细菌内毒素检查技术—— 鲎实验凝胶法

药学组 顾霞

复习提问 鲎实验的原理是什么？ 鲎试剂能与内毒素发生凝集反应，产生肉眼

可见的凝胶。 鲎试剂的灵敏度（ λ ）： λ=0.25EU/ml 当溶液中内毒素浓度大于或等于 0.25EU/ml

时可与鲎试剂发生凝胶反应（阳性反应）。 当溶液中内毒素浓度小于 0.25EU/ml 时不能

与鲎试剂发生凝胶反应（阴性反应）。

实验步骤 (2005 药典二部）

编号 内毒素浓度 / 配制的溶液 平行管数

A 未知 / 供试品溶液 ( 即供试品溶液） 2

B 2λ/ 检查用水（即内毒素标准品溶液） 1

C 2λ/ 供试品溶液（即供试品、标准品溶液） 1

D 无 / 检查用水 ( 即检查用水） 1

1 、按下表制备溶液 A 、 B 、 C 、 D 。

2 、鲎试剂复溶。3 、在鲎试剂中分别加入 A 、 B 、 C 、 D 各 0.1ml 。4 、封口， 37℃ ， 60 分钟保温。观察结果。

注： A 为供试品溶液， B 为阳性对照， C 为供试品阳性对照， D 为阴性对照

一、溶液的配制编号 内毒素浓度 / 配制内毒素的溶液 平行管数

A 未知 / 供试品溶液 ( 即供试品溶液） 2

B 2λ/ 检查用水（即内毒素标准品溶液） 1

C 2λ/ 供试品溶液（即供试品、标准品溶液）

1

D 无 / 检查用水 ( 即检查用水） 1

注： A 为供试品溶液， B 为阳性对照， C 为供试品阳性对照， D 为阴性对照。

教材 P109

S1 S2 PC阳性对照

PPC供试品阳

性对照

NC阴性对照

0.1mlBET+

0.1mlSMVD

0.1mlBET+

0.1mlSMVD

0.1mlBET+

0.1mlE2λ

0.1mlSMV

D +0.1mlE2λ

0.2mlBET

内毒素溶液的制备 标准品： 120EU ，粉末状 标准品溶液： 0.5EU/ml1.2mlBET 水

100EU/ml

4.5ml 4.5ml 1ml

10EU/ml 1EU/ml 0.5EU/ml

—— 溶解—— 稀释

0.5ml 0.5ml 1ml

号 实验步骤 注意事项1 无菌操作，打开内毒素标准品和 1 支

BET 水（ 2ml) ；分别编号 1 、 4 。无菌操作

2 用移液器移取 1mlBET 水加入内毒素标准品中，充分振摇混匀 (4 号剩余1ml 水） 。

移液器最大移液量为 200ul 。充分振荡。

3 取 2 支 5mlBET 水，分别编号 2 、 3 。打开，用移液器从 2 中移取 0.2ml 至内毒素标准品中，从 2 中再移去 0.3ml; 从 3 中移去 0.5ml 。

2 、 3 不能混淆。

4 从第 1 支移 0.5ml100EU/ml 内毒素溶液至第 2 支中；混匀后，从第 2 支移 0.5ml 至第 3 支中；混匀后，从第3 支移 1ml 至第 4 支中；混匀。

同一移液枪头只接触同一稀释度溶液。充分混匀。

二、鲎试剂复溶

S1 S2 PC阳性对照

PPC供试品阳

性对照

NC阴性对照

0.1mlBET+

0.1mlSMVD

0.1mlBET+

0.1mlSMV

D

0.1mlBET+

0.1mlE2

λ

0.1mlSMV

D +0.1mlE2λ

0.2mlBET

三、分别加入 ABCD 溶液

1 2 3 4 5

S1 S2 PC阳性对照

PPC供试品阳

性对照

NC阴性对照

0.1mlBET+

0.1mlSMVD

0.1mlBET+

0.1mlSMV

D

0.1mlBET+

0.1mlE2

λ

0.1mlSMV

D +0.1mlE2λ

0.2mlBET

三、分别加入 ABCD 溶液复溶溶剂 加入溶液

1 0.1mlBET 水 0.1ml 供试品溶液

2 0.1mlBET 水 0.1ml 供试品溶液

3 0.1mlBET 水 0.1ml0.5EUE/ml 内毒素标准品溶液

4 0.1ml 供试品溶液 0.1ml0.5EUE/ml 内毒素标准品溶液

5 0.1mlBET 水 0.1mlBET 水

四、封口， 60 分钟 37° 保温胶带在酒精灯火焰上快速通过后，绕安瓿瓶

口一圈，捏紧封口。 五、结果观察、出报告。

结果观察 安瓿缓慢倒转 180° ，若管内形成凝胶，且凝胶不变

形、不从管壁滑脱者为阳性；未形成凝胶或凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。

1 （供试品）： 2 （供试品）： 3 （阳性对照）： 4 （供试品阳性对照）： 5 （阴性对照）：

结果判断 阴性对照 5 号为阴性 阳性对照 3 号为阳性 供试品阳性对照 4 号为阳性1 、若 3 、 4 、 5 号管呈上述结果，则实验有效2 、若 1 、 2 号管均为阴性则供试品合格3 、若 1 、 2 号管均为阳性则供试品不合格4 、若 1 、 2 号管一管为阳性、一管为阴性，则

复试；复试需平行做 4 份； 4 份都阴性则合格，否则不合格。

试剂组： 鲎试剂： λ=0.25EU/ml 细菌内毒素检查用水（ BET ）： 内毒素 <0.015EU/ml 规格： 2ml 、 5ml 内毒素标准品： 120EU供试品：氯化钠注射液，内毒素限值 0.5EU/ml