天津医药2013年9月第41卷第9期

苏拉明联合人参皂苷Rg3抑制肺腺癌小鼠移植瘤生长的作用*

贺兼斌 1 张贻秋 1 向 志 1 唐建新 1 许霞辉 2 张 平 2

【摘要】 目的 观察苏拉明联合人参皂苷Rg3（PG-Rg3）对肺腺癌小鼠异体移植瘤生长的抑制作用，初步探讨

其相关机制。方法 构建肺腺癌小鼠移植瘤模型，将40只接种Lewis肺癌细胞的C57BL/6J小鼠随机分成5组：对照

组、顺铂（DDP）组、苏拉明组、PG-Rg3组、苏拉明+ PG-Rg3组（联合组）。给予相应药物干预，于接种后24 d处死，剥

离皮下肿瘤，免疫组化和图像分析系统检测皮下移植瘤中肝细胞瘤扩增序列（Eph）受体家族EphB4蛋白、B细胞淋巴

瘤/白血病-2（Bcl-2）蛋白表达及微血管密度（MVD），并检测肿瘤细胞凋亡情况。结果 各用药组皮下肿瘤体积、质

量低于对照组（P < 0.05），顺铂组、苏拉明组、PG-Rg3组、联合组的抑瘤率分别为 39.20%、49.11%、54.86%、62.49%。

与对照组及DDP组比较，苏拉明组、PG-Rg3组和联合组EphB4、Bcl-2灰度值及MVD明显降低，而凋亡指数明显升高

（均 P < 0.05）。与联合组比较，苏拉明组、PG-Rg3组 EphB4、Bcl-2灰度值及MVD增加，而凋亡指数减少（均 P<0.05）。结论 苏拉明和PG-Rg3对肺腺癌移植瘤的生长具有协同抑制作用，其机制与其抑制肿瘤内EphB4表达，抑

制微血管形成，促进肿瘤细胞凋亡有关。

【关键词】 肺肿瘤；腺癌；原癌基因蛋白质 c-bcl-2；受体, EphB4；细胞凋亡；免疫组织化学；小鼠, 近交C57BL；苏拉明；人参皂苷Rg3

Inhibitory Effects of Suramin in Combination with PG-Rg3 on the Growth of LungAdencarcinoma in Mice

HE Jianbin, ZHANG Yiqiu, XIANG Zhi, TANG Jianxin, XU Xiahui, ZHANG Ping1 Department of Respiration, First People’s Hospital of Huaihua, Huaihua 418000, China; 2 The First Affiliated

Hospital of Nanhua University

[Abstract] Objective To observe the effect of suramin combinated with PG-Rg3 on xenograft growth of lung adeno⁃carcinoma in mice, and the related mechanism thereof. Methods Forty C57BL/6J mice bearing Lewis cells were random⁃ized into five groups: control group, cisplatin (DDP) group, suramin group, PG-Rg3 group and combination group. Appropri⁃ate interventions were given in five groups of mice. Mice were sacrificed at day 24 after tumor inoculation. The subcutaneoustumors were stripped for histological examination. The tumor inhibitory rate was measured. The expressions of erythropoietin-producing hepatoma amplified sequences (Eph) B4 protein, Bcl-2 and tumors microvessel density (MVD) were determinedby immunohistochemistry method with image analyze system. The apoptosis of tumor cells was measured by biotinyateddUTP nick and labeling (TUNEL) method. Results There were significantly lower values in subcutaneous tumor volumeand weight in drug-treated groups than those in control group (P < 0.05). The inhibitory rates were 39.20%, 49.11%, 54.86%and 62.49% in cisplatin group, suramin group, PG-Rg3 group and combined group (P < 0.05). The values of EphB4, MVDand Bcl-2 grey values were significantly decreased, the apoptotic index was significantly increased, in suramin group, PG-Rg3 group and combined group than those of control group and DDP group (P < 0.05). The values of EphB4, MVD and Bcl-2grey values were significantly increased, the apoptotic index was significantly decreased, in suramin group and PG-Rg3group than those of combined group (P < 0.05). Conclusion Suramin combinated with PG-Rg3 can produce a synergeticinhibitory activity against tumor growth of lung adenocarcinoma, which may be associated with the effect of suppressing theexpression of EphB4 and angiogenesis, and the promotion of tumor cell apoptosis.

[Key words] lung neoplasms; adenocarcinoma; proto-oncogene proteins c-bcl-2; receptor, EphB4; apoptosis; immu⁃nohistochemistry; mice, inbred C57BL; suramin; PG-Rg3

doi:10.3969/j.issn.0253-9896.2013.09.012

在20世纪50年代，肺癌的组织学亚型主要是鳞

癌，腺癌约仅占 5%，但近 50年来，肺腺癌的发病率

迅速上升，2000—2003 年，腺癌已占全部肺癌的

*湖南省卫生厅科研基金资助项目（项目编号：B2010-133）作者单位：1湖南省怀化市第一人民医院（邮编 418000）；2南

华大学附属第一医院

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Tianjin Med J, Sep 2013, Vol 41 No 9

47%[1-2]。肺腺癌血管丰富，生长快，是预后最差的恶

性肿瘤之一。肿瘤的生长具有血管依赖性，近年来

以抗血管生成为靶点的抗肿瘤治疗成为研究热点，

苏拉明是一种合成的六萘酸脲阴离子化合物,有研

究表明其对肺腺癌生长有明显的抑制作用，但具体

机制尚不十分清楚 [3]，人参皂苷Rg3（PG-Rg3）系由

西洋参中提取的单体皂苷，近年来其抗肿瘤作用也

逐渐受到关注[4-5]，两者联合应用于抗肺腺癌的生长

鲜见报道。本研究构建肺腺癌小鼠移植瘤模型，以

顺铂（DDP）为阳性对照，观察苏拉明联合PG-Rg3对肺腺癌移植瘤生长的影响，通过检测移植瘤内产生

促红素的肝细胞瘤扩增序列（erythropoietin-produc⁃ing hepatoma amplified sequences,Eph）受体家族中

EphB4蛋白、B细胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lympho⁃ma/leukemia-2,Bcl-2）蛋白的表达、肿瘤细胞凋亡及

移植瘤内的微血管密度（MVD），以探讨其抗瘤

机制。

1 材料与方法1.1 材料

1.1.1 细胞株及实验动物 C57BL/6J小鼠40只，雌雄各半，

SPF级，平均体质量（20±2）g，购自中国医学科学院肿瘤医院

实验动物中心，许可证号：SCXK11-00-0005，由南华大学肿

瘤研究所提供SPF级饲养环境。Lewis肺癌（鼠源）荷瘤种鼠

2只，购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心。

1.1.2 药品及试剂 顺铂购于江苏豪森药业股份有限公司

（生产批号:040605），苏拉明购于美国Sigma公司，PG-Rg3纯品购自吉林亚泰制药有限公司（生产批号：200053），兔抗鼠

EphB4单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，兔抗鼠Bcl-2抗体购于美国Dako公司，TUNEL凋亡检测试剂盒购于武汉博

士德公司，CD34免抗鼠一抗、广谱型SP试剂盒、DAB显色剂

均购自福州迈新生物工程公司。

1.1.3 主要仪器 倒置显微镜（日本OLYMPUS CK-2型）；

ABI 9600低温高速离心机（德国Heraeus公司）；光学显微镜及

照像系统、Luzex-F图像分析系统（日本OLYMPUS株式会社）。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的建立 处死 2只 Lewis肺癌荷瘤种鼠，无

菌条件下剥离皮下瘤体，剪去瘤体表面的血管、结缔组织以及

内部坏死组织，生理盐水冲洗，剪碎后放入匀浆器，研磨瘤组

织成为细胞悬液，滴加生理盐水调节细胞密度至1×107/mL，各小鼠右腋下接种0.2 mL细胞悬液（含细胞数2×106个）形成小

鼠动物肿瘤模型。

1.2.2 分组及用药 40只小鼠皮下移植处均成瘤，接种后第

4天开始药物干预。将40只小鼠随机分为5组：荷瘤对照组、

顺铂组、苏拉明组、PG-Rg3组和联合组，每组 8只，雌雄各

半。对照组，生理盐水0.2 mL/只腹腔注射（ip），每天1次；顺

铂组,顺铂 4 mg/（kg·d）溶于生理盐水 0.2 mL中 ip，于接种后

第4、11、18天各1次，其他时间予生理盐水0.2 mL/只,每天腹

腔注射1次；苏拉明组、PG-Rg3组分别将苏拉明、PG-Rg3 10mg/（kg·d）溶于生理盐水0.2 mL中 ip，每天1次；联合组，苏拉

明及 PG-Rg3按以上方法用药。肿瘤接种 24 d处死全部小

鼠，剥离皮下肿瘤称质量，然后置入 4%中性甲醛固定，石蜡

包埋，4 μm切片行HE染色及免疫组化染色。

1.2.3 肿瘤生长的观察 用药期间,每隔2 d用游标卡尺测量小

鼠皮下肿瘤的最大长径（a）和横径（b），计算肿瘤体积a×b2/2。计

算各组药物的抑瘤率，抑瘤率=（对照组瘤质量-实验组瘤质

量）/对照组瘤质量×100%。

1.2.4 免疫组化 采用 SP法检测，方法步骤严格按试剂盒

说明书进行，一抗均1∶100稀释为工作液，用PBS缓冲液代替

一抗作为阴性对照。EphB4、Bcl-2的判定标准：高倍镜下计

数100个细胞，肿瘤细胞浆及胞膜中呈棕黄色阳性细胞所占

比例<10%为阴性，≥10%为阳性，采用全自动图像分析系统

测定肿瘤组织中EphB4、Bcl-2的平均灰度值。

1.2.5 肿瘤细胞凋亡 用 TUNEL原位凋亡法检测，方法步

骤按试剂盒说明书进行，已知的阳性片为对照。结果判断：

以细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性细胞,选择阳性细胞密集

区域，排除坏死区，每张切片计数10个高倍视野中阳性细胞

数及细胞总数，计算凋亡指数（AI）=（阳性细胞数/计数细胞

总数）×100%。

1.2.6 肿瘤MVD检测 采用原始造血细胞抗原（CD34抗原）

免疫组化染色。MVD判定标准：凡与临近的肿瘤细胞、微血

管或结缔组织分开的，呈棕黄色CD34染色的单个内皮细胞

或内皮细胞串计为1个血管，但肌层较厚，或管腔直径大于8个红细胞直径的血管不计数。MVD计数参考文献[6]方法，

先在低倍镜下扫视整个组织切片，在肿瘤浸润区选择内皮细

胞染色清晰、背景良好、微血管最密集的 4个视野,然后在高

倍镜视野范围内计数所有染色的微血管，取4个视野的计数

结果均数为该切片的微血管数。

1.3 统计学方法 用 SPSS 17.0软件进行统计学处理，计量

资料以 x̄ ± s表示，多组均数比较行单因素方差分析，多重比

较采用LSD-t检验，率的比较采用χ2检验，P < 0.05为差异有

统计学意义。

2 结果

2.1 肿瘤生长情况 肿瘤接种后的第 1~4天，接种

处成瘤率为 100%，移植瘤生长基本相同，各组皮下

移植瘤的体积逐渐增大，呈局部结节状生长。18~24 d，对照组移植瘤生长明显快于其他组，联合组肿

瘤生长最慢，处死后解剖观察见肿瘤质硬，表面有血

管生长分布，以对照组明显，各用药组对移植瘤生长

均有抑制作用，以联合用药更为明显,各组肿瘤的生

长情况，见图1、表1。2.2 小鼠皮下肿瘤中EphB4、Bcl-2表达 EphB4主要表达于肿瘤细胞的胞浆及胞膜中，血管内皮细胞

也见表达，呈棕黄色颗粒。对照组的表达为强阳性，

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苏拉明组、PG-Rg3组、联合组与对照组比较EphB4表达减少（P < 0.05），但顺铂组与对照组相比差异无

统计学意义，见图2，表2。Bcl-2表达于肿瘤细胞胞

浆及细胞膜，对照组Bcl-2的表达为强阳性，苏拉明

组、PG-Rg3组、联合组同对照组相比Bcl-2表达减

少（P < 0.05），联合组低于 PG-Rg3组和苏拉明组

（P < 0.05），见图3，表2。

2.3 各组肿瘤内细胞凋亡情况 TUNEL染色凋亡

细胞核呈棕黄色染色，未凋亡的细胞核呈蓝绿色，各

用药组较对照组AI明显增加（P < 0.05），联合用药

亦明显促进肿瘤细胞的凋亡，见图4、表2。2.4 各组肿瘤内MVD检测 所有肿瘤组织内MVD均阳性，内皮细胞被染成棕黄色。苏拉明组、PG-Rg3组及联合组与对照组相比较，MVD明显减少

（P < 0.05），联合组与 PG-Rg3 组、苏拉明组相比

MVD均明显减少（P < 0.05），而顺铂组与对照组比

较差异无统计学意义，见图5，表2。3 讨论

目前，肺癌患者的预后仍然很差，Ⅱ~Ⅳ期患者

的5年生存率仅15％左右[1]。肺腺癌瘤内血管丰富，

生长快，手术机会少，预后极差，寻找与其生长相关

的指标对肺腺癌的靶向治疗有重要意义，开发抑制

其生长的药物已成为一项重要课题。近年来苏拉明

和 PG-Rg3的抗肿瘤作用逐渐受到瞩目 [3-5]，但两者

联合应用于抗肺腺癌生长鲜见报道。

肿瘤内新生血管能提供肿瘤生长所需营养，对

恶性肿瘤的发生、发展和转移起重要作用[6-7]；血管生

成的核心是血管内皮细胞增殖，依赖于血管生长因

子，其过程涉及到各种复杂的分子信号，而内皮细胞

酪氨酸激酶受体（RTKs）是血管生成不可或缺的调

控因素，EphB4是其家族中的重要成员，正常情况

下，EphB4的主要作用是调节胚胎的形成和血管的

发生，在人类微血管内皮细胞中表达，是强有力的促

血管生成剂。近年研究表明，许多肿瘤发生、发展中

都伴随着EphB4的过表达 [8-9]。MVD是反映肿瘤血

管生成活性或强度的重要定量指标，本研究所选取

的血管内皮细胞标志物为CD34抗原，其特异性最

高，重复性最好 [10]。在本研究中，苏拉明组和 PG-Rg3组肿瘤质量明显下降，联合组肿瘤生长进一步

受到抑制，与对照组比较差异有统计学意义，顺铂

组、苏拉明组、PG-Rg3组、联合组的抑瘤率分别为

39.20%、49.11%、54.86%、62.49%，随着肿瘤生长受

到抑制，EphB4表达逐渐下调，苏拉明组和PG-Rg3组的EphB4表达低于对照组，联合组EphB4表达的

下调更为明显，表明苏拉明和 PG-Rg3皆能抑制肺

腺癌肿瘤内的血管生成，两者联合应用有协同作用，

抑制肿瘤生长。

Bcl-2是近年发现的细胞凋亡调控基因，通过抑

制细胞凋亡,延长细胞生存而参与肿瘤生长,在肿瘤

细胞增生和积累方面均有促进作用,其过表达可导

致DNA受损的细胞持续生存、突变产物聚集，使肿

瘤生长加速、对治疗反应性差、生存期短,是肿瘤预

后不良的因素之一,其作为凋亡抑制因子在细胞凋

亡调控机制中起重要作用[11-12]。在本研究的各组肿

瘤组织中，对照组Bcl-2表达最高，其AI最低，而苏

拉明组和PG-Rg3组Bcl-2表达下调，凋亡细胞明显

增加，AI升高，联合组Bcl-2表达最低，AI较其他各

组明显升高，说明苏拉明和 PG-Rg3亦可通过促进

细胞凋亡而抑制肿瘤生长，其机制可能与其下调肿

瘤组织内 Bcl-2 的表达有关。本研究结果提示

EphB4 和 Bcl-2 的高表达促进肿瘤生长，可能是

EphB4能够上调抗凋亡因子的表达而抑制肿瘤细胞

凋亡，促进细胞的增殖和恶性转化，有研究表明PG-Rg3能抑制人前列腺癌细胞 EphB4及抗凋亡蛋白

Bcl-2-xl的表达，与以上结果一致[13]。

综上所述，苏拉明和 PG-Rg3对肺腺癌的生长

有明显抑制作用，联合应用有协同作用，它们抑制肺

组别

对照组

顺铂组

苏拉明组

PG-Rg3组联合组

F

皮下肿瘤体积（cm3）

5.471±1.5203.932±1.352ab

2.893±0.513ab

2.733±0.597ab

1.985±0.526a

12.625＊

皮下肿瘤质量（g）5.009±1.0413.046±1.027ab

2.549±0.433ab

2.261±0.327ab

1.879±0.358a

11.917＊

肿瘤抑制率（%）

-39.2049.1154.8662.49

Table 1 Comparison of tumor growthbetween five groups

表1 各组小鼠肿瘤生长情况的比较 （n=8）

＊P＜0.05；a与对照组比较，b与联合组比较，P＜0.05

组别

对照组

顺铂组

苏拉明组

PG-Rg3组联合组

F

EphB4灰度值

148.20±6.35133.72±5.51b

90.18±5.16 ab

86.78±4.90 ab

64.70±4.29a

54.207＊＊

Bcl-2灰度值

128.52±6.11103.83±5.43 b

84.16±4.64 ab

81.85±4.97 ab

70.31±4.43a

46.751＊＊

AI（%）

12.18±3.7924.85±4.77 b

41.23±3.19 ab

46.08±3.78 ab

61.28±4.17 a

30.406＊＊

MVD24.57±4.5923.52±4.74 b

16.29±2.51 ab

14.17±2.43 ab

9.32±1.60 a

21.296＊＊

Table 2 Comparison of expressions of EphB4,Bcl-2,apoptosis and MVD in tumor between five groups

表2 各组皮下肿瘤内EphB4、Bcl-2表达、凋亡情况及

肿瘤内MVD的比较 （n=8，x±s）

＊＊P＜0.01；a与对照组比较，b与联合组比较，P＜0.05

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Tianjin Med J, Sep 2013, Vol 41 No 9

腺癌生长可能与其抑制肿瘤内EphB4表达，抑制血

管形成,降低癌细胞侵袭能力及下调Bcl-2表达，促

进肿瘤细胞凋亡有关。苏拉明和PG-Rg3具有多靶

点治疗的作用，可能具有潜在的抗肿瘤临床应用价

值，但其更具体的抗肿瘤机制尚需进一步研究。（图1~5见插页）

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2009,24（1）：60-63.（2012-11-22收稿 2013-05-02修回）

（本文编辑 李国琪）

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读者·作者·编者

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苏拉明联合人参皂苷Rg3抑制肺腺癌小鼠移植瘤生长的作用

对照组

顺铂组

苏拉明组

PG-Rg3组

联合组

Figure 1 Pictures of subcutaneous xenograft tumor in five groups图1 各组小鼠皮下移植瘤

A：对照组 B：联合组Figure 2 The expression of EphB4 in transplant tumor (SP×400)

图2 肿瘤EphB4表达（SP×400）

A：对照组 Figure 3 The expression of Bcl-2 in transplant tumor (SP×400)图3 肿瘤Bcl-2表达（SP×400）

A：对照组 Figure 4 The apoptotic cells in transplant tumor (TUNEL×200)图4 肿瘤细胞凋亡情况（TUNEL×200）

Figure 5 The MVD in transplant tumor (SP×400)图5 肿瘤MVD（SP×400）

（正文见887页）

A：对照组

B：联合组

B：联合组

B：联合组