85697053-tejeda-bioseparaciones

Parte I

Captulo 1

Introduccin

El cultivo de clulas con el objeto de obtener productos tiles, es unaactividad que ha realizado el hombre prcticamente durante toda suhistoria. Recientemente a esta actividad se le ha denominado Biotec-nologa. Esta ha evolucionado a partir de los conocimientos generadosen diversas disciplinas, tanto del rea de las ciencias bsicas como de lasingenieras. Hoy la Biotecnologa puede ser definida como la coleccinde procesos industriales que involucran el uso de sistemas biolgicos(Wang, 1988).

Las operaciones que comprenden los procesos biotecnolgicos a es-cala comercial, se han dividido tradicionalmente en operaciones pre-vias (procesos "upstream") y operaciones posteriores o bioseparacio-nes (procesos "downstream"). Dentro de las primeras se considera lapreparacin del medio, la esterilizacin y el funcionamiento del biorre-actor (Cooney, 1990). Los procesos de bioseparacin como se muestraen la Figura 1.1, involucran la recuperacin y purificacin de produc-tos provenientes del biorreactor. Comprenden todos los tratamientosque requiere el caldo de cultivo para la obtencin del producto en lascondiciones de pureza y actividad deseadas.

En un proceso dado, la parte correspondiente a las bioseparacionespuede representar hasta un 60% del costo total de produccin sin con-siderar las materias primas (Kalk, 1986). Debido a lo anterior, exite unarelacin inversa entre el precio de venta de un producto biotecnolgico yla concentracin de ste en el caldo del biorreactor (Figura 1.2). Puededecirse entonces que el xito comercial de un proceso biotecnolgico

6 CAPTULO!. INTRODUCCIN

depende en gran medida de la adecuada seleccin del proceso de biose-paracin.

1.1 Evolucin de los BioprocesosActualmente se pueden distinguir de manera general tres generacionesde procesos biotecnolgicos, en relacin al tipo de bioseparaciones questos involucran.

La primera generacin comprende el conjunto de procesos desarro-llados mediante cultivos de organismos no recombinantes, cuyos pro-ductos se obtienen en forma activa tanto si son intracelulares o si sonsecretados al medio de cultivo. En esta generacin se encuentran losprocesos de la Biotecnologa tradicional como los de la produccin deetanol, enzimas, cido ctrico, y antibiticos. Los productos de estosprocesos se presentan en concentraciones altas al inicio de la etapa deseparacin y no requieren de una extremada pureza para su venta.

Los descubrimientos asociados con la Biologa Molecular y la Inge-niera Gentica logrados particularmente en las ltimas dos dcadas,han ampliado las capacidades biotecnologas del hombre. En estaetapa podemos situar una segunda generacin de productos de la Bio-tecnologa como la insulina humana, la hormona de crecimiento, y alfainterfern, entre otros. Estos son producidos intracelularmente uti-lizando clulas recombinantes de Escherchia coli. Se caracterizan porencontrarse en bajas concentraciones dentro de la clula, son de ele-vado peso molecular, tienen propiedades similares a los contaminantesy requieren un alto grado de pureza. Ademas, generalmente al pro-ducirse en la clula no poseen actividad biolgica por tratarse de ca-denas peptdicas sin la conformacin o estructura apropiada; lo que setraduce en la necesidad de aplicarles tratamientos fisicoqumicos adi-cionales para lograr el producto en su estado activo.

La tercera generacin de la Biotecnologa, la podemos caracterizarpor procesos mediante los cuales se obtienen productos extracelularesen clulas recombinantes, la mayora de las cuales son eucariticas.En estos sistemas se ha observado la capacidad no slo de producirexgenamente el producto deseado, sino que ste se obtiene en formaactiva. El factor VIII de la sangre y el agente tromboltico Activador

1.1. EVOL UCIN DE LOS BIOPROCESOS

Inoculo Esterilizacin y preparacindel medio

Producto intracelular Esterilizacin del caldosi es recombinante

Producto extracelular

Rompimiento celular

'

Remocin de desechoscelulares

Separacin celular

Recuperacin y concentracindel producto

Purificacin del producto

Figura 1.1: Operaciones de un proceso biotecnolgico: a). Operacionesprevias b). Operaciones posteriores o bioseparaciones. Adaptada de:Bujurstrom, 1985.Reproducida con el permiso de Me Graw Hill. Copyright 1985. Todos los derechos

reservados.

CAPTULO 1. INTRODUCCIN

(g/i)

O1

"*

10*

wr

.Etanol.Acidoctrico MSG

, Penicilina,Treonina

> CefalospornakGentamioina

. Acido Giberflico. Enzimas a granel

. Glucosa oxidas

Enzimas dinvestigacin ydiagnstica

Anticuerpos

GlioroHosato-deshidrogenas*

LucHerasa

Factor VIII

Urakinasa

Enzimas teraputicas ^ "^

IOZ ' K) I01 K)2 I03 K>4 K)5 O6 KJ7 K)" O9

Precio de venta $/Kg

Figura 1.2: Relacin entre la concentracin inicial del producto en elcaldo y el precio final de venta del producto. Fuente: Dwyer, 1984.Reproducida con el permiso de Nature Publishing Co. Copyright 1984. Todos los derechos

reservados.

1.2. CARACTERSTICAS DE LOS BIOPROCESOS

Tabla 1.1: Caractersticas de los Procesos Biotecnolgicos.

Caracterstica

PerodoTipo de clulasFortaleza delas clulasConocimiento de pro-piedades bsicasConocimientoTecnolgico

GeneracinPrimera

- 1975No recombinantes

Alta

Alto

Alto

Segunda

1975-Recombinantes

Alta

BajoBajo

Tercera

1985-Recombinantes

BajaBajoBajo

Tabla 1.2: Caractersticas de los Productos Biotecnolgicos

Caracterstica

Producto tipo

Idealizacin

TamaoActividadal secretarsePureza deseadaSimilitud concontaminantesValor

GeneracinPrimera

AntibiticosAminocidosExtracelulare intracelularIntermedio

Si

AltaBajaBajo

Segunda

Insulina humanaHC

Intracelular

MacromolculasNo

Muy altaAlta

Alto

Tercera

Factor VIIItPA

Extracelular

MacromolculasSi

Muy altaAlta

Alto

del Plasmingeno tisular (t-PA de sus siglas en ingls) son produc-tos caractersticos de esta generacin. Debido a su empleo con finesteraputicos, estos productos deben ser obtenidos con un alto grado depureza (Datar et a/, 1993) .

1.2 Caractersticas de los BioprocesosEn la Tabla 1.1 y en la Tabla 1.2 se presentan algunas caractersticasasociadas a los procesos y a los productos de las tres generaciones dela Biotecnologa, aqu descritas.

10 CAPTULO 1. INTRODUCCIN

Los procesos biotecnolgicos tanto de la segunda como de la ter-cera generacin, se encuentran en una etapa de desarrollo que requiereampliar el conocimiento de las propiedades fisicoqumicas de los pro-ductos y sus contaminantes, con el objeto de seleccionar las operacionesde separacin adecuadas debido al alto grado de pureza requerido porlos productos.

Los aspectos de rendimiento y pureza del producto son bsicos paradeterminar la viabilidad de un bioproceso, debido a que para lograrel grado de purificacin requerido por este tipo de productos, general-mente la purificacin debe realizarse en varios pasos. Un ejemplo delo anterior se muestra en la Figura 1.3 con un diagrama de flujo delproceso para la obtencin de insulina humana a partir clulas de E.coli recombinante.

Las operaciones de bioseparacin para un proceso deben seleccio-narse cuidadosamente con el fin de que el costo sea mnimo. Es decir,si el rendimiento por paso de purificacin es bajo y se requieren variaspasos, puede tenerse un proceso no viable econmicamente debido a suan ms bajo rendimiento global.

La Figura 1.4 muestra como decrece el rendimiento global en funcindel nmero de pasos de purificacin, considerando rendimientos porpaso de 95 %, 90 %, 80 % y 60 %. Por ejemplo, si el rendimientopromedio por paso en un proceso de purificacin de 10 pasos es de 60 %,el rendimiento global del proceso de purificacin es de 0.6 %. Si debidoa la desnaturalizacin del producto el rendimiento desciende a 30 %por etapa, el rendimiento global del proceso es 0.0006%. Esto significaque se require 1000 veces ms cantidad de materia prima para lograrla misma masa de protena purificada. Por otra parte si el rendimientopromedio por paso fuese de 95 %, el rendimiento total alcanzado seradel 60 % (Hearn y Anspach, 1990).

Ejemplo 1.1: Estimacin de la pureza y el rendimiento deuna enzima en un proceso de purificacin.

En el desarrollo de un proceso para la obtencin de una enzima apartir de E. coli, se sabe que sta tiene un 80 % de humedad y queel 60 % de su peso seco es protema. El proceso de purificacin de laenzima consta de 4 pasos (Figura 1.5). En la tabla siguiente se presenta

1.2. CARACTERSTICAS DE LOS BIOPROCESOS 11

Salida delireeste'ril

Esterilizador icontinua

( A )

Sedimentador 1(B)

uulLJJ. i [ J Tanques de m

TSrfii rtH i hio*1 Sedimentador2 I *- * t '.Tanque de almacenamiento

intercambiador de calor

' Fermentadordefiltra de aire produccinesteVH (O)

Centrifugas

Compresor

Tratamiento dedesechos

e(E)

i** 4

Tanquede

sterilizaon

^ t t1 1 1

otras corrientes de desecho

CNBr formato

n ni_r.f ,1

Reactor para eliminacinde CNBr

(H)Reactor de

solubilizacin

Figura 1.3: Representacin esquemtica del proceso para la obtencinde Insulina Humana. Fuente: Datar y Rosen, 1990.Reproducida con el permiso de Marcel Dekker Inc. Copyright 1985. Todos los derechos

reservados.

12 CAPTULO 1. INTRODUCCIN

Del tratamientodCNBr

Reactor decuMonan(K)

bufer bufer bufertris enzimas Iris tris*NaCt _,;?

? ^T

d**eho iHiPLC(O)

desechoenzimatico (M)

(NJ

acetato de amonio

3rReactor de

renaturalizacin(L)

Uhrafihraein

IjUReactor de

cristalizacin(Q) Centrifugacin

vapor

1PRODUCTO

Evaporadorinstantneo

Figura 1.3: Continuacin.


Rendimiento (%)100 _

95%

90%

4 6 8Nmero de pasos

Figura 1.4: Representacin grfica del rendimiento global de un procesode purificacin de un producto biotecnolgico en funcin del nmero depasos. Fuente: Hearn y Anspach, 1990.Reproducida con el permiso de Marcel Dekker Inc. Copyright 1985. Todos los derechos

reservados.

14 CAPTULO 1. INTRODUCCINla cantidad de enzima y de protena total al final de cada paso.

Paso

RompimientocelularPrecipitacinIntercambioinicoCrom atografagel

Protenatotal (g)

12.0001.800

0.240

0.036

Enzimatotal (g)

0.0800.060

0.048

0.036

Fraccinenzima xlO~3

6.66733.333

200.000

1000.000

Se desea obtener el factor de purificacin de la enzima en cada paso,el rendimiento por paso y el rendimiento global.

/-'

Solucin:El factor de purificacin, el rendimiento por paso y el rendimiento

global del proceso se presentan junto con los datos del problema en latabla siguiente:

Paso

RompimientocelularPrecipitacinIntercambioinicoCromatografagel

Prot.tot. (g)

12.0001.800

0.240

0.036

Enzimatot. (g)

0.0800.060

0.048

0.036

Fraccinenz. XlO~3

6.66733.333

200.000

1000.000

Factor depurific.

15

30

150

% Recup*Por etapa

10075

80

75

racinGlobal

10075

60

45

a). El factor de purificacin se obtiene mediante el cociente de lafraccin de enzima en cada paso, entre la fraccin de enzima inicial.

b). El rendimiento en cada paso est dado por el cociente de lacantidad de enzima total obtenida en cada paso, entre la cantidad totalde enzima al inicio del paso.

c). El rendimiento global al final de cada paso est dado por elcociente de la cantidad de enzima total obtenida en ese paso entre lacantidad total de enzima inicial.


Rompimiento celular

iPrecipitacin consulfato de amonio

Fraccincolectada

Cromatografa deintercambio inico

Cromatrografia defiltracin por gel

Producto

35 40 45 50 55% de saturacin

60 70 100

Carga ElucinNmero de fraccin

Nmero de fraccin

Figura 1.5: Proceso hipottico de cuatro pasos para la purificacin deuna enzima.

16 CAPTULO 1. INTRODUCCINEl conocimiento tecnolgico de los procesos biotecnolgicos de se-

gunda y tercera generacin es limitado. Actualmente es necesario pro-fundizar en los mtodos de escalamiento de algunas operaciones, ya quegeneralmente se han adaptado a escala comercial a partir del laborato-rio. En el proceso de escalamiento es necesario considerar los volmenesy normas del mercado para el producto (Nuil, 1987).

La Biotecnologa ha adoptado con xito operaciones de la Inge-niera Qumica, en la purificacin de productos biotecnolgicos tradi-cionales. Sin embargo, existen limitantes para lograr sto cuando setrata de obtener productos caractersticos de la segunda y tercera ge-neracin. Existe una necesidad real de desarrollar procesos de biosepa-raciones apropiados, con la participacin de bioqumicos y bilogos conel propsito de lograr, tanto la pureza deseada del producto, como laeficiencia y rentabilidad del mismo (Wang, 1988).

1.3 SumarioLos procesos de bioseparacin involucran la recuperacin y purificacinde productos provenientes del biorreactor. Las bioseparaciones com-prenden todos los tratamientos que requiere el caldo de cultivo paraobtener un producto biotecnolgico en las condiciones de pureza y ac-tividad requeridas.

La economa de los procesos biotecnolgicos depende en gran me-dida de las operaciones de bioseparacin que involucran, de tal maneraque la correcta seleccin de estas operaciones tiene un fuerte impactoen el xito del proceso.

1.4. PROBLEMAS 17

1.4 Problemas1.1 .-Efectuar un anlisis comparativo en relacin a las operaciones deseparacin que utilizan, de los procesos para la produccin de cidoctrico, penicilina e insulina.

1.2.- Un proceso para la recuperacin de hidroxibutirato deshidro-genasa consta de tres pasos: Un rompimiento de las clulas para liberarla enzima intracelular, seguido de dos pasos de adsorcin/ desorcin porafinidad.

En la siguiente Tabla se presentan los datos obtenidos de actividadde enzima y protena total al final de cada paso.

Calcular la actividad especfica, el ndice de purificacin y el % derecuperacin.

Paso

RompimientoAds/Des (1)Ads/Des (2)

Actividad Total(Unidades)

6,8606,8005,380

Protena Total(mg)

76,2002,200

267

1.3.- Completar la siguiente tabla relacionada con la purificacin deuna enzima:

Material

Extractoler. piso

Vol.

mi

50050

Conc.prot.

mg/ml

1410

Prot.total"IR

760

Act.enzim.U/ml

Act.total

U

Act.esp.

U/mg

Rend.Etapa Total

Fac.purif.

1.4.- En un proceso biotecnolgico para producir una enzima quese encuentra en desarrollo, se obtiene una concentracin de 0.1 mg/mlde la enzima en el caldo inicial. Si a los proyectos se les exige unmargen sobre ventas del 50 %, estime el costo de produccin mximodel producto utilizando la Figura 1.2

18 CAPTULO!. INTRODUCCIN

1.5 BibliografaBujurstrom, E. 1985. Biotechnology. Chem. Eng. Feb. 18. Me Graw

Hill. New York. 126-158.

Cooney, C. L. 1990. Separations for biotechnology. Trends in Bio-technology. 8, 338-340.

Datar, R.V., Cartwright, T. y Rosen, C.G. 1993. Process economicsof animal cell and bacterial fermentations: A case study analysisof tissue plasminogen activator. Bio/Technology. 11, 349-357.

Datar, R. y Rosen C. G. 1990. Downstream process economics. En:Separations Processes in Biotechnology. Asenjo, J.A. (Ed.). Mar-cel Dekker Inc. New York. 741-793.

Dwyer, J. 1984. Scaling up bioproduct separaton with high perfor-mance liquid chromatography. Biotechnology. 2, 957-964.

Hearn, M. T., y Anspach, B. 1990. Chemical, physical and biochemicalconcepts in isolation and purification of proteins. En: SeparationsProcesses in Biotechnology. Asenjo, J.A. (Ed.). Marcel DekkerInc. New York. 17-63.

Kalk, J. P. y Langlykee, A. F. 1986. Cost estimation for biotechno-logy projects. En: Industrial Microbiology and Biotechnology.Demain, A.L. y Solomon, N. (Eds.). American Society for Micro-biology. New York. 363-384.

Nuil, H. R. 1987. Selection of a separation process. En: Handbookof Separation Process Technology. Rousseau, R.W*, (Ed.). JohnWiley & Sons. New York. 982-995.

Wang, D. I. C. 1988. Biotechnology: Status and perspectives. AIChE,84-18, 1-21.

Captulo 2

Seleccin del Proceso

2.1 IntroduccinEl desarrollo de un proceso biotecnolgico para la obtencin de unproducto de inters comprende varios aspectos, fundamentalmente loseconmicos relacionados con el mercado y los tcnicos que involucranel diseo del proceso .

El estudio de mercado permite evaluar el potencial econmico delproceso y es requisito indispensable para la formulacin del proyectoa desarrollar. Por ejemplo, an cuando la factibilidad tcnica de unproceso dado pueda ser atractiva, el valor esperado del producto pudierano justificarlo (Knight, 1990).

En el diseo de un proceso es necesario un trabajo completo y cui-dadoso que permita desarrollar y evaluar varios esquemas de operacincon el propsito de aproximarse al diseo ptimo, bajo las restriccionespresupustales establecidas. (Kelly, 1987).

Un aspecto central en el diseo de un bioproceso, es la especificacinde la secuencia de operaciones de separacin que se requieren, debidoal alto costo que stas representan.

En este captulo en la seccin 2.2 se presenta los principales as-pectos econmicos y tcnicos a considerar para la seleccin de un pro-ceso biotecnolgico, particularmente en su secuencia de operaciones debioseparacin. Los equipos ms comunes para realizar dichas opera-ciones se describen en la seccin 2.3. Las metodologs utilizadas para

19

20 CAPTULO 2. SELECCIN DEL PROCESO

MERCADO

ESPECIFICACIN DELPRODUCTO

PROCESO

- Operaciones y secuencia

-Escala

Etapas o tiempo poroperacin

-Costo

PRODUCTO

Figura 2.1: Elementos para la seleccin de un bioproceso.

la seleccin apropiada de la secuencia de bioseparaciones para un pro-ceso se establecen en la seccin 2.5.

2.2 Fundamentos

Los factores que intervienen en la seleccin de un proceso biotecnolgicoson de dos tipos (Figura 2.1):

Econmicos: Relacionados principalmente con el mercado y lasespecificaciones del producto.

Tcnicos: Relacionados directamente con el el proceso.

2.2. FUNDAMENTOS 21

Tabla 2.1: Influencia del mercado en el precio del producto.

Caso tipo

1

2

Compaa

GENENTECH

Diversas

Producto

t-PA

BST*

Preciopor dosis

$ 2000.00

$ 0.50

Demanda Anual (USA).No. de Dosis

100,000

5 X 10*

Masa

10 Kg

100 Tons.

Datos de: Spalding, 1991.* Somatotropina de Bovino

2.2.1 Mercado y Especificacin del ProductoEl mercado es un factor muy impoortante para el establecimiento de unbioproceso, ya que determina el precio del producto. El mercado de losproductos biotecnolgicos puede enmarcarse entre dos casos extremos(Tabla 2.1):

1. Productos de alto valor, bajo volumen de produccin y libres decompetencia, como el t-PA.

2. Productos de alto volumen de produccin, en mercados muy com-petitivos, como la BST.

En los productos libres de competencia, es posible que se seleccioneel primer proceso exitoso que se logre en el laboratorio. Sin embargo,si el mercado del producto aumenta y aparecen nuevos competidores,la economa del proceso cobra especial importancia (Spalding, 1991).

Actualmente varios productos biotecnolgicos modernos estn libresde competencia, pero existe una tendencia hacia un incremento en lacompetitividad del mercado. Es en esta transicin donde el diseoadecuado de los bioprocesos presenta especial relevancia.

El primer paso en la seleccin de un proceso es la definicin delobjetivo del mismo, especificando claramente la pureza y recuperacinque se desea obtener. Con frecuencia las especificaciones sobre pureza


del producto son establecidas por regulaciones legales o por el mer-cado. Las especificaciones de recuperacin son fijadas para asegurar laeconoma del proceso. Idealmente la recuperacin debe ser una variabledependiente del diseo de proceso, en la bsqueda de la optimizacindel mismo. En la prctica, debido a limitaciones de tiempo esta faseno siempre se concluye (Nuil, 1987).

2.2.2 El ProcesoEl diseo de un proceso comprende todo el trabajo conceptual quees necesario realizar antes de construir una planta productiva, y tienecomo objetivo definir las principales caractersticas del proceso como:La secuencia de operaciones de proceso.

La escala del proceso.

Nmero de etapas por operacin.

El costo del proceso.

Operaciones de Separacin y su SecuenciaUna vez definido el producto (o productos) que se desea obtener, ascomo su pureza y la recuperacin deseada, el siguiente paso es deter-minar que operaciones son capaces de realizar la produccin y la sepa-racin del producto. En este trabajo slo se abordan estas ltimas.

Las operaciones de separacin se basan en las diferencias que existenentre las propiedades fsico-qumicas de los componentes presentes en elcaldo de cultivo. El objetivo del diseo de un proceso de separacin esexplotar esta diferencia en las propiedades en la forma mas econmica.

Generalmente existe una propiedad diferente que es la base primariapara la separacin. Los mtodos de separacin usados con ms frecuen-cia, as como la propiedad en que se basan, se muestran en la Tabla 2.2

En un anlisis realizado con datos de 100 artculos publicados sobrepurificacin de protenas, se observa que hay una secuencia preferen-cial aunque no estricta, con la cual se desarrollan las operaciones deseparacin (Bonnerjea y Hoare, 1986). Tal y como se observa en la

2.2. FUNDAMENTOS 23

Tabla 2.2: Operaciones de separacin y su propiedad bsica.

Mtodo (Operacin) Propiedad

DestilacinExtraccin

CristalizacinAdsorcinOsmosis InversaUltrafiltracinIntercambio InicoDilisisElectrodilisis

Membranas LquidasElectroforesis

Cromatografa

Filtracin por Gel

Presin de vaporDistribucin entre fasesb'quidas inmisciblesPunto de fusin o solubilidadSorcin superficialDifusividad y solubilidadTamao molecularEquilibrioDifusividadCarga elctrica y movilidadinicaDifusividad y equilibrioCarga elctrica y movilidadinicaDepende del tipo de faseestacionariaTamao y forma molecular


i 2 a 4 s e__ Homogmizactn PrecipiUcin

Intercambio inico AfinidadFiltracin n Gl

Figura 2.2: Secuencia de operaciones utilizadas en un proceso de pu-rificacin de protenas. Fuente: Bonnerjea et al, 1986.Reproducida con el permiso de Nature Publishing Co. Copyright 1986. Todos los derechosreservados.

Figura 2.2 frecuentemente la homogeneizacin va seguida de una preci-pitacin, despus la cromatografa de intercambio inico, la separacinpor afinidad y finalmente la filtracin por gel. Esta secuencia es validageneralmente en el caso en que el producto sea una protena, la reali-dad es que cada producto presenta una secuencia de separacin ptimadiferente.

Escala de OperacinFrecuentemente la escala de operacin es el factor econmico determi-nante en la seleccin entre procesos de separacin alternativos. Cual-quier proceso de separacin que se escoja, deber ser compatible con laescala industrial a la cual se va a disear. Esto es importante porquevarios procesos desarrollados en el laboratorio no tienen su contraparte

2.2. FUNDAMENTOS 25

industrial. Muchas operaciones de separacin tienen un lmite respectode la capacidad mxima que pueden manejar y esto limita la escalade produccin para la cual esa operacin puede ser considerada. Enalgunos casos, este lmite superior se debe a una restriccin impuestapor un fenmeno fsico inherente a la operacin de separacin, mientrasque en otros casos el lmite superior se debe simplemente a las limita-ciones que ofrece la fabricacin de equipo comercial. En la Tabla 2.3 sepueden observar las capacidades mximas en una sola etapa de algunasoperaciones de separacin.

Cada operacin de separacin tiene en s misma una determinadaconfiabilidad que es producto de la experiencia y conocimiento de lamisma. As se tiene que la destilacin es la operacin ms confiablede los procesos de separacin por el conocimiento que de ella se tiene.La electroforesis en cambio, es una operacin que se realiza a pequeaescala, entonces la nica forma de tener confiabilidad a gran escala esusando mltiples unidades en arreglo paralelo.

Debido a consideraciones de confiabilidad del diseo, puede ser nece-saria una planta piloto para probar la operacin integrada del proceso.En tal caso, todas las operaciones deben ser incluidas en la planta pi-loto an cuando no se requieran pruebas individuales de confiabilidadde cada una de ellas.

Nmero de Etapas por Operacin

Otra variable importante en la seleccin de un proceso de separacin(Figura 2.1), es el nmero de etapas de contacto que se realizan poroperacin. En la mayora de los casos una operacin de una sola etapaes ms econmica que una operacin de etapas mltiples.

Las operaciones de separacin que aparecen en la Tabla 2.1 tienendiferente habilidad para realizar una separacin en una sola etapa. Aspor ejemplo, la destilacin es una operacin capaz de separar una mez-cla binaria en una sola etapa, siempre y cuando no haya formacin demezclas azeotrpicas entre los componentes que sern separados. Laextraccin requiere de al menos dos etapas de contacto para separarun flujo de alimentacin en dos corrientes y obtener el producto encondiciones aceptables. La adsorcin es una operacin que consiste de


Tabla 2.3: Capacidades mximas por operacin.

Operacin deSeparacin

Lmite Comercialpor Operacin Simple

DestilacinExtraccinCristalizacinAdsorcinOsmosis Inversa

Ultrafiltracin

IntercambioInicoElectrodilisis

Electroforesis

SeparacionesCromatogrficasFiltracin por Gel

Sin lmiteSin lmite10-70xl06 kg/aoSin lmite0.45xl06 kg/aoflujo de agua por mdulo,con varios mdulospor unidad0.45xl06 kg/ao deflujo de agua por mdulo,con varios mdulospor unidad450xl06 kg/ao de 'flujo de agua0.45x106 kg/ao deflujo de agua1000 kg/ao deproductoO.OQxlO6 kg/aode lquido100 kg/ao deproducto

Fuente: Nuil, 1987.

Reproducida con el permiso de John Wiley and Sons. Copyright 1987. Todos los derechosreservados.

2.2. FUNDAMENTOS 27

dos etapas, la adsorcin en si misma, y la regeneracin del adsorbente.Tericamente la ultrafiltracin puede separar dos solutos de alto pesomolecular si la diferencia en tamao molecular es del orden de 10; encaso de que esto no sea as, la separacin requiere varias etapas. Encualquier caso de los sealados anteriormente, se requieren etapas deprocesamiento adicionales para obtener el producto con la pureza de-seada. En el caso de las operaciones de electroforsis, cromatografa, yla filtracin en gel; dado que separan el producto por dilucin, requierenetapas de concentracin posteriores.

CostosUna vez que ha sido definido el objetivo de la separacin, esto es, quese ha identificado el producto que se desea obtener y se ha establecidoel proceso, se debe estimar el costo del mismo. Esto comprende la es-timacin del costo total del producto y del capital necesario para lainversin. Ambos parmetros, conjuntamente con los ingresos espera-dos, determinan la rentabilidad del proceso.

Costo Total del Producto.- Como se muestra en la Tabla 2.4, elcosto total del producto se divide comunmente en dos partes: costos defabricacin y gastos generales. En los costos de fabricacin se ubicanlos costos de operacin, los costos fijos y la parte proporcional de losgastos generales de la planta.

Dentro de los costos de operacin directos se puede resaltar los cos-tos de las materias primas que son consumidas directamente en el pro-ceso de produccin del producto o que son usadas en la recuperacin delmismo, debido a que stas constituyen la'mayor parte de estos costos.Los costos de las materias primas son ms relevantes en sistemas de pro-duccin basados en procesos biolgicos que en plantas qumicas conven-cionales. En los primeros las materias primas pueden representar del 30al 80 % del costo de produccin, mientras que en los convencionales slorepresentan del 10 al 50 % de ese costo (Kalk y Langlykke, 1986). Enlos procesos de produccin biotecnolgicos, no solamente las materiasprimas principales (aquellas que se convierten directamente a producto)tienen un impacto significativo sobre la economa del proceso, sino que


Tabla 2.4: Factores que intervienen en el costo total del producto.

I.

II.

Costos de Operacin Directos

A. Materias primas y suministros

B. Mano de obra y supervisin

C. Servicios

Costos Fijos

a. materia prima primariab. materia prima secundariac. fletesd. operacine. mantenimientof. laboratoriog. otros

a. salarios y estmulosb. horas extras

a. vaporb. electricidadc. aguad. tratamiento de desechos

A. DepreciacinB. ImpuestosC. SegurosD. Renta

III.

IV.

V.

VI.

Proporcin de GastosGenerales de la Planta

Administracin

Mercadotecnia

Investigacin y Desarrollo

Para estimacin de costos:Costo de Fabricacin (CF) = I+II+IHGastos Generales (GG) = IV+V+VICosto Total del Producto =CF-f GG

-

2.2. FUNDAMENTOS 29

I. Costos de Operacin Directos (59 % )II. Costos Fijos ( 1 1 % )

III. Proporcin de Gastos Generalesde la Planta ( 1 0 % )

IV. Gastos Generales (20 % )

de

0stos ?ara un Producto biotec-

tambin las materias primas secundarias como cofactores, enzimas in-ductores y materiales de recuperacin, influyen considerablemente enlos costos de produccin.

Los sueldos y salarios representan una fraccin importante del totalde los costos de fabricacin, esto es, del 10 al 40 %.

Los costos fijos comprenden la depreciacin de maquinaria y equipoimpuestos y seguros principalmente. '

La parte proporcional de los gastos generales de la planta que sele asignan al producto, son aquellos que se requieren para la operacineficiente de la planta pero no son asignables directamente al producto yse estiman entre el 10 y 50 % de los sueldos y salarios (Kalk y Langlykke,

En la Figura 2.3 se presenta una estructura de costos tpica para unproducto biotecnologa).

Estimacin del Capital de Inversin.- El capital de inversin to-tal se conforma del capital fijo y del capital de trabajo. El capital fijose refiere a todos los fondos necesarios para el diseo, construccin y

30 CAPTULO 2. SELECCIN DEL PROCESOarranque de la planta. Es en este punto donde se hacen las estimacionesde escala del proceso y la estimacin del costo de los equipos necesariospara las operaciones previas y las bioseparaciones. Cuando se com-paran dos procesos de separacin alternativos, se escoge el que requieremayor capital solamente si la rentabilidad generada es tan grande quejustifica la diferencia de requerimientos de capital entre ambas alterna-tivas. Los costos de arranque son difciles de estimar y pueden ir desdemenos del 5 % del capital de inversin fijo para una planta basada enuna tecnologa ya establecida, hasta ms del 50 % del capital fijo paranuevas tecnologas donde no se tiene experiencia, como son los proyec-tos biotecnolgicos. El capital de trabajo es la inversin necesaria parala operacin normal de la planta una vez contruda, y comprende losrequerimientos de sueldos e inventarios.

Ejemplo 2.1- Produccin de somatotropina porcina.Cuando se administra a cerdos la hormona somatotropina porcina

(SP) se incrementa la velocidad de su crecimiento hasta en un 30 % ydisminuye su contenido de grasa. Cada cerdo requiere de una sola dosisde 200 mg.

Para producir SP mediante un cultivo de clulas recombinantes, secuenta con los siguientes datos:

1. Mercado:

Produccin estimada = 6,000 Kg/aoPrecio por dosis de 200 mg = $6.00 dlls. (base: 1988)

2. Tcnicos:

Concentracin celular al final de la fermentacin en peso seco 35g/i

Peso protena/peso celular: 57 %Protena SP/protena total : 20 %Recuperacin total esperada: 25 %Duracin del ciclo de fermentacin: 30 hDas de operacin anual: 330 das

2.2. FUNDAMENTOS 31

Impuesto sobre la renta (ISR): 45 %3. Estimados:

(a) Produccin de peso seco celular: 1 Kg 1 Kg 1 Kg

= 6000 x . . x ___ ? x *ao 0.25 Kg 0.2 Kg 0.57

= 210,500 Kg/ao

(b) Volumen de fermentacin total (Vt):210,000 Kg

* ~ 35 f= 6,015,037 /

(c) Volumen por ciclo de fermentacin6,015,037 /

Vc = dias ^ ciclo ., 24 h~

x ~

x "

Vc = 22,784 I ciclo

Este volumen de 22,784 I/ciclo puede ser manejado por unsolo fermentador. Si se considera el volumen de fermentacincomo el 70 % del volumen total del fermentador, entonces elvolumen de fermentacin V/ es:

Vj = 32,500 /

Considerando este fermentador se realizan las siguientes es-timaciones de costos.


4. Costos (dlls. base 1988)I. Costos de operacin directos.(A) Materias primas y suministros:(B) Mano de obra y supervisin:(C) Servicios (agua, vapor, electricidad y

tratamiento de desechos):

II. Costos fijos.(A) Depreciacin:(B) Impuestos:(C) Seguros:(D) Renta:(E) Mantenimiento:

III. Gastos generales de planta:IV. Administracin:V. Mercadotecnia:VI. Investigacin y Desarrollo:

5. Capital de inversin:

Inversiones fijas.(A) Equipo de proceso, instalacin e

instrumentacin:(B) Instalaciones elctricas:(C) Edificios:(D) Instalaciones:

Inversiones diferidas.(A) Ingeniera, construccin y

contratos:

Capital de trabajo.2 meses de materias primas, serviciose investigacin y desarrollo:

Estimar para este proceso:

1. El retorno sobre la inversin.

2. El costo promedio del producto.

6,315,581.00580,720.00

1,054,864.00

Subtotal:

2,939,746.00587,949.00293,975.00000 000.00

1,763,848.00

Subtotal:

10,618,780.00487,100.00

2,191,950.002,679,050.00

Subtotal:

13,420,579.00

Subtotal:

1,756,141.00

Subtotal:

Total:

7,951,165.00

5,585,518.001,469,873.00

85,680.00000.00

2,500,000.00

Total: $ 17,592,236.00

15,976,880.00

13,420,579.00

1,756,141.00

$ 31,153,600.00

2.2. FUNDAMENTOS 33

3. El costo porcentual de cada concepto del producto.

Solucin:1. Clculo del retorno sobre la inversin:Ingreso anual:6,000 j x ^ 92 180,000,000Menos costo anual 17,592,236Utilidad bruta 162,407,764

Menos 45 % ISR 73,083,494Utilidad neta 89,324,270

Mas depreciacin 2,939,746

Flujo de efectivo neto $ 92,264,016El retorno sobre la inversin RSI expresado en porcentaje, est dado

por el cociente del flujo efectivo neto y el capital de inversin por 100,por lo tanto:

$92,264016RSI = $3115300

RSI = 296%Esto significa que el proyecto es muy atractivo bajo las condiciones

establecidas.2. Costo promedio del producto:El costo promedio del producto se obtiene mediante el cociente del

costo anual y la produccin estimada del producto, esto es:

$17,592,236/anoG ost o promedio = - - -F 6, 000 Kg/ao

Costo promedio = 2, 932 $/Kg

3. Costo porcentual del producto por concepto.


Este costo est dado por el cociente del costo de cada concepto entreel costo de operacin:

Concepto Costo porcentual

Materias primas y suministros

Servicios

Depreciacin

Mantenimiento

Gastos generales

Inversin y desarrollo

Otros

6,315.58117,592,236 X

1,054,864 ..17.592,236 X

2.939,746 x 100 - 16 7%17,592,236 x iuu ~ 1D-' /0

1,763,84817,592,236

1,469,873 y 1 00 - 8 4%17,592,236 X 1UU ~ O.1VO

2,500,000 . .17,592.236 X

Total:

8.8%

100.00 %

2.3 EquipoParte importante en la seleccin de un proceso biotecnolgico consis-te en determinar el equipo necesario para realizar una determinadaoperacin. Varios tipos de equipos pueden ser empleados para unamisma operacin y la seleccin depende en gran medida del tipo deproducto que va a obtenerse.

La Tabla 2.5 muestra las operaciones ms comunes por etapa enfuncin de las caractersticas de los procesos y productos biotecnolgi-cos. Algunos de los equipos ms usados en cada una de esas etapas sonlos siguientes:

1. Remocin de insolubles: Con frecuencia se usan sistemas de fil-tracin al vacio, sistemas de filtracin intermitentes, as comocentrfugas tubulares, de discos con descarga intermitente o decanasta.

2.3. EQUIPO 35

Tabla 2.5: Operaciones de bioseparacin empleadas de acuerdo a lascaractersticas del proceso

Etapa

Generaciones

Primera Segunda Tercera

Remocin deInsolubles Filtracin

Centrifugacin- Filtracin- Microfiltracin- Ultrafiltracin- Centrifugacin

MicrofiltracinUltrafiltracinCentrifugacin

Rompimiento- Homogeneizacin- Abrasin- Permeabilizacin

Concentracin- Extraccin por

solventes- Adsorcin- Destilacin

- Extraccin en dos fases acuosas- Adsorcin- Precipitacin- Ultraftracin

Purificacin- Adsorcin- Cromatografa

- Cromatografa- Ultrafiltracin- Electroforesis


2. Rompimiento celular: En esta etapa los equipos que ms se mane-jan son los homogeneizadores y los molinos de perlas.

3. Concentracin: En la concentracin del producto se emplean ex-tractores que pueden funcionar en forma continua o intermitente,as como tambin tanques agitados y lechos empacados con di-versos tipos de adsorbentes.

4. Purificacin: En esta etapa se emplean diversos sistemas croma-togrficos que se traducen en la utilizacin desde equipos muysencillos como puede ser una simple columna, hasta equipos muysofisticados como los utilizados en cromatografa liquida de altaresolucin. Tambin son utilizados en esta etapa sistemas de elec-troforsis.

5. Acabado: En la etapa de acabado, dependiendo de la presentacincon que se va a lanzar el producto al mercado, pueden utilizarseliofilizadores secadores y cristalizadores.

2.4 DiseoEl diseo de un proceso biotecnologa) comprende diversas actividadesbasadas en la experiencia, la teora y el apoyo computacional disponible.Entre estas actividades podemos destacar las siguientes:

Sntesis: Establecimiento de las operaciones del proceso o diagramade flujo.

Anlisis: Modelacin y establecimiento de los valores de las variablesdel proceso.

Evaluacin: Economa, seguridad y confiabilidad del proceso.

Optimizacin: Determinacin de las condiciones para lograr el valorptimo de una funcin objetivo.

El xito de un diseo depende fuertemente de la sntesis del pro-ceso ya que las tres actividades restantes: anlisis, evaluacin y opti-mizacin, se derivan del diagrama de flujo seleccionado.

2.4. DISEO 37

Actualmente existe un gran inters por el desarrollo de mtodoscomputacionales para el diseo de procesos que incluyan la sntesisde los mismos y que permitan el anlisis y la evaluacin de diversasalternativas, para encontrar en forma rpida el diseo ptimo. En laprctica los procesos rara vez se seleccionan de esta manera, dado queni los algoritmos computacionales, ni las descripciones cuantitativasde los mtodos de separacin estn suficientemente desarrollados. Sinembargo, estos mtodos cada vez son ms utilizados como apoyo enalgunas fases de la seleccin del proceso.

En esta seccin se describen los dos enfoques complementarios uti-lizados para la seleccin de un proceso:

Desarrollo de un Caso Base.

Sntesis de procesos.

Mtodo heurstico

Mtodo algortmico

Sistemas expertos

2.4.1 Desarrollo de un Caso Base

En la prctica normal el caso base representa el juicio cualitativo delingeniero de diseo y presupone ser el proceso de separacin ms eco-nmico que pueda ser desarrollado dentro de las restricciones que entiempo y dinero tiene el proyecto (Nuil, l)87).

Una vez que el caso base ha sido seleccionado, el diseador de pro-ceso determinar los costos de operacin y capital con el mayor detalleposible. Cuando el caso base ha sido evaluado, se hace un juicio so-bre el ms prximo proceso econmicamente competitivo. El procesoalternativo se evala con las mismas restricciones que el caso base. Siel proceso modificado tiene costos de operacin y capital ms bajos,entonces ste nos lleva a un nuevo caso base de diseo. Este nuevo casobase vuelve a probarse hasta encontrar un caso base ptimo.


2.4.2 Sntesis de ProcesoLa investigacin que se realiza para seleccionar un proceso, es decir lasecuencia de operaciones para transformar una serie de materias primasen productos, se llama sntesis de proceso. El mtodo heurstico, elmtodo algortmico y los sistemas expertos, son producto de este tipode trabajos.

Mtodo HeursticoEl mtodo heurstico trata de limitar las alternativas posibles para unproceso usando reglas desarrolladas a travs de diseos previos y laexperiencia. Al basarse en la experiencia, el sentido comn y la intui-cin del ingeniero, la aproximacin heurstica no garantiza la solucinptima. An as, estos mtodos han probado ser una herramientavaliosa en la optimizacin de la estructura del proceso. Algunas de estasreglas heursticas son generales y aplicables para la sntesis de procesosde bioseparacin. Cuatro de tales reglas heursticas son (Petrides et a/,1989):

1. Primero remover el componente ms abundante.

2. Primero remover lo que sea mas fcil.

3. Hacer las separaciones mas caras y difciles al final.

4. Seleccionar el proceso que permita aprovechar al mximo las di-ferencias entre las propiedades del producto y los contaminantes.

Existen reglas heursticas ms especficas que las mencionadas an-teriormente, como las usadas en el diseo de procesos de purificacinde protenas a gran escala:

1. Si el producto es intracelular, se requiere romper la clula.

2. Si la clula cultivada es de mamfero, el producto es extracelular.

3. Si el rompimiento de la clula se lleva a cabo por mtodos mec-nicos, se requiere precipitar los cidos nucleicos.

2.4. DISEO 39

4. Si la concentracin de la protena total al final de la recuperaciny antes de la purificacin, es menor que 60 g/l, se requiere con-centrar el producto.

5. Si la alimentacin para la purificacin por cromatografa no es uncaldo claro, se requiere un pretratamiento.

6. Si uno o dos pasos de intercambio inico producen una purezasimilar a la de cromatografa de afinidad, debe escogerse el inter-cambio inico.

7. La filtracin en gel se puede utilizar como una etapa de separacinintermedia slo para la eliminacin de sales.

8. La filtracin por gel se puede utilizar como un paso de acabadoslo para separar fracciones proteicas.

Este tipo de reglas son utilizadas conjuntamente con otras an msespecficas, en el desarrollo de bases de conocimientos para sistemasexpertos (Prokopakis y Asenjo, 1990).

Aproximacin Heurstica para la Seleccin de un Proceso deBioseparacin.- Se presenta en esta seccin una aproximacin heu-rstica de la sntesis de un proceso de bioseparacin de materiales bio-lgicos tpico (Petrides et a/, 1989). El primer paso en la sntesis de unproceso, consiste en desarrollar un diagrama de bloques de sus princi-pales etapas. Posteriormente, se seleccionan para cada etapa las opera-ciones alternativas posibles. El desarrollo del diagrama de bloques estbasado en la estructura general que se prqsenta en la Figura 2.4

1. Etapas de Recuperacin Primarias: Productos Intracelulares.

En el desarrollo de un diagrama de bloques para un nuevo proceso,es necesario distinguir entre productos extracelulares e intracelu-lares. La recuperacin y purificacin de los productos extracelu-lares es comparativamente ms fcil de realizar que la de los pro-ductos intracelulares. En el caso de los productos intracelulares,las operaciones que se utilizan son las siguientes:


BtORREACTOR

Producto intracelular

COSECHA DE CLULAS

CentrifugacinMicrofirtracinUKraftracin

Producto extraoelular

ROMPIMIENTO DE CLULASHomogenizacinMolino d perlasChoque osmtico

EXTRACCIN DELPROOUCTOSolventes orgnicos

REMOCIN DE DESECHOSCentrifugacinMicfufilb acinFiltracin al vacoFiltracin por presin

Polmero -sRuidos supxAdsorcinMicelas invDestilacin

RENATURAUZACION

SolubilizacinReoxidacin

REMCOON DE BIOMASAFiltracin al vacoCentrifugacinMicrofiltracinUltrafiltradnFiltracin en prensaFiltracin en cmaraRotacin

CONCENTRACINUltrafiltradnEvaporacinOsmosis inversaPrecipitacinCristalizacinExtraccinAdsorcinDestilacin

Especificaciones de afta pureza Especificaciones de baja pureza

PURIFICACIN FINALAdsorcinFiltracin geiEledrodialisisDiafiltracinElectroforesis

DESHIDRATAOON

Secado por aspersinSecado por IkrfilizaonSecado en lecho fluidizado

Figura 2.4: Diagrama de flujo de un proceso de bioseparacin. Fuente:Petrides et al, 1989.Reproducida con el permiso de American Institute of Chemical Engiixeers. Copyright 1989AIChE. Todos los derechos reservados.

2.4. DISEO 41

(a) Cosecha de Clulas: El primer paso en un proceso parala recuperacin de productos intracelulares es la cosechade clulas. Remover primero el lquido extracelular, esten completa concordancia con la primera regla heurstica:primero remover el componente ms abundante.Como se establece en la Figura 2.4, la centrifugacin y lafiltracin por membrana son las nicas tcnicas usadas paracosecha de clulas a gran escala. La centrifugacin tiene ven-tajas para microorganismos grandes (dimetro mayor que 2mieras y densidad mayor que 1030 kg/m3). Para microor-ganismos ms pequeos pueden usarse tcnicas de coagu-lacin para aumentar el tamao de la partcula que sedi-mentar. La filtracin por membrana tiene ventajas paracosechar clulas pequeas como la de E. coli. Cuando elflujo es mayor que 20 //m2 h, la filtracin por membranaes la que produce mejores resultados. Otra ventaja de la fil-tracin por membrana es la recuperacin del producto. Conla centrifugacin siempre se pierden de 1 a 5 % de las clulas.Con filtracin por membrana se recuperan todas las clulas,siempre que no se presente rompimiento o lisis.

(b) Rompimiento de Clulas: Con frecuencia el segundo paso enla obtencin de productos intracelulares es el rompimientode la clula. El rompimiento de bacterias y levaduras esrealizado por homogeneizadores a alta presin o con molinosde perlas. Para altas capacidades (varios m3/h) solamente sepuede disponer de homogeneizadores. Para el rompimientocelular, tambin se utilizan mtodos qumicos. Dentro destos se puede destacar el uso de la digestin enzimtica paraliberar protena intracelular de bacterias gram-positivas, ladisolucin lipdica para el caso de bacterias gram-negativas,as como el choque osmtico que puede utilizarse para liberarprotenas del espacio periplsmico.

(c) Remocin de Desechos Celulares: Una vez que la clula serompe y el producto es liberado, los desechos son eliminadospor medio de una o varias operaciones como: centrifugacin,microfiltracin o filtracin por presin.


Cuando el producto es soluble, ste es recuperado en la faseligera de una centrfuga o en el filtrado de un filtro. Lascentrfugas son eficientes para la separacin de partculasgrandes como los restos celulares, de tal manera que cuandose usen para este efecto, deben ser acompaadas de una ope-racin de filtrado para eliminar las partculas ms pequeas;debido a que stas pueden ocasionar problemas en etapasde bioseparacin posteriores, principalmente en las de cro-matografa. Cuando se usan microfiltros para remover losdesechos, se requiere posteriormente realizar una diafiltra-cin.Cuando el producto es insoluble (por ejemplo los cuerposde inclusin), debe ser separado primero de otras partculasy posteriormente tratado para que adquiera su forma ac-tiva. Este es un problema comn de muchas protenas eu-cariticas producidas por microorganismos procariotes, porejemplo la hormona de crecimiento producida por E. coli.Las protenas recombinantes forman cuerpos de inclusindentro de la clula husped. Estos pueden ser separadosde los restos celulares con una centrfuga de discos. La pu-rificacin es realizada por resuspensin y recentrifugacin dela fase pesada en 2 o 3 pasos. Posteriormente se pueden usardetergentes para remover otros contaminantes.La separacin del producto de los desechos puede ser llevadaa cabo tambin por extraccin con solventes orgnicos o conalgunas soluciones de polmeros.Los sistemas de dos fases acuosas han sido aplicados parala recuperacin de protenas. La separacin del producto delos desechos y su concentracin simultnea puede ser alcan-zada utilizando tcnicas de extraccin-adsorcin utilizandoya sea adsorbentes de afinidad o de intercambio inico. Eneste proceso, las clulas rotas y el producto son mezcladosen un tanque agitado con un adsorbente. Posteriormentesigue un paso de lavado en el cual muchos de los desechos ycontaminantes son eliminados.

2.4. DISEO 43

Etapas de Recuperacin Primaria: Productos Extracelulares.

(a) Eliminacin de Biomasa: La eliminacin de biomasa es elprimer paso que se realiza en un proceso de separacin cuan-do el producto es extracelular. Este paso se ajusta a lasegunda regla heurstica. En esta operacin los equipos msempleados son: la centrfuga decantadora, los filtros prensa ylos filtros con membranas. Cada uno de ellos tiene ventajasy desventajas segn el tipo de producto y tipo de clula,haciendo de la seleccin un problema difcil. No hay unaalternativa nica para todos los productos.

2. Operaciones de Alta Resolucin.Una vez realizada la separacin primaria del producto ya sea steintracelular o extracelular, la purificacin es llevada a cabo me-diante operaciones de alta resolucin. Si el producto es soluble,primero es necesario concentrarlo. Si el producto es insoluble yse encuentra desnaturalizado, entonces primero se renaturaliza ydespus se purifica.

(a) Concentracin.Despus de una primera clarificacin del caldo obtenido delbiorreactor o una vez rota la clula, el producto se encuentradiluido; para su concentracin las operaciones alternativasson: Ultrafiltracin, Extraccin, Osmosis inversa, Evapora-cin, Precipitacin y Destilacin.

i. Ultrafiltracin: Es una operacin usada ampliamentepara la concentracin de protenas. La presin de opera-cin tpica vara entre 0.2 y 0.5 MPa y el flujo promedioentre 20 y 50 l/m2 - h.

ii. Extraccin: La extraccin con solventes es una opera-cin ampliamente usada en la concentracin de produc-tos biotecnolgicos, particularmente en la obtencin deantibiticos. Se requiere que el coeficiente de particindel sistema sea alto para poder llevar a cabo la concen-tracin del producto en el menor nmero de etapas decontacto.

44 CAPTULO 2. SELECCIN DEL PROCESOiii. Osmosis Inversa: Se usan unidades con membranas de

tamao de poro pequeo para la concentracin de solu-ciones de productos con bajo peso molecular. Operan aaltas presiones (4 a 6 MPa) y a bajas temperaturas.

iv. Evaporacin: Se utilizan evaporadores de pelculas del-gadas los cuales operan a bajas temperaturas (4050(7)al vaco. Estas unidades compiten en el mercado con laultrafiltracin y la osmosis inversa para la concentracinde compuestos tanto de alto como de bajo peso molecu-lar.

v. Precipitacin: Es una operacin usada para concen-tracin y purificacin. Comnmente se usan sales, sol-ventes y polmeros para la precipitacin selectiva decompuestos de inters. La precipitacin es usada pararemover contaminantes.

vi. Destilacin: En los procesos de bioseparacin esta ope-racin se utiliza generalmente para la recuperacin desolventes orgnicos.

(b) Renaturalizacin.Las protenas eucariticas producidas por organismos pro-cariticos, frecuentemente forman cuerpos de inclusin en laclula recombinante. Estos cuerpos de inclusin pueden sersolubilizados mediante el uso de sales y agentes reductores.Despus que la protena desnaturalizada es solubilizada, seeliminan los solubilizantes utilizando cromatografa o diafil-tracin. Al final se obtiene una solucin de protena diluida.

3. Purificacin.Las operaciones para la purificacin final dependen fuertementede la pureza requerida del producto, distinguindose los produc-tos farmacuticos por su alta pureza en comparacin a la de losproductos industriales. Para productos de pureza relativamentebaja como las enzimas para detergentes, la operacin de purifi-cacin final consiste slo en la eliminacin del solvente. Paraproductos de alta pureza, las operaciones de purificacin finalesson normalmente la cromatografa y la ultrafiltracin.

2.4. DISEO 45

(a) Cromatografa: Es una operacin que se realiza al final deun proceso, en concordancia con la regla heurstica "hacerlas separaciones ms difciles y caras al final". Existen difer-entes tipos de cromatografa como la de intercambio inico,la de filtracin por gel y la de afinidad, entre otras. Normal-mente se requiere de una secuencia de varias operaciones cro-matogrficas para alcanzar la pureza deseada del producto.En la seleccin de la secuencia de estas operaciones debe ob-servarse la cuarta regla heurstica: "seleccionar el procesoque permita aprovechar al mximo las diferencias entre laspropiedades del producto y los contaminantes.

i. Cromatografa de Filtracin en Gel: Este tipo de cro-matografa separa molculas en base a su tamao mo-lecular; tiene dos aplicaciones principales: remocin depequeas molculas de las protenas y remocin de pro-tenas contaminantes de la protena producto. En elfraccionamiento de protenas, la filtracin por gel eslenta comparada con otras tcnicas cromatogrficas.

ii. Cromatografa de Intercambio Inico: Esta separacinse basa en la diferencia de la carga molecular de lasbiomolculas. Puesto que el la carga depende del pHy la fuerza inica, cualquier anin o catin en un so-porte puede ser usado para realizar la separacin. Enla prctica sin embargo, la seleccin normalmente estdeterminada por el pH al cual es estable el producto quese desea purificar.

iii. Cromatografa de Afinidad: Las separaciones por afini-dad o reconocimiento molecular, estn basadas en lasinteracciones especficas entre biomolculas. Es una o-peracin apropiada en cualquier etapa de la purificacindel producto y particularmente lo es para el manejo degrandes volmenes de material con baja concentracinde producto y gran cantidad de contaminantes. Es unaoperacin altamente eficiente ( ms del 90 % ). Su limi-tante es el alto costo de los materiales (ligandos) involu-crados.

46 CAPTULO 2. SELECCIN DEL PROCESO4. Acabado.

Las operaciones de acabado comprenden aquellas que se realizanpara la esterilizacin y estabilizacin del producto.

Los microfiltros de membrana son utilizados para esterilizar so-luciones biofarmacuticas, removiendo cualquier contaminacinbacteriana. Una limitante de estas membranas es la incapacidadpara la remocin de pirgenos y virus. Para minimizar el riesgo decontaminacin el agua utilizada deber estar libre de pirgenos.

Para incrementar la vida del producto se utilizan como agentesestabilizadores algunas sales como sulfato de amonio, cloruro decalcio o cloruro de sodio. Algunos productos son ms establescomo slidos. Las tcnicas ms comunes de deshidratacin paraproductos inestables son la liofilizacin y la cristalizacin.

Mtodo Algortmico

El uso de algoritmos matemticos para desarrollar la sntesis de unproceso, es en teora el nico camino vlido para desarrollar un procesoptimo. Esto se basa en el hecho de que todas las secuencias posiblespara el procesos pueden considerarse rigurosamente. El desarrollo deestos algoritmos se lleva a cabo mediante tcnicas de programacinmatemtica.

Actualmente la lnea principal de investigacin en tcnicas de pro-gramacin matemtica, aplicadas a la optimizacin estructural de unproceso, se basa en el uso de la programacin lineal (o no lineal) enteramixta (MILP o MINLP de sus siglas en ingls). La idea principal deestas tcnicas es la formulacin de una superestructura que consiste enun diagrama de flujo que contiene todas las posibles alternativas dediseo. A cada operacin unitaria de la superestructura se le asociauna variable binaria (una variable que slo puede tomar los valores O 1) y se construye una formulacin ptima. A continuacin se presentauna descripcin de estas tcnicas para una situacin particular.

Generalmente el problema consiste en separar una mezcla que tieneTV componentes: /4, B, (7,. . . y esta separacin puede ser realizadamediante M mtodos de separacin. La sntesis consiste en obtener la

2.4. DISEO 47

secuencia ptima de separacin utilizando el costo total como funcinobjetivo.

Para desarrollar este problema se hacen las siguientes considera-ciones:

1. Se parte de una mezcla ternaria (ABC) y como resultado de unaseparacin o varias separaciones de la mezcla se obtienen los sub-grupos: 1. (ABC), 2. (AB), 3. (BC\ 4. (AC), 5. (A), 6. (),7. (C)

2. Los mtodos de separacin son: 1. destilacin y 2. extraccin

3. Los componentes en cualquier mezcla estn colocados en ordendescendente con respecto a la propiedad caracterstica en la quese basa el mtodo de separacin.En el caso de la destilacin el orden de los compuestos de lamezcla es (ABC), lo que significa que el compuesto A tiene mayorvolatilidad que el compuesto C. De esta manera pueden tenerlugar dos separaciones en la columna de destilacin: (A/BC) o(ABIC).En el caso de la extraccin el orden en el cual se encuentranlos componentes de la mezcla es (BAC), lo que significa que elcomponente B tiene mayor solubilidad que el componente C. Enel extractor las separaciones que tienen lugar son: (B/AC) o(BA/C).

4. La funcin primaria de una etapa de separacin es separar losdos componentes adyacentes. Se denominan fase ligera y fasepesada a los componentes adyacentes entre los cuales tiene lugarla separacin.

En la Figura 2.5. se muestra a superestructura que origina el proble-ma de separacin de la mezcla ternaria considerando slo los mtodos deseparacin alternativos: destilacin y extraccin. En la parte superiorde dicha figura se muestra el proceso utilizando como operacin deseparacin la destilacin y en la parte inferior se muestra la separacinpor extraccin. La destilacin o la extraccin pueden ser usadas encualquier nivel de la separacin.


(ABC)]->(AB/C)

DESTILAaON

EXTRACCIN

-4(BAq

-H (A/B)

-H (B/A)

-J (A/C)

Figura 2.5: Superestructura de todas las secuencias de separacin al-ternativas para una mezcla ternaria. Fuente: Prokopakis y Asenjo,1990.Reproducida con el permiso de Marcel Dekker Inc. Copyright 1990 . Todos los derechos reser-vados.

2.4. DISEO 49

Para sistematizar el anlisis se emplean las convenciones siguientes:

1. Se definen los siguientes ndices:

i: subgrupoj: mtodo de separacin empleadok: fase ligera obtenida en la separacin

2. Se introduce una variable binaria 3/,,jk para cada operacin. Porejemplo la variable binaria 3/1,1,1 se asocia a la separacin que serealiza en el grupo ABC ', por medio de la destilacin y cuya faseligera es A.

3. Se define la variable costo C,,jt, para cada operacin. Esta varia-ble es funcin de parmetros operacionales como : temperatura(T), presin (P) y flujo (F).

4. Se establece la funcin objetivo que permite la optimizacin delproceso, para la obtencin de la secuencia de separacin de costomnimo. Esta funcin puede puede formularse como:

i 3 k

de tal manera que el costo total CT sea mnimo.

La funcin objetivo est sujeta a las siguientes restricciones:1. Una y solamente una separacin que involucre al subgrupo con

N componentes (mezcla original) de,be existir en la secuencia.

M N-l

y^k = l Para = 1, . 2" - 1 (2.2)j=l k=\

2. Para cualquier subgrupo, cuando mucho una separacin que in-volucre a ese subgrupo puede existir en la secuencia. Cualquiersubgrupo que haya sido procesado no puede aparecer nuevamenteen otra separacin.


M Ni-1

Z/ZXfc = 1 P

2.4. DISEO 51

Parmetrosgenerales

Parmetrosespecficos

Base dedatos

Sistema Experto- Base de conocimientos Sistema de inferencia

Secuencia de Proceso

Figura 2.6: Diagrama de operacin de un sistema experto.

donde se va a obtener, el sistema debe ser capaz de generar un procesode recuperacin. En la Figura 2.6 se muestra un diagrama de operacinde un SE.

En los procesos biotecnolgicos para obtencin de protenas, el di-seo de la secuencia de las operaciones de recuperacin y purificacinutilizando un sistema experto, se inicia con la respuesta del usuario apreguntas bsicas sobre el producto y sobre la clula de la cual se va aobtener.

Una pregunta tpica es la siguiente: Qu tipo de clula est siendocrecida para generar la protena en cuestin? cual es la concen-tracin?. Se preguntar tambin sobre algunas propiedades de la pro-tena de inters que puedan afectar el proceso de separacin, comoson: punto isoelctrico, hidrofobicidad superficial, peso molecular, lo-calizacin dentro de la clula y concentracin.

Una vez que se ha alimentado la informacin bsica al sistema, stegenera el diagrama de bloques de todas las etapas del proceso. Estediagrama contiene una descripcin de aquellas operaciones en la se-cuencia de separacin que deben ser llevadas a cabo para para obtenerel producto con el rendimiento y pureza deseada por el usuario. Poste-riormente el sistema decide sobre la operacin unitaria particular que


debe emplearse en cada etapa. En este tipo de sistemas la informacincualitativa se proporciona mediante conjuntos de reglas inferencialesSI - ENTONCES".

Ejemplo 2.2.- Funcionamiento de los sistemas expertos.Se desea seleccionar un proceso mediante un sistema experto, para la

obtencin de insulina pura a partir de un caldo de E. coli recombinanteque produce TrpE-Met-proinsulina intracelularmente (Prokopakis y A-senjo, 1990; Datar y Rosen, 1990).

Solucin:

1. Deben alimentarse al SE los parmetros que caracterizan al pro-ceso que en este caso son:

Parmetros Generales

Tipo de clula: E. coli recombinante

Producto de inters: protena

Localizacin celular: intracelular

Nombre: insulina

Presentacin en el mercado: cristales de insulina

Parmetros Especficos

Peso molecular

Hidrofobicidad

Punto isoelctrico

Curva de titulacin

Base de datos sobre liberacin diferencial del producto

Base de datos de equilibrio en dos fases

2.4. DISEO 53

2. El sistema experto revisa las reglas de la base de conocimientospara seleccionar el equipo de cosecha (EC). Cuando existen equiposalternativos para realizar la misma operacin, el sistema cuenta conponderaciones heursticas que auxilian la seleccin.

SIENTONCES

Microorganismo =EC =EC =

LevaduraCentrfuga de Discos 0.6Microfiltracin 0.4

SIENTONCES

Microorganismo =EC =EC =

BacteriaCentrfuga de Discos 0.5Microfiltracin 0.5

En este caso debido a las caractersticas de la E. coli y al cono-cimiento experimental que se proporciona al SE, ste elige la opcin"centrfuga de discos" para la operacin de cosecha de clulas.

3. Una vez que se ha definido el equipo de cosecha debern estable-cerse los parmetros de la corriente de salida de la unidad, como son:concentracin, viscosidad, densidad y otros. El SE consulta al usuariosobre estos parmetros ya sea que hayan sido medidos o estimados es-timados.

4. El SE decide sobre las operaciones siguientes en base a la infor-macin que le proporcione el usuario sobre la localizacin del producto,usando las siguientes reglas:


SI Microorganismo = MamferoENTONCES El Producto es Extracelular

SI El Producto es IntracelularENTONCES Se Requiere Rompimiento

Se Requiere Separacin de DesechosSe Requiere Precipitacin de cidos Nucleicos

El Producto es ExtracelularNo se Requiere RompimientoNo se Requiere Separacin de DesechosNo se Requiere Precipitacin de cidos Nucleicos

5. En este caso como la protena de inters es intracelular, el SEestablece la necesidad de realizar operaciones de rompimiento celulary separacin de desechos. Posteriormente el SE selecciona el equiporequerido para cada una de las operaciones.

1. En el caso de la operacin de rompimiento celular, utiliza lassiguientes reglas para seleccionar el equipo de rompimiento celular(ER).

2.4. DISEO 55

SI Se Requiere Rompimiento yMicroorganismo =

ENTONCES ER =Tamao de los Desechos =

BacteriaHomogeneizadorPequeo

SI Se Requiere Rompimiento yMicroorganismo =y las proteasas son altas

ENTONCES Agregue un inhibidor deproteasas al medio

Bacteria



LevaduraHomogeneizadorPequeo



HongoMolino de PerlasMedio

2. El sistema decide la separapacin de los cuerpos de inclusin delhomogeneizado utilizando el mismo equipo de centrifugacin em-pleado en la cosecha celular.

56 CAPTULO 2. SELECCIN DEL PROCESOCon las letras a, 6, c se muestran en la Figura 2.7 las tres primeras

operaciones generadas con el SE. Hasta este punto del proceso la TrpE-Met-proinsulina obtenida se encuentra formando cuerpos de inclusin.

6. Se establece la necesidad de solubilizar los cuerpos de inclusincon una solucin de cido clorhdrico-guanidina (GuHCl) y 3 mer-captoetanol en un reactor qumico, para obtener una solucin de TrpE-Met-proinsulina.

7. Se establece la necesidad de concentrar la solucin de TrpE-Met-proinsulina. Para decidir sobre el mtodo de concentracin y el equipo(EC) el SE utiliza las siguientes reglas:

SI Se Requiere Concentraciny la Eficiencia de la Separacinen Dos Fases = Altay la Eficiencia de Adsorcin = Alta

ENTONCES IMPRIME: Debido a que ambas operacionestienen una eficiencia alta, el equipoms adecuado ser aquel que se hayautilizado experimentalmente

SI Se Requiere Concentraciny la Eficiencia de la Separacinen Dos Fases =y la Eficiencia de Adsorcin =

ENTONCES EC =

AltaMediana o BajaSeparacin enDos fases

2.4. DISEO 57

SI Se Requiere Concentraciny la Eficiencia de la Separacinen Dos Fases = Bajay la Eficiencia de Adsorcin = Bajay la Eficiencia de laInteraccin Hidrofbica = Baja

ENTONCES EC = Precipitacin(sulfato de amonio)

En los procesos establecidos para la obtencin de insulina, la con-centracin se realiza mediante una precipitacin.

8. Se decide utilizar el mismo equipo de centrifugacin empleado enla cosecha de clulas para separar el precipitado de la solucin anterior.

9. El concentrado se somete a un tratamiento en un reactor qumicopara liberar la proinsulina.

10. La solucin obtenida en g est compuesta de proinsulina, frag-mentos de TrpE y residuos de metionina, que podrn separarse por unproceso de ultrafiltracin para obtener un concentrado de proinsulinacruda (operacin h de la Figura 2.7). La concentracin de proinsulina seincrementa mediante una evaporacin. El concentrado de proinsulinacruda se renaturaliza en un reactor qumico.

11. Una vez renaturalizada la proinsulina debe ser purificada en unaoperacin de alta resolucin. El SE cuenta con reglas para la seleccindel equipo de alta resolucin (EAR) como las siguientes:

SI Bioespecificidades posible

ENTONCES EAR = Cromatografa de Afinidad 0.3EAR = Cromatografa de Intercambio

Inico de Alta Resolucin 0.6EAR = Cromatografa de Interaccin

Hidrofbica 0.1


SI Producto = IgG MonoclonalENTONCES EAR = Cromatografa de Afinidad 0.6

BioespecficaEAR = Cromatografa de Intercambio 0.4

Inico (1 o 2 etapas)

SI Producto = No est DefinidoENTONCES EAR = Cromatografa de Afinidad

EAR = Cromatografa de IntercambioInico

0.20.8

12. Al llegar a ciertos puntos de la secuencia el SE puede hacerpreguntas adicionales al usuario, para poder determinar la operacinms apropiada. Una pregunta puede ser: "Tendr el producto usosteraputicos?". Si el usuario a su vez pregunta "por qu?", el sistemaresponder: "Si el producto va a tener uso mdico la protena debetener una pureza de 99.98% y debe estar libre de pirgenos". Cuandoel usuario responde "s" a la pregunta del SE., entonces ste decideque la operacin de purificacin de insulina proveniente del reactorenzimtico (en el cual la proinsulina se transform en insulina) debeser una cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC), operaciones/, m de la Figura 2.7.

13. Finalmente se puede mencionar que para la seleccin de lasoperaciones de acabado el sistema toma en cuenta la presentacin delproducto en el mercado, seleccionando para ello las operaciones o, p,

2.4. DISEO 59

( a )

(b )

(c)

(d)

(e )

Fermentador

Cosecha de Clulascon centrifuga de discos

Clulas de E. cot

Rompimiento de Clulascon homogeneizador

Cuerpos de inclusin deTrpE-Met-Proinsulina + desechos

Separacin por Centrifugacincon centrfuga de discos

Cuerpos de inclusin deTrpE-Met-Proinsulina

Solubilizacinen reactor qumico con GuHCI

Solucin deTrpE-Met-Proinsulina

Precipitacinen reactor

Precipitado deTrpE-Met-Proinsulina

Figura 2.7: Diagrama de bloques para el proceso de obtencin de in-sulina humana.


(f)

(g)

(h)

( i )

Concentracin por Centrifugacincon Centrfuga de Discos

iSeparacin Qumica

de Trp-Met-Proinsulinaen Reactor Qumico

\ r

Separacin porUHrafittracin

1r

Secado conEvaporador Centrfugo

i r

Renaturalizacinen Reactor Qumico

\ r

Purificacin enColumna de Intercambio inico

1'2

Concentrado deTrp E -Met-Proinsulina

Proinsulina + TrpE +Metionina

Concentrado deProinsulina cruda

Concentrado deProinsulina cruda

Proinsulina activaen solucin

Proinsulina activa

Figura 2.7: Continuacin...

2.4. DISEO 61

(i)

(n)

(o)

(P)

(q)

Transformacin enReactor Enzimtico

i r

Purificacin > 99 %con HPLC

\ r

Concentracin porUKrafiltran

i r

Cristalizacin enReactor Qumico

i r

Concentracin conCentrfuga de Discos

\ r

Secado conEvaporador instantneo

Insulina

Insulina Pura

Concentradode Insulina

Cristales deInsulina6-Zn2

Pasta cristalina deInsulina6-Zn2

Insulina Humana Recombinate99.9 % de pureza

Figura 2.7: Continuacin...


2.5 SumarioLa seleccin de un proceso de separacin para la obtencin de un pro-ducto biotecnolgico se basa fundamentalmente en el mercado del pro-ducto y en sus especificaciones.

Existen varios mtodos que contribuyen a seleccionar el procesode bioseparacin ptimo, sin embargo el proceso final generalmente esobtenido mediante una combinacin de la teora y la experiencia de quese dispone.

2.6. PROBLEMAS 63

2.6 Problemas2.1.- Desarrollar un diagrama de flujo de un proceso para la obtencinde un producto biotecnolgico.

2.2.- El proceso de obtencin de una enzima consta de cuatro o-peraciones de separacin, cada una de ellas presenta una eficiencia derecuperacin del 80 %. Estime la recuperacin global del proceso.

2.3.- Se cuenta con los siguientes datos para producir insulina re-combinante:

(A) Mercado:

(B) Costos anuales:

(C) Depreciacin:(D) Inversin fija y diferida:(E) Capital de Trabajo:(F) ISR:

Produccin 1,000 kg/ao

ao 1:ao 2-10:

45%

$34,877.00$31,525.00$2,766.00

$30,468.00$2,742.00

Estimar el precio de venta para obtener un Retorno Sobre la In-versin (RSI) de 40%.

Resp. $53,664.00/Kg


2.7 BibliografaBonnerjea, J., Oh, S. y Hoare, M. 1986. Protein purification: The

right step at the right time. Bio/Technology. 4, 954-958.

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Spalding, B. 1991. Downstream processing: Key to slashing produc-tion cost 100 fold. Bio/Technology. 9, 229-240.

Parte II

Remocin de Insolubles yRuptura Celular.

67

Del conjunto de operaciones que integran normalmente un procesode bioseparacin, en esta parte se revisan las relacionadas con la re-mocin de insoluoles y la ruptura celular, que son utilizadas en lasprimeras etapas de recuperacin del producto de acuerdo a las tresprimeras reglas heursticas de la seleccin del proceso de separacin.

En las operaciones de remocin los principales insoluoles que se con-sideran son clulas enteras, restos celulares y cuerpos de inclusin. Parala remocin de insoluoles de un caldo pueden ser utilizados diversostipos de equipos; la seleccin depende de varios factores como el tipode clula, la disponibilidad de equipos, eficiencias y costos.

Las operaciones tpicas de remocin de insolubles son la filtracintradicional, muy utilizada para la separacin de hongos filamentosos; yla centrifugacin, empleada en la separacin de levaduras, bacterias yclulas de mamferos. Estas operaciones se tratan en los captulos 3 y4, respectivamente.

Cuando el producto de inters es intracelular despus que las clulashan sido separadas del caldo es necesario romperlas. En el captulo 5se presentan los principales equipos que se emplean en esta operacina nivel industrial y los principales factores para su diseo.

Captulo 3

Filtracin

3.1 IntroduccinLa filtracin consiste en la separacin de un slido de un fluido poraccin de un medio filtrante y un gradiente de presin.

Normalmente en los procesos biotecnolgicos se utilizan tres tiposde mecanismos de filtracin (Figura 3.1):

- Filtracin de lecho profundo.

- Filtracin con formacin de torta o filtracin convencional.

- Filtracin por membranas (Microfiltracin y Ultrafiltracin).

En la filtracin de lecho profundo los slidos se depositan dentrcdel medio filtrante. En la filtracin con formacin de torta los slido;se depositan sobre el medio filtrante formando una pasta. La filtraciipor membrana se realiza utilizando membranas especiales de tamarude poro muy pequeo, que generalmente operan con flujo paralelo a 1;membrana (cruzado), de tal manera que no hay un depsito de slidosobre la membrana sino una concentracin del caldo.

De los tres mecanismos de filtracin descritos, dos son de partculainters en las bioseparaciones slido-lquido: La filtracin convencioncy la filtracin con membranas.

70 CAPTULOS. FILTRACIN

Suspensin

lilia). Filtracin de lecho profundo

Medio filtrante

Suspensin

b). Filtracin con formacin de torta

f\ Suspensin

c). Filtracin con membrana

> Retenido

MembranaFiltrado

Figura 3.1: Mecanismos de filtracin.

3.2. FUNDAMENTOS 71

El objetivo este captulo es presentar los aspectos fundamentalesde la filtracin convencional y su aplicacin a la filtracin de caldosbiolgicos. La filtracin por membranas se revisa en el captulo 10.

En la seccin 3.2 de este captulo se centra la atencin en los fun-damentos de la filtracin convencional. Los principales equipos que seutilizan en este tipo de filtracin se presentan en la seccin 3.3. Laseccin 3.4 se dedica a presentar los aspectos ms relevantes del diseode filtros convencionales.

3.2 Fundamentos

La filtracin convencional forma parte de un conjunto de operacionesllamadas Bioseparaciones Slido-Lquido (BSL). Para llevar a cabo unproceso de BSL generalmente es necesario seleccionar entre una opera-cin de filtracin y una operacin de sedimentacin (como la centrifu-gacin), y frecuentemente la decisin es instrumentar una combinacinde estos dos tipos de operaciones.

Debido a la naturaleza de los caldos que se manejan en biosepara-ciones, es comn que stos sean pretratados mediante agentes fsicos oqumicos para mejorar su comportamiento en las operaciones de sepa-racin slido-lquido a que van a ser sometidos.

Un aspecto fundamental en el tratamiento de la operacin de fil-tracin es la teora bsica existente, la cual contribuye al diseo, se-leccin y operacin racional de los diferentes equipos de filtracin. Departicular inters es observar como esta teora puede ser utilizada en lafiltracin de caldos biolgicos.

En base a lo anterior, esta seccin se entra en tres aspectos funda-mentales:

La filtracin como parte de los sistemas de BSL.

El pretratamiento de caldos biolgicos.

La teora de la filtracin convencional.


Caldo

lquido

liquido

Figura 3.2: Etapas y mtodos de las BSL. Adaptada de Tiller, 1974.Reproducida con el permiso de Me Graw Hill Inc. . Copyright 1974. Todos los derechosreservados.

3.2.1 La Filtracin corno parte de los Sistemas deBSL

Un proceso de separacin slido-lquido (Figura 3.2) consta general-mente de una o ms etapas (Tiller, 1974 ), entre las que destacan lassiguientes:

- Pretratamiento.

- Concentracin.

- Separacin de slidos.

- Postratamiento.

El pretratamiento mejora las propiedades del caldo para facilitar laseparacin. La concentracin de slidos permite una separacin gruesade slidos que disminuye el volumen a manejar, y puede disminuir los

3.2. FUNDAMENTOS 73

Tabla 3.1: Factores para el diseo y seleccin de procesos de BSL.

Requerimientosdel ProcesoFlujoIntermitente o continuo% SeparacinPostratamientosEsterilidad

Propiedadesdel CaldoTamao de partculadensidadesViscosidadTiempo sedimentacin% SlidosTipo de tortaEspumeoToxicidadLabilidad

Caractersticasdel EquipoCapacidadIntermitente o continuoTamao de partculaConc. mximaCapacidad de lavadoEsterilidadClaridad descarga

costos del proceso global de separacin slido- lquido. La mayor partede los slidos es obtenida en la etapa de separacin . Los slidos re-cuperados pueden requerir un postratamiento de lavado o secado deacuerdo con los requerimientos del proceso.

En el diseo y seleccin del proceso de BSL es necesario considerarvarios factores de orden tcnico que deben conjuntarse para una ade-cuada decisin. En la Tabla 3.1 se presentan algunos de estos factoresagrupados de acuerdo a los requerimientos del proceso, las propiedadesdel caldo y los equipos disponibles.

En general todos los sistemas mecnicos de BSL estn basados endos principios (Svarovsky, 1979) que dan origen a las operaciones de:- Sedimentacin.

- Filtracin.

En el proceso de sedimentacin la separacin se basa en una dife-rencia de densidad entre la fase slida y la fase lquida. Entre mayorsea esta diferencia la separacin es ms fcil. Cuando esto no ocurre,la diferencia puede ser aumentada aparentemente aplicando una fuerzacentrfuga o incrementando la densidad de la partcula por medio deuna coagulacin o una floculacin. Los principales equipos utilizadosen BSL que se basan en el principio de sedimentacin, son los sedimen-tadores por gravedad y las centrfugas.


En la filtracin la separacin se logra utilizando un medio fsico queno permite el paso de slidos a travs del cual el fluido se hace pasarpor medio de un gradiente de presin.

En general los sistemas de sedimentacin son ms baratos y puedenoperar continuamente, pero no recuperan el 100% de los slidos. Sinembargo, an cuando el sedimentador no alcance la separacin deseada,es posible utilizarlo conjuntamente con un filtro como una operacin deconcentracin previa a la de acabado que realiza la filtracin.

En el diseo y seleccin de sistemas para BSL es necesario conside-rar algunos factores de orden prctico que permiten complementar losanlisis que se efectan en cada uno de los captulos de esta parte dellibro, dentro de los cuales se puede destacar los siguientes:

- Varias combinaciones de equipos pueden ser tcnicamente factiblespara lograr una determinada separacin . Sin embargo, tratndo-se de materiales biolgicos el nmero de posibilidades se reduceconsiderablemente.

- El anlisis terico que se dispone de las BSL es limitado, as como elconocimiento de las propiedades bsicas de los medios (porosidad,permeabilidad, tiempo de sedimentacin, etc.), de tal manera queen el diseo y seleccin del equipo las pruebas experimentalesdirectamente con el material, y la experiencia, juegan un papelmuy importante.

- Parte considerable de la informacin, la experiencia y los equipospara pruebas experimentales, est en manos de las compaasfabricantes y/o distribuidoras del equipo.

- La escala de experimentacin vara con el tipo de operacin. Enel diseo de filtros puede ser suficiente los datos obtenidos en ellaboratorio. En el caso de centrfugas es generalmente necesariorealizar pruebas a nivel piloto o a escala industrial.

3.2.2 Pretratamiento de Caldos para BSLLas propiedades de los caldos sujetos a BSL pueden ser mejoradas pormedio de pretratamientos fsicos, qumicos o biolgicos con el objeto de

3.2. FUNDAMENTOS 75

facilitar estas operaciones. A continuacin se describen tres tipos depretratamientos comnmente empleados para caldos biolgicos.

Pretratamiento TrmicoEl calentamiento de los caldos permite reducir su viscosidad, su vo-lumen y romper estructuras gelatinosas que dificultan las operacionesposteriores. En el caso de caldos de clulas recombinantes esta ope-racin es obligada por cuestiones de seguridad ambiental. Por otrolado, esta operacin es de uso limitado cuando se manejan productostermolbiles.

Coagulacin y FloculacinDebido a que los caldos biolgicos sujetos a BSL presentan partculasmuy pequeas (0.5 a 100 /m), los pretratamientos para incrementar eltamao de partcula facilitan su manejo.

Las partculas coloidales (tamao en el rango de una miera) no sedi-mentan fcilmente debido a que por accin de sus cargas superficialesforman suspensiones muy estables llamadas soles, a diferencia de lassuspensiones formadas por partculas de mayor tamao que sedimen-tan con relativa facilidad.

Las soles pueden ser alteradas por medio de agentes qumicos. Enel proceso de coagulacin se emplean electrolitos simples que neutra-lizan las cargas repulsivas superficiales de las clulas o partculas, locual genera fuerzas de atraccin del tipo de London- Van Der Waalsentre ellas, que permiten formar partculas ms grandes y densas. Loselectrolitos ms empleados son derivados de iones polivalentes positivoscomo fierro, aluminio y calcio. La coagulacin tambin puede ser efec-tuada empleando sustancias que varen el pH del caldo y por lo tantola carga superficial de las partculas.

En el proceso de floculacin se utilizan sustancias qumicas sintticasde alto peso molecular llamadas polielectroltos. Estos producen unefecto combinado (Figura 3.3) ya que actan neutralizando las cargassuperficiales de las partculas y provocan su atrapamiento por mediode las redes que forman.

Los polielectroltos pueden ser aninicos, catinicos o neutros. Los


Figura 3.3: Mecanismo de floculacin.

materiales disponibles comercialmente son derivados de la poliacril-amida, polietilenimina y la poliamina.

Es importante sealar que los pretratamientos qumicos son de usolimitado dado que implican la adicin de sustancias al caldo que puedenagregar toxicidad o impurezas a ste.

Uso de Ayudas-Filtro

En las operaciones de filtracin convencional se emplean sustanciasslidas llamadas Ayudas-Filtro (AF). Estas sustancias se adicionan alcaldo antes de la filtracin y/o se utilizan como precubierta del filtro.Los AF actan como adsorbentes de las partculas coloidales mejorandoel tamao de partcula, y mejorando la incompresibilidad y permeabi-lidad de los slidos, de tal manera que se facilite su filtracin.

Los AF mas utilizados son las tierras diatnicas (Rees, 1990) y lasperlitas. Las tierras diatnicas son restos de esqueletos de pequeasplantas acuticas prehistricas que se obtienen de depsitos naturales.Las perlitas se obtienen de vidrios volcnicos que contienen de 2 a 5% deagua, que permite romperlos por accin trmica o de presin, formandoun polvo con caractersticas apropiadas como AF.

3.2. FUNDAMENTOS 77

Con el uso de los AF la filtracin se convierte en una operacin detres pasos:

- Primero se forma una precubierta de AF sobre el medio filtrantehaciendo reciclar sobre ste una lechada de AF.

- Una vez formada la precubierta se inicia la alimentacin del caldoa filtrar, al cual se le agrega continuamente una dosis de AF.Esto permite que las caractersticas de la superficie de filtracinse mantengan uniformes.

- Al final del ciclo la precubierta de AF debe ser removida.

La precubierta de AF permite retardar el taponamiento del filtro,facilita su limpieza, disminuye la cada de presin y produce un filtradode calidad uniforme. La adicin continua de AF al caldo es uno de losmtodos ms efectivos para minimizar los costos de filtracin. La dosisde AF que es necesario agregar continuamente es funcin directa dela concentracin y compresibilidad de los slidos del caldo. Asimismo,entre ms rpido se desee efectuar la filtracin, la dosis necesaria esmayor, ya que para aumentar la velocidad de filtracin se requiere unmayor gradiente de presin, lo que hace necesario aumentar la incom-presibilidad y porosidad del material slido.

Existen diversas marcas comerciales de AF que difieren bsicamenteen el tamao de partcula. Los de partculas ms grandes facilitan lafiltracin pero producen filtrados ms turbios. La seleccin implica uncompromiso entre el flujo deseado y la claridad aceptable.

3.2.3 Teora de la Filtracin,La filtracin convencional (Figura 3.4) puede ser definida como la se-paracin de los slidos de un lquido. Esta se efecta haciendo pasaruna suspensin a travs de un medio permeable que retiene los slidosutilizando un gradiente de presin.

La teora de la filtracin convencional se deriva de los estudios dela mecnica de fluidos en medios porosos. La ecuacin que describeel movimiento de fluidos newtonianos a travs de medios porosos, fueformulada en 1856 por el gelogo Francs D'Arcy. La aplicacin de


4> N

/ iSuspensin

Fuerza impulsoraPresionVaco

O o . 0 * 0

0oo0oo0o0c?o0o0cPlifllllll Medio filtrante

EQUIPO DEFILTRADO

rFiltrado

Figura 3.4: Concepto de filtracin.

esta ecuacin al caso particular donde se desprecian los efectos gravita-cionales (lechos cortos), puede ser escrita como:

v =kAP

V*(3.1)

donde 1 :1Las unidades de los miembros de las ecuaciones se presentan en trminos de

dimensiones fundamentales y entre parntesis cuadrados. Las dimensiones funda-mentales se representan como:

F: Fuerza.

M: Masa.

L: Longitud,: Tiem

85697053-tejeda-bioseparaciones

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