RPR 100 72515 500 72516

KOMPLETI ZA KVALITATIVNO I POLUKVANTITATIVNO OTKRIVANJE NETREPONEMSKIH PROTUTIJELA POVEZANIH SA SIFILISOM, REAGINA, U LJUDSKOME SERUMU ILI PLAZMI POMOĆU MAKROSKOPSKE AGLUTINACIJE NA TESTNIM KARTICAMA ZA JEDNOKRATNU UPORABU

883684 - 2014/12

[HR] 2

SADRŽAJ

1. NAMJENA ................................................................................................ 3 2. SAŽETAK I OBJAŠNJENJE TESTA ........................................................... 3 3. NAČELA POSTUPKA ............................................................................... 3 4. REAGENSI ............................................................................................... 4 5. UPOZORENJA I MJERE OPREZA ............................................................. 4 6. UZORCI ................................................................................................... 5 7. POSTUPAK .............................................................................................. 6 8. OGRANIČENJE TESTA ............................................................................ 8 9. KARAKTERISTIKE IZVEDBI ...................................................................... 8 10. BIBLIOGRAFSKE REFERENCE. ............................................................. 1 0

[HR] 3

1. NAMJENA Kompleti RPR namijenjeni su za kvalitativno i polukvalitativno otkrivanje netreponemskih protutijela povezanih sa sifilisom (reagin) u ljudskom serumu ili plazmi te kao pomoć pri dijagnosticiranju infekcije sifilisom.

2. SAŽETAK I OBJAŠNJENJE TESTA Sifilis je kronična infekcija koja se razvija kroz različite faze: primarna, sekundarna, tercijarna i kvartarna. U ovim fazama nastaju različiti klinički simptomi. Obično se prvo javljaju tvrdi čankiri, zatim sifilisni osip nakon čega slijede duga razdoblja mirovanja. Ako se infekcija ne liječi, s vremenom može uzrokovati kardiovaskularne probleme i neurosifilis. Uzrok infekcije je spiroheta Treponema pallidum. Infekcija se obično prenosi spolnim kontaktom, ali može se i prenijeti i transfuzijom zaražene krvi. Također se javlja intrauterina infekcija. Pokazalo se gotovo nemogućim kultivirati organizam u umjetnim medijima, a dijagnosticiranje infekcije uglavnom ovisi o utvrđivanju prisutnosti protutijela u krvi, koja se pojavljuju nedugo nakon početne infekcije i mogu ostati prisutna godinama. Testovi na sifilis dijele se u četiri kategorije: izravan mikroskopski pregled, testovi na treponemska protutijela, testovi na netreponemska protutijela te izravni testovi na antigene. Brzi test na plazmatski reagin (Rapid Plasma Reagin) je “netreponemski” test, što znači da protutijela koja se otkrivaju nisu specifična za T. pallidum, iako je njihova prisutnost u serumu ili plazmi bolesnika čvrsto povezana s infekcijom tim organizmom. Ovom se vrstom testa mjere protutijela (IgG i IgM) koja se stvaraju u reakciji na lipoidni materijal kojega ispuštaju oštećene stanice domaćini, kao i na lipoproteinu sličan materijal koji ispuštaju spirohete. Nakon uspješnog liječenja infekcije ta protutijela obično nestaju.

3. NAČELA POSTUPKA Kompleti RPR koriste se karbonskim česticama obloženima smjesom lipidnih antigena na koja će se vezati protutijela prisutna u serumu ili plazmi bolesnika. Te su čestice suspendirane u mediju čiji sastojci eliminiraju nespecifične reakcije. Pozitivne se reakcije očituju kao makroskopska aglutinacija (nakupine) tih čestica. Iako je ovaj komplet ponajprije namijenjen kvalitativnom testiranju, razine protutijela mogu se titrirati dvostrukim razrjeđenjem. Obrasci aglutinacije tumače se vizualno.

[HR] 4

4. REAGENSI

4.1. Opis

Tekst na oznaci Opis Prezentacija

72515 72516 100 testova 500 testova

R1 RPR Antigen RPR Antigen Karbonske čestice obložene kardiolipinom, lecitinom i antigenom kolesterola u fosfatnom puferu

1 bočica 2 ml

1 bočica 10 ml

R2 Positive control

Pozitivna kontrola Ljudski serum koji sadržava protutijela povezanim s T. pallidum, negativan na HBs antigen, anti-HIV1/2 i anti-HCV protutijela, razrijeđen u fosfatnom puferu

1 bočica 1 ml

1 bočica 2 ml

R3 Negative control Negativna kontrola Zečji serum u fosfatnom puferu 1 bočica

1 ml 1 bočica

2 ml Bočica za ukapavanje (za ponovnu

upotrebu) 1 1

Igla za ukapavanje (za ponovnu upotrebu) 1 1

Testne kartice (deset ciklusa) 10 50

4.2. Skladištenje i rukovanje Ovaj komplet treba čuvati na +2 – 8 °C. Bočice treba skladištiti u uspravnom položaju. Ne zamrzavati. Svaki pojedini dio kompleta koji se čuva na temperaturi od +2 – 8 °C može se upotrebljavati sve do isteka roka trajanja naznačenog na pakiranju. Nakon otvaranja i uz odsutnost kontaminacije, reagensi R1, R2 i R3, koji su se čuvali na temperaturi od +2 – 8 °C mogu se upotrebljavati do isteka roka trajanja naznačenog na etiketi.

5. UPOZORENJA I MJERE OPREZA Za in vitro dijagnostiku. Za uporabu od strane zdravstvenih profesionalaca.

5.1. Mjere opreza glede zdravlja i sigurnosti: § Ovim testnim kompletom treba rukovati samo kvalificirano osoblje koje je

upoznato s laboratorijskim postupcima i s njima povezanim potencijalnim rizicima. Nosite odgovarajuću zaštitnu odjeću, rukavice, zaštitu za oči/lice te rukujte na odgovarajući način s potrebnom primjenom dobre laboratorijske prakse.

§ Dostavljeni kontrolni materijali dobiveni su od ljudskoga seruma. Testirani

su na razini davatelja i pokazali su se negativnima na HBs antigen, anti-HIV1/2 i anti-HCV protutijela. Niti jedna poznata metoda testiranja ne može ponuditi potpunu sigurnost kad je riječ o nepostojanju agensa infekcije. Zato se svi derivati ljudske krvi, reagensi i ljudski uzorci trebaju

[HR] 5

tretirati kao da mogu prenijeti zarazne bolesti, uz pridržavanje preporučenih univerzalnih mjera opreza za patogene koji se prenose putem krvi definiranih od strane lokalnih, regionalnih i nacionalnih propisa.

§ Proliveni biološki materijali: Proliveni materijal iz ljudskog izvora treba se

tretirati kao potencijalno zarazan.

Prolivene sadržaje koji ne sadrže kiseline treba odmah dekontaminirati, uključujući i mjesto na kojem su proliveni, kontaminiranu površinu i opremu, odgovarajućim kemijskim dezinficijensom koji je učinkovit protiv potencijalno biološki opasnih tvari ovisno o vrsti prolivenih uzoraka (obično 1:10 razrijeđeni kućni izbjeljivač, 70-80% etanol ili izopropanol, jodofor [kao npr. 0,5% Wescodyne™ Plus itd.) te dobro osušiti brisanjem.

Prolivene sadržaje koji sadrže kiseline treba adekvatno apsorbirati (obrisati) ili neutralizirati, područje treba isprati vodom i osušiti brisanjem; materijale korištene za apsorbiranje prolivenog sadržaja možda treba zbrinuti kao biološki opasan otpad. Tada područje treba dekontaminirati nekim od kemijskih dezinficijensa. NAPOMENA: Ne stavljajte u autoklav otopinu koja sadržava izbjeljivač!

§ Sve uzorke i materijale korištene prilikom izvođenja testa zbrinite na odgovarajući način jer mogu sadržavati infektivni agens. Laboratorijskim, kemijskim ili biološki opasnim otpadom mora se rukovati i zbrinuti ga u skladu s lokalnim, regionalnim i nacionalnim zakonima.

§ Sigurnosno-tehnički list dostupan je na www.bio-rad.com.

5.2. Mjere opreza povezane s postupkom 5.2.1. Priprema

Pouzdanost rezultata ovisi o ispravnoj primjeni sljedeće dobre laboratorijske prakse: • Ne miješajte i ne povezujte reagense iz različitih lotova u okviru testiranja. • Ne koristite reagense kojima je istekao rok trajanja. • Prije uporabe pričekajte 30 minuta da se reagensi stabiliziraju na sobnoj temperaturi (18 – 30 °C).

5.2.2. Obrada • Ne mijenjajte postupak testa. • Koristite novi nastavak za raspodjelu svakog uzorka. • Ne dirajte površinu za reakciju na karticama za utvr�ivanje aglutinacije.

6. UZORCI Uzorci seruma i plazme (EDTA, natrijev citrat, natrijev heparin i ACD) ne smiju sadržavati krvne stanice. Na temperaturi od +2 – 8 °C mogu se čuvati najviše 7 dana do testiranja. Uzorci koji se moraju čuvati dulje moraju se zamrznuti na -20 °C ili još

[HR] 6

nižoj temperaturi. Zamrznute je uzorke prije testiranja potrebno odmrznuti i dobro promiješati. Nemojte ponoviti više od 5 ciklusa zamrzavanja/odmrzavanja. Uzorci zagrijani tri sata na 56 °C ne utječu na rezultate. Uzorci koji sadržavaju do 120 g/l albumina, 200 mg/l bilirubina, 33 g/l trioleina i uzorci koji sadržavaju do 2 g/l hemoglobina ne utječu na rezultate. Međutim, ne preporučuje se koristiti hiperlipidemične i hiperhemolizirane uzorke. Ako se uzorke treba otpremiti, treba ih zapakirati u skladu s važećim propisima vezanim uz prijevoz etioloških agensa te se preporučuje prevoziti ih zamrznute.

7. POSTUPAK

7.1. Potrebni materijali 7.1.1. Dostavljeni materijali

Ispravno kalibrirana jednokratna bočica s kapaljkom i iglom za ispuštanje karbonskih čestica.

7.1.2. Potrebni materijal koji nije dostavljen Rotator za rotiranje testnih kartica pri brzini od 100 o/min, u kružnici približnog promjera 1 cm. Ispravno kalibrirana i održavana pipeta i nastavci kojima se izdaje volumen od 50 µl. 0,9% fiziološka otopina (za polukvalitativan postupak)

7.2. Postupak analize Sa svakom serijom testa, moraju se provesti i pozitivne (R2) i negativne (R3) kontrole ovoga kompleta.

7.2.1. Kvalitativni test 1. Stavite 50 µl uzorka ili kontrole u krug na testnoj kartici. 2. Uzorak i kontrole ravnomjerno rasporedite unutar kružne testne površine. 3. Za izbjegavanje sedimentacije netom prije upotrebe protresite bočicu s RPR

antigenom kako biste dobro promiješali. 4. Pričvrstite iglu kapaljku na odgovarajuću plastičnu bočicu pa usisajte RPR

antigen. 5. Okrenite kapaljku pa je nježno stisnite kako biste iz igle istjerali zrak. 6. Držeći bočicu s kapaljkom okomito iznad testnog uzorka kapnite jednu kap RPR

antigena. 7. Testnu karticu stavite na rotator kartica pa je rotirajte 8 minuta pri 100 o/min. 8. Odmah očitajte i protumačite rezultate pri dobrom osvjetljenju. (Pogledajte 7.4) Napomena:

Ako nije moguće odmah protumačiti rezultate, karticu je potrebno zadržati na rotatoru za rotiranje testnih kartica do 15 minuta.

9. Neiskorišteni antigen iz bočice s kapaljkom vratite u staklenu posudicu. 10. Bočicu s kapaljkom i iglu isperite destiliranom vodom pa ih pustite da se posuše

prije ponovne uporabe.

[HR] 7

7.2.2. Polukvalitativan test 1. U 0,9-postotnoj fiziološkoj otopini napravite dvostruka razrjeđenja od nerazrijeđenog do 1 : 16. 2. Stavite 50 µl svakog razrjeđenja i kontrole u zaseban krug na testnoj kartici. 3. Svako razrjeđenje ravnomjerno rasporedite unutar testnog kruga. 4. Nastavite kao u odjeljku Kvalitativni test 3. Titar uzorka izražen je kao recipročna vrijednost najvećeg razrjeđenja koje pokazuje aglutinaciju karbonskih čestica. Ako je reaktivno i najveće testirano razrjeđenje (1 : 16), nastavite dalje s nizom razrjeđenja pripremanjem pomoću 0,9-postotne fiziološke otopine dvostruko većih razrjeđenja uzorka od 1 : 32 do 1 : 512. Dobro promiješajte i nastavite kao od koraka 2 u polukvantitativnom testu.

7.3. Kontrola kvalitete Koristite pozitivnu kontrolu (R2) i negativnu kontrolu (R3) za svako testiranje radi potvrde analize.

7.4. Tumačenje rezultata i kriteriji za validaciju testa

Jako reaktivno (SR): veliki agregati karbonskih čestica, čista pozadina.

Reaktivno (R): veliki agregati karbonskih čestica, donekle disperziraniji nego kod jako reaktivnog.

Slabo reaktivno (WR): mali agregati karbonskih čestica, pozadina svjetlosiva.

Reaktivno u tragovima (TR): slabo nakupljanje karbonskih čestica koje se obično vidi kao gumb nakupina u središtu testnog kruga ili disperzirane nakupine uokolo rubova testnog kruga.

[HR] 8

Nereaktivno (NR): Obično gladak sivi obrazac ili gumb neagregiranih karbonskih čestica u sredini testnog kruga ili velik krug karbonskih čestica bez nakupljanja u unutrašnjosti. Reaktivni uzorci moraju se zabilježiti kao pozitivni na protutijela i moraju se (u svjetlu nespecifične prirode otkrivenih protutijela) podvrgnuti daljnjim testovima radi određivanja prisutnosti ili odsutnosti specifičnih antitreponemskih protutijela. Kako bi test bio valjan, pozitivna kontrola mora dati snažan pozitivan obrazac, a priložena negativna kontrola mora dati jasno negativan rezultat.

8. OGRANIČENJE TESTA Ne postoji jedinstven test ili konačan referentni standard za svaku fazu bolesti. Dijagnosticiranje sifilisa stoga pretežno ovisi o serološkom testiranju te su potrebni rezultati dobiveni kako netreponemskom tako i treponemskom metodom. Lažno pozitivni rezultati mogu se opaziti kada se očitavanje ne provede odmah nakon rotiranja. RPR karbonski test nije specifičan za sifilis. Svi reaktivni uzorci trebali bi se ponovno testirati treponemskim metodama poput TPHA-a za potvrdu rezultata.

9. KARAKTERISTIKE IZVEDBI

9.1. Proučavanje preciznosti Panel uzoraka sastojao se od jednog negativnog uzorka, jednog slabo pozitivnog uzorka (titar 1 : 4) i jednog pozitivnog uzorka (titar 1 : 16); testiran je na ponovljivost u osam ponavljanja tijekom iste serije. Za srednju preciznost i unutarserijske studije ponovljivosti uzorci su testirani u dva ponavljanja po danu tijekom pet dana (očitavala su dva operatora) te u dvije različite proizvodne serije.

9.1.1. Ponovljivost Sva ponavljanja negativnog uzorka dala su negativne rezultate i sva ponavljanja pozitivnih uzoraka dala su pozitivne rezultate.

9.1.2. Srednja preciznost / unutarserijska ponovljivost Sva ponavljanja negativnog uzorka dala su negativne rezultate i sva ponavljanja pozitivnih uzoraka dala su pozitivne rezultate, bez obzira na uvjete.

[HR] 9

9.2. Klinička izvedba 9.2.1. Specifičnost

Studija specifičnosti bila je retrospektivna studija provedena na 102 zamrznuta uzorka seruma iz rutine u laboratoriju Centra za spolno prenosive bolesti u Francuskoj. Rezultati RPR testa na sifilis uspoređeni su s RPR/VDRL testom s oznakom CE.

Ukupan broj uzoraka

Inicijalna reaktivnost (IR)

Ponavljajuća reaktivnost (RR)

Specifičnost RR-a (%) 95% CI (%)

102 2 (dvosmisleni) 0 100%

102/102 96,4% – 100,0%

Od 102 uzorka dva su bila dvosmislena. Nakon ponovnog testiranja uzorci su bili negativni. Dijagnostička specifičnost na retrospektivnim uzorcima bila je jednaka 102/102 = 100 % s intervalom pouzdanosti na 95 % od [96,4% – 100,0%].

9.2.2. Osjetljivost Studija osjetljivosti bila je retrospektivna studija provedena na 101 zamrznutom uzorku seruma iz rutine u laboratoriju Centra za spolno prenosive bolesti u Francuskoj. Rezultati RPR testa na sifilis uspoređeni su s RPR/VDRL testom s oznakom CE.

Ukupan broj uzoraka

Inicijalna reaktivnost (IR)

Ponavljajuća reaktivnost (RR)

Specifičnost RR-a (%) 95 % CI (%)

101 100 (1 dvosmislen) 101 100%

101/101 96,4% – 100,0%

Od 101 uzorka jedan je bio dvosmislen. Nakon ponovnog testiranja svi uzorci su bili pozitivni. Dijagnostička osjetljivost iznosi 100% (101/101) s intervalom pouzdanosti od 95% od [96,4% – 100,0%].

9.3. Analitička specifičnost – studija križne reaktivnosti Analitička specifičnost RPR testa na sifilis evaluirana je na temelju ukupno 65 križno reaktivnih uzoraka odabranih iz drugih zaraznih bolesti i/ili ostalih stanja koja mogu dati lažno pozitivan rezultat zbog nespecifičnosti (reumatoidni čimbenik, lajmska bolest, EBV, rubeola, leptospiroza, SLE (lupus), hepatits B, hepatitis C, HIV 1/2, žene koje su rodile više puta, trudnice). Primijećena specifičnost kod ove ciljane populacije iznosi 100,0% (65/65) s intervalom pouzdanosti od 95% od [94,5% – 100,0%].

9.4. Prozonski učinak Testirana su tri (3) vrlo visoko sifilis Ab pozitivna uzorka (> 1 : 128) koji su bili nerazrijeđeni i razrijeđeni kako bi se potvrdila odsutnost prozonskog učinka. Svi nerazrijeđeni pozitivni uzorci bili su pozitivni. U titrovima do 1 : 256 nije bio vidljiv prozonski učinak.

[HR] 10

10. BIBLIOGRAFSKE REFERENCE. 1. Larsen SA.,Pettit , et coll., EDTA –treated plasma in the Rapid Plasma Reagin

card test and the toluidine red unheated serum test for serodiagnosis of syphilis. J Clin Microbiology 1983;17;431-5

2. Larsen S.A., Pope V., et coll., A manual of Tests for Syphilis. 9th Edition ;1998; 193 – 207

3. Portnoy J. Modifications of the rapid plasma reagin (RPR) card test for syphilis, for use in large-scale testing.Am J Clin Pathol;1963;40;473-9

4. Singh AE and Romanowski. Syphilis: Review with emphasis on clinical, epidemiological, and some biologic features. Clin Microbiol Rev. 1999 Apr; 12(2):187–209.

5. Stability of selected serum proteins after long-term storage in the Janus Serum Bank. Clin Chem Lab Med. 2009. 47:596-606.

[HR] 11

[HR] 12

Bio-Rad 3, Boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel.: +33 (0) 1 47 95 60 00 Faks: +33 (0) 1 47 41 91 33 2014/12

www.bio-rad.com 883684