CROMATOGRAFIA

Cromatografia este o metod de analiz care se bazeaz pe

separarea n zone spaiale distinct a componenilor unui amestec la trecerea

acestuia printr-un mediu n care componenii se deplaseaz cu viteze diferite.

Termenul de cromatografie provine de la cuvntul grecesc chroma care

nseamn culoare.

n cromatografie se disting dou faze: faza staionar (faza fix)

i faza mobil (eluentul). Faza staionar este reprezentat de materialul prin

care circul proba i care asigur separarea componenilor din amestec iar

faza mobil este fluidul (lichid sau gazos) care transport proba la suprafaa

fazei staionare.

Clasificarea metodelor cromatografice

Dup mecanismul de separare, metodele cromatografice pot fi

mprite astfel: cromatografie de adsorbie, cromatografie de partiie,

cromatografie de schimb ionic, cromatografie de excludere molecular i

cromatografie de afinitate. Dac se ine seama de starea de agregare a celor

dou faze, metodele cromatografiece sunt clasificate n: metode

cromatografice de tip solid-lichid, lichid-lichid, lichid-gaz.

Cromatografia de adsorbie se bazeaz pe adsorbia difereniat

a componenilor unui amestec pe un suport adsorbant i deplasarea acestora,

sub aciunea fazei mobile, cu viteze invers proporionale cu tria forelor de

adsorbie. ntre suportul adsorbant i substanele care se deplaseaz peste

faza staionar se stabilesc interacii intermoleculare de tipul: dipol-dipol,

van der Waals, legturi de hydrogen care conduc la o adsorbie fizic,

reversibil. n cazul n care s-ar forma legturi chimice, procesul s-ar numi

chemoasorbie; deoarece chemoasorbia este un process ireversibil nu

prezint interes pentru cromatografie.

Cromatografia de partiie are ca punct de referin coeficienii

de repartiie diferii ai componenilor unui amestec ntre dou faze

nemiscibile sau parial miscibile: apa sau alt solvent polar (faza staionar)

sau un solvent organic (faza mobil)

Coeficienii de repartiie sunt dependeni de structura chimic i

de solubilitatea substanelor n cele dou faze, substanele de analizat

dizolvndu-se preferenial n faza staionar i faza mobil. Componentul cu

solubilitate mai mare n faza mobil va avea o vitez de deplasare

superioar, comparative cu componentul cu solubilitate mai mare n faza

staionar care se va deplasa cu o vitez sczut.

Cromatografia de schimb ionic utilizeaz ca faz staionar

schimbtorii de ioni. Schimbtorii de ioni sunt substane de natur organic

sau anorganic care au proprietatea de a schimba un ion propriu cu un alt ion

din mediul lichid cu care se afl n contact.

Cromatografia de excludere molecular numit i gel filtrare,

utilizeaz ca faz staionar anumite substane cu structur tridimensional

(dextran, poliacrilamid) care prezint proprietatea ca n contact cu apa sau

cu soluii saline s se imbibe rapid, formnd geluri de diferite poroziti.

Aceast metod permite separarea componenilor unui amestec

lichid pe baza diferenelor de mrime molecular. Sub aciunea fazei mobile (

eluentul) moleculele cu dimensiuni mari vor fi excluse de structura gelului i

se vor deplasa o dat cu eluentul; moleculele cu dimensiuni mici vor penetra

gelul ptrunznd n lichidul din interiorul porilor avnd o vitez de deplasare

prin coloan invers proporional cu dimensiunea pe care o prezint.

Cromatografia de afinitate reperzint o tehnic de separare

aproteinelor, acizilor nucleic, hormonilor, celulelor, pe baza proprietilor

lor de legare specific, prin fore necovalente, de moleculele complementare

numite ligand. n cadrul acestei metode cromatografice faza staionar este

constituit de o matrice polimeric poroas (dextran, agaroz,

poliacrilamid) de care se leag covalent ligandul.

Ligandul are proprietatea de recunoate i lega reversibil i

selectiv, dintr-un amestec multicomponent, numai componentul care

prezint o structur complementar cu a sa.

Cromatografia de gaze este foarte utilizat deoarece poate fi

aplicat oricrui amestec de componente lichide cu temperature joase de

fierbere.

CROMATOGRAFIA N STRAT SUBIRE A FOSFOLIPIDELOR

Cromatografia n strat subire (CSS) este o tehnic

cromatografic de importan major, simpl i expeditiv, utilizat n

analiza calitativ.

Stratificarea adsorbantului const n depunerea unui strat de

adsorbant (silicagel, oxid de aluminiu etc.) de aproximativ 250 grosime pe

o plac inert de sticl, aluminiu sau pe filme rigide de plastic de dimensiuni

variabile.

Pentru prepararea stratului adsorbant se realizeaz o suspensie

apoas format din adsorbant care se depune uniform pe placa

cromatografic.

Dup evaporarea apei, pe plac rmne un strat subire de

suport. Deoarece centrii de adsorbie au capacitatea de a reine puternic

moleculele de ap este necesar ca dup uscare s se efectueze activarea

suportului prin nclzire la o anumit temperatur. Procesul de activare

(ndeprtarea apei) trebuie reglat i controlat deoarece temperature i timpul

de uscare nainte de utilizare determin numrul de poziii active, tipul

cromatografiei (de adsorbie sau de partiie) i n concluzie eficacitatea

separrii.

O temperatur de uscare prea nalt i un timp de uscare prea

ndelungat pot genera transformri chimice, care vor determina modificarea

proprietilor adsorbante.

Aplicarea probelor se efectueaz n spoturi discrete cu ajutorul

capilarelor sau a micropipetelor n volume cuprinse ntre 1 i 100L.

Pentru o separare cu un grad nalt de rezoluie este necesar ca

spoturile aplicate s fie ct mai mici i mai bine definite. Pentru aceasta,

proba este dizolvat ntr-un solvent volatile. Dac probele sunt foarte diluate

aplicarea probei este repetat, pn la depunerea cantitii dorite, aplicarea

fiind efectuat cu mult grij astfel nct s se obin un spot mic i bine

definit.

Developarea (irigarea) se efectueaz dup aplicarea i uscarea

spoturilor; placa cromatografic este introdus ntr-o camer de developare

(tank cromatografic), sub un unghi de aproximativ 45, care conine un strat

de 0,5-1,0 cm de solvent n care se imerseaz un capt al plcii, efectundu-

se o irigare de tip ascendant.

Pentru realizarea unei separri corespunztoare atmosfera din

camera de developare trebuie s fie saturat cu faza mobil. Pentru a asigura

condiiile de saturaie, interiorul camerelor se tapeteaz cu hrtie de filtru

umectat n solventul de developare. Pentru ca developarea s fie

reproductibil este necesar meninerea acelorai valori de temperatur,

concentraie i timp de nclzire i developare, grosimea adsorbantului,

ntruct orice modificare a gradului de saturaie va influena gradul de

adsorbie.

Vizualizarea (revelarea) fraciilor separate se poate efectua prin

pulverizarea cromatogramei cu un reactive de culoare sau prin iluminarea

cromatogramei cu o lamp cu lumin ultraviolet.

Evaluarea calitativ (identificarea spoturilor) se efectueaz prin

compararea vitezei de migrare a spoturilor corespunztoare fraciunilor

separate cu cele corespunztoare culorii spoturilor.

Cea mai frecvent metod de identificarea const n compararea

valorilor Rf ale spoturilor corespunztoare fraciunilor separate cu valorile Rf

ale standardelor. Valoarea Rf este o mrime care reflect deplasarea

compusului urmrit comparativ cu cea a solventului ( faza mobil).

Rf Distana de la punctul de start pn n centrul spotului

Distana parcurs de solvent din punctul de start

CROMATOGRAFIA PE HRTIE

Cromatografia pe hrtie utilizeaz ca support pentru separarea

componenilor unui amestec o hrtie de filtru special, fabricat din puf de

bumbac care conine 2000- 3600 de resturi de -glucoz, cu un numr mare

de legturi de hidrogen ntre catenele poliglucidice.

Mecanismul separrii componenilor se bazeaz pe coeficienii

de repartiie diferii ai acestora ntre dou faze nemiscibile sau parial

miscibile: faza staionar reprezentat de lichidul polar care mbib hrtia de

filtru i faza mobil reprezentat de solventul organic care se deplaseaz de-

a lungul porilor hrtiei de filtru.

Componenii cu solubilitate mai mare n faza staionar se vor

deplasa cu vitez sczut, n timp ce componenii cu solubilitate mai mare n

solventul organic vor prezenta o vitez de migrare mai mare.

n funcie de direcia de deplasare a solventului i

componenilor pe hrtia de filtru se disting urmtoarele tipuri de

cromatografie pe hrtie:

Cromatografia ascendent- deplasarea se face de jos n sus;

Cromatografia descendent- deplasarea se efectueaz de sus n

jos;

Cromatografia circular - deplasarea se efectueaz din centrul

hrtiei spre exterior (radial).

Tipuri de cromatografie pe hrtie

cromatografie cromatografie

cromatografie

ascendent descendent circular