Načelo metode

ULTRALJUBIČASTA I VIDLJIVA (UV-Vis) SPEKTROFOTOMETRIJA

� molekulska apsorpcijska spektroskopija

� mjerenje količine apsorbirane svjetlosti u UV (190-380 nm) i vidljivom području (380-800 nm)

� apsorpcija UV i Vis zračenja u organskim molekulama

prelaz e- iz osnovnog u jednu od vibracijskih i rotacijskih razina pobuñenog elektronskog energijskog stanja

� talasna duljina pri kojoj molekula apsorbira ovisi o jakosti kojomsu vezani njezini elektroni ( e- )

� kromofori - nezasićene organske funkcionalne skupine

� auksokromi - grupe s jednim ili više nesparenih elektronskih parova

� batokromni i hiperkromni pomak

Faktori koji utiču na apsorpciju u UV/Vis području

Lambert-Beerov zakon

A = - log T = log Io / I = k × c × l

k = ε = molarna apsorptivnost

A = ε × c × l

UV-Vis-spektrofotometar

• izvor zračenja: hidrogenova ili živina lampa, volframova lampa

• monokromator: prizma ili rešetka s ulaznom i izlaznom pukotinom

• nosač uzorka• detektor zračenja

UV-Vis-spektrofotometar

‘Diode array’ instrument

� skala talasnih duljina

• otopina holmijeva perhlorata• dozvoljeno odstupanje ±1nm (UV) i ± 3 nm (Vis)

Kalibracija instrumenta

UV spektar otopine holmijeva perhlorata

� mjerna skala

• otopina kalijeva dihromata• dozvoljeno odstupanje

apsorbancije ± 0.01

UV spektar otopine kalijeva dihromata

� rezolucija (za kvalitativnu analizu)

• kontrolisana širinom pukotine • otopina toluena u heksanu,• omjer maksimuma (269 nm) i minimuma (266 nm) apsorpcije

1.kvalitativna ispitivanja

� potvrda identiteta lijekova: Ph. Eur.- Sekundarna identifikacija

� u monografiji je definisana talasna duzina maksimuma (± 2 nm) i specifična apsorbancija ili omjer apsorbancija na različitim talasnim duzinama

specifična apsorbancija

1%

Primjena UV/Vis spektrofotometrije u analitici lijekova

A1cm = 10εεε/Mr

apsorbancija otopine koja u 100 ml sadrži 1 g ispitivane tvari, debljina sloja 1cm

MERKAPTOPURINMercaptopurinum

IDENTIFICATION

A. Dissolve 20 mg in 5 ml of dimethyl sulphoxide R and dilute to 100 ml with 0.1 M hydrochloric acid. Dilute 5 ml of the solution to 200 ml with 0.1 M hydrochloric acid. Examined between 230 nm and350 nm (2.2.25), the solution shows only one absorption maximum, at 325 nm.

Primjeri u Ph. Eur.

MORFIN HIDROHLORIDMorphini hydrochloridum

IDENTIFICATION

A. Dissolve 10 mg in water R and dilute to 100.0 ml with the same solvent. Examined between 250 nm and 350 nm (2.2.25), the solution shows a single absorption maximum, at 285 nm. Thespecific absorbance at the maximum is about 41.

IBUPROFENIbuprofenum

IDENTIFICATION

B. Dissolve 50.0 mg in a 4 g/l solution of sodium hydroxideR and dilute to 100.0 ml with the same alkaline solution. Examined between 240 nm and 300 nm (2.2.25), using a spectrophotometer with a band width of 1.0 nm and a scanspeed of not more than 50 nm/min, the solution shows a shoulder at 258 nm and two absorption maxima, at 264 nm and 272 nm. The ratio of the absorbance measured at the maximum at 264 nm to that measured at the shoulder at 258 nm is 1.20 to 1.30. The ratio of the absorbance measuredat the maximum at 272 nm to that measured at the shoulderat 258 nm is 1.00 to 1.10.

UV spektar hidrokortizona i betametazona

λλλλmax = 240 nmA1cm

435390

1%

2. ispitivanje čistoće lijekova

OKSITETRACIKLINOxytetracyclinum

TESTSAbsorbance (2.2.25). Dissolve 20.0 mg in buffer solution pH 2.0 R and dilute to 100.0 ml with the same buffer solution. Dilute10.0 ml of the solution to 100.0 ml with buffer solution pH 2.0 R. The specific absorbance determined at 353 nm is 290 to 310, calculated with reference to the anhydrous substance.

a) specifična apsorbancija ( )

� ispitivano onečišćenje i ljekovita tvar imaju apsorpcijski maksimum na različitim talasnim duzinama ili različitu specifičnu apsorbanciju na istoj talasnoj duzini

A1cm1%

b) apsorbancija (A)

• ne smije preći odreñenu vrijednost

• ne smije biti veća od apsorbancije poredbene otopine koja sadrži gornju dozvoljenu količinu onečišćenja

ADRENALIN TARTARATAdrenalini tartras

TESTSAdrenalone. Dissolve 50.0 mg in0.01 M hydrochloric acid and diluteto 25.0 ml with the same acid. Theabsorbance (2.2.25) of thesolution measured at 310 nm isnot greater than 0.10.

REZERPINReserpinum

TESTSOxidation products. Dissolve 20 mg in glacial acetic acid R anddilute to 100.0 ml with the same acid. The absorbance (2.2.25) measured immediately at 388 nm is not greater than 0.10.

TESTSAbsorbance (2.2.25). The absorbance of solution S measured at 440 nm is not more than 0.10. (This limit corresponds to 0.035 per cent of omeprazoleimpurity F or omeprazole impurity G).

IMPURITIES

OMEPRAZOLOmeprazolum

F. R = OCH3, R′ = H: 1,3-dimethyl-8-methoxy-12- thioxopyrido[1′,2′:3,4]imidazo[1,2-a]benzimidazol-2(12H)-one,

G. R = H, R′ = OCH3 : 1,3-dimethyl-9-methoxy-12-thioxopyrido[1′,2′:3,4]imidazo[1,2-a]benzimidazol-2(12H)-one.

c) omjer apsorbancija (A1/A2) na dvije različite talasne duzine (ispitivana tvar, onečišćenje)

BACITRACINBacitracinum

TESTS

Bacitracin F and related substances. Dissolve 0.15 g in0.05 M sulphuric acid and dilute to 100.0 ml with the sameacid. Dilute 2.0 ml of this solution to 10.0 ml with 0.05 Msulphuric acid. The ratio of the absorbance (2.2.25) at290 nm to that at 252 nm is not greater than 0.20.

• Kvantitativna analiza lijekova

� odreñivanje pomoću specifične apsorbancije

lA

Ac

cm ×=

11%

� odreñivanje pomoću poredbene otopine

� odreñivanje pomoću kalibracione krive

• kalibraciona kriva prireñena pomoću poredbenih otopina

• linearan odnos apsorbancije i koncentracije

• sadržaj ispitivane tvari odredi se interpolacijom (povlačenjem pravca)

Kalibraciona kriva

HLORAMFENIKOLChloramphenicolum

ASSAY

Dissolve 0.100 g in water R and dilute to 500.0 ml with the same solvent. Dilute 10.0 ml of this solutionto 100.0 ml with water R. Measure the absorbance(2.2.25) at the maximum at 278 nm.

Calculate the content of C11H12Cl2N2O5 taking thespecific absorbance to be 297.

Primjer u Ph. Eur.

DIENESTROLDienestrolum

ASSAY

Dissolve 25.0 mg in ethanol R and dilute to 100.0 ml withthe same solvent. To 5.0 ml of this solution add 10 mlof ethanol R and dilute to 250.0 ml with 0.1 M sodiumhydroxide. Prepare a reference solution in the same manner using 25.0 mg of dienestrol CRS. Measure theabsorbance (2.2.25) of the solutions at the maximum at 245 nm.

Calculate the content of C18H18O2 from the measuredabsorbances and the concentrations of the solutions.

� derivatizacija analita prije odreñivanja

• analiza adrenalina u prisutnosti lokalnih anestetika

Povećanje selektivnosti i osjetljivosti u kvantitativnoj analizi

Primjer

apsorpcijski maksimumi u istom UV području

Fe λλλλmax = 540 nm

kompleks adrenalina s Fe2+

� derivatizacija onečišćenja prije kvantitativne analize

KARBASALAT KALCIJUMCarbasalatum calcicum

TESTS

Salicylic acid. In a 100 ml volumetric flask, dissolve 0.200 g in 80 ml of water R and add 10 ml of a 10 g/l solution of ferric nitrate R in a 80 g/l solution of dilute nitric acid R. Dilute to 100.0 ml withwater R. Immediately after preparation, measure the absorbance(2.2.25) of the solution at the maximum of 525 nm using water R as the compensation liquid. The absorbance is not greater than0.115 (0.5 per cent, expressed as salicylic acid).

Primjer

� pomak apsorpcijskog maksimuma podešavanjem pH vrijednosti otopine analita

λλλλmax = 299 nm

Primjer

• analiza acetilsalicilne kiseline u prisutnosti kofeina i dekstropropoksifena

• značajan utjecaj kod širokih apsorpcijskih maksimuma slabog nagiba

� derivativni spektri

Apsorpcijski spektri cefotaksim natrija (A) i cefadroksil monohidrata (B)

cefotaksim natrij

cefadroksil monohidrat

Prva derivacija Druga derivacijaapsorpcijskih spektara

cefotaksim natrija (A) i cefadroksil monohidrata (B)

4. odreñivanje fizikalno-kemijskih svojstava lijekova(pretformulacijska i formulacijska istraživanja)

a) odreñivanje topljivosti lijeka

• otapanje lijeka u vodi ili puferu i mjerenje apsorbancijenakon uspostavljanja ravnoteže

• prevoñenje lijeka u neionizirani oblik i mjerenje zamućenja

b) odreñivanje koeficijenta raspodjele lijeka

c) ispitivanje stabilnosti lijeka

• razgradni produkti imaju različit apsorpcijski maksimum od ishodne ispitivane tvari

• praćenje kinetike razgradnje lijeka

d) odreñivanje pKa vrijednosti

• pH ovisan UV pomak ionizirane i neionizirane grupe

AuA

AAipHpKa

−−+= log

UV spektar fenilefrina u kiselom i lužnatom mediju

A - apsorbancija u puferu poznate pH vrijednostiAi - apsorbancija potpuno ionizirane vrste Au- apsorbancija potpuno neionizirane vrste

e) odreñivanje oslobañanja lijeka iz formulacije

(dissolution testing)

• rutinska metoda za praćenje oslobañanja aktivne tvari

Oslobañanje pseudoefedrina iz dozirnog oblika

Posebnosti metode

Ograničenja metode

� jednostavna, jeftina, izdržljiva i precizna metoda za odreñivanje lijekova

� rutinska metoda za odreñivanje fizikalno-kemijskih svojstava lijekova

� upotreba derivativnih spektara rješava probleme osnovne metode

� umjereno selektivna; selektivnost ovisi o kromoforupojedinog lijeka

� slabo primjenjiva u analizi smjesa