BASES MOLECULARES DE LAS REACCIONES

IHQ CROMOGÉNICAS:

Inmunoperoxidasa e inmunofosfatasaProf. Laura ochoa Martínez.

Cómo se demuestra la reacción Ag-Ac

Con la presencia de una enzima que está activa.

La enzima puede estar conjugada al anticuerpo

primario, al secundario o a la avidina, vale decir

al penúltimo paso de la reacción IHQ.

La actividad enzimática se revela con un sustrato

y un cromógeno.

Marcador enzimático: cromogénica

Enzimas más utilizadas en IHQ.

Peroxidasa de Rábano Picante (Horse Radish

Peroxidase)

Fosfatasa Alcalina intestinal (AP).

Métodos de conjugación de las enzimas

con los sistemas de marcación en IHQ.

La conjugación se lleva a cabo por una unión química covalente.

Se utiliza Glutaraldehido para unir la enzima con otras moléculas.

Enzima--biotina

Enzima--IgG

Enzima--estreptavidina

Enzima--dextrano

Métodos de conjugación de enzimas en

los sistemas de marcación en IHQ.

Unión no covalente.

Utiliza anticuerpos no marcados o moléculas biológicamente adhesivas

para formar complejos enzima—anticuerpo.

PAP

APAAP

ABC

Polímero marcado.

Peroxidasa(HRP, Horse Radish Peroxidase)

Enzima obtenida de la raíz de rábano picante.

Glicoproteína de 40 KD

Actúa a pH 7,6

Es una oxido-reductasa, que cataliza reacciones, bisustrato de carácter de redox.

La cantidad de HRP presente influencia directamente la cantidad de producto coloreado formado. Pero no es estequiométrica.

Tejidos problemáticos…

Células mieloides: mieloperoxidasa

Eritrocitos: seudoperoxidasa

Bloqueo:

H2O2 3% acuoso o en metanol absoluto.

Cromógenos para HRP

3,3’ diaminobenzidina (DAB), precipitado café. (Tratar con Hipoclorito de Sodio o Permanganato de Potasio: compuesto inerte)

3’,5’ tetrametilbenzidina (TMB), precipitado azul (uso limitado, precipitado semisoluble en agua).

3 amino-9-etilcarbazol (AEC), produce un precipitado color rojo, soluble en solventes orgánicos. Novared (VectorLabs.). Sensible a la luz.

4-cloro-1-naftol, produce un precipitado azul negruzco. Difunde (no recomendable para IHQ).

HRP

Ventajas

Gran estabilidad.

Fácil de conjugar con otras

moléculas ((Ig, AV, etc.)

Facilidad para detectarla por

métodos colorimétricos.

Rapidez de la reacción.

Posee variados sustratos.

Preparaciones permanentes.

Gran utilidad en la IHQ

ultraestructural.

Desventajas

La actividad peroxidasa está

presente en muchas esta

células.

Requiere bloqueo de la

peroxidasa endógena.

Su actividad se mantiene

después de la fijación.

Fosfatasa Alcalina.

Enzima hidrolítica, que cataliza la hidrólisis de ésteres de ácido

fosfórico.

PM de 100 Kd.

Actúa a un pH óptimo de 8.

La AP intestinal de origen bovino es la más comúnmente usada.

El principal sustrato de la AP es la sal de Sodio monobásica α-

naftil fosfato.

Visualización de la Fosfatasa Alcalina.

Fosfatasa Alcalina.

Tejidos problemáticos:

Hueso

Riñón

Hígado

Es más abundante en tejidos frescos.

Bloqueo:

Levamisol 1 a 5 mM

Bloqueo de fosfatasa alcalina intestinal: solución de ácido débilácido

débil

Procedimientos esenciales:

Bloqueos:

• Boqueo de la peroxidasa endógena luego de la desparafinación.

• Bloqueo de receptores para Fc de Igs: 1% suero normal (antes del Ac primario)

• Bloqueo de receptores endógenos para Avidina y Biotina.

Recuperación antigénica:

• Mediante uso de calor y buffer adecuado (antigen retrival).

• Métodos enzimáticos.

Controles de la reacción.

- Control anticuerpo primario de conejo:

Se reemplaza el anticuerpo primario por suero normal de conejo diluido como el primario y se continúa el procedimiento.

- Control anticuerpo secundario de cabra:

No se usa anticuerpo primario, se lo reemplaza por suero normal de cabra diluido % y se continúa el secundario y el resto del procedimiento.

- Control del revelado:

Sólo se incuba con PBS en reemplazo del suero primario y del secundario, y se continúa el procedimiento

- Controles de “especificidad” de la reacción:

Usar tejidos controles positivos y negativos