生物相容性反应

魏强2009.12.12

http://www.cchem.berkeley.edu/crbgrp/

http://users.ox.ac.uk/~dplb0149/index.html http://www.udel.edu/chem/fox/

http://www.cup.uni-muenchen.de/oc/carell/

http://raolab.stanford.edu/http://www.scripps.edu/chem/sharpless/

http://www.chemistry.buffalo.edu/people/faculty/lin/

http://cmir.mgh.harvard.edu/fac/faculty/about/85

http://www.chem.ucsb.edu/~bodegroup/index.php

http://www.ncmls.nl/NCMLS/MenuStructures/PI/theme3/FlorisRutjes.asphttp://userpage.chemie.fu-berlin.de/~hackenbe/01home.htm

生物相容性反应的条件 反应速度快 无需辅助试剂，无副产物或副产物无害 不与生物体内靶标外的大量官能团反应 可以耐受新陈代谢 反应温度约 37°C, pH 6-8 对空气、水份不敏感

醛酮成腙、肟

OHOHO

HOHN

OH

O

O

ManLev

Metabolic conversionto unnatural sialic acid

O

OH

HOO

O

OH

HOOH

CO2-

O

HOO

O

OH

HOOH

O

CO2-

Cell

Incorporation intoglycoconjugate

Hydrazone formation withuniquely reactive ketone

O

HOO

N

OH

HOOH

O

CO2-

CellNH

OFuctional group

经过代谢过程每个细胞可以接种上约 1.8×106 个非天然唾液酸

R1 R2

O

H2N

HN R3

O

+EtOH or Water heat N

HN R3

OR2

R1

acetic acid

N

HN NH2

OR2

R1Wolff Reduction(1912)

Martti Tolvanen and Carl G. GahmbergJ. BIO. CHEM. 261 1986 ， 9546

O

CH2OH

OH

OHOH

OH

OH

CH2OH

OOHOH

OH

NH2NH2

-H2O

OH

CH2OH

NNH2

OHOH

OH

O

CH2OH

NHNH2

OHOH

OH

Carolyn R. BertozziSCIENCE 276 1997， 1125-1128 （ 276s1125.pdf ）

Carolyn R. BertozziTHE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 273, 1998 31168–31179, (273jbc31168.pdf)

细胞表面寡糖的官能化

Carolyn R. Bertozzii THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 274, 1999 21878–21884, （ 274jbc21878.pdf ）

醛酮成腙、肟反应的局限性

1. 需要弱酸性条件（ pH = 5-6 ），不能在大多数生物组织内反应只能在特殊的细胞、细胞表面或体外反应）；2. 受生物体内原有醛酮的影响；3. 受羰基可以存在的位置的影响（一般存在于细胞外环境和细胞表面）。

生物相容的官能团叠氮叠氮化合物的特点：1. 几乎不存在于生物体中；2. 略微的亲电性，不与硬亲和试剂反应；3. 基本上不与水反应；4. 有抗氧化能力；5. 只有三个原子。

对叠氮化合物的误区 : 1. 热稳定性差； 2. 见光分解； 3. 有毒。

staudinger reaction

图：经典的 staudinger反应

但由于磷试剂易被氧化，最只要的是此反应速率非常慢，所以此反应应用与生物分子的标记有一定的限制，因此如何加快此反应的速

率问题决定了它在生物标记的应用。

P + N3R P N3R P NR + N2

R' PPh2

OR''

O

R N3+

-N2 R' P+

OR''

O

PhPh

N-

R

-R''OH

R' P+

O

Ph Ph

N R

H2O

R' PPh2

NHR

O

phosphine azideaza-ylide

amide-linkedligation product

H. Staudinger and J. Meyer Helv. Chim. Acta. 2, 635(1919)Y. G. Gololobov and L. F. Kasukhin, Tetrahedron 48, 1353(1992)

Carolyn R. Bertozzi SCIENCE 287 2000 ， 2007-2010

Eliana Saxon and Carolyn R. Bertozzi*SCIENCE VOL 287 17 MARCH 2000， 2007-2010 （ Cell Surface Engineering by a modified staudinger reation.pdf）

Roger Y. TsienScience 281, 269 (1998)

最早将荧光基团标记活体细胞的例子：

Carolyn R. Bertozzi,PNAS 2002,99,19

Carolyn R. Bertozzi,NATURE 430 2004， 873-877 （ nature02791.pdf ）

Chemical remodelling of cell surfaces in living animals

Carolyn R. Bertozzi

ChemBioChem 2004, 5, 371 – 374 (5chembiochem371.pdf)Carolyn R. Bertozzi

J. AM. CHEM. SOC. 2007, 129, 8400-8401 （ ja070238o.pdf ）

Carolyn R. BertozziAngew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 2394 –2397 （ anie200704847.pdf）

OO OH

N

O

N

O

PPh2

O

O

N

N

N

NO2

1

AcO

AcOAcO

OAcHN

O

N3

Ac4ManAz

Raphael M. Franzini and Eric T. KoolJ.AM.CHEM.SOC.2009,131,16021-16023

Staudinger 反应的范围和限制

非生物的无毒化合物，叠氮和三芳基膦可以在 pH 约为 7 的条件下反应形成目标产物

限制：三芳基膦易被氧化限制了此反应的应用范围。空气及体内的酶都可以将三芳基膦氧化。

Christian P. R. HackenbergerChem. Commun., 2008, 2932–2934Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, ASAP (acie-asap)

R1

N3+ P(OR2)3

-N2PN

OR2

OR2

OR2

R1

PN

OR2

OR2

OR2

R1

H2O-R2OH

PHN

OR2

OR2

O

R1

Staudinger-phosphite reaction

Cu-Catalyzed Huisgen reaction

C.W. Tornoe, C. Christensen, M. Meldal, J. Org. Chem.2002, 67, 3057 V. V. Rostovtsev, L. G. Green, V. V. Fokin, K. B. Sharpless,Angew. Chem. Int. Ed. 2002, 41, 2596

OS

RO

O N3Li, CuCl

Minor

OS

RO

O

HNN N

N3

low yield

Lábbé, G. Bull. Soc. Chim. Belg. 93, 1984 579-592

Pd(0) or Pd(II)complexs

LnPd(0)

LnPd(II)

R1

X

LnPd(II)

R1

R2

R1

R2

R1 X R2

Cu

CuX

H R2

[amine base]H+X-

+amine base

oxidationaddition

transmetallation

reductiveelimination

Sonogashira, K Tetrahedron Lett.1975, 16, 4467-4470.

O

N N+ N-

+ N NN

O

98oC, neat

18h

Huisgen, R. Angew. Chem. Int. Ed. 2 ,1963 565–598. Huisgen, R. Angew. Chem. Int. Ed. 2 ,1963 633–645. R. Huisgen in 1,3-Dipolar Cycloaddition Chemistry (Ed.: A.Padwa), Wiley, New York, 1984, pp. 1 – 176

Valery V. Fokin, and Guochen JiaJ. AM. CHEM. SOC. 2005, 127, 15998-15999

Ronald T. RainesJ. AM. CHEM. SOC. 2007, 129, 12670-12671

Valery V. FokinOrg. Lett., 9, 2007 5337-5339

某些配体的加入可提高铜催化 Huisgen 反应的速率和选择性。

K. Barry Sharpless, and Valery V. FokinOrg. Lett., Vol. 6, No. 17, 2004 ， 2853-2855

David A. TirrellJ. AM. CHEM. SOC. 2003, 125, 11164-11165

Click chemistry 在细胞中的应用：

Benjamin F. CravattJ. AM. CHEM. SOC. 2003, 125, 4686-4687Chemistry & Biology, 11, 2004 535–546

Chi-Huey WongPNAS 15, 2006 103 12371–12376

由 Huisgen 反应生成的五元环有时不仅可起到连接作用，而且还可以促进荧光基团发光。

Christian P. R. Hackenberger and Dirk SchwarzerAngew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 10030 – 10074

Valery V. Fokin, K. Barry Sharpless and James R. HeathAngew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 4944 –4948

Click chemistry 在蛋白质的应用：

原位制备类抗体蛋白

Thomas CarellAngew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 8350 – 8358Org. Lett., 10 ， 2008 249-251Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 3442 –3444

Click chemistry 在 DNA 中的应用：

Click chemistry 的优缺点：

优点： 1. 叠氮，端炔罕见于生物体内； 2. 反应速度较快（在细胞溶菌液中的速度是 staudinger ligation 反应的 25 倍）； 3. 反应有很好的区域选择性，没有背景标记。缺点： 1. 非 Cu 催化的 Huisgen 反应需要加压或加热，不适于生物相容性反应； 2. 端炔在生物体内可以反应，不能实现生物正交反应； 3. Cu 对细胞是有毒性的。

Strain-Promoted Huisgen reaction

OCOOH

O COOH

COOH

F

COOH

H

F

F

OCOOH C. R. Bertozzi,

J. Am. Chem.Soc. 2004, 126, 15046ACS Chem. Biol. 2006, 1, 644Chembiochem 2004, 5, 637.PNAS 2007 104,16793.J. AM. CHEM. SOC. 2008, 130, 11486–1493

1.0 （ 0.0012M-1s-1 ）

0.5

1.8

0.5

31.8 （ 0.076M-1s-1 ）

Staudinger ligation ： 0.0025M-1s-1 Cu catalyst click ： 0.0625M-1s-1 （ not in vivo ）

环张力 huisgen 反应

优点：室温，无催化，无毒。（环张力释放的 18kcal/mol 的大于成环所需的能量）缺点：反应速度慢

反应速率有所提高

R N3R'

strain promoted NN

N

RR'

Br Br

OH

MeO

O

Br

OMeO

O

+

3eq AgClO4

Tol

1. 2eq NaOMe, DMSO2. 10eq LiOH, 20% H2O/Dioxane

O

HO

O

F3C OPfp

O

1.

Pyr

2. 4, Et3N

NH

OH2N

S

NH

HN

H

HOO

3

4

NH

O

S

NH

HN

H

HOO

3

O

HN

O

C. R. Bertozzi, J. Am. Chem.Soc. 2004, 126, 15046

Geert-Jan BoonsAngew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 2253 –2255

HO

TBSCl, pyridine

TBSO

Br2, CHCl3

HO

Br Br

LDA, THF

HO

O

O

Cl

NO2

pyridine OO

O

NO2H2N

ONH

O S

HN

NH

O3 4

DMF, Et3N ONH

O S

HN

NH

O3 4

ONH

O

ONH

O S

HN

NH

O3 4N

HO

Ph2P

O

MeO

ONH

O S

HN

NH

O3 4

ONH

O

Carolyn R. BertozziOrg. Lett., 10, 2008 3097-3099(ol801141k.pdf)

另外本文也给出了含炔八元环的合成方法，见下图。

Carolyn R. BertozziNATURE BIOTECHNOLOGY 25 2007 ， 1483-1487PNAS 2007 104 16793–16797

Carolyn R. Bertozzi320 SCIENCE ， 2008 664-667

In Vivo Imaging of Membrane-Associated Glycans in Developing Zebrafish

Floris P. J. T. Rutjes ChemBioChem 2008, 9, 1805 – 1815

Floris P. J. T. Rutjes ChemBioChem 2007, 8, 1504 – 1508

O

CF3

OO

O

CF3

OO

BnN3, MeOD25oC, 14h N

N

NBn

CF3

COOEt

NN

NBn

COOEt

CF3

+ O

NN

NR3

O

R1

R2

+N3 R3

NN

N R3

R1 R2

O

R1

R2

O R1

R2

N

N

N

R3

N

N N

R3

OO

R2

R1

path Apath B

另一种环张力促进的 huisgen 反应：

Photoactivated Huisgen reaction

Qing LinAngew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 2832 –2835

NN

NN

Ar1

Ar2hv

-N2

Ar1 N+ N- Ar2

nitrile imine

Z

Y

NNAr1

Ar2

ZY

Photoactivated 1,3-dipolar cycloaddition reation between a 2,5-diaryl tetrazole and substituted alkene dipolarophile

NH2Lyso

(250M)Lysom/z=14304

NN

NN

O

O

NNaO3S

O

O1.25mM

100mM NaH2PO4, 25mM NaOAc,pH 8.5, RT, 3h

NN

NN

HN

O

Lyso

(7M)Lyso-Tetm/z=14552

NH2

O350M

PBS, pH 7.5, RT2min 302nm

NN

HN

O

Lyso

Lyso-Pyrm/z=14595

NH2

O

J. S. Clovis, A. Eckell, R. Huisgen, R. Sustmann, Chem. Ber. 1967, 100, 60.

Qing LinJ. AM. CHEM. SOC. 2008, 130, 9654–9655

Qing LinOrg. Lett., Vol. 9, No. 21, 2007 4155-4158Qing LinOrg. Lett., Vol. 10, No. 17, 2008 3725-3728

N N

NN +

R3

R4

302nm

NN

R2

R3

R1,R2=OMe, Cl, Br, CO2H, NMe2R3, R4=CO2Me. CN, CONHPh, CHO, Ph, alkyl

R1R2

R1R2

MeO

O

N NN

NNR2

+R'

R

R'

365nm

MeO

O

NN

NR2

R' R'R

R=H, MeR'=CO2Me. CN, CONHPh, Ar

Other Huisgen reaction

这里作者使用了另一类生成 N ， O杂环的 Huisgen反应，并提供了其所选底物的合成方法。

Thomas CarellOrg. Lett., 11, 2009 ， 2405-2408

HR1

R2 N+ O-

R1

O

N

R2

HH R1

ON

HR2

exo-1,4-product exo-1,5-product

+

Diels-Alder reaction 2008年 ScottA.Hilderbrand课题组通过使用四氮烯类化合物来做二烯体进行了活细胞的标记，无论是产率，选择性，还是速率都非常高。

NH2

N

N N

N

+CO2H -N2

CO2H

HNN

NH2

S. A. Hilderbrand Bioconjugate Chem. 2008, 19, 2297 – 2299.

约 1.9 M-1 s-1

Fast and Sensitive Pretargeted Labeling of Cancer Cells through a Tetrazine/trans-Cyclooctene Cycloaddition

Scott A .Hilderbrand Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 7013 –7016

6000±200 M-1 s-1

J. M. Fox, J. Am. Chem. Soc.,130, 2008 13518 – 13519.

N N

NNR R

NN

NN

R

R -N2

R=Ph or N

N

N

H

H

R

R

NH

N

R

R

HH

5

+

N

N

N N

N

N

5

N

N

H

HNH

N

N

N

N

N

100% conv after 40 min at 25oC at 5M~quantitative yield with k2= 2000M-1s-1

successful reactivity in organic solvent, water, cell media or cell lysateN2 is the only byproduct

The thiol-ene reaction

历史最早的 thiol-ene

T. Posner, Chem. Ber. 1905, 38, 646 – 657.

Horst KunzAngew. Chem. Int. Ed. 2007, 46, 5226 –5230

Alessandro DondoniAngew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 8995 – 8997

Benjamin G. DavisAngew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 7798 –7802

Thiyl Glycosylation of Olefinic Proteins: S-Linked Glycoconjugate Synthesis

Benjamin G. DavisJ. AM. CHEM. SOC. 2008, 130, 5052–5053

Cross-Metathesis Application to Site-Selective Protein Modification

Benjamin G. DavisJ. AM. CHEM. SOC. 2008, 130, 9642–9643Chem. Commun., 2009, 3714–3716ChemBioChem 2009, 10, 959 – 969

Benjamin G. DavisChemBioChem 2009, 10, 959 – 969

Benjamin G. DavisJ. AM. CHEM. SOC. 2009, 131, 16346–16347

Protein Suzuki-Miyaura Cross-Coupling

Pd catalyst 50 eqboronic acid 500eq

Conversion >95%LnPd(0)

LnPd(II)

R2

X

R2 Xoxidationaddition

LnPd(II)

R2

OR

L(n-1)Pd(II)

R2

R1

R1-R2

R1 BR2 + M+(-OR)

organoborane base

R1 BR2

OR

borate

L + RO BR2

OR

M+(-OR)

M+(-X)

reductiveelimination

transmetallation

Suzuki cross coupling

Jianghong Rao Angew. Chem. Int. Ed. 2009 ASAP

O OHO

CO2H

HN

O

HN

NH

ON

SCN

FITC-CBT

S

NHHNHN

O

O

O

H H

32

HN

ON

S CN

biotin-CBT

O NEt2Et2N

SO3-

S

HN

O

HN

OO

O N

SCN4

rhodamine-CBT

N

SHO

CN +H2N

OH

O

HSPBS

pH 7.4 N

SHO

N

S

OH

O

H2N

HN

O

HS

protein

PBS

pH 7.4

N

SCN

F

HN

Oprotein

S

NN

SF

E. H. White, F. McCapra, G. F. Field, W. D. McElroy, J. Am. Chem. Soc. 1961, 83, 2402.

Labeling of Terminal Cysteine Residues on Proteins

Chemoselective Amide Ligations

Jeffrey W. BodeAngew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 1248 –1252

Jeffrey W. BodeJ. AM. CHEM. SOC. 2006, 128, 1452-1453

R1

O

OH

ONH

R2HO+-H2O, -CO2

DMF, 40oC0.2-0.01 M

R1

O

NH

R2

R1

O

OH

O

+DMF, 40oC

OHN

R2

OMe

OMe

OR1

O

NH

R2 O

O

OMe