ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝΑΝΟΙΚΤΑ ΑΚΑΔΗΜΑΪΚΑ ΜΑΘΗΜΑΤΑΕργαστήριο Βιοχημείας

Καλλιέργεια του Βακτηρίου Ε.coliDH5a/pUC18 και απομόνωση πλασμιδιακού DNAΔιδάσκοντες: Αναπλ. Καθ. A. E. Κούκκου, Καθ. M. E. Λέκκα, Αναπλ. Καθ. Ε. Πάνου, Καθ. Ε. Παπαμιχαήλ, Καθ. Α. Τσελέπης, Καθ. Δ. Τσουκάτος

Άδειες Χρήσης

• Το παρόν εκπαιδευτικό υλικό υπόκειται σεάδειες χρήσης Creative Commons. • Για εκπαιδευτικό υλικό, όπως εικόνες, που υπόκειται σε άλλου τύπου άδειας χρήσης, η άδεια χρήσης αναφέρεται ρητώς.

63

ΑΣΚΗΣΕΙΣ 4 και 5

ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΤΟΥ ΒΑΚΤΗΡΙΟΥ Ε.COLI DH5Α/pUC18 ΚΑΙ

ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΠΛΑΣΜΙΔΙΑΚΟΥ DΝΑ

1. Γενικό μέρος

Α. Καλλιέργειες μικροοργανισμών

Β. Αποστείρωση

Γ. Απομόνωση και προσδιορισμός DΝΑ

Δ. Βασικές αρχές απομόνωσης του DΝΑ

Ε. Προσδιορισμός του DΝΑ

2. Πειραματικό μέρος

DΝΑ Ι (Άσκηση 4)

DΝΑII (Άσκηση 5)

64

65

1. ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

Α. ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ ΜΙΚΡOΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ

Καλλιέργεια μικροοργανισμών σημαίνει ανάπτυξη πληθυσμών μικροοργανισμών σε

καθορισμένες συνθήκες ανάπτυξης, όσον αφορά τη σύσταση του θρεπτικού υλικού, το pΗ, τη

θερμοκρασία κ.λ.π.

Κάτω από κατάλληλες συνθήκες ανάπτυξης σε υγρό θρεπτικό υλικό, τα κύτταρα

διαιρούνται σε κανονικά χρονικά διαστήματα και η αύξηση του πληθυσμού των κυττάρων,

διέρχεται από τέσσερις φάσεις: 1) Φάση εφησυχασμού, 2) Εκθετική φάση ανάπτυξης, 3)

Στατική φάση και 4) Φάση θανάτου (σχήμα 1) .

Σχήμα 1: Καμπύλη ανάπτυξης βακιηριακού στελέχους σε υγρή καλλιέργεια.-a. περίοδος εφησυχασμού,

β.εκθετική φάση, γ. στατική φάση, δ. τάση θανάτου (Σημειώσεις Βιοτεχνολογίας Κ. Δραΐνας, Ιωάννινα

1987)

Για την παρακολούθηση της ανάπτυξης υγρής καλλιέργειας μικροοργανισμών

χρησιμοποιούνται διάφοροι μέθοδοι κυριότερες των οποίων είναι:

α. Μέτρηση της οπτικής πυκνότητας (Ο.D.) της καλλιέργειας.

β. Μέτρηση του αριθμού των κυττάρων με μικροσκοπική παρατήρηση.

γ. Προσδιορισμός της ολικής πρωτεΐνης.

δ. Προσδιορισμός του ξηρού βάρους των κυττάρων κ.ά.

Εκτός όμως από τις υγρές καλλιέργειες, υπάρχουν και οι στερεές καλλιέργειες, όπου

στο θρεπτικό υλικό προστίθεται κάποια πηκτωματοποιητική ύλη (αγαρ) και το υλικό

απλώνεται σε ειδικά δοχεία (τρυβλία Petri)

66

Β. ΑΠΟΣΤΕΙΡΩΣΗ

Απαραίτητη προϋπόθεση για την επίτευξη μιας καθαρής καλλιέργειας

μικροοργανισμών είναι η απαλλαγή της από ανεπιθύμητες προσμίξεις άλλων

μικροοργανισμών. Για το λόγο αυτό τα θρεπτικά υλικά και σκεύη που θα

χρησιμοποιηθούν, πρέπει να είναι αποστειρωμένα.

Αποστείρωση ενός υλικού είναι η καταστροφή όλων των μικροοργανισμών, σε

οποιαδήποτε μορφή και αν υπάρχουν. Αποστείρωση μπορεί να επιτευχθεί:

α. με θέρμανση (υγρή ή ξηρή αποστείρωση)

β. με ακτινοβολίες (UV, ακτίνες x ή γ)

γ. με μηχανικές μεθόδους (διήθηση, φυγοκέντρηση, απορρόφηση σε ιοντοανταλλακτικές

στήλες).

Γ. ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΚΑΙ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ DΝΑ

Ι. Θεωρητικό Μέρος

Γενικά

Το DΝΑ είναι νουκλεϊνικό οξύ (Deoxyribo-Nucleic-Acid). Είναι το γενετικό υλικό

(κληρονομικό υλικό) των ζωντανών οργανισμών. Περιέχει όλη την πληροφορία για την

ανάπτυξη, λειτουργία και αναπαραγωγή των κυττάρων. Μέσα στο κύτταρο το DΝΑ

μπορεί να έχει διάφορες μορφές π.χ. χρωμόσωμα, πλασμίδιο, μιτοχονδριακό DΝΑ κλπ.

Τα χρωμοσώματα προκαρυωτικών οργανισμών (π.χ. Βακτήρια, βάκιλλοι), τα

πλασμίδια και τα μιτοχονδριακά DΝΑ είναι καθαρό DΝΑ, ενώ τα χρωμοσώματα

ευκαρυωτικών οργανισμών (π.χ. μύκητες, ζυμομύκητες, φυτά, ζώα κλπ.) είναι

σύμπλοκα του DΝΑ με πρωτεΐνες. Το μόριο του DΝΑ είναι μια διπλή αλυσίδα από

δεοξυριβονουκλεοτίδια που συγκρατούνται με φωσφοδιεστερικούς δεσμούς μεταξύ της 3'

- ΟΗ ομάδας και της 5' -PO4 ομάδας. Οι δυο αλυσίδες συγκρατούνται με

υδρογονοδεσμούς μεταξύ των απέναντι πουρινικών και πυριμιδινικών βάσεων (σχήμα.

2). Το DΝΑ στο χώρο έχει τη μορφή μιας διπλής έλικας, (δευτεροταγής δομή ή κατ'

άλλους τεταρτοταγής).

67

Σχήμα 2: Η δομή του DNA:α) φωσφοδιεστερικός δεσμός, β) υδρογονοδεσμοί μεταξύ των

βάσεων, γ) η διπλή έλικα.

Το DΝΑ είναι πάρα πολύ μεγάλο μόριο (1-100 Μd), πολύ μεγαλύτερο από το RΝΑ και

τις πρωτεΐνες. Το μέγεθος ποικίλει ανάλογα με το είδος του DΝΑ, π.χ. τα πλασμίδια έχουν

συνήθως μικρότερο ενώ τα χρωμοσώματα έχουν πολύ μεγαλύτερο μοριακό βάρος. Το

μέγεθος του DΝΑ κάνει την απομόνωση του δύσκολη γιατί οι μηχανικές πιέσεις, η

θερμοκρασία, η δράση αποσυνθετικών ενζύμων (νουκλεάσες) κλπ. μπορεί να κόψουν το

DΝΑ σε μικρότερα τμήματα με αποτέλεσμα να διευκολύνουν την παραπέρα αποσύνθεση

του. Αυτό είναι ένα μεγάλο εμπόδιο για περιπτώσεις που επιδιώκεται να απομονωθεί ένα

τμήμα DΝΑ που περιέχει μια συγκεκριμένη γενετική πληροφορία (γονίδιο). Σ' αυτές τις

περιπτώσεις το DΝΑ που απομονώνεται πρέπει να έχει πολύ μεγάλο μοριακό βάρος ώστε

να υπάρχει πιθανότητα να περιέχει άθικτο το τμήμα της πληροφορίας του ενδιαφέροντος.

Το DΝΑ έχει ορισμένες χαρακτηριστικές φυσικές και χημικές ιδιότητες που

διευκολύνουν την απομόνωση τους και οπωσδήποτε τον προσδιορισμό του σε διάκριση

από τα άλλα νουκλεϊνικά οξέα (RΝΑ) και τις πρωτεΐνες.

Φυσικές και Χημικές Ιδιότητες του DΝΑ

α. Συμπεριφορά σε αλκαλικό περιβάλλον: Σε ήπιο αλκαλικό περιβάλλον (π.χ. 0.3

Μ ΚΟΗ) οι Ν-γλυκοσιδικοί δεσμοί και οι φωσφοδιεστερικοί δεσμοί του DΝΑ είναι

σταθεροί, ενώ οι φωσφοδιεστερικοί δεσμοί του συγγενικού του RΝΑ είναι ασταθείς. Αυτό

οφείλεται στη 2' - ΟΗ της ριβόζης του RΝΑ.

β. Συμπεριφορά σε όξινο περιβάλλον: Ήπιες όξινες συνθήκες έχουν μικρή

επίδραση στο DΝΑ. Ενδιάμεσα όξινες συνθήκες (π.χ. παρατεταμένη έκθεση σε αραιά οξέα

2 nm

κυτοσίνη 0.34 nm

3,4 nm γ

68

και αυξημένη θερμοκρασία) προκαλούν καταλυτική όξινη υδρόλυση των Ν-γλυκοσιδίων

των πουρινών. Πολύ όξινες συνθήκες (π.χ. βρασμός με 6-10Ν ΗCl) καταλύει αρχικά την

ποσοτική απομάκρυνση των πουρινών και μιας μικρής ποσότητας (= 5) των πυριμιδινών.

Στη συνέχεια καταλύεται η αφυδρογόνωση της D-δεοξυριβόζης που σχηματίζει ω-

υδροξυλεβουλινυλική αλδεΰδη (σχήμα 3).

Σχήμα 3: Υδρόλυση του DNA σε ισχυρά όξινο περιβάλλον

γ. Επίδραση pΗ, θερμοκρασίας, αλάτων. Αυξημένο pΗ και θερμοκρασία σε

χαμηλή συγκέντρωση αλάτων έχουν αποτέλεσμα τον διαχωρισμό των δύο αλυσίδων

του DΝΑ (καταστροφή της διπλής έλικας - μετουσίωση). Αυτό οφείλεται στην

αποσύνδεση των υδρο-γονοδεσμών μεταξύ των βάσεων των δύο αλυσίδων. Βαθμιαία

πτώση της θερμοκρασίας έχει αποτέλεσμα την επανασύνδεση των υδρογονοδεσμών και

αποκατάσταση της διπλής έλικας. Απότομη πτώση της θερμοκρασίας (quenching)

μονιμοποιεί τη μετουσίωση του DΝΑ.

δ. Απορρόφηση στο υπεριώδες (UV): Τα νουκλεϊνικά οξέα, τα νουκλεοτίδια και

τα νουκλεοσίδια, εμφανίζουν εκτεταμένη απορρόφηση στο UV, η οποία οφείλεται στις

αζωτούχες βάσεις (πουρίνες, πυριμιδίνες) που περιέχουν. Κάθε μία από τις βάσεις αυτές

έχει τη δική της χαρακτηριστική απορρόφηση που εξαρτάται από το pΗ (σχήμα 4). Το

άθροισμα των απορροφήσεων των διαφόρων βάσεων που περιέχονται σ' ένα μόριο

νουκλεϊνικού οξέος δίνει τη συνολική απορρόφηση του μορίου αυτού, που έχει λmax 260

nm. Η απορρόφηση είναι απόλυτα ανάλογη με την συγκέντρωση του οξέος και έχει

βρεθεί ότι σε διάλυμα 1 mg/ml νουκλεϊνικού οξέος που στερείται δομής διπλής έλικας

και σε pΗ ουδέτερο, η απορρόφηση στα 260 nm είναι 25 (για κυψελίδα με πλευρά 1 cm).

69

Σχήμα 4: Χαρακτηριστικά φάσματα απορρόφηση των νουκλεοσιδίων στο UV

() = pH 7, ( ) = pH 1, (- - -) = pH 13

Η δομή-διπλής έλικας μειώνει

την απορρόφηση των νουκλεϊνικών

οξέων γιατί οι αζωτούχες βάσεις

των δύο αλυσίδων συνδέονται

μεταξύ τους με δεσμούς υδρογόνου.

Έτσι σε διάλυμα 1 mg/ml DΝΑ με

δομή διπλής έλικας και σε ρΗ

ουδέτερο η απορρόφηση στα 260

nm είναι 20 (για κυψελίδα με

πλευρά 1 cm).

Το φαινόμενο της μείωσης της

απορρόφησης UV ενός νουκλεϊνικού

οξέος εξ αιτίας της δημιουργίας της

δομής της διπλής έλικας καλείται

υποχρωμικό φαινόμενο, ενώ

αντίστροφα το φαινόμενο της

αύξησης της απορρόφησης ΙΙΥ του

νουκλεϊνικού οξέος εξ αιτίας της

καταστροφής της δευτεροταγούς του

δομής λέγεται υπερχρωμικό

φαινόμενο.

ε. Αντίδραση με χρωστικές: Το

βρωμιούχο αιθίδιο (ethidium bromide-

EtBr, σχήμα 5) ενσωματώνεται στην

αλυσίδα του DΝΑ μεταξύ γειτονικών

νουκλεοτιδίων. Σύμπλοκο DΝΑ-EtBr φθορίζει στο υπεριώδες φως. Αυτό διευκολύνει την

ανίχνευση του DΝΑ σε gel ή σε κλίσεις. Η χρωστική διαμινοφαινυλινδόλη (DAPI)

σχηματίζει δεσμούς εκλεκτικά με περιοχές του DΝΑ πλούσιες σε Α-Τ. Η DΑΡΙ δεν

δεσμεύεται με RΝΑ και φθορίζει στο υπεριώδες.

70

Δ. ΒΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗΣ ΤΟΥ DΝΑ

Γενικά

α) Η μέθοδος απομόνωσης του DΝΑ εξαρτάται κυρίως από το είδος του DΝΑ. Για

παράδειγμα η απομόνωση μιτοχονδριακού ή χρωμοσωμικού DΝΑ προαπαιτεί την

απομόνωση μιτοχονδρίων ή πυρήνων αντίστοιχα. Η απομόνωση πλασμιδιακού DΝΑ

περιλαμβάνει στάδια που καταστρέφουν το χρωμοσωμικό DΝΑ. Οποιαδήποτε όμως και

αν είναι η μέθοδος χρειάζεται μεγάλη προσοχή στη μεταχείρηση του DΝΑ. Ιδιαίτερα αν

επιδιώκεται να απομονωθεί όσο μεγαλύτερο μόριο είναι δυνατό. Πρέπει να

αποφεύγονται: α) οι μηχανικές πιέσεις (π.χ. βίαια ανατάραξη, μεταφορά με πιπέτες

μικρού ανοίγματος κλπ.) β) να αγγίζονται με γυμνά δάκτυλα ότι δοχεία έρχονται σε

επαφή με το DΝΑ. Το δέρμα φέρει νουκλεάσες που καταστρέφουν το DΝΑ γ) η

χρησιμοποίηση μη αποστειρωμένων διαλυμάτων και δοχείων, γιατί υπάρχει κίνδυνος

το DΝΑ του οργανισμού που απομονώνεται να περιέχει ίχνη DΝΑ άλλων

μικροοργανισμών, δ) θερμοκρασίες μεγαλύτερες των 4°C για να ελαχιστοποιηθεί η

δράση αποσυνθετικών ενζύμων και η μετουσίωση του DΝΑ.

β. Προετοιμασία των Κυττάρων

Το πρώτο βήμα στην απομόνωση του DΝΑ είναι ο εκχυλισμός των κυττάρων

στα οποία περιέχεται. Αυτό θα πρέπει να γίνει όσο πιο ήπια γίνεται για να

αποφευχθεί σπάσιμο του DΝΑ. Η μέθοδος εκχυλισμού είναι ανάλογος με το είδος

των κυττάρων που χρησιμοποιούνται. Για παράδειγμα κύτταρα μικροοργανισμών

και φυτικών ιστών περιβάλλονται από κυτταρικό τοίχωμα, ενώ κύτταρα ζωικών

ιστών δεν περιβάλλονται από κυτταρικό τοίχωμα. Το κυτταρικό τοίχωμα θα πρέπει

πρώτα να αφαιρεθεί ώστε να γίνει ο εκχυλισμός του κυττάρου που απομένει

(πρωτοπλάστης) λιγότερο βίαιος.

γ. Απομάκρυνση πρωτεϊνών

Πρωτεΐνες καθώς και άλλες ενδομοριακές ενώσεις (π.χ. λιπίδια) μπορούν να

απομακρυνθούν με εκχυλίσεις με φαινόλη ή χλωροφόρμιο-ισοαμυλική αλκοόλη

(24:1). Πρωτεΐνες και RΝΑ μπορούν να απομακρυνθούν από το διάλυμα που περιέχει

το DΝΑ με την επώαση με πρωτεάσες ή RΝάσες αντίστοιχα. Τα πρώτα είναι ένζυμα

που αποσυνθέτουν πρωτεΐνη, ενώ τα δεύτερα είναι νουκλεάσες που αποσυνθέτουν

ειδικά RΝΑ.

71

δ. Κατακρίμνηση του DΝΑ

Το DΝΑ είναι αδιάλυτο σε υψηλή συγκέντρωση αιθανόλης (70%) σε χαμηλές

θερμοκρασίες (-20°C). Οι συνθήκες αυτές κάνουν δυνατή την εκλεκτική κατακρίμνηση

του DΝΑ.

ε. Διαχωρισμός του DΝΑ

Η χαρακτηριστική πυκνότητα του DΝΑ (1.4-1.6) κάνει δυνατό εκλεκτικό

διαχωρισμό του από οποιαδήποτε άλλη μεγαλομοριακή ενδοκυτταρική ουσία. Για το

διαχωρισμό βάση της πυκνότητας χρησιμοποιούνται ευθύγραμμες κλίσεις χλωριούχου

κέσιου με υπερφυγοκέ-ντριση (1x10) μεγάλης διάρκειας (40 h). Στο διάλυμα που περιέχει

DΝΑ προστίθεται CsCI σε ποσότητα που να δίνει πυκνότητα διαλύματος ίση με την

πυκνότητα του DΝΑ. Κατά τη διάρκεια της φυγοκέντρησης σχηματίζεται μια ευθύγραμμη

κλίση πυκνότητας CsCl μέσα στο φυγοκεντρικό σωλήνα. Το DΝΑ συγκεντρώνεται στη

ζώνη εκείνη όπου η πυκνότητα του είναι ίση με την πυκνότητα της κλίσης.

DΝΑ μπορεί να διαχωριστεί κατά μοριακό βάρος με ηλεκτροφόρηση σε gel

αγαρόζης. Μετά την ηλεκτροφόρηση το gel χρωματίζεται με βρωμιούχο αιθίδιο και οι

δέσμες του DΝΑ επάνω στο gel γίνονται ορατές στο υπεριώδες φως. Η δέσμη του DΝΑ

που ενδιαφέρει μπορεί εύκολα να εκχυλιστεί από το gel. DΝΑ μπορεί να διαχωριστεί κατά

μοριακό βάρος και με υ-περφυγοκέντριση σε ευθύγραμμες κλίσεις συγκέντρωσης

σακχάρων.

Ε. Προσδιορισμός του DΝΑ

1. Ποιοτικός Προσδιορισμός: Αυτός μπορεί να γίνει με ηλεκτροφόρηση σε gel

αγαρόζης και σύγκριση με πρότυπα δείγματα DΝΑ που ηλεκτροφορούνται παράλληλα με

το άγνωστο δείγμα DΝΑ.

2. Ποσοτικός Προσδιορισμός: α) Φωτομετρικός προσδιορισμός με έγχρωμα

αντιδραστήρια: Αντιδραστήρια όπως η διφαινυλαμίνη, (σχ. 5) ή ορκινόλη κ.ά.

χρησιμοποιούνται συνήθως για φωτομετρικό προσδιορισμό του DΝΑ.

Η μέθοδος αυτή βασίζεται στη διάσπαση των Ν-γλυκοσιδικών και

φωσφοδιεστερικών δεσμών του DΝΑ σε ισχυρά όξινο περιβάλλον και ψηλή θερμοκρασία.

Η δεσοξυριβόζη που ελευθερώνεται αφυδρογονούται σε ω-υδροξυλεβουλινική αλδεΰδη.

Αυτή τελικά αντιδρά με διφαινυλαμίνη και δίνει ένα μπλε προϊόν που απορροφά στα 595

nm.

72

Σχήμα 5: α) Βρωμιούχο αιθίδιο, β) υδροξυλεβουλινική αλδεϋδη, γ) διφαινυλαμίνη

β) Απορρόφηση στο υπεριώδες: Όπως αναφέρθηκε πιο πάνω το DΝΑ απορροφά

στα 260 nm. Η απορρόφηση είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του DΝΑ (όταν όλα τα

μόρια DΝΑ του διαλύματος έχουν την ίδια δευτεροταγή δομή). Συγκρίνοντας την

απορρόφηση με απορροφήσεις πρότυπων διαλυμάτων DΝΑ γίνεται ποσοτικός

προσδιορισμός.

γ) Φθορισμός συμπλοκών DΝΑ-DΑΡΙ: Ο φθορισμός συμπλοκών DΝΑ-DΑΡΙ είναι

ανάλογος της συγκέντρωσης των συμπλοκών και επομένως του DΝΑ. Προσθέτοντας

DΑΡΙ στο άγνωστο και στο πρότυπο διάλυμμα DΝΑ μπορεί να γίνει ποσοτικός

προσδιορισμός του πρώτου συγκρίνοντας τις τιμές φθορισμού των δύο.

2. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

Εισαγωγικά

Στην άσκηση θα χρησιμοποιηθεί το βακτήριο Escerichia coli στέλεχος

DH5a/pUC18. Το Ε. coli είναι ένα αρνητικό κατά Gram εντεροβακτήριο. Παρασιτεί

στο παχύ έντερο του ανθρώπου. Το στέλεχος DH5a δεν είναι παθογόνο. Η Ε. coli

αναπτύσσεται πολύ γρήγορα. Ο χρόνος αναδιπλασιασμού σε πλούσιο θρεπτικό υλικό

είναι 20 min. Η ανάπτυξη του βακτηρίου σε μη ανανεώσιμες καλλιέργειες

περιλαμβάνει ένα διάστημα προσαρμογής στο θρεπτικό υλικό που δεν παρατηρείται

ανάπτυξη (lag period), ένα διάστημα εκθετικής ανάπτυξης (exponential growth) και

τέλος ένα διάστημα πλατώ που οφείλεται στην παύση της ανάπτυξης λόγω έλλειψης

θρεπτικών υλικών (σχήμα 1).

73

Η άσκηση περιλαμβάνει μικροβιακές τεχνικές σε άσηπτες συνθήκες. Πρέπει να

ακολουθηθεί μια διαδικασία ρουτίνας με σκοπό να αποφεύγονται οι μολύνσεις. Η

διαδικασία αυτή περιλαμβάνει:

α) Χρησιμοποίηση αποστειρωμένων γυάλινων σκευών, διαλυμάτων και εργαλείων

που έρχονται σε επαφή με τα βακτηριακά κύτταρα.

β) Κάψιμο στη φλόγα λύχνου bunsen του στομίου όλων των γυάλινων σκευών

στα οποία περιέχονται διαλύματα ή κυτταρικά αιωρήματα, πριν και μετά τη μεταφορά

του περιεχομένου τους.

γ) Διατήρηση της πόρτας κλειστής και μετακίνησης μέσα στον εργαστηριακό χώρο

περιορισμένης για να αποφεύγονται τα ρεύματα μέρος που διευκολύνουν τις μολύνσεις.

δ) Ήρεμες κινήσεις κατά τη διάρκεια του πρακτικού μέρους της άσκησης για να

αποφεύγονται απρόοπτα δυστυχήματα.

Για περισσότερες πληροφορίες μικροβιακών τεχνικών βλέπε Πρακτική Βιοχημεία β.

Μ. Καπούλα.

ε) Αποστείρωση του πάγκου, που δουλεύουμε τις καλλιέργειες. Η αποστείρωση

γίνεται μεEtOH 70%.

DΝΑ Ι (Άσκηση 4)

Απομόνωση πλασμιδιακού DΝΑ από κύτταρα E. coli

• Φυγοκέντρηση 1.5 ml καλλιέργειας για 2 min σε μικροφυγόκεντρο.

• Απόχυση του υπερκείμενου και επανεώρηση των κυττάρων σε 100 μl διαλύματος 1.

Παραμονή 5 min σε θερμοκρασία δωματίου.

• Προσθήκη 200 μl διαλύματος II και ανάδευση ελαφρά. Παραμονή 5 min στον πάγο.

• Προσθήκη 150 μl διαλύματος III και ανάδευση ελαφρά. Παραμονή 5 min στον πάγο.

• Φυγοκέντρηση 10 min σε θερμοκρασία δωματίου.

• Μεταφορά 400 μl από το υπερκείμενο σε νέο σωληνάκι eppendorf και προσθήκη 320

μl παγωμένης ισοπροπυλικής αλκοόλης (0.8 του αρχικού όγκου).

• Φυγοκέντρηση 10 min σε θερμοκρασία δωματίου.

• Απομάκρυνση προσεκτική του υπερκείμενου.

• Επανεώρηση του ιζήματος σε 300 μl διαλύματος ΤΕ.

• Προσθήκη 30 μl δ. CΗ3CΟΟΝa, 3Μ, pΗ 5.5 και 800 μl παγωμένης (-20°C) αιθανόλης

95%. Παραμονή 15 min στους -70°C.

74

• Φυγοκέντρηση 15 min στους 4°C.

• Απομάκρυνση του υπερκείμενου.

• Ξήρανση του ιζήματος για 5 min υπό κενό.

• Επανεώρηση σε 20 μl νερού. Φύλαξη στο ψυγείο.

Διάλυμα Ι Διάλυμα II

(0.2Ν ΝaΟΗ σε 1 % SDS)

Διάλυμα III

50 mΜ γλυκόζης 80μl ΝaΟΗ 10Ν 6 ml CΗ3ΟΟΟΚ 5Μ

25 mM Τris pΗ 8.0 400 μl SDS 10% 1.15 ml CΗ3ΟΟΟHglacial

10 mΜ ΕDΤΑ 2520 μl Η2Ο 2.85 ml Η2Ο

5 mg/ml λυσοζύμη Σύνολο =3 ml Σύνολο =10 ml

DΝΑ II (Άσκηση 5)

Καλλιέργεια του βακτηρίου E. Coli DH5a/pUC18

και ηλεκτροφόρηση πλασμιδιακού DΝΑ

1. Υγρή καλλιέργεια του βακτηρίου E. Coli DH5a/pUC18

Θρεπτικά υλικά

Υγρό θρεπτικό υλικό Luria (100 ml)

1g Bacto-tryptone

0.5 g yeast excract

1 g NaCl

0.15 ml ΝaΟΗ 1Ν, ώστε να έχουμε τελικό pΗ ~ 7.5

-

II. Καλλιέργεια του βακτηρίου

100 ml υγρού θρεπτικού υλικού Luria εμβολιάζονται με κύτταρα Ε. coli από υγρή

προκαλλιέργεια και επωάζονται υπό ανάδευση στους 37°C. Κάθε 30 min λαμβάνονται

δείγματα 2 ml από την καλλιέργεια, αραιώνονται 1:1 με dΗ2O και μετράται η

απορρόφηση τους στα 600 nm. Η ανάπτυξη της καλλιέργειας παρακολουθείται

σημειώνοντας σε ημιλογαριθμικό χαρτί την οπτική πυκνότητα του δείγματος σε

συνάρτηση με τον χρόνο επώασης.

75

2. Ηλεκτροφόρηση του πλασμιδιακού DΝΑ

Ι. Αντιδραστήρια

Διάλυμα ΤΒΕ (Tris-Borate): 0.089 Μ Tris-HCl

0.089 Μ Βορικό οξύ

0.2Μ EDTA pΗ 8.0

Το διάλυμα παρασκευάζεται σε συγκέντρωση 10 φορές μεγαλύτερη (10Χ) και

φυλάσσεται σε θερμοκρασία δωματίου.

Το τελικό διάλυμα (1X) παρασκευάζεται λίγο πριν την ηλεκτροφόρηση με κατάλληλη

αραίωση του διαλύματος (10Χ).

Για 1L, ζυγίζονται 108 g Tris και 55 g βορικού οξέος, ενώ προστίθενται 100 ml 0.5 Μ

ΕDΤΑ pΗ 8.0. Ο τελικός όγκος του διαλύματος ρυθμίζεται με απιονισμένο νερό.

Διάλυμα βρωμιούχου αιθιδίου (ΕtBr): 3 mg/ml.

ΠΡΟΣΟΧΗ ΜΕΤΑΛΛΑΞΟΓΟΝΟ! Χρησιμοποιείται μόνο από τους υπεύθυνους της

άσκησης.

Ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης: 0.25% (w/ν) κυανούν βρωμοφαινόλης

0.25% (w/ν) κυανολικoξυλένιο (xylenecyanol)

30% γλυκερόλη (διατηρείται στους 4°C).

II. Παρασκευή πήγματος αγαρόζης - Ηλεκτροφόρηση

• 0.4 g αγαρόζης προστίθενται σε 50 ml διαλύματος ΤΒΕ 1X και διαλύονται με

θέρμανση σε λύχνο. Στη συνέχεια αφού η θερμοκρασία του διαλύματος φτάσει

περίπου στους 50°C προστίθεται διάλυμα βρωμιούχου αιθιδίου και αποχύνεται στην

αντίστοιχη θέση της συσκευής ηλεκτροφόρησης. Μετά την πήξη του πήγματος,

αφαιρείται το κτένι ώστε να δημιουργηθούν τα φρεάτια. Προστίθεται το ρυθμιστικό

διάλυμα ΤΒΕ 1X μέχρι ύψους 0.5 επί πάνω από την επιφάνεια του πήγματος.

• Στα δείγματα του DΝΑ προστίθεται δ. φόρτωσης (3μ1) και γίνεται φόρτωση των

δειγμάτων στα φρεάτια με μικροπιπέττα Gilson.

• Εφαρμόζεται τάση 40 V και η ηλεκτροφόρηση πραγματοποιείται σε θερμοκρασία

δωματίου.

• Το πέρας της ηλεκτροφόρησης καθορίζεται από τη θέση των χρωστικών πάνω στο

πήγμα.

• Το πήγμα εκτίθεται σε συσκευή υπεριώδους ακτινοβολίας προκειμένου να γίνουν

76

ορατές οι ζώνες του DΝΑ, οι οποίες φθορίζουν.

3. Στερεή καλλιέργεια του βακτηρίου E. coli DH5a.

Ι. Θρεπτικά υλικά

Θρεπτικό υλικό Luria+ 2% άγαρ

Π. Καλλιέργεια του βακτηρίου

Αποικίες από τρυβλίο καλλιέργειας E. Coli DH5a μεταφέρονται

με συρμάτινη θηλειά σε νέο τρυβλίο, διασπείρονται γραμμικά

όπως φαίνεται στο σχήμα που ακολουθεί και στη συνέχεια

τοποθετούνται σε επωαστικό θάλαμο των 37°C για επώαση.

Τέλος Ενότητας

Χρηματοδότηση• Το παρόν εκπαιδευτικό υλικό έχει αναπτυχθεί στα

πλαίσια του εκπαιδευτικού έργου του διδάσκοντα.• Το έργο «Ανοικτά Ακαδημαϊκά Μαθήματα στο

Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων» έχει χρηματοδοτήσει μόνο τη αναδιαμόρφωση του εκπαιδευτικού υλικού.

• Το έργο υλοποιείται στο πλαίσιο του Επιχειρησιακού Προγράμματος «Εκπαίδευση και Δια Βίου Μάθηση» και συγχρηματοδοτείται από την Ευρωπαϊκή Ένωση (Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο) και από εθνικούς πόρους.

Σημειώματα

Σημείωμα Ιστορικού Εκδόσεων Έργου

Το παρόν έργο αποτελεί την έκδοση 1.0. Έχουν προηγηθεί οι κάτωθι εκδόσεις:• Έκδοση 1.0 διαθέσιμη εδώ.http://ecourse.uoi.gr/course/view.php?id=1374.

Σημείωμα ΑναφοράςCopyright Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων, Διδάσκοντες: Αναπλ. Καθ. A. E. Κούκκου, Καθ. M. E. Λέκκα, Αναπλ. Καθ. Ε. Πάνου, Καθ. Ε. Παπαμιχαήλ, Καθ. Α. Τσελέπης, Καθ. Δ. Τσουκάτος. «Εργαστήριο Βιοχημείας. Καλλιέργεια του Βακτηρίου Ε.coli DH5a/pUC18 και απομόνωση πλασμιδιακού DNA». Έκδοση: 1.0. Ιωάννινα 2014. Διαθέσιμο από τη δικτυακή διεύθυνση: http://ecourse.uoi.gr/course/view.php?id=1374.

Σημείωμα Αδειοδότησης

• Το παρόν υλικό διατίθεται με τους όρους της άδειας χρήσης CreativeCommons Αναφορά Δημιουργού -Παρόμοια Διανομή, Διεθνής Έκδοση 4.0 [1] ή μεταγενέστερη.

• [1] https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/.