荷斯坦奶牛隐性遗传疾病检测技术的建立及应用

报告人：张滢寅作者： 王成导师：张淑君教授

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背景

2 材料和方法

结果

4 讨论

一、背景 隐形遗传疾病： ♣ 有害基因传代 繁殖、生长及经济

性状缺陷

♣ 人工授精、胚胎移植等现代繁殖技术 扩大危害范围 ♣ 国内检测技术缺乏，国外费用昂贵

♣ 很有必要建立一种准确、快速而且成本较低的遗传疾病鉴定方法♣ 对奶牛群进行检测

♣ 淘汰有害基因♣ 为健康的选育提供依据

疾病 DUMPS BLAD CVM

致病基因 UMPS CD18(β亚基 ) 基因 SLC35A3

碱基突变 C405-T405 A383-G383 Exon4:G-T

氨基酸转换 精氨酸 -终止密码 天门冬氨酸 -甘氨酸

缬氨酸 -苯丙氨酸

功能缺失 不能催化乳清酸转为尿甘酸

整合素表达明显减少或缺乏

核苷酸糖转运酶不足

酶切位点 AvaⅠ酶切位点消失

TaqⅠ酶切位点消失

无

致病分子机理：

二、材料和方法

材料 132 份精液样本； 417 头荷斯坦牛的血液样本

方法

提取 DNA

引物设计 退火温度摸

索

对所有样本进行疾病检测

筛选出有害基因携带者

AS-PCRCRS-PCR

PCR-RFLP测序

验证

结果

返回

Allele-specific PCR

根据单碱基突变位点的碱基替代情况设计 PCR 引物， 其中一条引物根据突变位点邻近序列设计， 人为引入错配碱基， 使得引物 3’端和单碱基突变的一种突变型在 PCR扩增后形成一个酶切位点， 其 PCR 产物可用类似 PCR-RFLP方法进行分析。

返回

Created Restriction Site PCR

三、结果

AS-PCR

CRS-PCR

RFLP 测序

扩大样本检测及应用

建立

应用

验证 验证

1 、 DUMPS（尿苷酸合酶缺乏症）

扩增条件：两引物分开扩

Tm ： 63.3℃

1-4 ：健康个体（ 90bp ）； 5 ：携带者（ 261bp/90bp ）； M ： Marker

1.1 AS-PCR：

1.2 利用 RFLP和测序技术验证：

PCR 扩增结果：目的片段为 358bp

CC：健康个体； CT ： DUMPS携带者； M ： MarkerI

DUMPS 携带者测序结果 健康个体测序结果

所建技术准确、可靠

1.3 扩大样本检测 549 个：（ 417个奶牛样本和 132个精液样本）

基因型Genotype

样本数Number

基因型频率Genotype frequency

等位基因频率Allele frequency

T C

CT 1 0 ． 0018 0.0009 0.9991

CC 548 0.9982

合计 549 1.0

2 、 BLAD（白细胞黏附缺陷病）

扩增条件：两引物分开扩 Tm ： 65℃

1-2 健康个体 818bp ；3 ：携带者为 818bp/500bp ；M ： Marker

2.1 AS-PCR：

2.2 利用 RFLP技术验证：

PCR 扩增结果：目的片段为 961bp

酶切结果：AA ：健康个体；M ： MarkerI

2.3 扩大样本检测： 549个（ 417个奶牛样本和 132个精液样本）

无 BLAD有害基因

PCR 扩增结果：目的片段为 225bp

AA：健康个体；AB： CVM携带者；M ： MarkerI

3 、 CVM（脊椎畸形综合症）3.1 CRS-PCR:

CVM 携带者测序结果 健康个体测序结果

3.2 利用测序技术验证： 该方法准确、可靠

基因型Genotype

样本数Number

基因型频率Genotype

frequency

等位基因频率Allele frequency

T G

GT 10 0.029 0.015 0.985

GG 332 0.971

合计（ Tota

l ）

342 1.0

3.3 扩大样本检测： 549个（ 417个奶牛样本和 132个精液样本）

单管 AS-PCR技术

四、讨论

准确、快速、大规模应用

两步 AS-PCR 技术

PCR-RFLP 技术

减少了引物设计和条件摸索的难度，更稳定

比较

比较

难度减低快速低成本

三种隐形遗传疾病在公牛群携带情况表

DUMPS 美国1984 1990

2%0.2%-2.5%

BLAD

美国1992 1999

14.1% 9.6%

波兰1995-1997

1998-1999

2000-2001

2002-2003

2004-2006

7.9% 4.0% 2.1% 1.8% 0.8%

德国1997 2007

9.4% 0.3%

CVM 德国2002 2007

8.3% 2.3%

表明分子标记辅助选择能够从根本上降低有害基因频率

• 非常感谢导师张淑君教授

• 感谢实验室各位老师

• 感谢武汉市畜牧兽医研究所刘晓华老师

• 感谢张老师小组的所有成员和实验室的 同学

致谢