7 enzim beta fruktofuranosidase

Nova Nurfauziawati 240210100003 Kelompok 11A

V. HASIL PENGAMATAN

Tabel 1. Hidrolisis Enzim Beta-Fruktofuranosidase

Tabung [S] A V = 퐴푡(푠)

1/S

(x)

1/V

(y)

11 150 0,409 0,001136 0,00667 880,281

12 120 0,688 0,001911 0,00833 523,286

13 90 0,930 0,00258 0,011 387,597

14 60 1,264 0,00351 0,0167 284,90

15 30 1,363 0,00379 0,033 263,852

Hasil regresi kalkulator :

A = 715,55

B = -16351,79

A = 1푉푚푎푥

715,55 = 1푉푚푎푥

Vmax = 1,398x10-3

B = 퐾푚푉푚푎푥

-16351,79 = 퐾푚1,398x10−3

Km = -22,852

0

200

400

600

800

1000

0,00667 0,00833 0,011 0,0167 0,033

1/V

1/S

Kurva standar untuk larutan glukosa dengan perlakuan reagen Benedict


VI. PEMBAHASAN

Invertase dikenal sebagai β-fructofuranoside fructohydrolase merupakan

sebuah katalis untuk hidrolisis sukrosa yang menghasilkan fruktosa dan glukosa

(gula invert). Sukrosa merupakan produksi akhir asimilasi karbon (C) pada proses

fotosintesis yang terjadi di daun (Kim et al. 2000) dan bentuk karbohidrat yang

mudah ditransportasikan ke jaringan simpan atau sink tissues (Cheng et al .1996).

Enzim invertase banyak ditemukan pada ragi roti yang mengandung khamir

Saccharomyces ceriviseae. Invertase diproduksi oleh bakteri, fungi, tumbuhan

tingkat tinggi, dan beberapa sel hewan (Lee Huang et al. 2000). Tetapi banyak

penelitian dilakukan pada produksi invertase yang dihasilkan oleh khamir

Saccharomyces cereviceae. Khamir ini banyak terkandung pada ragi roti,

dan secara komersil banyak dijual dipasaran. Khamir atau Yeast merupakan

mikroorganisme uniseluler berbentuk ellips, bulat atau silindris, yang ukurannya

5-10 kali lebih besar dari bakteri. Enzim invertase yang dihasilkan oleh

Saccharomycees ceriviceae mempunyai aktivitas paling tinggi pada pH 4,5 dan

temperatur 30ºC (Bergamasco et al. 2000).

Pada praktikum kali ini diawali dengan pemurnian enzim fruktofuranosidase

kemudian hidrolisis sukrosa dengan β-enzm dan uji benedict. Langkah-langkah

yang dilakukan dalam pemurnian enzim fruktofuranosidase ialah sebanyak 0,5

gram yeast dihaluskan kemudian ditambahkan 50 ml buffer pH 4,7 kemudian

dilakukan sentrifius dan diambil filtratnya. Untuk melakukan hidrolisis sukrosa,

maka sukrosa, ditambahkan akuadest dan buffer dengan jumlah tertentu.

Kemudian campuran tersebut dipanaskan pada suhu 370C selama 5 menit. Lalu

sebanyak 2 ml suspensi yeast 1% di tambahkan ke dalam campuran tersebut dan

campuran tersebut diinkubasi pada suhu 370C selama 6 menit. Suhu tersebut di

atur agar tidak terlalu panas, karena suhu yang terlalu panas maka

mikroorganisme penghasil enzim intervase akan mati, sehingga enzim tidak akan

diperoleh. Setelah selesai masa inkubasi, larutan tersebut ditambahkan 1 ml

NaOH 1%. Pemecahan sel dilakukan setelah proses inkubasi. Hal ini dikarenakan

enzim invertase termasuk enzim yang berada di dalam sel (intraseluler), maka

perlu dilakukan proses pemecahan dinding sel untuk mengeluarkan enzim di


dalam sel supaya dihasilkan enzim yang lebih banyak. Fungsi dari penambahan

NaOH ini adalah untuk membantu proses pemecahan sukrosa.

Satu unit aktivitas enzim merupakan banyaknya μmol gula pereduksi yang

dihasilkan oleh 1 ml enzim pada setiap menit (Bayramolu et al., 2003). Gula

invert merupakan campuran antara glukosa dan fruktosa yang diperoleh dari hasil

hidrolisisi sukrosa. Sukrosa bukan merupakan gula pereduksi sedangkan glukosa

dan fruktosa merupakan gula pereduksi, maka dari itu pada praktikum ini

dilakukan uji benedict. Uji benedict ini digunakan untuk membedakan gula

reduksi berdasarkan ion cupri dalam suasana alkalis dengan indicator yaitu adanya

perubahan warna khususnya menjadi merah bata, bila kadar gula reduksinya lebih

rendah maka akan tampak warna biru, hijau, merah atau merah kekuningan.

Pengujian ini berdasarkan dari reduksi Cu2+ menjadi Cu+ oleh karbohidrat yang

mempunyai gugus aldehid (-CHO) atau keton bebas (-CO-). Hal ini dilakukan

untuk mencegah terjadinya pengendapan CaCO3 dalam larutan Na-karbonat pada

larutan benedict. Pereaksi kupri sulfat, natrium sitrat, dan natrium karbonat.

Monosakarida segera mereduksi senyawa-senyawa pengoksidasi seperti

ferisianida, gen peroksida, atau ion kupri (Cu2+). Pada reaksi seperti ini, gula

direduksi pada gugus karbonil dan senyawa pengoksidasi menjadi tereduksi.

Adapun reaksi yang berlangsung sebagai berikut.

O O

║ ║

R—C—H + Cu2+ 2OH- → R—C—OH + Cu2O

Gula Pereduksi Endapan Merah Bata

Adapun struktur dari glukosa dan sukrosa adalah sebagai berikut:

Gambar1. Struktur glukosa dan fruktosa


Untuk melakukan uji benedict ini maka sebanyak 3 ml larutan yang

diperoleh dari hasil hidrolisis sukrosa tersebut ditambahkan 1 ml benedict

kemudian dipanaskan pada suhu 960C selama 2 menit untuk memperjelas warna

yang menunjukkan adanya gula invert. Setelah dipanaskan maka larutan tersebut

didinginkan dengan hasil berupa larutan berwarna hijau. Semakin tinggi

konsentrasi gula invert maka warna hijau semakin dominan. Agar absorbansinya

dapat diukur oleh spektrofotometer maka larutan tersebut diencerkan terlebih

dahulu dengan cara menambahkan aquadest lalu dikocok sehingga warna yang

dihasilkan tidak terlalu pekat dan menjadi hijau muda. Setelah itu, larutan hasil

pengenceran dipindahkan ke dalam kuvet untuk dilakukan pengukuran

absorbansinya dengan menggunakan λ 630 nm.

Adapun hasil pengamatan dari praktikum ini dapat dilihat pada tabel 1.

Tabel 1. Hidrolisis Enzim Beta-Fruktofuranosidase

Tabung [S] A V = 퐴푡(푠)

1/S

(x)

1/V

(y)

11 150 0,409 0,001136 0,00667 880,281

12 120 0,688 0,001911 0,00833 523,286

13 90 0,930 0,00258 0,011 387,597

14 60 1,264 0,00351 0,0167 284,90

15 30 1,363 0,00379 0,033 263,852

Sumber: Dokumentasi pribadi, 2011

Berdasarkan data di atas dapat dilihat bahwa nilai absorbansi atau A untuk

setiap tabung berbeda. Semakin rendah nilai S maka semakin tinggi nilai A dan

semakin tinggi pula nilai V. Setiap enzim mempunyai nilai tetapan Michaelis-

Menten tertentu, dimana nilai Km dapat digunakan untuk memperkirakan jumlah

substrat yang diperlukan agar reaksi enzimatis berjalan efisien. Dengan

mengetahui nilai Km dan Vm suatu enzim, maka dapat dilakukan optimalisasi

penggunaan enzim tersebut sebagai biokatalisator reaksi pemecahan substrat

menjadi produk. Laju reaksi meningkat saat suhu mencapai nilai optimum dan


berkurang saat suhunya maksimum. Sedangkan aktivitas enzim akan meningkat

dengan meningkatnya kadar substrat (Lehinger 1982).

Jika dibuat hubungan antara laju (V) dengan konsentrasi substrat (S) maka

penambahan konsentrasi substrat akan menaikkan kecepatan reaksi dikarenakan

aktivitas enzim invertase semakin besar. Akan tetapi pada batas konsentrasi

tertentu tidak akan terjadi kenaikan kecepatan reaksi walaupun konsentrasi

substrat diperbesar dikarenakan enzim sudah jenuh dengan substratnya. Atau

dengan kata lain tidak terdapat lagi sisi aktif enzim karena hampir semua enzim

telah membentuk kompleks enzim-substrat [ES]. Harga Vm dan Km dapat

ditentukan dengan menggunakan persamaan Lineweaver Burk (Lehninger, 1997),

sebagai berikut: 1푉0

= 1푉푚

+ 퐾푚푉푚 . 1[푆]

Penentuan kinetika enzim intervase (Vmax dan Km) didasarkan pada plot

grafik hubungan antara konsentrasi enzim dan substrat (Fayyaz et al. 1995; Dinu,

2001). Selanjutnya dibuat tabel V dan [S] dan dikonversikan menjadi 1/V dan

1/[S] seperti pada tabel 1 di atas. Lalu ditentukan nilai Vmaks dan Km yang

didasarkan atas persamaan kurva Lineweaver Burk, dengan cara:

Bahwa dari persamaan: 1푉= 1

푉푚푎푥 + 퐾푚푉푚푎푥

. 1[푆] di atas, Bila 1

푉 = Y dan 1[푆]= X, maka

rumusnyadapat ditulis menjadi: Y = a + bX, sehingga: a = 1푉푚푎푥

dan b = 퐾푚푉푚푎푥

Dengan demikian, bila harga 1푉푚푎푥

diketahuimaka nilai Vmaks didapat, begitu

pula nilai Km akan juga didapat dari persamaan b 퐾푚푉푚푎푥.

Berdasarkan persamaan tersebut dan dengan menggunakan data yang

diperoleh dari praktikum maka diperoleh kurva standar untuk larutan glukosa

dengan perlakuan benedict sebagai berikut:


Berdasarkan kurva hubungan 1V dengan 1

[S] untuk larutan glukosa dengan

perlakuan reagen benedict di atas, maka diperoleh intersep sebesar 715,55 dan

nilai slope sebesar -16351,79 sehingga diperoleh persamaan regresi Y= 715,55 -

16351,79x, dengan demikian diperoleh nilai Vmax sebesar 1,398 x 10-3

μmol/ml.menit dan nilai Km sebesar -22,852. Nilai R2 dari kurva di atas adalah

0,4794. Hal ini menunjukkan bahwa kelinearan kurva standar baik karena hampir

mendekati +1 dimana titik-titik pada kurva standar melewati garis lerengnya.

Aktivitas enzim invertase yang mula-mula meningkat secara signifikan

sejalan dengan meningkatnya konsentrasi substrat, tetapi tidak signifikan setelah

konsentrasi substrat ditingkatkan lagi. Hal ini terjadi karena suatu reaksi

enzimatisakan meningkat dengan bertambahnya konsentrasi substrat [S], akan

tetapi setelah [S] meningkat lebih lanjut akan sampai pada kecepatan yang tetap.

Pada kondisi dimana kecepatan reaksi enzimatis tidak dapat bertambah lagi

dengan bertambahnya [S] disebut kecepatan maksimum (Vmaks) (Wiesman,

1989).

Penentuan Vmaks akan menghasilkan gambaran tentang sifat-sifat kinetika

enzim lain, ½Vmaks, yaitu suatu konsentrasi substrat yang separuh lokasi aktifnya

telah terisi atau bila kecepatan reaksi enzimatis telah mencapai setengah dari

kecepatan maksimum, yang dikenal dengan Km (tetapan Michaelis-Menten).

Nilai Km digunakan selain sebagai ukuran afinitas E-S juga berhubungan dengan

tetapan keseimbangan disosiasi kompleks E-S menjasi E dan S. Fayyaz (1995)

menambahkan bila nilai Km kecil berarti kompleks E-S mantap dan afinitas

enzim terhadap substrat tinggi, sedangkan bila nilai Km besar afinitasnya menjadi

0

200

400

600

800

1000

0,00667 0,00833 0,011 0,0167 0,033

1/V

1/[S]

Kurva standar untuk larutan glukosa dengan perlakuan reagen Benedict


rendah. Harga Km enzim sangat bervariasi tergantung dari jenis substrat, keadaan

lingkungan dan kekuatan ion. Pada percobaan kali ini didapat Vmax mendekati

nol artinya reaksi berjalan sangat lambat. Serta didapatkan Km bernilai negatif

artinya konsentrasi substrat yang dibutuhkan untuk mencapai ½ Vmax sangat

sedikit sekali karena reaksi yang terjadi berjalan sangat lambat.


VII. KESIMPULAN

Invertase dikenal sebagai β-fructofuranoside fructohydrolase merupakan

sebuah katalis untuk hidrolisis sukrosa yang menghasilkan fruktosa dan

glukosa (gula invert).

Enzim invertase banyak ditemukan pada ragi roti yang mengandung

khamir Saccharomyces ceriviseae.

Untuk menentukan konstanta Michaelis-Menten (Km) maka dilakukan

pemurnian enzim fruktofuranosidase kemudian hidrolisis sukrosa dengan

β-enzm dan uji benedict.

Dari hasil praktikum diperoleh nilai Vmax sebesar 1,398 x 10-3

μmol/ml.menit dan nilai Km sebesar -22,852.

Vmax mendekati nol artinya reaksi berjalan sangat lambat.

Km bernilai negatif artinya konsentrasi substrat yang dibutuhkan untuk

mencapai ½ Vmax sangat sedikit sekali karena reaksi yang terjadi berjalan

sangat lambat.


DAFTAR PUSTAKA

Bayramolu, G., Akgol, S., bulut, A., Denizli, A. And Yakup, A.M. (2003), Covalent immobilization of invertase onto a reactive film composed of 2-hydroxyethyl methacrylate and glicidyl methacrylate, Biochemical Engineering Journal, 14: 117-126

Bergamasco R., Bassetti FJ, Moraes FF, ZaninGM. 2000. Characterization of free

andimmobilized invertase regarding activity andenergy of activation. Brazilian Journal of Chemical Engineering: 873-880

Cheng, WH, Im KH, Chourey PS. 1996. Sucrose phosphate synthase expression at

the cell andtissue leve1 is coordinated with sucrose sink-tosource transitions in maize leaf. Plant Physiol 111 : 1021-1029

Dinu D. 2001. Enzymatic hydrolysis of pectic acidand pectins by

polygalacturonase from Aspergillus niger. Roum Biotechnol 6 (5) :397-402

Fayyaz A, Asbi BA, Ghazali HM, Che-Man YB,Jinap S. 1995. Kinetics of papaya

pectinesterase. Jurnal of Food Chemistry 53 :129-135 Kim J.Y., Mahe A, Brangeon J, Prioul JL. 2000.Amaize vacuolar invertase ,

IVR2, is induced by water stress. Organ/tissue specificity anddiurnal modulation of expression. Plant Physiol 124:71-84

Lehninger AL. 1982. Dasar-Dasar Biokimia. Jilidke-1. Maggy Thenawidjaja;

penerjemah.Terjemahan dari: Principles Of Biochemistry.Erlangga: Jakarta Wiseman A. 1989. Handbook of Enzyme Biotechnology. 2nd. Edition. New

York: EllisHoward.

7 enzim beta fruktofuranosidase

Documents