ΠΑΡΑΣΚΕΥΗΣ
DESCRIPTION
ΠΑΡΑΣΚΕΥΗΣTRANSCRIPT
19/12/2013
1
Εφαρµογές µοριακών µεθόδων στην
επιδηµιολογική µελέτη διάγνωση
παρακολούθηση και θεραπεία ιογενών
λοιµώξεων
∆. Παρασκευής([email protected])
Εθνικό Κέντρο Αναφοράς Ρετροϊών,
Εργαστήριο Υγιεινής και Επιδηµιολογίας
Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήµιο Αθηνών,
Θεµατολογία (1)
Εφαρµογές της µοριακής διαγνωστικής στιςιογενείς λοιµώξεις
• Ποιοτικές δοκιµασίες
• ∆ιάγνωση, έλεγχος µεταγγίσεων, έλεγχος αντοχής,
έλεγχος για γενετικούς παράγοντες που σχετίζονται
µε τη νόσο, εκτίµηση γονότυπου HCV
• Ποσοτικές δοκιµασίες
• ∆ιάγνωση, πρόγνωση εξέλιξης της νόσου, εκτίµηση
χρονικής περιόδου για έναρξη θεραπείας
• Αξιολόγηση αποτελεσµατικότητας θεραπείας
19/12/2013
2
Θεµατολογία (2)
Εφαρµογές της µοριακής τυποποίησης (µοριακήεπιδηµιολογία) στις ιογενείς λοιµώξεις
• Μελέτη επιδηµιών
• Εκτίµηση χαρακτηριστικών επιδηµιών (γεωγραφική
και χρονική προέλευση, τρόπος διασποράς, εκτίµηση
δυναµικής επιδηµίας)
• Εφαρµογές στις επιδηµίες του ιού του AIDS (HIV) και
Ηπατίτιδας C (HCV)
Εισαγωγή
• Εκτιµήσεις του ΠΟΥ αναφέρουν ότιπαγκοσµίως:
• Περισσότεροι από 33 εκατοµύρια άτοµα έχουνµολυνθεί µε τον ιό του AIDS
• 130-180 εκατοµµύρια µε τον ιό της ΗπατίτιδαςC και
• Περισσότεροι από 350 εκατοµµύρια πάσχουναπό χρόνια Ηπατίτιδα Β
19/12/2013
3
5December 2009
Σύνολο: 33.4 million (31.1 – 35.8 million)
Western & Central Europe
850 000[710 000 – 970 000]
Middle East & North Africa
310 000[250 000 – 380 000]Sub-Saharan Africa
22.4 million[20.8 – 24.1 million]
Eastern Europe & Central Asia
1.5 million [1.4 – 1.7 million]
South & South-East Asia
3.8 million[3.4 – 4.3 million]Oceania
59 000[51 000 – 68 000]
North America
1.4 million[1.2 – 1.6 million]
Latin America
2.0 million[1.8 – 2.2 million]
East Asia
850 000[700 000 – 1.0 million]
Caribbean
240 000[220 000 – 260 000]
Παγκόσµια κατανοµή HIV-οροθετικών (2008)
Πηγή: KEEΛΠΝΟ
Αριθµός HIV-οροθετικών ανά 100.00 πληθυσµού και έτος διάγνωσης
19/12/2013
4
492
406
18
487
256
605604
653
517573565
442434397
954
1049
Years
15 17 11 11 19 16 9 9 14 15
Total
IDUs
31/10/2012
Ne
wly
dia
gn
os
ed
HIV
-1 c
as
es
Provided by the Hellenic Center for Diseases Control and Prevention
Πηγή: KEEΛΠΝΟ
Oµάδες κινδύνου HIV-οροθετικών στην Ελλάδα
MSM
46,1%
MSW
22,9%
UN 23,3%
IDUs,3,4%
BT1,1%
MTCT, 0,6%
19/12/2013
5
Σηµασία µοριακής διαγνωστικής (1)
Με τη µοριακή διαγνωστική µπορεί ναπραγµατοποιηθεί:
• Έγκαιρη διάγνωση
• Έλεγχος µεταγγίσεων
• Έλεγχος αντοχής σε φάρµακα
• Έλεγχος για γενετικούς παράγοντες πουσχετίζονται µε τη νόσο
• Ποσοτικοποίηση των ιών σε ιστούς
∆ιάγνωση
Έλεγχος µεταγγίσεων
19/12/2013
6
∆είκτες οξείας HIV-λοίµωξης
∆είκτες οξείας HCV-λοίµωξης
19/12/2013
7
HBV DNA
HBsAgAnti-HBc
Anti-HBs
Φυσική ιστορία HBV-λοίµωξης
Περίοδος παραθύρου
Περίοδος οξείας λοίµωξης
Μη µετάπτωση σε χρόνια HBV-λοίµωξη
Occult HBV infection
• Η διάγνωση πραγµατοποιείται µε τους παρακάτωτρόπους:
• Με ανίχνευση αντισωµάτων έναντι των ιών(µέθοδοι τύπου ELISA και WB)
• Με ανίχνευση αντιγόνων του ιού
• Mε ανίχνευση και των 2 παραπάνω
• Με καλλιέργεια των ιών
• Με ανίχνευση του HIV-RNA, HBV-DNA ή τουΗCV-RNA, αφού έχει προηγηθείπολλαπλασιασµός τµήµατος του γονιδιώµατοςτου ιού (Νucleic Acid Testing, NAT)
Μεθοδολογία διάγνωσης ιογενών-
λοιµώξεων
19/12/2013
8
• Οι ορολογικές µέθοδοι διακρίνονται σε: 1)
µεθόδους γενικευµένης εξέτασης (screening
test) και 2) σε επιβεβαιωτικές (confirmatory
tests)
• Προκειµένου να τεκµηριωθεί η οροθετικότητα
ενός ατόµου απαιτείται το θετικό αποτέλεσµα
και των 2 µεθόδων
• Τα χαρακτηριστικά των screening test είναι η
υψηλή ευαισθησία (~100%) και για αυτό το
λόγο χρησιµοποιούνται και για τον έλεγχο του
αίµατος
Ορολογικές µέθοδοι
Οι µοριακές µέθοδοι χρησιµοποιούνται:
• Σε περίπτωση αδιευκρίνιστου
αποτελέσµατος µε ορολογικές µεθόδους
• Σε περιπτώσεις που οι ορολογικές µέθοδοι
δεν µπορούν να χρησιµοποιηθούν (έλεγχος
νεογνών)
• Όταν απαιτείται έγκαιρη διάγνωση
(επαγγελµατική έκθεση, έλεγχος
µεταγγίσεων)
Μοριακές µέθοδοι
19/12/2013
9
• Παρότι οι µέθοδοι ανίχνευσης αντισωµάτων
παρουσιάζουν µεγάλη ευαισθησία και
ειδικότητα, ένα από τα σηµαντικότερα
προβλήµατα στον έλεγχο των λοιµώξεων (HIV,
HCV, HBV) είναι το διαγνωστικό παράθυρο
∆ιαγνωστικό παράθυρο
∆είκτες οξείας HIV-λοίµωξης
19/12/2013
10
Πώς θα µπορούσε να µειωθεί ο κίνδυνος
µετάδοσης των λοιµώξεων την περίοδο του
διαγνωστικού παραθύρου στις µεταγγίσεις
αίµατος;
• Προκειµένου να µειωθεί ο κίνδυνος µετάδοσης
λοιµώξεων κατά την περίοδο του διαγνωστικού
παραθύρου είναι απαραίτητο να ανιχνεύσουµε
το γενετικό υλικό των ιών που αποτελεί τον πιο
πρώιµο δείκτη κατά το στάδιο της οξείας
λοίµωξης
• Για αυτό το λόγο έχουν αναπτυχθεί µέθοδοι
ανίχνευσης του HIV-RNA, HCV-RNA και HBV-
DNA (Nucleic acid testing, NAT)
Τρόποι αντιµετώπισης του κινδύνου µετάδοσης λοιµώξεων στο διαγνωστικό παράθυρο
19/12/2013
11
Οι µέθοδοι NAT περιορίζουν σηµαντικά
το διαγνωστικό παράθυρο
Χαρακτηριστικά γνωρίσµατα
• Τεχνολογία αιχµής στον έλεγχο του αίµατος
• Ανιχνεύει πολύ χαµηλά επίπεδα RNA ή DNA ιού τα
οποία µπορεί να µην είναι ανιχνεύσιµα µε τη χρήση
άλλων σύγχρονων εγκεκριµένων ορολογικών
δοκιµασιών
• Υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα για νουκλεϊκά οξέα
ιών
Οφέλη
• Παρέχει επιπλέον επίπεδο ασφάλειας στην παγκόσµια
διακίνηση αίµατος
• Ανιχνεύει τη µόλυνση νωρίτερα από άλλες µεθόδους
διαλογής
Μέθοδος ΝΑΤ
19/12/2013
12
Βασικές αρχές µεθοδολογίας Transcription
mediated amplification (TMA)
• Η µέθοδος ανιχνεύει ταυτόχρονα 3 ιούς (HIV,
HBV, HCV)
• Σε κάθε αντίδραση υπάρχει εσωτερικός
µάρτυρας (Internal Quality control, IC)
• Σε περίπτωση θετικού αποτελέσµατος
ακολουθεί διαχωριστική αντίδραση για τον
προσδιορισµό του ιού
• Η ανίχνευση του στόχου πραγµατοποιείται µε
ειδικούς ανιχνευτές σε κάθε ιό
Βασικές αρχές µεθοδολογίας Transcription
mediated amplification (TMA)
19/12/2013
13
Εσωτερικός µάρτυρας (Internal control, IC)
19/12/2013
14
Analytical sensitivity (95% detection probability) with WHO and other standards
* HIV-1 Type B alternate panel used due to WHO standard contamination
Data on file at Gen-Probe, 2003
Ultrio Assay Discriminatory Assays
HIV-1* 20.72 copies/mL
(17-25)
17.84 copies/mL
(15-21)
HCV 2.78 IU/mL
(2.4-3.3)
1.95 IU/mL
(1.7-2.4)
HBV 7.46 IU/mL
(6.4-8.9)
7.42 IU/mL
(6.3-9.0)
Ultrio Analytical Sensitivity
19/12/2013
15
• Σηµασία υψηλής ευαισθησίας
• Χρήση εσωτερικού µάρτυρα
• Εφαρµογή σε διαπιστευµένο εργαστήριο
• Τεχνολογία αιχµής (δυνατότητα ανάλυσης πολλώνδειγµάτων)
Συµπερασµατικά
Γονότυπος HCV
19/12/2013
16
Σηµασία εκτίµησης γονότυπου ΗCV
Σύµφωνα µε τις διεθνείς συστάσεις θεραπείας, ο
γονότυπος θα πρέπει να ταυτοποιείται πριν τη θεραπεία:
• Οι ασθενείς µε HCV γονότυπους 1 και 4 σε
παρουσιάζουν µικρότερη πιθανότητα ανταπόκρισης
στη θεραπεία, σε σχέση µε εκείνους µε 2 ή 3.
• Σύσταση για µεγαλύτερη διάρκεια, δόση θεραπείας και
διαστήµατος παρακολούθησης σε ασθενείς µε
γονότυπους 1 και 4.
Ταξινόµηση του HCV
Timm and Roggendorf 2007
19/12/2013
17
Παγκόσµια κατανοµή των γονότυπων HCV
http://hcv.lanl.gov
1b
34%
13%
1a
3
28%
7%
2
13%4%
0.5%4
5
Απροσδιόριστοι
Katsoulidou et al, 2006Katsoulidou et al, 2006
Επιπολασµός HCV γονότυπων στην Ελλάδα
19/12/2013
18
Ποσοτικές δοκιµασίες HIV-RNA,HCV-RNA, HBV-DNA
Πρόγνωση για ανάπτυξη AIDS: HIV RNA, CD4
19
42
73
93
22
40
57
78
5 15
26
48
67
0
20
40
60
80
100
Perc
en
tag
e w
ith
AID
S
CD4 <350 CD4 351-500 CD4 > 500
Progression to AIDS at 6 Years < 500
501 - 3,000
3,001 - 10,000
10,001 - 30,000
> 30,000
From: Mellors J et al. Science 1996;272:1167-70.
HIV RNA Level (bDNA)
19/12/2013
19
Σηµασία ποσοτικοποίησης HIV-RNA
• Το HIV-RNA στο πλάσµα αντικατοπτρίζει ταεπίπεδα του ιικού πολλαπλασιασµού
• Προγνωστικός δείκτης για ανάπτυξη νόσου
• Κριτήριο για έναρξη θεραπείας
• ∆είκτης αξιολόγησης αποτελεσµατικότηταςθεραπείας και, συνεπώς της κλινικής πορείαςενός ασθενούς
• ∆είκτης για ανάπτυξη αντοχής του ιού στηθεραπεία
• Μέθοδοι ενίσχυσης στόχου
• Real-time PCR, ή real-time RT-PCR
• End-point PCR
• NASBA
• Μέθοδοι ενίσχυσης σήµατος
• Branched-DNA (b-DNA)
Μεθοδολογία που εφαρµόζεται για την
ποσοτικοποίηση του ιικού RNA ή DNA
19/12/2013
20
• H real-time PCR ή RT-PCR εφαρµόζεται µεεπιτυχία για τον ποσοτικό προσδιορισµό τουHIV-RNA, HBV-DNA και HCV-RNAχρησιµοποιώντας ανιχνευτές φθορισµού
• H ποσοτικοποίηση µε real-time PCRπαρουσιάζει σηµαντικά πλεονεκτήµατα όπωςµεγάλο εύρος ποσοτικοποίησης (> 6 log),υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα
• H ποσοτικοποίηση επιτυγχάνεται µε εξωτερικάπρότυπα (standards) µε διεθνή βαθµονόµηση(IU/mL)
Real-time PCR
Πλεονέκτηµα real-time PCR
19/12/2013
21
Πλεονέκτηµα real-time PCR
• H end-point PCR παρουσιάζει σηµαντικάµειονεκτήµατα σε σχέση µε τη real-time PCRόπως µικρό εύρος ποσοτικοποίησης (~4log),και σχετικά µικρότερη επαναληψηµότητα
• Για αυτούς τους λόγους οι δοκιµασίες πουβασίζονται σε real-time PCR τείνουν νακαθιερωθούν αποκλειστικά σε σχέση µε τηνend-point PCR
End-point PCR και real-time PCR
19/12/2013
22
Μέθοδοι ενίσχυσης σήµατος
Μέθοδος διακλαδιζόµενου DNA
(Branched-DNA)
• H µέθοδος αυτή αποτελεί µια από τιςµεθόδους ενίσχυσης σήµατος σε αντίθεση µετις µεθόδους (PCR, NASBA) που ενισχύουντο στόχο.
• Ένα από τα σηµαντικά πλεονεκτήµατα τηςµεθόδου σε σχέση µε την PCR, είναι ηµικρότερη πιθανότητα επιµόλυνσης, λόγωτου µη-πολλαπλασιασµού του στόχου.
19/12/2013
23
Amplification curve of a real-time PCR
Έλεγχος αντοχής στη θεραπεία
19/12/2013
24
Ως αντοχή στην αντιρετροϊκή θεραπεία ορίζεται ως η
ικανότητα του ιού να πολλαπλασιάζεται παρουσία
θεραπείας
Η αντοχή αναπτύσσεται, κυρίως, ως συνέπεια της
µερικής καταστολής του ιικού πολλαπλασιασµού
Η αντοχή µπορεί να προέλθει και από µετάδοση
ανθεκτικών στελεχών (αιτία µη-ανταπόκρισης)
Ορισµός αντοχής στη θεραπεία
Locarnini S, et al. Antivir Ther 2004; 9:679–693
Ιικός πολλαπλασιασµός
Χρόνος
Έναρξη θεραπείας
• Μέγιστη καταστολή = Μικρή πιθανότητα αντοχής
Κυρίαρχο στέλεχος
Στελέχη µε φυσικούς πολυµορφισµούς
Όριο ανίχνευσης
Καταστολή ιικού πολ/σµού και αντοχή (1)
19/12/2013
25
Fung SK & Lok ASF. Antivir Ther 2004; 9:1013–1026
Locarnini S, et al. Antivir Ther 2004; 9:679–693
• Μερική καταστολή- Μικρή δραστικότητα/Επίπεδα φαρµάκου
- Μη ικανοποιητική συµµόρφωση
- Προϋπάρχουσα αντοχή
Χρόνος
ΙΙκός πολλαπλασιασµός
Έναρξη θεραπείας
Κυρίαρχο στέλεχος
Στελέχη µε φυσικούς πολυµορφισµούς
Ανθεκτικά στελέχη
Όριο ανίχνευσης
Καταστολή ιικού πολ/σµού και αντοχή (2)
Περιοχές που αναπτύσσεται η αντοχή
1-99, PIs
41-238
N(t)RTIs, NNRTIs
66-263 IIs 36-45 FIs
11-25 V3
19/12/2013
26
Γονοτυπικές µέθοδοι
Ταυτοποίηση νουκλεοτιδικής αλληλουχίας
Εκτίµηση επιπέδων αντοχής από το γονότυπο
Φαινοτυπικές µέθοδοι
Άµεση ταυτοποίηση των επιπέδων αντοχής του ιούin vitro
Μεθοδολογία (1)
Εκτίµηση φαινοτυπικής αντοχής
19/12/2013
27
∆ιάγνωση HIV λοίµωξης
Εργαστήριο και HIV λοίµωξη
Θεραπεία HIV λοίµωξης
• Έναρξη- επιλογή πρώτου σχήµατοςΗΙV-RNA, ανοσολογικός έλεγχος, έλεγχος αντοχής,έλεγχος τροπισµού, έλεγχος υπερευαισθησίας σε
φάρµακα
• Παρακολούθηση/τροποποίηση θεραπείαςHIV-RNA, ανοσολογικός έλεγχος, έλεγχος αντοχής,έλεγχος τροπισµού, έλεγχος υπερευαισθησίας σε
φάρµακα
Προοπτικές για το µέλλον
• HIV-DNA, επίπεδα φαρµάκων, γενωµική, ανίχνευση
υποπληθυσµών αντοχής
για γενετικούς
παράγοντες που
σχετίζονται µε τη νόσο
ω
ω
ω
ωω
19/12/2013
28
Γενετικοί παράγοντες που σχετίζονται
µε τη νόσο
Από µελέτες προέκυψε ότι γενετικοίπολυµορφισµοί σε 3 διαφορετικές γενοµικέςπεριοχές συσχετίζονται µε διαφορετικό τρόπο µετη θεραπεία για το ΑΙDS
Συγκεκριµένα, οι περιοχές αυτές αφορούν ταγονίδια: UGT1A1, CYP2B6, HLA-B*5701:
Η οµάδα HLA-B*5701 βρέθηκε ότι συσχετίζεται µευπερευαισθησία σε abacavir
Ένας πολυµορφισµός στο γονίδιο CYP2B6σχετίζεται µε υψηλά επίπεδα efavirenz
Ένας πολυµορφισµός στο γονίδιο UGT1A1σχετίζεται µε ίκτερο, σε ασθενείς κατόπινθεραπείας µε atazanavir
Γενετικοί παράγοντες που σχετίζονται
µε τη νόσο
Λόγω των παραπάνω οι διεθνείς συστάσεις για τηχορήγηση αντιρετροϊκής αγωγής, συστήνουν τονέλεγχο για την ταυτοποίηση των παραπάνωγονοτύπων, πριν τη χορήγηση των αντίστοιχωνφαρµάκων
19/12/2013
29
Συµπεράσµατα
Η µοριακή διαγνωστική βρίσκει άµεσεςεφαρµογές στην:
Έγκαιρη διάγνωση και συνεπώς στην ασφάλειατων µεταγγίσεων
Στην επιλογή του χρόνου έναρξης θεραπείας
Στην παρακολούθηση της αποτελεσµα-τικότητας της θεραπείας
Στην επιλογή της βέλτιστης θεραπείας (έλεγχοςαντοχής)
Στην επιλογή θεραπείας µε τις λιγότερεςσοβαρές παρενέργειες
ω
ω
ω
ωω
19/12/2013
30
Υπερευαίσθητες µέθοδοι sequencing
Με τις υπερευαίσθητες µεθόδους είναι δυνατόννα ανιχνευθούν στελέχη µε συχνότητα έως και0.1%
Έχει βρεθεί ότι η ανίχνευση στελεχών µεµεταλλαγές αντοχής, που δεν ανιχνεύονται µεσυµβατικές µεθόδους, µειώνει την πιθανότηταανταπόκρισης σε NNRTI-σχήµατα (Goodman et al,
2009; Latallada et al, 2009)
Παράλληλα σε ασθενείς µε πολλαπλέςαποτυχίες τα επίπεδα αντοχής είναι υψηλότερα
∆ιάγραµµα εργασίας
Προετοιµασία και δέσµευση των adaptors στα µονόκλωνα DNA emPCR
Προσθήκη των σφαιριδίων στην
πλάκα picotiterSequencing
19/12/2013
31
Picotiter sequencing
Σύγκριση µεθόδων
Χαρακτηριστικά Μέθοδος Sanger GS FLX
Απόδοση 5 x104 bp 4-6 x108 bp
∆ιάρκεια ~ 24 ώρες < 10 ώρες
Mήκος
αλληλουχίας400-500 bp 400-500 bp
Aριθµός
αλληλουχιών~ 1x102 1x106