、代謝経路解析 • リン酸化タンパク質の GO、Pathway Enrichment 解析

2.カスタマイズ • お客様のご要望に合わせ、タンパク質相互作用ネットワークの解析等、データ解析をカスタマイズしま

す。

納品物

納品データ例

Num

ber o

f pro

tein

s

The number of peptides0 5

020

4060

8010

012

0

10 15 20 25 30 35

図 1 タンパク質でユニークなペプチドの分布

Mass delta (ppm)-10

20

40

60

80

100

120

-5 0 5 10

Mas

cot I

on S

core

図 2 ペプチドマッチングの誤差範囲

Peptide Length

Num

ber o

f Pep

tides

140

120

100

80

60

40

20

01 3 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 295

図 3 ペプチドの長さの分布





サンプル量≧ 5mg

(濃度 ≧ 1mg/mL)

2.解析：TiO2 Enrichment・LC-ESI-MS/MS

3. 質量分析プラットフォーム：LTQ Orbitrap VelosTM・Triple TOFTM 5600

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タンパク質同定

製品概要タンパク質同定とは、MALDI-TOF/TOF または LC-MS/MS 質量分析法を用いて、電気泳動したゲルから切り出したタンパク質スポットやバンドを、免疫沈降 (IP：immunoprecipitation) や精製してから同定を行う技術です。データ解析はタンパク質同定の結果とデータ解析の結果（GO と pathway 解析）を含みます。

技術特長 • 高解像度と高精度：LTQ Orbitrap VelosTM プラットフォームでは、解像度は 105 超、精度は 1ppm 未満 • 高速スキャニング：Ultrafle Xtreme プラットフォーム（TOF と TOF/TOF モード）のスピードは 1KHz 以上 • 高感度：低濃度のタンパク質に対して優れた検出効果があり、ナノグラムレベルでも検出可能

ワークフロー


酵素カット

MALDI-TOF/TOF LC-MS/MS

MS/MS ピークのリスト



・タンパク質同定の結果

・タンパク質の GO 解析・タンパク質の COG 解析・タンパク質の Pathway 解析

データ解析 • データの統計と品質管理 • タンパク質同定の結果 • タンパク質の GO 解析（LC-MS/MS 解析のみ） • タンパク質の COG 解析（LC-MS/MS 解析のみ） • タンパク質の Pathway 代謝経路解析（LC-MS/MS 解析のみ）

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1.サンプル要件 • SDS-PAGE スライス・2D-PAGE ゲルスポット : ≧ 1.5mm3 クマシーブルー染色や銀染色によってゲルを可視化させ、電気泳動後、一週間以内に弊社まで送付してください。

銀染色の場合、グルタルアルデヒドを混入しないように注意してください。

2.解析：LC-MS/MS・MALDI-TOF/TOF

3.質量分析プラットフォーム：MALDI TOF/TOFTM・LTQ Orbitrap VelosTM・Triple TOFTM 5600


表 2 タンパク質でマッチングしたペプチドの情報リスト

Protein ID:gi/533066Sequence Coverage:28.82%Matched peptides shown in Bold Red:

VGFKAGVKDY KLTYYTPDYE TKDTDILAAF RVTPQPGVPP EEAGAAVAAE

SSTGTWTTVW TDGLTSLDRY KGRCYHIEPV AGEESQFIAY VAYPLDLFEE

GSVTNMFTSI VGNVFGFKAL RALRLEDLRI PPAYVKTFQG PPHGIQVERD

KLNKYGRPLL GCTIKPKLGL SAKNYGRAVY ECLRGGLDFT KDDENVNSQP

FMRWRDRFLF CAEAIYKAQA ETGEIKGHYL NATAGTNEDM MKRAVFAREL

IDs 90.00%

None IDs 10.00%

図 1 サンプルの識別率

M/Z

Inte

nsity

020

00

809.

3366

839.

0858

855.

0509

861.

0671 8

77.0

424

917.

2810

921.

3223

985.

5725 10

05.6

100

1025

.610

010

50.0

928

1060

.080

910

63.0

629

1250

.092

8

1464

.060

9

1963

.062

9

871.

0310

800 1000 1200 1400 1600 1800 2000

4000

6000

8000

1000

0

図 2 プライマリ PMFのスペクトル

納期ゲルスポット：約 15 営業日ゲルバンド：約 20 営業日

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