ISOLASI BAKTERI

I. PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Di alam populasi mikroba tidak terpisah sendiri menurut jenisnya, tetapi terdiri dari campuran berbagai macam sel. Di dalam laboratorium populasi bakteri ini dapat diisolasi menjadi kultur murni yang terdiri dari satu jenis yang dapat dipelajari morfologi, sifat dan kemampuan biokimiawinya. Di dalam bidang ilmu mikrobiologi, untuk dapat menelaah bakteri khususnya dalam skala laboratorium, maka terlebih dahulu kita harus dapat menumbuhkan mereka dalam suatu biakan yang mana di dalamnya hanya terdapat baktri yang kita butuhkan tersebut tanpa adanya kontaminasi dari mikroba lain. Biakan yang semacam ini biasanya dikenal dengan istilah biakan murni. Untuk melakukan hal ini, haruslah di mengerti jenis- jenis nutrien yang disyaratkan bakteri dan juga macam ligkungan fisik yang menyediakan kondisi optimum bagi pertumbuhan bakteri tersebut (Pelczar, 1986). Selain teknik pertumbuhan bakteri atau teknik isolasi di atas, dikenal juga adanya teknik isolasi mikroba yaitu inokulasi yang merupakan suatu teknik pemindahan suatu biakan tertentu dari medium yang lama ke medium yang baru dengan tujuan untuk mendapatkan suatu biakan yang murni tanpa adanya kontaminasi dari mikroba yang lain yang tidak dinginkan. Mikroorganisme (bakteri, fungi /cendawan, protozoa, dan mikroorganisme lain) yang terdapat di ikan dan lingkungan budidayanya umumnya terdapat dalam populasi campuran. Untuk mencirikan dan mengidentifikasi suatu species mikroorganisme tertentu, pertama-tama mikroorganisme tersebut harus dapat dipisahkan dari mikroorganisme lain yang umum dijumpai dalam habitatnya, lalu ditumbuhkan menjadi biakan murni. Biakan murni diperlukan karena semua metode mikrobiologis yang digunakan dalam menelaah dan mengidentifikasi mikroorganisme memerlukan suatu populasi yang terdiri dari satu macam mikrorganisme saja. Ada beberapa metode untuk memperoleh biakan murni dari suatu sampel tertentu. Dua diantaranya yang paling digunakan adalah metode cawan gores (baik dengan cara penggoresan kuadran maupun cara penyebaran) dan metode cawan tuang. Kedua metode ini didasarkan pada prinsip yang sama yaitu mengencerkan organisme sedemikian sehingga individu species dapat dipisahkan dari lainnya, dengan anggapan bahwa koloni terpisah yang tampak pada cawan petri setelah inkubasi berasal dari satu sel tunggal. Pada kegiatan ini akan diperkenalkan metode cawan gores, yang dilakukan dengan menggoreskan inokulum/sampel pada permukaan medium agar dengan cara penggoresan kuadran.

I.2. Tujuan :

Mempelajari cara mengisolasi bakteri dari ikan dan lingkungan budidaya serta mengamati ciri-ciri koloni bakteri yang tumbuh.

Metode Penggoresan Kuadran

1.Tuliskan nama/kelompok dan tanggal pada tutup cawan petri anda 2.

Baliklah cawan petri anda dan dengan menggunakan spidol bagilah seluruh area dasar cawan petri seperti gambar 1. (Kelak bila anda telah dapat menguasai teknik penggoresan ini dengan baik, maka pembagian semacam ini tidak perlu digambarkan lagi, jadi label dapat dituliskan pada permukaan luar dasar cawan petri sebagaimana seharusnya dan bukan pada tutupnya). Gambar 1. Pembagian dasar cawan Petri A. Pembagian sektor sebagaimana tergambar pada permukaan luar dasar cawan petri. B. Pembagian sektor sebagaimana tampak melalui tutup cawan petri . Perhatikan bahwa sektor I kini diatas sedangkan sektor O adalah disebelah kiri. 3. Dengan menggunakan lup inokilasi, pindahkanlah secara aseptik satu lup organ ikan/sampel air (jenis organ/sampel air sesuai tugas ) yang telah digerus pada sektor O dan goreskanlah lup anda bolak-balik pada permukaan agar (lakukanlah hal ini dengan cara membuka sedikit saja tutup cawan petri anda pada sisi yang berlawanan dengan sektor O, lihat gambar 2). Gambar 2. Cara membuka cawan Petri saat penggoresan

PEMBAHASAN

Teknik Penanaman yang dilakukan adalah dengan teknok Goresan (Streak) yang bertujuan untuk mengisolasi mikroorganisme dari campurannya atau meremajakan kultur ke dalam medium baru. Ada beberapa teknik goresan yang biasa dipakai yaitu :

Teknik goresan yang kita pergunakan adalah teknik goresan kuadran. Prinsip nya adalah sama dengan yang lainnya yaitu pengenceran dimana goresan pertama paling pekat kemudian menjadi semakin encer sampai pada goresan ke empat yang terletak ditengah-tengah media. Bila metode ini dilakukan dengan baik akan menghasilkan terisolasinya mikroorganisme, dimana setiap koloni berasal dari satu sel. Berdasarkan hasil pembiakan pada media agar dicawan petri, setelah diinkubasi selama 24 jam tampak pada sektor O terdapat koloni yang bertumpuk atau bergerombol tebal pada media agar yang digores. Pada sektor I koloni tampak

tidak terlalu tebal dan sedikit terpisah, tidak bergerombol seperti pada sektor 0. Demikian pula pada sektor II jumlah koloni semakin sedikit dan terpisah-pisah dan pada sektor III jumlah koloni sangat sedikit dan lebih terpisah, koloni hanya tampak berbaris pada bekas goresan saja. Semakin sedikitnya jumlah koloni bakteri pada sektor I, II dan III, disebabkan asal bakteri yang diinokulasi pada sektor 0 berasal dari sumber utama (stock bakteri), sektor I berasal dari bakteri sektor 0, sektor II berasal dari sektor I dan sektor III berasal dari sektor II, sehingga jumlah bakteri asal atau sumber yang dinokulasi pada masing-masing sektor berbeda. Bakteri adalah merupakan mikroorganisme yang sangat sederhana, tidak mempunyai nukleus dan sifatnya berbeda dengan organisme yang mempunyai inti sel. Bakteri termasuk organisme yang mempu menguraikan bahan organik menjadi unsur anorganik sederhana yang bisa dimanfaatkan organisme produsen dalam proses fotosentesis. Seperti telah kita ketahui bahwa Satuan ukuran bakteri adalah mikron (seperti pada gambar di bawah ini) namun ketika ditumbuhkan dalam media umumnya akan membentuk koloni. Koloni inilah yang memudahkan kita melakukan pengamatan secara langsung dan visual.

Berdasarkan hasil pengamatan tersebut diatas (tabel 1), dapat diketahui bahwa isolasi dari ikan dan lingkungannya didapatkan beberapa koloni bakteri. Isolasi dari usus ikan pada kelompok satu diperoleh satu macam koloni bakteri dengan ciri-ciri warna koloni bening yang berbentuk bundar dengan tepian licin dan elevasi cembung, sedangkan pada kelompok 6 diperoleh satu macam koloni dengan ciri-ciri koloni warna koloni putih susu yang berbentuk bundar dengan tepian licin dan elevasi cembung. Dengan adanya perbedaan warna koloni diduga berasal dari koloni bakteri dari jenis yang berbeda walaupun memiliki bentuk, tepian dan elevasi yang sama. Setelah waktu inkubasi bakteri yang tergores pada media di harapkan tumbuh dan menyebar dan bisa terpisah membentuk koloni-koloni terpisah. Menururt Tarigan (1988) kebutuhan mikroorganisme untuk pertumbuhan dapat dibedakan menjadi dua kategori, yaitu: kebutuhan fisik dan kebutuhan kimiawi atau kemis. Aspek-aspek fisik dapat mencakup suhu, pH dan tekanan osmotik. Sedangkan kebutuhan kemis meliputi air, sumber karbon, nitrogen oksigen, mineral-mineral dan faktor penumbuh. Dalam pertumbuhannya setiap makhluk hidup membutuhkan nutrisi yang mencukupi serta kondisi lingkungan yang mendukung demi proses pertumbuhan tersebutt, termasuk juga bakteri. Menurut Darkuni (2001) pertumbuhan bakteri pada umumnya akan dipengaruhi oleh faktor lingkungan. Pengaruh faktor ini akan memberikan gambaran yang memperlihatkan peningkatanb jumlah sel yang berbedadan pada akhirnya memberikan gambaran pula terhadap kurva pertumbuhannya. Kebutuhan-kebutuhan tersebut dipenuhi dari media pertumbuhan yang kita gunakan dan pengkondisian pada saat inkubasi. Pertumbuhan merupakan proses bertambahnya ukuran atau subtansi atau masa zat suatu organisme, misalnya kita makhluk makro ini dikatakan tumbuh ketika bertambah tinggi, bertambah besar atau bertambah berat. Pada organisme bersel satu pertumbuhan lebih diartikan sebagai pertumbuhan koloni, yaitu pertambahan jumlah koloni, ukuran koloni yang semakin besar atau subtansi atau masssa

mikroba dalam koloni tersebut semakin banyak, pertumbuhan pada mikroba diartikan sebagai pertambahan jumlah sel mikroba itu sendiri seperti pada gambar di bawah ini.

Pertumbuhan merupakan suatu proses kehidupan yang irreversible artinya tidak dapat dibalik kejadiannya. Pertumbuhan didefinisikan sebagai pertambahan kuantitas konstituen seluler dan struktur organisme yang dapat dinyatakan dengan ukuran, diikuti pertambahan jumlah, pertambahan ukuran sel, pertambahan berat atau massa dan parameter lain. Sebagai hasil pertambahan ukuran dan pembelahan sel atau pertambahan jumlah sel maka terjadi pertumbuhan populasi mikroba Menurut Widanarni

et al (2007), bakteri mampu hidup karena dapat menyerap cairan tercerna ekstrakselular dari bahan organik yang ada disekitarnya, pencernaan bahan organik tersebut dilakukan melalui dinding sel masuk ke memberan sitoplasma yang bersifat permeabel selektif. Menurut Michael et al (1997), faktor lingkungan baik biotik maupun abiotik sangat berpengaruh terhadap pertumbuhan dan kelangsungan hidup mikroorganisme.

Isolasi Bakteri Asam Laktat Menghasilkan Antimikroba

Bakteri asam laktat merupakan jenis bakteri yang mampu menghasilkan asam laktat, hidrogen peroksida, antimikroba dan hasil metabolisme lain yang memberikan pengaruh positif bagi produktivitas hasil ternak dan pencernaan tubuh. Bakteri asam laktat diisolasi untuk menghasilkan antimikroba yang dapat digunakan sebagai probiotik.

Dalam isolasi bakteri asam laktat, kegiatannya meliputi pengenceran, pemupukan, pemurnian, pengayaan, dan penyimpanan bakteri asam laktat dalam gliserol stock. Media yang digunakan adalah MRS (de Mann, Rogosa, Sharpe) baik dalam bentuk padat maupun cair, media Mueller Hinton Agar s Trypticase Soy Broth (TSB). Untuk menghasilkan antimikroba, dilakukan dengan menanam biakan bakteri (0,1 ml) dalam 10 ml media TSB dan diinkubasi pada suhu 37?C selama waktu optimum. Selanjutnya dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 600 rpm selama 15 menit sehingga diperoleh filtrat yang digunakan dalam konfrontasi dengan abkteri untuk menentukan dihasilkan atau tidaknya antimikroba.

Untuk mengetahui bakteri penghasil substansi antimikroba dilakukan metode sumur agar (well diffusion agar). Pada metode ini, bakteri yang mampu menghasilkan substansi antimikroba akan melakukan penghambatan terhadap bakteri yang digunakan. Hal ini ditunjukkan dengan adanya zona bening di sekitar sumur agar. Semakin besar diameter zona bening di sekitar sumur menunjukkan aktivitas antimikroba yang tinggi. Setelah mengetahui bakteri penghasil substansi antimikroba, maka perlu dilakukan uji sensitifitas antimikroba terhadap enzim proteolitik (pepsin), pH, dan suhu. Pengujian aktivitas antimikroba ini dilakukan dengan metode sumur agar.

Untuk isolasi bakteri asam laktat penghasil antimikroba, digunakan isolat bakteri asam laktat murni yang diperoleh dari isolat saluran pencernaan. Setelah dilakukan konfrontasi isolat dan bakteri, menunjukkan bahwa bakteri Salmonella sp. yang sensitif terhadap isolat dibandingkan dengan bakteri uji yang lain.

Seleksi berdasarkan kemampuan penghambatan, menunjukkan bahwa pada isolat nomor 7 dari feses ayam (FA7), isolat nomor 3 dari feses sapi (FS3) dan isolat nomor 3 dari saluran pencernaan ayam (RA3) mampu menghasilkan antimikroba dan menghambat Salmonella sp. Hal ini diketahui dengan adanya zona bening di sekitar sumur. Dengan diketahui aktivitas dari bakteri tersebut, dapat dilakukan uji sensitifitas antimikroba dengan melakukan penambahan enzim proteolitik pada substansi penghasil antimikroba. Penambahan enzim ini dapat menyebabkan aktivitas dari bakteri tersebut berkurang dan bahkan tidak ada aktivitas. Substansi antimikroba yang sensitif terhadap enzim proteolitik menunjukkan bahwa komponen utama pada substansi antimikroba yang aktif merupakan protein. Substansi protein yang dihasilkan oleh strain bakteri tertentu dan mempunyai kemampuan menghambat bakteri lain dan sensitif terhadap enzim proteolitik disebut sebagai antimikroba.

Setelah dilakukan uji sensitifitas antimikroba terhadap enzim proteolitik, perlu dilakukan uji sensitifitas antimikroba terhadap pH dan suhu. Dengan melakukan uji ini dapat diketahui bahwa antimikroba yang dihasilkan memiliki aktivitas optimum pada pH 6,5-7,0 dan paa suhu 35?C.

Isolasi bakteri asam laktat dilakukan untuk menghasilkan antimikroba yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri. Dengan mengetahui aktivitas antimikroba terhadap bakteri tertentu sangat penting peranannya dalam meningkatkan produksi hasil ternak (sapi dan kambing) maupun mencegah terkontminasinya produk-produk pertenakan oleh bakteri, khususnya bakteri patogen yang berbahaya sehingga dapat menimbulkan penyakit baik pada hewan ternak maupun pada manusia. Isolasi bakteri asam laktat yang mampu menghasilkan antimikroba, dapat digunakan sebagai probiotik. Dengan memberikan probiotik sebagai suplemen dapat mengambalikan keseimbangan bakteri (rasio antara bakteri patogen dan nonpatogen) dalam saluran pencernaan terutama dalam usus.