6. előadás oligonukleotidok szintézise, koenzimek,...
TRANSCRIPT
6. Előadás Oligonukleotidok szintézise,
koenzimek, vitaminok
Oligonukleotidok szintézise
Elv:
NO
OH
O
PO OH
OH
NO
OH
O
PO OH
OH
( )
( )
1. Kondenzáció
5’-OH + H (3’)
2. Vízmentes közeg
3. Védőcsoportok
Módszerek
1. Karbodiimid módszer, oldatban (1955)
Tood (Nobel díj 1957), Khorana (Nobel díj 1975)
Kapcsoló szer: DCC/Piridin
8-12 tagszám
2. Foszfit módszer, szilárd hordozón
Beaucage, Caruthers; (1981)
(Merrifield Nobel dij, 1984)
5’ 3’
Kapcsoló szer: DCC/Piridin
Védőcsoportok: acetil, tritil
1. lépés: Védett komponensek kapcsolása
N, N – diciklohexil-karbodiimid (DCC)
Tritil (Tr)
O-acetil (Ac)
N-acetil (Ac)
N
N
N
N
NH
OO
OH
C
C
O
CH3
N
N
NH
O
OO
O
OH
OH
O
P
C
CH3
O
C
O
CH3
6
4
1. Szintézis oldatban
C
N
N
Sir Alexander R. Todd
(1907-1997)
2. lépés: A védőcsoportok eltávolítása
AO
OH
O C
OO
OH
O
P
OH
AO
Tr
O C
OO
OH
O
P
OH
OH T
OO
OH
O
P
OAc
AO
Tr
O C
OO
OH
O
P
OAc
Ac
Ac
1. Lúg
2. Sav
(80% AcOH)
Lúg
+
3. lépés: Láncnövekedés
Megjegyzések: (alkalmas a ribooligonukleotid sorban is)
Védőcsoportok
CO
védelem (Bz)
CMeO
védelem (MMTr)
AO
MMTr
O
OH
OHO P
OBz
Bz2
MMTr = monometoxi-tritil
2.1 Szilárd hordozó: szilika, üveggyöngy, műanyag, cellulóz, papir
szilika Si OH Si O (CH2)3 NH2szilika
1. borostyánkősavanhidrid
2. védett nukleotid
szilika Si O (CH2)3 NH C (CH2)2 C
O O
O
AO
DMTrBz2
savérzékeny
bázis érzékeny
Si O (CH2)3 NH C (CH2)2 C
O O
O
AO
OH
szilika
Bz H +
+ DMTr +
l= 498 nm
2. Szintézis szilárd fázison
(karbokation)
Foszfit módszer Beaucage, Caruthers (1981)
3-aminopropanol
2.2 Védőcsoportok
benzoil
CO
N-6-benzoil adenin [ABz] N-4-benzoli citozin [CBz] N-2-isobutil guanin [GIBu]
C
O
C
OCH3
OCH3
4,4’-dimetoxitritil (DMtr)
a) CH3-
b) b-CN-CH2-CH2-
(b-cianoetil)
NP
N,N diizopropil
N
N
N
N
NH2
OOH
O
OH OHP
C+
OCH3
OCH3
DMTr +
szilika
Bz2
Si O (CH 2 ) 3 N H C (CH 2 ) 2 C
O O
O
A O
DMTr
izopropioil
2.3 Aktiválás
A
OO
O
DMTr
P
NH3CO
N
N
NN
A
OO
O
DMTr
P
H3CO
N
N
NN
H
tetrazol
Bz Bz
diizopropil foszforamidát
2.4 Kapcsolás
N
N
NN
A
OO
O
DMTr
P
H3CO
Bz
G
OOH
O
Szilika
IBu
A
OO
O
DMTr
P
H3CO O G
O
O
Szilika
IBu
Bz
+ tetrazol
2.5 Oxidáció: „foszforos sav (foszfonsav) foszforsav”
A
OO
O
DMTr
P
H3CO O G
O
O
Szilika
IBu
Bz A
OO
O
DMTr
P
OCH3
OG
O
O
O
Szilika
IBu
Bz
3
2
1
I2, H2O
kollidin*
2.6 Hasítás
1. OCH3 eltávolítása (tiofenol) helyette OH
2. Oligonukleotid lehasítása a (szilika) hordozóról (NH3)
3. Nukleozid bázis védőcsoport (Bz, iBu) eltávolítása (NH4OH + hő)
2.7 Tisztítás HPLC Elektroforézis
*trimetil-piridin
Foszforsavak
P
O
OH
OH
OH
P
O
OH
OH
RO
P
O
OH
OR2
R1O
P
O
O
OH
OH
OH
OH
O
P
P
O
O
OH
RO
OH
OH
O
P
P
O
O
OH
OH
OH
O
O
P
OH
OH
O
P
P
O
O
OH
RO
OH
O
O
P
OH
OH
O
P
P
O
OHO
monoészter
foszfodiészter - lineáris - ciklusos
>300 oC
metafoszforsav difoszforsav
160 oC
foszforsav (ortofoszforsav)
trifoszforsav
difoszforsav-észter trifoszforsav-észter
Phosphoramidite chemistry
https://www.sigmaaldrich.com/technical-
documents/articles/biology/
dna-oligonucleotide-synthesis.html
bázis1
bázis2
bázis1
bázis2
bázis2
bázis1
bázis1
bázis1
Következő ciklus
Kezdés
„Sapkázás” (capping): reakció ecetsavanhidriddel, a szabad OH acetilezése
DNS/oligonukleotid szintetizátor
DNS/oligonukleotid chip (csip)
Koenzimek, vitaminok
Koenzimek
Enzim = apoenzim (fehérje) + koenzim (nem-fehérje)
Szubsztrátspecifitás Reakciótípus
Nukleotid Fémion (példa) Egyéb
Fe (citokróm oxidáz)
NAD Cu (aszkorbinsav oxidáz) B1
FAD Zn (alkohol dehidrogenáz) B6
ATP Mn (hisztidin ammónia-liáz) B12
Koenzim A Co (glutamát mutáz) folsav
Ni (ureáz) pantoténsav
Mo (xantin oxidáz) biotin
V (nitrát reduktáz) Koenzim Q
Se (glutation peroxidáz)
Típusai
Nukleotid koenzimek
1. Adenozin mono-, di- és trifoszfát
felfedezés: Lohmann, Fiske (1929)
OO
OHOH
P
O
O-
O- N
N
N
N
NH2
OO
OHOH
P
O
O-
P
O
O
O-
OH
O-
O
O
PN
N
N
N
NH2
OO
OHOH
P
O
O-
P
O
O
O-
OHN
N
N
N
NH2
P
O
OH
O-
O-
++ H
2O
Adenozin-monofoszfát (AMP)
ATP ADP foszforsav
DH° = -31 kJ/mol
b-N-glikozid
D-ribóz
észterkötés
ciklusos AMP
2. NAD/NADH: oxidáció
N
O
NH2
N
N
NH
N
NH2
nikotinamid
adenin
nikotinamid-adenin-dinukleotid (NAD+)
5’
5’
D-ribóz
Példa:
CH3-CH2-OH + ADH
enzim CH3-COH +
NAD+ NADH
ADH = alkohol dehidrogenáz
acetaldehid
Mechanizmus
N+
O
NH2
H
H
H H
R
N
O
NH2
H
H
H H
R
H
+2e- + H+
NAD+ NADH
3. FAD/FADH2: oxidáció
Flavin-adenin-dinukleotid (FAD)
/enzimkötődés/ H
oxidált
redukált
Flavus (latin), sárga
4. Koenzim-A (CoA) felfedezés: Lipmann, 1946
adenozin-3’,5’-difoszfát
2,4-dihidroxi-3,3-dimetil-vajsav
b-alanin ciszteamin
pantoténsav (vitamin)
5’
3’
észter kötés
észter kötés
savamid kötés
savamid kötés
- NH –(CH2)2 - SH - NH –(CH2)2 - S – CO – CH3
S-acetil koenzim-A (Ac-CoA)
VITAMINOK
1912: vitamin = vita amines (Casimir Funk)
„Kis mennyiségben kívülről kell felvenni.”
Nem vitaminok: esszenciális aminosavak
esszenciális zsírsavak
Provitaminok
Antropocentrikus
pl. C-vitamin: ember (tengeri malac) igen
patkány nem
p-amino-benzoesav: baktérium igen
ember nem
Kémiai szerkezet: heterogén Felosztás (oldékonyság alapján)
Vízoldékony Zsírban oldódó
B, C, H és P vitaminok A, D, E és K vitaminok
- koenzimek is - bélből szívódnak fel
- felesleg kiürül - májban raktározódnak
1958: 15-20 féle vitamin
B1 vitamin (tiamin) szerkezet 1934, szintézis 1936
Beriberi piroszőlősav nem bomlik le
N
N
NH2
CH3S
N+
CH3
CH2CH2OHN
N
NH2
CH3S
N+
CH3
CH2CH2O
O
O-
O P
O-
O-
O P
N
N
NH2
CH3S
N+
CH3
CH2CH2O
COOH
CH3
OH
O
O-
O P
O-
O-
O P
ATP
pirimidin tiazol
tiamin-pirofoszfát (koenzim)
COOH
O
CH3
piroszőlősav:
piroszőlősav-dekarboxiláz
„aktív piruvát”
• brit tengerészek (1747) • Ch. Eijkman (1897), F. G. Hopkins [orvosi Nobel-díj (1929)] • C. Funk – vita amin (1912)
1 2
3
tiamin
észter kötés
+
B2-vitamin (riboflavin)
izolálás: Richard Kuhn (1933), 4500 liter tejsavóból 1g
(természetben 1-foszfát-észter)
N N
NNH
O
O
OH
OH
OH
OH
CH3
CH3
H
H
H
HH
1,3,5,8-tetraazanaftalin (pteridin)
bőrbántalom
növekedés
B6-vitamin (piridoxál, piridoxin)
izolálás: Euler (1937)
NCH3
OH
CHO
CH2OH
NCH3
OH
CHO
CH2O O-
O-
O
P
piridoxál (- CHO) piridoxin (- OH)
5’-foszfát - észter (koenzim)
Bőrbántalmak, élesztő
Izo-alloxazin váz
D-ribóz
http://www.tankonyvtar.hu/hu/tartalom/tkt/tej-tejtermekek/ch03s05.html
(1900- 1967) „for his work on carotenoids and
vitamins„ Nobel-díj, 1938
Prof. D. Hodgkin, National Portrait Galery, London
B12-vitamin (kobalamin)
korrinváz
Szerkezet: D. Hodgkin, Oxford,
Nobel díj, 1964 (penicillin is)
5,6-dimetil- benzimidazol
CN- vagy HO- vagy H20
Folsav (pteroil-glutaminsav)
izolálás: Peterson (1940)
N
NH
N
N
NHO
O
O
NH2
NH
O OH
OHpteridin
p-amino-benzoesav
glutaminsav
5-formil-5,6,7,8-tetrahidrofolsav, folinsav (koenzim)
•vérszegénység (anémia, leukopénia)
N
NH
N
N
NHO
O
O
NH2
NH
O OH
OH
4
2 8
5
1 7
CHO
N
NH
N
N
NHO
O
O
NH2
NH
O OH
OH
CH3
NH2
methotrexat
Nikotinsav(niacin)/ B3 vitamin és a nikotinsavamid
N
O
OH
N
O
NH2
hiánya: pellagra (pelle agra = durva bőr)
nikotinsavamid NAD+ (koenzim)
Pantoténsav/B5 vitamin
O
ONH
OH
OH
CH3
CH3
OH
b-alanin
koenzim A élesztő
niacin
a,g - dihidroxi – b,b- dimetil-vajsav
Koleszterin szint szabályozó (?)
„stressz ellenes” vitamin
pantothen (πάντοθεν): mindenfelől
Roger J. Williams 1933
C-vitamin (L-aszkorbinsav)
felfedezés: 1928 izolálás: Szentgyörgyi A. (1932)
O
OHOH
O
OH
OH
O
O
HO
HO
HO
H
H
CH2OH
=
•skorbut
1
3 4 6
H-vitamin (biotin)
imidazolidin
tetrahidrotiofén
* *
*
izolálás: Kögl (1936) 2800 kg tojássárgája 390 mg
2-keto-L-gulonsav g-laktám
1
2
6
L-aszkorbinsav)
Avidin – biotin Kd = 10-15
1 tojás 50 g, ebből 17 g sárgája 390 mg = 164 706 db tojás
Koenzim-Q (ubikinon, CoQ)
(eukarióta sejtekben, mitokondriumok)
szemikinon
ubikinol
Koenzim Q4, n = 4 Koenzim Q9, n = 9 Koenzim Q10, n = 10
(Izoprén egységek)
ubikinon
Peter D. Mitchell, 1961 (Nobel díj, kémia, 1978) „for his contribution to the understanding of biological energy transfer through the formulation of the chemiosmotic theory". Később: elektrontranszport lánc koncepció – CoQ10 „protonvonzó”
1920-1992
http://www.q10facts.com/a-brief-history-of-coenzyme-q10-2/
A-vitamin
OH
O
O
N-protein
N-protein
O
provitamin: b-karotin
A vitamin
világos sárga olaj fp.: 136°C (vákuum) A1 = retinol A2 = dehidroretinol
„all-transz” retinal
4
1 7 11
12
11
11-cisz-retinal
opszin
rodopszin
H2O
hn
H2N-protein
Kuhn, 1931
halak májából
növekedési
faktor,
farkasvakság
0,5-1 mg/nap
1 NE = 0,6 mg
H2N-protein +
CH2=C-CH=CH2
CH3
D-vitaminok
CH2
OH
CH3
CH3
CH3
CH3
H
H
CH3
CH3
HH
CH3
CH3
OH
CH3
napfény
hn
7-dehidrokoleszterin D3-vitamin (kolekalciferol)
op.: 84-85°C
Szerepe: Ca2+- és foszfát felszívódás, csontképződés sziv- és érrendszer védelme, immunhiányos állapot, osztódás Hiánya: angolkór (rickets), csontritkulás, csontosodási zavar Hipervitamiózis: Csontszövet Ca2+- lerakódás, vesekőképződés
CH2
CH3
OH
CH3
CH3
CH3
CH3
H
HCH3
CH3
HH
CH3
CH3
OH
CH3
CH3
hn
ergoszterol D2-vitamin (ergo)kalciferol
op.: 115-117°C
1 NE = 0,025 mg
l = 270-300 nm 3 7 5
19 1
20
Állati eredetű élelmiszerek Halolaj, máj, tojás, tejtermék
Növényi eredetű élelmiszerek Sörélesztő, gombák
R2
R
R1
A B
C D 1 2
3
4 5
6 7
8 9
1
0
1
1
1
2 1
3 1
4 1
5
1
6
1
7
E-vitamin (tokoferol)
O
R2
R1
R3
CH3
CH3
CH3
CH3CH3
CH3
izolálás 1936 felfedezés 1927 szintézis 1938
R1=R2=R3=CH3 a-tokoferol (5,7,8-trimetil)
R1=R3=CH3, R2= H b-tokoferol (5,8-dimetil)
R2=R3=CH3, R1= H g-tokoferol (7,8-dimetil)
halványsárga olaj
•antisterilitás (patkány)
5
7
kromán váz C16 lánc
Előfordulás: növényi olajok, napraforgó, oliva, tökmag hús, máj, tojás, tejtermék Szerepe: antioxidáns, gyulladásgátló Hiánya: vérszegénység, izomsorvadás, meddőség (embernél ritka) Hipervitamiózis: Csontszövet Ca2+- lerakódás, vesekőképződés
O
R2
R1
R3
CH3
CH3
CH3
CH3CH3
CH3
E-vitamin (tokotrienol)
τόκος [tókos], φέρειν [phérein] = születés, hordozni
K1-vitamin (fillokinon)
sárga olaj
O
O
CH3
CH3
CH3CH3
CH3CH3
2
4
3
1
fitil-csoport naftokinon
2-metil-3-fitil-1,4-naftokinon
Előfordulás: spenót, káposztafélék, saláta, brokkoli tejtermék, máj Szerepe: antioxidáns, gyulladásgátló, koaguláció Hiánya: vérzékenység (a koaguláció hiánya miatt) Bomlás: fény, hő (100oC felett)