IX DOKUZUNCU BLM REKOMBINANT DNA TEKNOLOJS1970 ortalarnda molekler genetik alan sadece genetikiler iin deil tplar bitkisel retimciler; hayvansal retimciler yatrmclar genel olarak kamu iin olduka nemli gelimelere maruz kalmtr. Tplar bakmndan yeni hastalk tedavi stratejleri hizmete sunulmutur. Bitkisel retimciler iin verimi arttrlm bitkiler retilmitir. Hayvansal retimciler iin evcil hayvanlarda verim arttrlmas sz konusu olmutur. Genetikiler ve Molekler biyologlar gen faaliyetleri ve kontrol iin yeni grler oluturmulardr. DNA ile ilgili ilemler onun izolasyonu, oaltlmas dizili srasnn analizi belli yabanc DNA nn plazmid ya da faj gibi tayc (=vektr) aracl ile prokoryot ya da eukoryot konuku hcreye sokulmas ve faaliyetinin temini (yani transkripsiyon ve translasyon srecinden sonra proteine dnme eklinde gruplanabilir. Yaygn kullanlan konuku hcre E.colidir Yabanc DNA oaltlp saflatrlr ve DNA dizili sras belirlenir. Yabanc DNAnn gen rn byk llerde protein olarak retilmek suretiyle saladnda ilem tamamlanm olur. Bu yeni teknoloji Gen klonlama, Rekombinant DNA teknolojisi, Genetik Mhendislii gibi eitli adlarda ifade edilir. Bu bakmdan rekombnant DNA teknolojs dogal olarak br arada bulunmas mumkun olmayan DNA molekullernn yapay yolla br araya getrlmes(kombne edlmesdir).bu teknoloj 7 temel safay ierir 1. Doku yada hucrelerden DNA zole edlmes 2. Bu DNA molekullernn RE (Restriksyon Endonkleozlar) denlen ozel enzmlerle eklenp aktarlablecek ierikde kesilmesi 3. RE le ilem grm DNA molekullernn vektor ad verlen tayc molekuller yklenmesi 4. Vektor ve tasdg molekul(Bu brlktelk art rekombnant DNA molekuludur) un faalyet gostereceg konak hcreye nakl 5. Konak hucre ve kend genomu ogalrken bu arada aktarlan DNA da ogalacagndan DNA molekulunun klonlanmasnn saglans. 6. Klonlanms DNA nn konak hucreden zole edlp ncelenmes 7. Klonlanms DNA nn gen rnnn elde edilmesi yani klonlanm DNA transripsiyona ugrayabiilir mRNAs translasyona ynlendirilebilir gen rn izole edebilir ve aratrma, ticari maksat iin kullanlr. Bu basmaklarn her biri ayr balk altnda bundan sonraki ksmlar da sunulacaktr.

286

ekil 1. Rekombinant DNA tekniinin zeti. nce bir hibrit vektr oluturulur. Bu vektr ierisinde kalan yabanc DNAy da ierir. Vektr konuku organizmaya sokulur. Konukunun replikasyonu ile yabanc DNA da oalr. Eer gen faaliyeti salanrsa, bu genin rn ok miktarda elde edilmi olur. (Robert H.Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.)

REKOMBNANT DNA TEKNOLOJISININ ARALARI Restriksiyon Endonkleaz Enzimleri 1978de Fzyoloji Tp Nobel dl W.Arben ,H.Smth ,D.Nathannn Restiriksyon endonkleaz enzimleri hakkndaki almalarndan dolay verilmitir. Bu oluumlar bakterinin sahip olduu yabanc DNAlar yok eden enzimlerdir. Normaldeki ilevi bakteri hcresini igal eden igalci virslerin DNAsn nkleotd zincirini sadece belli baz zel yerlerden tanyarak kesmektedir. Bu zel tanma yerlerine Restriksiyon (snrlama=kesme)blgeleri ad verilir. Bu yerler DNA molekl zerinde

287

bulunan ve genellikle 4-8 baz ifti uzunlukta yerlerdir. Bu enzimlerin faaliyeti sonucu DNA bu yerlerden kopar. Balangta bu enzimlere Restriksiyon enzim ad verilmesinin ana sebebi udur. Fajlar baz bakterilerde yaayabilirlerken farkl restrksyon enzimlere sahip baka bakterilerde de yaayabilememektedir. Bu yzden bakteri soylar arasnda faj infeksiyonu bakmndan snrllk vardr. tip Restrksyon enzimi bilinmektedir. Bu gruplama enzimi (DNA) daki kestii blgenin yapsna ve enzim yapsna gredir. 1.ve 3.tip Restriksiyon enzimleri gen klonlamada kullanlmaz. nk bunlar DNAy tanma blgeleri dnda keser ve kesim yeri tesadf olup nceden tahmin edilmeyen bir yerde kesim yapar, oysa 2. Tip Restrksyon enzimi ise belli zel yerlerden keser. Ayrca kesim yerleri belli bir simetri gsterir. Mesela (Bam I )isimli ikinci tip enzim [5-GGA/TTC3] [3-CCT/AGG-5] blgesinde kesim yapar. Eer okuma dey yaplrsa merkezden alttaki zincirin AGGs ile (soldan saa okunur) ve stteki zincirin GGAs sadan sola okununca (AGG) ayndr. Byle bir tersinir elenik yapya POLINDROM ( polndrom yunanca polndrom =geriye kesmek demektir) denir. Her iki ynde okunuu ayn olan yaplar tanmlar.Mesala (1238321) her iki ynde de ayndr. Aadaki ekilde byle iki tip Restrksyon Enzimi (RE) verilmitir. Hemen hemen (100) u akn 2. Tip R.E.bilinir. Konuku hcreler kendi DNA larn bu enzim yerlerine sahip olmamalar yansra kend (DNA) sn bu blgelerde metilletirme nedeniyle korurlar.

ekil 2. Deiik Restriksiyon Endonkleaz ile yaplan dizili sralar. Pu Purinleri, Py purimidinleri gstersin. Oklarn yerleri Endonkleazlarn DNA kesim yerlerini gsterir. 1971 ylnda K.Danna ve D.Nathan Restriksiyon Endonkleazlarn DNAy hemen hemen ayn boyutlarda paralara bldkleri,Enzim aksiyonunun tekrarlanabilirlii ve kesinlii bunlar ilerde yaplacak aratrmalar iin faydal klacag gorusu ifade edilmitir..Aslnda Btn resriksiyon endonkleazlar 3 ve 5 ular retmez, bazlar kr ular retir.(Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.)

288

ekil 3. Sitozine Metilaz enzimi yardm ile Metil grubu katlmas sonucunda 5-Metilsitozine dnr. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndanmodifiye edilerek alnmtr.)

ekil 4. Konuku DNA (Hpa II ) Restriksiyon yerinde metilleme ile kendi DNA sn R.E. den korur . Yldzlar sitozindeki Metil grubunu gsterirler. (DNA) Replikasyonundan sonra DNA yarm metillenir. Yeni kol metile sahip deildir. Yarm metillenmi DNA, daha sonra hcre enzimlerle metillenir. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill),isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.)

289

Endonkleazlarn hcumuna maruz kalan ayn dizili sras metillemi durumda ise metillenmemie nazaran korunmu haldedir. Yani enzim etki yapamaz. Konuku (DNA) oalmasndan sonra yeni ift sarmal hemimetil (yarm metilli) konumdadr. Yani eski kol metilli yeni kol metilsizdir. Byle bir durumda yeni kol kolayca metillenebilir. Hangi kolda olursa olsun metil iermeyen yabanc DNA lar .RE lerce parcalanablr, Restriksiyon enzimleri izole edildii canlya gre isimlendirilir. Mesela Bam HI isimli enzim Bacillius amlio Liqufeciens (H) soyundan elde edilmitir. Eco R1 ise E.col (RY-13) soyundan elde edilmitir. Hind II ise Haemophylus influence (Rd) soyundan Bgl 1 ise bacillus grobigiden elde edilir. Bunlarn genel adlar Restrksyon enzimleridir. (R.E)ler DNAy iki biimde keser.Mesela Hnd II ve tanma blgeleri iki zincirde ayn hizada olup kesimden sonra (DNA)nn iki kt u oluur. Bu durum ekildede gsterilmitir. Ayn ekilde mesela Bam HIn kesikleri yapkan u olarak adlandrlr(5u asl durur.)Bu durumda kendiliinden komplementer bazlarla hidrojen balar ile yeniden eklenebilir. Byle yapkan ularn byle yeniden eklenme (Reanneaal) yetenei S.Cohen,L.. Boyer ve ark.ca 1971de ortaya konmutur. VEKTRLER KLONLANACAK DNA PARALARI Tama Srecinde Kullanlan Tayclardr Vektr molekllerin kunukudan kolay izole edilebilen kendi ve tad DNA molekln bamsz replike edebilen, sadece bir (RE) ile krlma (kesilme) blgesi oluturabilen bu surette tanacak (DNA) parasnda ayn enzimle kesilerek ekleme salanabilecek nitelikte olmaldr. Vektr moleklleri zerinde antibiyotik diren gen gibi bir iaretleyici tamaldr. Bu surette vektr tayan ve tamayan hcrelerin ayrm mmkn olur. Mevcut teknolojilerde in vitro olarak eitli kaynaklardan gelen DNAlarn birbirine eklenmesi mmkndr. ekilde bu durum gsterilmitir. Halka DNA molekl zel(R.E.)lerle kesilir. Bylece yeniden halkalar balanr. Eer farkl molekller ayn serbest ulara sahipse bunlar kaynaarak hibrit molekl oluur.Burada DNA ligaz enzimi molekllerin eklenmesinde kullanlr.Oneml br prokaryotk vektor plazmddr.Bir konak hucreye br plazmd grmesne karsn kendn br hucrede bnlerce kez bulunacak seklde ogaltr PROKARYOTK VEKTRLER Prokaryotlarda Plazmid vektor yansra LAMBDA ve M 13 BAKTERYOFAJ VEKTORLER, COZMIT ve MEKIK vektorler. Bakter yapay kromozomlar, bulunur . EUKARYOTLARDA se MAYA PLAZMITLERI ILE olusturulan vektorler, MAYA YAPAY KROMOZOMLARI kullanlablr. Prokaryotlarda konukcu hucre olarak E.Col hucreler Eukaryotlarda se bitkiler iin A.Tumofacens le nfekte olmus btk hucreler, hayvanlar cn se Esey yada yumurta hucreler kullanlr. Sz edilen vektrler aktarlacak materyalin byklne gre seilir.

290

ekil 5. Halka plazmid DNAs EcoRI aracl ile tannr. DNA endonkleaz ile kesildikten sonra ayni ileme maruz kalm olan ve halkalanarak yada ayn restriksiyon enzimleri ile kesilen iki yada daha fazla,daha dorusal moleklleri birletirir. Bunun sonucunda elde edilen aklklar DNA ligaz ile kapatlr.S.Cohen, H.Boyer ve arkadalar bu teknik ile 1971de ilk kez plazmidleri eklemilerdir. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (SixthEdition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.)

ekil 5.a. Rekombinant DNA almalarnn ilem basamaklar(Robert H. Tamarinin Principles ofGenetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.)

291

ekil 6. Rekombinant plazmidin ekillenmesi. Ayn restriksiyon enzimleri kullanlarak bu rnek de olduu gibi EcoRI kullanlarak hem konuku hemde yerleik DNA keslr. Ayn anda kesilen uclar biraraya getirilerek yabanc DNA araya sokulmu plazmid oluturulur. Ligaz enzimi ile aklklar kapatlr. P.Berg, SV40 virsnn genomunu fajna sokarken yabanc DNAy klonlayan ilk bilim adamdr. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (SixthEdition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.)

292

Ekleme ileminde yer alan bir DNA paras plazmid olabilir. Plazmidler bakteri hcresinde yer alan bamsz oalabilen DNA parasdr. Rekombinant plazmid molekl oluturulup hcreye eklenebilir. Rekombinant plazmid de Hibrit plazmid, hibrit tayc (vektr) yada Kimerik plazmid adda verilebilir Rekombinant plazmidin konukuya konulmas iin eitli metodlar vardr. Mesela bakteri hcresi bu yap iin geirgen (permeable) klnr. Bu ilem Kalsiyum kloritin seyreltilmi solsyonu katlarak salanr. Bu ilem salandnda hcre ii plazmid DNA oalrken aktarlan DNAdada oalma gerekleir. Konuku hcre iine yabanc DNA katlma ileminde,kesme(ekleme) yerlerinde kovalent baglar olumadndan bu ilem Ligaz enzm le saglanr.Ayrca plazmdn aktarldg hucredek varlgnn saptanablmes cn antbyotk drenc genler gb ozel tanma unsurlarda plazmde eklenr. M 13 faj lar da tek kollu DNA ieren faj lar olup vektor slevi grebilirler RESTRKSYON ENZMLER LE KLONLAMA Prokaryotlarda vektor olarak aktarlacak molekulun buyuklugune gore plazmd ,cozmt,faj.bakter yapay kromozomu mekk vektor gb tasiyici unsurlar kullanlablr. Farkl kaynaklardan gelen DNAlarn klonlanmasnda eitli koullar vardr.nce plazmid aygt (R.E)lerle bir noktadan kesilir. Eer birden fazla yerde kesim olursa deneme srasnda molekl paralanr. Lamda fajlarndan treyen Charon fajlarnda genomlarnn orta de birlik ksm faj iin cok gerekl bolge degldr Eco R I yardm le aktarlacak yabanc DNA bu de birlik ksma konulablr. Bu yzden Lamda nemli bir tayc aygttr.15000 baz ifti (15 kilo baz 15kb) byklnde faj grevleri iin hayati olmayan ksmn yabanc DNA ile deitirilmi olan lamda faj iyi bir hibrit tayc aygt olarak ilev grebilir. nk fajn bu ksm E.Coli kromozomuna eklenmek iin gereklidir. Bu ksm faj bakteriyi enfekte ettiinde bakteri iinde oalr ve sonuta ekleme blgesi olmakszn hcre lisise olur (patlar). Genetik mhendisleri Lamda zorunlu olmayan blgesi eksik ve Eco R1 kesme blgesi ieren DNA molekl oluturmulardr. Olusturulan recombnant molekuller ya yuksek verml transfecton meteodu ile konak bakteriye transfer edilir yada nfektif faj bcmnde infeksiyon ile aktarm saglanr. Normal E.Coli plazmiti ile klonlamada yabanc DNA (15kb) dan daha byk bir ekilde ok byk olduunda duraan yap kaybolmaktadr. Bu dezavantaj yan buyuk molekullerle alsma gerektgnde olusan zorluk lamda fajlar ile gderelr Yani byk kromozomal segmentler klonlandnda plazmid oaldka plazmid klonu baz ksmlarn kaybetme eilimde olmaktadr. Balca bu nedenle genetikiler Lamda fajn tayc olarak kullanmlardr. Bu fajlar (24 kb)lk byklkleride baaryla tarlar.Faj kromozomlar yaklak (50kb) DNA ierir. Faj ba ksm iinde Lineer biimde hcre iinde halka formundadr. Faj ban dolduran DNA infeksiyon esnasnda tannr.

293

nk her iki ucunda bir kollu kk bir segment vardr. Bu ular Cos yeri olarak anlr. Cos terimi cohesive u (Co hesive Ends) kavramn ierir. Cos yeri (12) bazlk uzunluktadr. Cos yerinin yeniden eklenmesi Lamda kromozomlarnn konukuya girdiinde halka yap almasna neden olur. DNAy (Cos) yerinden kesince halka alr,Lineer molekl oluur.Genetikiler (Cos) yerinin bu avantajn kullanarak (24 kb) dan daha uzun segmentleri bile klonlayabilir. Birok Eukaryotik genler intronlar ve transkripsiyon kontrol segmentleri nedeniyle daha uzundur. Eer (CoS) segmentleri her iki ucu plazmid orijinli (DNA)ya eklenmi ise oalma ilemi seii antibiyotik genlerle salanarak (50 kb) kadar DNAyla klonlaabilir. Bu cos yeri ieren plazmidlere cosmid ad verilir. Bu nedenle bu molekller lambda kromozomunun cos ksm le bakteryel plazmdn melez hbrt molekullerdr. Bu cosmidler byk DNAlar klonlamak yansra DNAs byk segmentlerin seiminde kullanlr. Kosmidler lambda fajnn faj protein klfna paketlenmesi iin gerekli (cos) yeri ile plazmid replikasyonu iin gerekli dizileri ve antibiyotik diren genleri ierir. nk kk cosmidler faj bana birleemez. Bylece 2.5-50 kb uzunlua kadar yabanc (DNA)lar plazmidleri choron fajlar yada cosmidler kullanarak klonlanr. Bira mayasnda milyon baz uzunlua kadar yabanc DNAy klonlamakta mmkn olmutur.

ekil 7. Bir kozmidin grn :Kosmdler (cos) ad verilen blgeler ieren plazmid olup lambda faj balarnda bakteriye aktarlr.nfeksiyon srecinde etkili bir metoddur. (cos) yerleri tek kollu olup konuku iinde kaynaarak halka formuna evrilir.(Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.)

294

HBRT VEKTRLER N SEM Yukardaki aklamalarda aklanan metotda (R.E)lerin ayr ayr hem vektr hem yabanc (DNA)y kesmesi sz konusudur. Daha sonra bu iki unsur ligazn mevcut olduu ortamda kartrlr. Neticede birok rn meydana gelir. Bu rnler guruba ayrlr. Yabanc DNAl vektrler, yabanc DNAsz vektrler ve paracklar. Daha sonraki blmlerde vektrdeki zel yabanc (DNA) paralarnn bulunmas incelenecektir. Burada herhangi bir (DNA) paras ieren vektrlerin seilmesi aklanacaktr. Choron fajlar basit olarak E.coli hcrelerini infekte etme kabiliyetlerine gre seilir. Bilindii gibi Lamda virs ba ksmnda paketlenme iin gerekli byklk ihtiyac yznden sadece Lamda faj DNAs ve yabanc DNA birlikte paketlenebilir. Bu yzden yabanc DNA ieren plasmid antibiyotik dayankllk zelliinin incelenmesi ile ayrt edilebilir. Mesela yaygn olarak kullanlan PBR 322 plasmid bu maksatla kullanlabilir. Plasmitler ilk inceleyenlerin isimlerini ba harfleri ile incelenir. Buna gre bu plasmid (P) F.Bolivar (B) ve R.Rodriges (R ) tarafndan incelenmi ve (1977)de bu konu ile ilgili yayn yaplmtr. Bu plasmidin Tetrasikline ve Ampisiline dayankllk genleri bulunur. Ayrca bu plasmid de eitli enzim kesme yerleri bulunur. Mesela Tetrasiklin dayankllk geni iinde (Bam H) enzimi kesim yeride bulunur. Ligasyon ilemi sonucunda yabanc (DNA) bulunduran ve bulundurmayan plasmidler oluacaktr. E.Coli hcrelerinin kalsiyum kloritli ortamda bu (DNA) karm ile birliktelii salandnda antibiyotik iermeyen ortamda DNA y iine alm E.Coli hcreleri elde edilmi olacaktr. Daha sonra bu ortama ilikin plakalardan Replika yntemi ile bir veya iki antibiyotiin ikisini yada birini ieren ortamlara nakil kopya alnr. Her iki antibiyotie dayankl kolonilerdeki hcreler yabanc DNA iermeyen plazmidli hcrelerden olumu olmaldr. Sadece Ampiciline dayankl koloniler ise yabanc DNA ieren plazmidli hcrelere ait olacaktr. Her bir antibiyotie dayankl olmayanlar ise plazmid iermeyen hcreleri temsil eder.

295

ekil 8. E.coli PBR 322 plazmidleri. Bu plazmidi (amp ) ve (tet ) sembolleri ile belrlenen amplisilin ve tetrasiline dayankllk, danda sorumlu iki gen yeri tar. (tet ) geni iinde (BamHI) kesici enzim yeri vardr.(tet ) geni iinde clonlanm paralar tetrasiline dayankll ortadan kaldrr.(Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.)

KR ULU EKLENME Kr ya da kt ulu ekleme (Blunt end ligasyon) ad verilen yntem (R:E) ile muamelenin klonlamada uygun olmad hallerde kullanlr.(R:E) ile kesme ilemi le klonlamann mumkun olamadg mesela kesim yerlernn istenen genin ortasnda oldugu durumlarda gerek duyulan yontem se Kor uclu ekleme(blunt end lgaton) yontemdr. Yabanc DNA nn fiziksel krlma gibi metotlarda elde edildii durumlarda da eitli clonlama metotlar bulunur. Bu metotlardan en populer olan kr uclu ekleme (blunt-end-ligasyon) denir. Bu metotta da yabanc DNA nn tayc aygtla eklenmesinin salanmas sz konusudur. Ancak birbirine bal olmak dolaysyla gerek ular (sticky ends) yada yapkan ular bulunmayan molekllerin birbirine eklenmesi sz konusudur. Mesela faj enzimi olan T4 DNA ligaz isimli enzim kr ulu DNA lar ekler. Kr ular DNA segmentleri klonlanaca zaman fiziksel olarak DNA larn krlmas ile Hnd III gibi kr u oluturan (R.E) ler ile salana bilir. Ligaz hangi kr ucun ekleneceine gre zel olmadndan bunun ilemi sonucunda birok istenmeyen rn neticeleri oluabilir.296

(R.E) leri kullanarak klonlama yapmada yapkan ular metodu tercih edilir. Kr ulu ligasyonun deiik halinde balayclar, eklemler (linker) kullanlmaktadr. Bunlar ksa yapay sentezlenmi DNA paralar olup (R:E) tanma yerleri ierirler. Bu balayclar DNA kr ularna eklenir uygun (RE) lerle muamele edilirse yapkan ular oluur. Bu durum ekil (9) da gsterilmitir. ekildeki balayclar ortasnda Eco R1 yeri olan 12 Baz ifti (Base pair=bp) uzunluktadr.Bunlar klonlanacak DNA ya (T4 DNA) ligazla beraber eklenir.Daha sonraki (EcoR 1) ile muamele (Eco 1) yapkan ular oluumuna yol aar.

ekil 9. Balayclar. Kk i Restriksiyon kesim yerlerine sahip ksa DNA segmentleridir. Bunlar T4 DNA Ligaz enzimi aracl ile kr ulu DNAlara katlabilir. Restriksiyon enzimleri ile muamele sonucu, ayn restriksiyon enzimi ile kesilmi her hangi bir (DNA) ile rekabet edebilen (DNA) larn olumasna yol aar.(Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.)

KLONLANACAK (DNA) LAR K EKLDE ELDE EDLR. 1. Arzu edilen gen ya da (DNA) sentezlenir veya direk yada (mRNA) dan tersinir kopyalama ile izole edilir. 2. Organizmann genomu ansa bal kk paralara blnr Bu ikinci usule tfek samas benzeri anlamna (shot gun) rastgele at klonlama denir. Sonra istenen (DNA) segmenti oluturulan eitli klonlar arasndan yakalanr(seilir). imdi klonlamadan nce istenen genin izole edilmesi ya da sentezlenmesi sonrada klonlamadan sonra istenen genin yerletirilmesini inceleyelim

297

1. BELRL BR GENN KLONLANMASI 1.1.Klonlanacak DNA nn oluturulmas. Belli bir geni ya da DNA parasnn klonlanmasndan nce ilgili geni ieren ift kollu (DNA) parasnn saflam halde mevcut olmas gerekir.(DNA) elde etmek iin eitli yollar vardr. eitli glk iermeyen oluumlar bir kollu (m RNA) elde edip onu ift kollu DNA ya evirmek byle bir usuldr. Bu durumda sorun istenen m RNA y elde etmektir. Belli bir zel gen iin m RNA zel genin niteliine gre elde edilebilir. Eer belli bir zel hcrede ok miktarda RNA mevcut ise direk olarak izole edilir. Mesela mevcut hayvanlarn eritrositlerinde (alfa) ve (beta) globulin mRNA si bolca bulunur. Ayrca Ribozomal RNA ve birok t RNA y uygun bir klonlama iin bolca ve kolayca elde etmek mmkndr. RNA tmr viruslarndan elde edilen tersinir kopyalanma (Reverse transcription) yardm ile saflam (RNA) dan klonlanacak ift kollu (DNA) elde edilebilir. Burada (3 poly-A) kuyruuna sahip Eukaryotlardan elde edilen m-RNA kullanlarak (RNA) nn (DNA) ya dnm aklanacaktr. ekil 10. (a) mRNA enzimi iki kollu DNAya evrilerek revers transkriptise kullanlarak klonlama yaplr. (b)Eukaryotik RNAnn Poly-A ucuna komplementer (PolyT)segmenti katlr. (c)RNA ablonundan bir primerin dizili sras kullanlarak DNA sentezlenmesi iin Revers Transkriptize kullanlr. NaOH kullanlarak RNA uzaklatrlr. U eklinde DNA genellikle sa tokas lopu Kvrlan lobu oluturur. Bu yapya DNA polimeraz 1 iin primer yeri de denir. Bundan ift kollu DNA oluur. (d-e) S1 Nkleaz enzimi sa tokasn uzaklatrr. (f) Sonuta komplementer DNA (cDNA) oluur. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.)

298

ekil (10)da grld gibi nce Poly-T, ad verilen primer kendine uygun Poly-Al kuyrua sahip m-RNA ya katlr. Bu eit ift kollu blgeler serbest [3-OH] ierdiinden polimeraz aktivitesi iin primer olarak balama unsuru olarak ilem grr. Bilindii gibi primer terimi (DNA) replikasyonunda (3-5)ci istikamete tek kollu olarak devam eden ift kollu ksa (DNA) parasn tanmlar. Daha sonra primer (RNA) tersinir kopyalama muamele edildii zaman ,(RNA)y kalp olarak kullanarak (DNA) nkleotidleri polimerize eder(Bir araya getirir yani zincir haline getirir).Sonuta (DNA-RNA) hibrid moleklleri oluur. Daha sonra m-RNAnn uzaklatrlmas iin (NAOH) ile muamele salanr. Bu unsur DNAy etkilemez. RNA uzaklatrldktan sonra DNAnn (3)ucu genellikle dier uca katlanr ve sa tokas biiminde lop oluturur. Meydana gelen ift kollu DNAya komplementer DNA (c DNA)ad verilir. Burada tek kollu m-RNAdan balanarak ift kollu DNA retilmitir. Bu (DNA) kr ulu ekleme metodu ile klonlanabilir. Eer (RNA) ok miktarda ortamda mevcut deilse eer belli bir gene ilikin proteinin aminoasit dizili sras biliniyorsa invitro olarak (DNA) sentezlenebilir. Bir genin protein unsuru yardmyla aminoasit dizili sras buna ilikin muhtemel nkleotid dizili sras ise kod szlnden elde edilir. Bu metod genetik kodda okluk (ayn aminoasidin birden ok kodla belirlenmesi) olduundan orjinal DNA tam yeniden oluumu salanmayabilir. Dier bir deile bir proteinde yer alan Leucinne ilikin (6) farkl kodon vardr. Btn bunlara ramen yeni tahmin her zaman gereklememekle birlikte belli bir protein kodlayan (DNA) sentezlenebilir. Gnmzde ekil (11)deki gibi her zaman birimde bir (baz) (100) baz uzunlukta DNA sentezleyicisi makineler gelitirilmitir. Aklanan bu metod ile genetik kod szln kullanarak komplementer, btnler (cDNA) yada sentetik DNA yapm da genin promotor blgesi ve (DNA) Protein evrimine urayan ksm (intron) Transkripsiyon Kontrol sralar gibi ksmlar eksik kalaca hususu aklda tutulmaldr. Eer bir geni promotor ve intronlar ile birlikte klonlamak istiyorsak klonlanan genomun tesadfi seilmi paralarn oluturduktan sonra yaplmas gerekir. lgi duyulan gen klonlamadan nce yada sonra bulunabilir. mRNA araclg le elde edlen cDNA eitli ekillerde kullanlablr.Soz gelimi uclarna ift zncrl ksa RE tanma yerler ceren DNAlar taklarak ardndan RE le kesp yapskan uclar olusturarak bell baz teknklerle faj yada plazmide aktarlarak klonlanr.Sadece bell br hucre tpnde(embroda.yada dokuda) aktf olan aktf olan dzler(mRNA) iceren kolleksyona cDNA kutuphanes denr. Bu term GENOMIK KUTUPHANEDEN farkldr. unku cDNA sadece o safada o hucrede mevcut mRNA larn karslg olan DNAlar ierir. Dger br deysle cDNA genomda yeralan DNA nn dzeneleyici bolgelerni Transkrpsyona ugramayan bolgeler ni iermez. Genomk DNA genomdak tum dzlerden enaz br kopya ieren klonlanm DNA kolleksyonudur.

299

nsan genomunu klonlamak cn faj vektoru kullanlrsa 4-5 milyon faj vektoru gerekr. Genomun br parcasndan ornegn tek kromozomdan olusan kutuphaneler kromozom-ozgul kutuphane dye adlandrlr. Br genomk kutuphane yuzbnler varan klon iereblir.

ekil 11. lk otomatize edilmi dng ile solid fazdaki DNA sentezi.Birinci nkleotid silica n maddesine (substrata)balanr.kinci nkleotid (aDMT=Dimetoksitrily) trevi ilk nkleotidle fosfodiester ba oluturur.DMT ikinci nkleotidin (5) ucunu korur.DMT uzaklatrlmadndan nkleotid katlamaz.DMT uzaklatrldktan sonra dinkleotid yeni dngye hazr hale gelir.(R1) ve (R2) koruyucu gruplar sre tamamlandnda uzaklatrlr.Ve oligonkleotidler silica n maddesinden ayrlr. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.) Promotor terimi (RNA) polimerazn transkripsiyon balatmak zere (DNA)da baland yeri tanmlar. ntron terimi ise (DNA) iinde transcribe olan fakat translasyondan nce uzaklatrlan ksmlar tanmlar.

300

GENOM KTPHANES OLUTURMA C-DNA veya sentetik DNA ile ilgili klonlama alsmalarnda genomun tumu buyukluk nedenyle kullanlmas mmkn olmadnda, organizmann toplam DNAs daha kk paralara blnr. Bu kk paralardan da arzu edilen gen yada DNA paralar izole edilir. Bir genomik kutuplarda genomdaki tm dizilerden en az bir kopya iereek ekilde hcrelerden DNA drstirileri (Rejler ile kesilir para vektrlere taklr. Her vektr sadece birka bin baz DNA iierir. Arzu edilen gen klonlamadan nce yada sonra elde edilebilir.Byle (DNA) genomik DNA olarak adlandrlr ve c(DNA)dan farkldr. Eer (DNA) klonlamadan nce elde edilmi ise o zaman sadece ihtiya duyulan DNA klonlanr. Dier bir yolda tfek samas benzeri (shotgun) ad verilen yaklam kullanmaktadr. Bu usulde genomunun bir rnei (kk para) kullanlarak klonlama yaplr.Bylece bir trn orjinal genomunun klonlanm paralarnn seti elde edilmi olur. Bu sete genom ktphanesi denir(ekil.12). cDNA kutuphanes tum gernomu degl sadece mRNA lar karslg olan DNA larn kutuphanesidir. O yzden (cDNA) ktphaneside denir.

ekil 12. Rastgele at(Tfek samas ats) yaklamn kullanarak oluturulmu,araya sokulmu unsurlar kullanarak Genomik ktphane oluturulur.Genom ksmlarna paralanr.Paracklar daha sonra vektrlerde ansa bal biimde klonlanr.Bu vektrlerin toplam genomik ktphanesi adyla bilinir. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.)301

Genom ktphanesi olgusunda arzu edilen gen klonlandktan sonra kutuphaneye yerletirilmi olur. SOUTHERN BLOTTING Genellikle Endonkleaz enzm le Sindirim aracl ile tesadf olarak retilen DNA segmentleri sz konusu ise bunlarn cnden arzu edilen genin yerini belirlemeye gerek vardr. Daha nce belirtildii gibi klonlamadan nce yada sonra gen aranabilir. nce (DNA)daki zel bir genin yerini (DNA) klonlamadan nce nasl olduunu inceleyelim DNA paralarnn ortasndaki zel bir genin yerini anlamak iin nce zel sonda (probe) ihtiya duyulur.Klonlanan genn karakterzasyonu,pekok DNA parcalar cnde stenlen parcanon varlgn gosterme,ilgili genn farkl turlerde karslgn bulma, gb slemler cn SOUTHERN BLOTLAMA yaplr Sondalar genellikle nkleik asid yapsnda olup dizili sras hibridizasyon sonucu ile varlg arastrlan hedef molekule(c-DNA)ya butunler olan ona uyan dizili srasn tanmlar. Sondalar daha sonra otoradyografi ile yada cemilmunuskent teknikler ile (ultraviyole yada laser nlar altnda varlklarn ortaya koyan iaretlerdir)iaretlerinden dolay belrlenebilmektedir. Eer mesela globin geninin yerini belirlemek istiyorsak radyoaktif olarak iaretlenmi globin mRNA yada aktif iaretlenmi cDNA kullanmamz gerekir. RNA-DNA yada DNA-DNA hibritleri zel gen ile radyoaktif sonda arasnda oluacaktr. Otoradyografi yada cemilmunuskent teknii radyoaktif sondann yerini gsterir. Mesela tavan -globin geninin klonlamak istediimizi varsayalm. nce tavan (DNA)snda Restriksiyon enzimleri ile kesintiler oluturmak gerekir. Daha sonra bu kesintiler agaroz jelde elekeroforeze tabi tutulur. Ve bylece byklklerine gre eitli ebatlarda paracklara ayrlr. Agoroz ok eitli byklkte (DNA) paracklarn ayrmak iin iyi bir ortamdr.Bu eit bir kesme ileminde ok sayda fragment sz konusu olup sonuta ok kkden ok bye olmak zere oligonkleotid lekeleri (band yaplar)oluur. Daha ileri ilem iin elekroforez fragmentleri dier ortama transfer edilerek sonda ilemi yrtlr.Bunun icin dogru DNA paralarnn agoroz jelden da dogru ntro seluloz fltreye dfze olmas salanr. Nitroselloz filtre yada naylon membranlar hibridizasyonda en iyi neticeyi verir.

302

ekil 13. Southern blotting tekniini kullanarak bir (DNA) Kitlesi iinde tavan -globin geninin varlg belirlemitir. Tava DNAs restriksiyon enzimler ile ksmlara ayrlr Agaroz jel ortamnda elektroforez yaplr Southern Blotting yaplr (Bantlar gorulur klmak cn aktarma (DNA) bantlar nitro seluloz filtreye geer. -globin haberci RNA eklindeki radyoaktif sonda -globin geni ieren DNA fregmentinin yerini saptar. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.)

303

Bu teknikte Agoraz jeldeki ift kollu DNA nce genellikle (NaOH) ile tek kollu (DNA)ya denatre edilir. Daha sonra Agoraz jeli filtre paras dikkatlice Nitroselloz filtre altna gelecek ekilde yerletirilir. Neticede Sandvi gibi Agoroz taraf aada slak snger stne gelecek ekilde yerletirilir. Sonra nitroselloz filtre tarafna kuru filtre kd konur. Bylece tpk fitil gibi agorozlardaki (DNA) segmentini tayan ksm Nitroselloz filtreye geirilir.

ekil 14. Southern blotting tekniinde jel ve filtrelerin dzenlenmesi (NaOH) Buffer solsyonu kuru filtre aracl ile yukar ekilir ve DNAy agarose jelden nitro seluloz filtreye transfer eder. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.) Burada (NaOH) tepside yer alarak nakledici solsyon olarak ilem grr.(DNA) kesintili paralar ise stma ilemi ile Nitroselloz filtreye kalc olarak balanr. Filtre zerinde DNA-DNA) hibridizasyonu gereklemi olur. Eer ayn teknik RNA zerinde salanrsa Northern blotting olarak adlandrlr.Northern blotlama belrl br genn farkl hucrelerde,dokuda organzmada transkrpsyon aktvtesn(mRNAlar araclg le) kullanlr . Nkleotid komplementaritesini olgusu iermeyen immunolojik tekniklerde ise proteinler iin sonda kullanlabilir. Bu teknie Western blotting denir. Yani antibodylerin sonda gibi kullanlarak belli bir proteinin aranmas ilemine Western blotting denir. aretlenmi sondalarda eitli ekillerde elde edilebilir. Bu rnekte radyoaktif sonda elde etmek iin en kolay yol tavan retikulositlerinde globin mRNAsn izole etmek ve tersinir kopyalama kullanarak (cDNA) oluturmaktr.

304

Tersinir kopyalamadade kullanlan Dideoksinkleotidler sentezlenirken Radyoaktif Fosfor [32P] ierirler. Bu durum ekil (13)de gsterilmitir. ekilde grld gibi Hibridasyondan sonra bir kollu radyoaktif band globin geni ieren DNA segmentinin yerini gsterir.Doal olarak (mRNA)dan treyen cDNA gende mevcut intronu iermeyecektir. Ancak nkleotid kolunda komplementer kollar olduu srece sondalama baarl olacaktr. globin genini klonlamak iin ekil (13)de kullanlan DNA kesintisi rneini kullanarak ikinci bir Agoroz jel uygulanr. (DNA-DNA) hibridasyonuna maruz braklmayan jel ayn yerde B globin segmentini ierir. Autoradyografi ile yeri bilinen bant agoroz jelden kesilip karlarak (DNA) izole edilir. Bylece bu DNA klonlama teknii ile klonlanr.

DNA SondalarBir Klon ktphanesinden zgl klonlarn seciminde kullanlan mototlar DNA prok kullanm ierir. Bir genomik ktphanede yz binlerce klon vardr. Bir ktphaneden alacak geni elde etmek iin yalnzca ilili geni ierir. Klona yada klonlarn belirlenmesi gelitirilmesi gerekir. Ayrca klonlar genini tutumunun btnn belirledii tesbiti gerekir. DNA gruplar tek zincirli yada cift zincirli molekller olarak hazrlanabilir. Sondaki genellikle radyoaktif polinoleotidlerdir. zgl polipeptidler belirlere de renk, kimyasal reaksiyonlar ieren sondalarda kullanlr. Bu maksatla palazmit ktphanesi taramas sa sz konusu olabilir. Bu ilem iin klonlar tayan bakteriler besleyici plaklarda retilip binlerce koloni oluturular. Koloni bakterileri plakdan nitroseller yapda kagt filitreye mhr replika yntemi ile hafifce bastrlarak filtre zerine aktarlr. Filtredeki kullanlan tek zincirli sonda ile muamele edilerek (DNA-DNA) hibritleri oluturulams salanr. Sonra filitre ykanr balanmam (hibrit oluumu) molekl hibridasyonu olup olmad anlanabilir. Fotorgraf filmi zerine konup sonra sondann radyoaktif olmas yada olmamasna gre film zerinde koyu lekeler yada kimyasal snma le ayr edilir. Bu maksatla Plaka hibridasyonu gibi baka yntemler de kullanlabilir. KLONLANMI GEN N SONDA DOT BLOTTING: Daha nce aklanan metodlar mesela Genom ktphanesi oluturulduktan sonra zaten plasmid iinde klonlanan genlerin yerini belirlemek iinde kullanlabilir. Bu durumda elektroforez ve Southern blotting gerekmeyecektir. nk belli bir kesinti iindeki DNA segmentinin yerinden ziyade zaten klonlanm DNAnn belli zel dizili sras klonlanacaktr. Dot blotting elektroforetik ayrm safhasn gerektirmeyen zaten klonlanm DNAnn Blotting (lekeler) ile ekillenen bantlar biiminde grlrlgn saglama tekniidir. Mesela insan-fare hibrit hcre hatt DNAs insan DNAsnn yerini belirlemek iin klonlanabilir.

305

Bu durumda hibrit hcre hatl sadece 20 nolu kromozomu olan bir tane insan kromozomu ierir. Bu kromozomdan gelen DNAnn yerini belirlemek iin insan kromozomundan izole edilmi sonda (prob) kullanlr. Sondalar radyoaktif olarak iaretlenir. Ayn anda her biri hibrit plasmid ieren (288) E. coli kolonisi yerletirilir ve direkt nitroselloz filtreye dhil edilir. Prob (sonda) ilemine hazrlk iin hcreler lisise edilir ve DNAlarn denatre olmalar salanr. Her klonun hcreleri iindeki plasmid DNAs radyo aktif bir sonda ile hibridize edilir. Yani insana zel dizili sras ieren prob(sonda)un radyoaktivtes kullanlr. Ayn anda ayr bir ilem olarakta (288) adet insan-fare hibrit hcre hatt DNA klonlar ile nitroselloz filtre zerinde (288) ayr yerde lisise edilir. Sonra prob (sonda) lisise edilen rneklere tadbik edilir. te bu (288) klon rneklerinden insan 20 nolu kromozom DNAs tayanlar koyu renk alr. Bu ekilde elektroforez ayrmn gerektirmeyen klonlarn (DNA) hibritlenmesi tekniine Dot Blotting denir.

ekil 15. Fare-insan hibrit hcre hatt ieren (DNA)ya ilikin (288) clonun Dot Blot otoradyagrafisi. Clonlar insana zg dizili sras iin sondalarla hibridize edilmitir. Sonda ilemi her clonun nitro seluloz filtre dolu rneklerinin Lisizi ile yaplmtr.ki koyu karanlk nokta,insan (DNA)s tayan clonlarn yerini gsterir.Bir ok dier noktalardaki silik radyasyon aratrcnn yerleimin biimini anlamasna yardmc olmak iin oluturulmutur. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.) WESTERN BLOTTING Bu teknik belli bir klonlanm zel genin yerini belirlemek iin farkl bir metod olarak bilinir. Plasmid ieren hcrelerdeki klonlanm genlerin gerek aklamasnn yaplmasndan yararlanlr. Eer eukaryotik genler E. coli plasmidlerinde klonlan-dnda aktif bir promotor uygun akm ynnde yer alm ise bu durumda gen faaliyeti (Transcripsiyon>Translasyon>Protein) elde edilmi olabilir.

306

Bilindii gibi Aag yn(Down stream) (akm yn) terimi (RNA) polimeraz enzimi ile lgl olagan,yonu tanmlar. DNA transcipsiyonun yn ve pozisyonuna dair olaan durum (5) ucundan (3) uc ynne dorudur. Bu durumda ters akm yn (up stream) (5) uca doru normal akm ynnu (Down stream) ise(3) uca doru polimerazn geliimini tanmlar. Promotor ise (RNA) polimeraz balanma yerini tanmlar. te yabanc DNAnn aklanmasna olanak veren plasmide expresion vektr ad verilir. Normal olarak bakteriler eukaryotik genleri aklamayacandan bu teknikte birok zorluk olduu hatrlanmaldr. Ancak genede klonlama yeri promotorun akm ynnde olan eitli zel plasmidler gelitirilmitir. Bu durumda eukaryotik gen prokaryotik genin bir ksm haline gelir ve bu ekilde genellikle prokaryotlar bir ka aminoasit ieren fusyon protein oluturur. phesiz eukaryotik genin uygun yerleimde yer almas ve uygun translasyon iin tam doru kodon ereve okunmasna maruz kalmas gerekir. Doal olarak byle bir olaslk dktr.Belli bir protein rnnn yeri Southern blottng yada Dot Blottnge benzer ekilde belirlenebilir. Bu teknie Western Blotting ad verilir. Yani burada antibiyotik kullanarak belli zel proteinin sonda teknii ile anlalmas amalanr.

ekil 16. Western Blot tekniiyle birok Klon arasndan belli bir proteini aklayan klonun yeri belirlenir. Aklanan proteini tayan Klonlar lisize adilir. Antibodi uygulanarak protein yeri saptanr.kinci bir antibadi,birinci antibadinin yerini saptar.Bu ilem florosent renklendirici ile yada otoradyografi ile yaplr. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.)

307

Bu teknikte sondalama radyoaktif oligonkleotid sondadan ziyade belli zel proteine zg antibodi ile yaplr. Birinci antibodiye zg ikinci bir antibodide iaretleyici olarak genellikle floresans nitelikli olur ve birincinin yerini belirler. Mesela ekil (15)deki clonda yer alan belli zel proteinin aklanmasn aryor olalm. Clonlar nitroselloz membrana aktarlr ve orada genellikle kloroform buhar ile lisize edilir. Sonra belli zel proteine zg antibody tatbik edilir. Ayn ekilde birinciye zel ikinci antibodi florescens iaretleyici ile iaretlenir ve filtreye uygulanr. kinci antibodinin florescens mas birinci antibodinin yerini gsterir. Bu da hangi klonun belli bir zel geni akladn gsterir. ekil 16da bu durum gsterilmitir. KROMOZOM YRY, KOMUU GENLERN TANIMLANMASI Bu terim bireysel olarak klonlanabilecekten daha uzun (DNA) segmentlerinin st ste akan sondalar kullanlarak incelenmesini aklar. Br genn yer yaklask blnyorsa once komsu dzler klonlayarak suret le o gende klonlamak mumkundur. Aktarlan yabanc (DNA) boyu snrl olmasna karn bazen daha uzun (DNA) segmentlerini st ste akan clonlar incelemek suretiyle kromozom yry adl teknikle inceleyebiliriz. Kromozom yry metodunda klonlarn ve DNAnn u ksm tekrar klonlanr ve Genomik ktphaneden baz dizileri rten dier klonlarn aratrlmasnda sonda (prob) olarak kullanlr. Sonu rtme dzeyi iin analiz edilir. kinci kez klonlanan rten blgenin ucu alnr tekrar baka rten klonalarn seimi iin sonda olarak kullanlr. Bylece kromozom boyunca yrm olunur.

ekil 17. Kromozom yry teknii ile blgeyi kapsayan araya sokulmu ksmn klonlarnda st ste akan ksmn yerini belirlemek eklinde uzun kromozom yry yaplr.(A)Araya sokulmu ksm olarak tanmladmz belli zel (DNA) paras ile balanr. Daha sonra bu ksmlarna blnerek dier klonlar iin,(A) blgesiyle akan blgeyi ieren genom ktphanesi iindeki dier klonlar iin sonda elde edilir.(aada dier blge (B) ile belirtlmitir.) (A-B)klonunun kendisi ksmlara ayrlr ve ilemi tekrarlayarak sonde elde edilir. Bylece kromozom zerinde srekli ilerlenir. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.)

308

Mesela (A) blgesi ad verdiimiz belli bir gen (1) no lu klonda yer alsn. Bu blgenin bu klonda yer ald sonda aracl ile anlalmtr. Klonlanm ksm ayn (R.E)yi kullanarak balang vektr ile yapld gibi alnp uzaklatrlr ve sonda (Prob) larn kendilerinin kullanm gibi paralara ayrlabilir. Burada ama birinci ile st ste akan klonlanan ksm ieren dier bir klonun yerini belirlemektir. kinci klonda ayn ekilde muamele grr. Bylece segmentleri kromozomda daha aa ksmlardaki dier st ste akan ksmlarda sonda olarak kullanlr. Bu ekilde nisbeten kromozomun uzun segmentleri akan klonlar yardm ile incelenebilir. Kromozom yrynn ak bir kullanm alan eukaryotik kromozomlarda hangi genlerin birbiriyle yan yana olduunu anlamay salar. Kstk fbroz ve kas dstrofs gennn yer boyle belrlenmstr. Bu teknik ok bktrc ilemleri gerektirir. Belli baz alanlarla snrl uygulamas vardr. Mesela Eukaryot DNA larda tekrarlanan dizili sralar gibi konular zel glkler oluturur. akan sonda birok ortak tekrarlanan dizili sras ierir bitiik segment iermeyen birok klonla hibritleir. Bu ekilde apraz iliki tekniin deerini azaltr. Yakn zamanda kromozom sramas (kromozom jumping) teknikler gelitirilmitir. Bu teknikler yry iin uygun olmayan blgeleri atlayan onlar (bypass) yapan tekniklerdir. Bu teknikler segmentler iki ucunun ortasnda yrme ilemi yaplmadan iki ularn yerlerinin belirleme kabiliyetlerine bamldr. Segmentlerin ular eer blge invert edilmi ise (ters evrilmi)yada byk bir blge klonlanp orta ksm sonra uzaklatrlarak sadece ular kalm ise segmentlerin ularnn yeri belirlenebilir. ki ucun sondas aratrcnn birinci ucu ve dierlerini etkili olarak clonlamasna ve e aradaki blgelerin zerinden atlanlmasn mmkn klar. Ksaca kromozom jumping terimi genomik kromozom zerindeki birbirini takip etmeyen fakat bilinen noktalar arasnda o blgeyi atlayan klonlarn izolasyonu salayan tekniktir. Bu i genellikle ilgili olmad dnlen blgeler zerinde ilem yapmak yada (yry) uzun olduunda by-pass blgelerinde yaplr. HETERODUPLEX ANALZ Genellikle eklenen parann boyutunu tahmin etmek iin clonlama tecrbelerinin sonularn grmek arzu edilir. Bu teknik heteroduplex analizi yada heteroduplex haritalama olarak anlr. Duplex DNA farkl kaynaklardan gelen tek kollarn (DNA) lar farkl olan yerlerde Loop yada knt yapacak ekilde oluumu ile elde edilir. Bu heterojen DNAya heteroduplex ad verilir. Elektron mikroskobu gzlemi ile analizi ile bu eit DNA analizlerinde rekombinans DNA aralarndaki nemli bilgiler salanr.

309

ekil 18. ki lambda faj kromozomunun iki blgede farkllam hetero dubleks haritas. Her ikiside hem uzunluk, hemde bir blgenin dizili sras bakmndan farkllar.(soldaki ok).Ayrca biri dierinde bulunmayan biraraya sokulmu ksm ierir.(sadaki ok).(a)Elektron Mikrografik (b)-Aklayc diyagram araya sokulmu blge ieren kromozom farkl izimle gsterilmitir. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.)

310

Heteroduplex analizi kullanlarak eitli yabanc DNA ilave yerler, delesyonlar yada (DNA) paracklarndaki heterojenite ile belirlenebilir. Bu yntemte klonlanan rnlerin clon genellikle kendi sondas yada clonsuz plasmidi olmak zere dier nkleik asit ile hibritletiinde heteoduplex DNA oluur. Bu ekilde clonlanan rn elektron mikroskobu ile grlebilir. Metot bu ekilde elektron mikroskobik incelemeye dayanr. Mesela bir canlda lamda fajlarnn iki klonlama vektr arasndaki farkll haritalamak iin Heteroduplex analiz kullanlabilir. Bu durum ekil 18de gsterilmitir. ekilde iki farkl blgede farkllaan iki faj kromozomunun hibridizasyonu gsterilmitir. ekilde okla iaretli yerde iki faj kromozomu ebat ve dizili sras farkldr. Bu durum heteroduplex kromozomdaki tek kollu lop halinde gzlenir. Oysa bunun her iki tarafnda eit kollu molekl yer alr. ki blge farkl dizili sras ile gzlenir. nk bunlar hibrit hibridize olmaz. Bunun nedeni blgeler ebat bakmndan farkldr. ki tek kollu zincir llerek akar olarak farkl olduu gsterilebilir. kinci farkl blgede ise tek kolu (DNA)nn gzlendii araya sokulmu loop gze arpar. Bu durum bir kromozomun ilave iine alnm kazanlm blge ierirken deerinin byle olmadn gsterir. Lamda kromozomu ebatn bilirsek iki vektrn ebat farkll yan sra farklln tam u noktasn belirlemek mmkn olur. Bu lmler aratrcya iki vektrn nelere maruz kaldn gsterir. EUKARYOTK VEKTRLER Yaplan eitli almalarda kimerik plazmidlerin balca E.Coli olmak zere bakterilere sokulmas sz konusudur. Ancak bu tekniklerin eukaryotlarda uygulanmas iin E.Coli gibi prokaryotlar, fajlar eukaryot genlerinin tmn aklamaya muktedir deildir. nk bunlar genetik baz transcripsiyon sonras yada translasyon sonras, ilemler, intron uzaklatrlmas, baz proteinlerin modifikasyonu gibi ilemler iin gerekli enzimler bakmndan eksiktir. canl Eukaryotik genomun in vivo (canl ii) organizasyon ve aklanmas konusunda da eitli konular arastrma alanlarn olusturmaktadr. Bunlar anlayabilmek iin Eukaryotik plazmidler ve eukaryotik genomun invivo ilemesi konular incelenmelidir. MAYA VEKTR Bira mayas kk bir eukoryatik olup, laboratuvarda tpk prokaryatik gibi genetk slemlere uygun alabilir ntelktedr.. Ekmek mayas (saccharomyces cerevisia ) da byle doal olarak mevcut 2 mikron ebadnda plazmitler vardr. Bu tp plazmt vektor olarak kullanlablr. Ayrca bakteriyel plazmitler maya hcresine konulabilir. Maalesef byle plazmitler hcreden kaybedilebilme eilimindedir. Bu glk maya sentromeri (cen) ve bakteriyal plazmitler birlestrlerek iinde maya DNA replikasyon orijini blgesinide (autonomously replication sequences ARS) ieren bakteriyel plasmitler oluturularak giderilmitir. Daha sonra plasmitler bir generasyondan generasyona maya aracl ile aktarlr.

311

Plazmitler ilerine konan telomerik dizili srasna sahiptir. Ancak endonkleazlarla telomerik sralarda kesilerek dorusal hale getirebilir. Yada plazmitler nce dorusal klnp ularna telomerik dizili sras eklenebilir. Bu plazmitler sonra maya suni kromozomu ( yeast articifical chomoromozom = Y.A.C.) olarak adlandrlr. YACnin zel avantaj ilerine konan byk (DNA) paralarn tama kapasiteleridir. Cosmitlerin 50 kb tadklar hatrlanrsa YACler 800 kb yada daha byk tayabilir. YAClar Eukaryotlarda insan genom prosesinde olduu gibi ok miktarda DNAnn klonlanmas sz konusu olduunda nem kazanmaktadr. Mayada Rekombinant DNA almalar, Eukaryotlarda gen regulasyonu, sentromer alma biimi eukaryotik, Linear, kromozom replikasyonunun ayrntlar anlaldka artacaktr.

ekil 19. E.Colide PBR 232 plazmidi. Bira mayasnda kullanm iin modifiye edilmitir. Bu plazmid hem bira mayasnda ve hemde E.Colide yaamakta ve replike olmaktadr. nk her iki durum iinde replikasyon orjin iermenin yan sra, bira mayas sentromerik blgesi(CEN) bulundurur. Bunlar dorusal hale getirildiinde telomerler de katldnda bira mayas, suni kromozomu(YAC) byk (DNA) paralarn klonlamak iin uygun hale gelmi olacaktr. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.) HAYVAN VEKTRLER Taksonomik bakmdan yksek hayvanlarda yaygn kullanlan aygt DNA tmor virs (SV40)dr.(S.V.sembol sgman vacuolotng virusu tanmlar. lk olarak maymunlarda izole edilmi olup normal fareye tavana hamster hcresinede transforme olabilir. Transformasyon kelimesinin bakterilerde kullanmnn aksine eukaryotlarda normal hcrenin hzl byyen kanserli hale dnmn tanmlar.

312

SV40 bu bakmdan ok kk ntelkte partkl olup kok az (5224 baz ifti ) kromozom ierir. Kaltsal ierii ift kollu halka DNA molekl halindedir. Lambde vektr gibi (SV40) virionlar kendi DNAlarnn bir ksmn yabanc DNA ile deiebilir. Rekombinant DNA almalarnda kullanlan viruslar iki eit yol izlerler. Bunlar kendi hayat sikluslarn rekombinant olmayan viruslar yardmyla tamamlar replike olur yada konuku hcrede mevcut stoplazmadaki halka plazmidler aracl ile aktif virus partiklleri yapmakszn(Yan hucrey lsze etmeden) yada konuku kromozomuna eklenerek hayat sikluslarn tamamlar(lsogen). (SV40)memeli hayvanlar genetik almalarnda nemli bir ara olmaktadr. Mesela tavan -Globun geni (SV40)de klonlanmtr.SV40da enhancer( kuvvetlendrc zenginletirici) dizili sras kefedilmitir. Onkogenler gibi transformasyon konusunda yeni bilgilerin ou DNA tmr viruslarn tayc aygt olarak kullanlan almalardan salanmtr. Enhancer ise eukaryotik DNA dizili srasnda transkribe edilen blgeden belli bir uzaklkta bile olsa transkribe olan blgenin transcipsiyonunu arttran DNA dizili srasna verilen addr.

ekil 20. SV40 bir klonlama aygt olarak kullanlabilir. Klonlama esnasnda sokulan (DNA) ile virsn bir ksm yer deitirir. Beraber normal helper (yardmc) virs yardm ile hala replike olur.(Rekombinant olmayan SV40). Helper virs yardm olmakszn, ya plazmt gibi oalr yada konuku kromozomuna eklenir. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.)

313

BTK VEKTRLER Yabanc genlerin bitki hcrelerine konulmasnda en iyi allan sistem doal olarak mevcut Krown genleri tumor sistemidir. Toprak bakterisi Agrobacterium tumofaciens birok dikotiledon bitkilerde Krown galerileri ad verilen tmre neden olur. Esas olarak Krown galerileri ise transforme olmu bitki hcresidir. Bu hcreler bakteri iinde bulunan tmr zendirici ad verilen Tumor Inducng (Ti) plasmidler araclg transformeolmus btk hucrelerdr. Plazmidin belli bir blgesine T-DNA (transfer edilen DNA) paras ad verilir. Eer plasmidin T-DNA ksm konuku bitki hcre kromozomuna integre olursa transformasyon oluur. Krown galeri hcreleri opn ad verilen bir cins aminoasit trevi retir. Bu unsur A. tumofacensin ihtiya duyduu bir unsurdur. Bu sistem kullanlarak genetikiler transformasyon ileminin nasl olduunu anlamlardr. Bu sreci bitkilerde gen aktarm iin kullanmlardr. Genetikilerin almas byk oranda E. coli maya ve meyva sinekleri gibi model bireyleri bitkilerde belirledikten sonra almalar hz kazanmtr. Bu konuda en byk ilgiyi ayr otlarndan Arabdopss thalana almtr. Bu kk bitki bitki genetii almalar iin idealdir. nk genomu ok kk olup (5) kromozomda 100 milyon baz ifti (2 nkleosu) bulunur. Bu miktar mayalarn (5) kat E. colinin (20) katdr. Dolaysyla bu genom byklnde ilem yapmak genomu tamamen analiz etmek mmkn olacaktr. Bitkiler ok sayda yetitirilerek her bitkinin binlerce tohumunu almak mmkn olduu dnlrse bu organizma genellikle almak iin olduka uygundur.

ekil 21. Arabidopsis thaliana bitkisinin cce formu. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.)

314

YABANCI DNANIN EUKARYOTK HCREDE FAALYETNN SALANMASI Yabanc DNA eukaryotik hcrelere bakteriyel transformasyona benzer tarzda konulur. Ancak bu durumda TRANSFECTION ad verilir. nk daha nce akland gibi eukaryotlarda transformasyon kanserli bymeyi ifade eder Eukaryotik organizmalar yabanc (DNA)y ald zaman Transgenik adn alr. Hayvan hcreleri yada hcre duvar uzaklatrlm bitki hcresi (protoplast) yabanc kromozomu yada (DNA)y direkt evreden Kalsiyuum bifosfat mevcudiyeti halinde dk etkinlikte kendi iine alr. , Bu etkinlik DNAy direkt olarak injekte etmek suretiyle arttrlabilir. Mesela Transgenik fare imdilerde dii farelere uygun hormonal hazrlk uygulanarak salanan oosite yada bir yada iki hcreli emriyo halinde iken yabanc DNA injekte edilebilmektedir(ekil23).

ekil 22. Fare oositininn ekirdeine DNA njeksiyonu. Oosit pipet ierisine ekilirve daha sonra injekte edilir. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.) Klonlanm DNAdan yaklak 2 picoliter (2x10-12 litre) hcreler alc konuku dii uterusuna reimplante edilir(yeniden yerletirilir.)Bu injesiyonlarn yaklak %15inde yabanc DNA embriyoya incorpore olur. Transgenik hayvanlar yabanc eukaryotik genlerin kontrol ve aklanmas iin faydaldr.1988de transgenik fare patenti alnan ilk genetik olarak dzenlenmi kansere eilimli patenti alnm ilk organizmadr. Transgenik fare kanser zerinde almalar iin idealdir. Farelerde kemirgen byme hormonu geni ile transfecte edilmi fare baar ile elde edilmitir. nsan phtlama faktr reten Transgenik koyun elde edilmitir. En son Rekombinant DNA uygulamas bilimsel tartma yaratan bir olgu olarak koyun klonlanmas ile 1997de elde edilmitir.

315

Transfeksiyon Retro virusler ile de yrtlebilir. Retroviruslar RNA ieren viruslar olup tersine kopyalama enzimini ierirler. Mesela insan akyuvar hcrelerinde Adenosndeamnaz enzimi eksiktir. Bu eksiklik Retrovirus vektr infeksiyonu ile giderilir. Kemirgenlerde lsemi ekillendirmekten sorumlu retrovirus olan Moloreu murin losemi virusu byle btn genler iin dzenlenmi virusun btn genleri karlm neomisin dayankllk antibiyotik iaretleyici ile yer deitirilmitir. Virus hcre yzeyine balanr ve hcre iine alnr. Bunun RNAs tersinir kopyalama ile DNAya evrilir ve DNA hcre kromozomlar ile birleip ona incorpore olur. Bu olduka yksek modifiye edilmi virusun bir yardmc Helper virusu olmadka hcrelere hcum edip bozmas mmkn deildir. ekil 20deki (SV40) virusu modifiye edilmi Moleney virusu nemli genler uzaklatrld iin Helper virus olmakszn baarl infeksiyon balatamaz. Dier eit teknikte eukaryotik hcrelere Rekombinant DNA konmasnda kullanlr. Bu teknikler elektroporasyon, Lpozom aracl ile tranfer. biolistik transferdir. Elektroporasyon d kaynakl eksojen DNAnn yksek voltajl elektrie maruz kalm hcreye alnmasdr. Bu elektrik alan mhtemelen hcre membranndan geici porlar oluturmakta ve eksojen DNA ieri girmektedir. Lipozom aracl ile transfer yontemnde ise yabanc DNA suni membranl bal lipozom ad verilen kesecikle kaplanr. Bu lipozomlar DNAy hedef hcreye aktarmada kullanlr. Bir denemede farelerin 50si byle DNA ieren lipozomlarla injekte edilmi ve transfekte olmu neticede transfekte DNA ile kodlanan protein retilmitir. Bir ok nedenlerin yansra ift membranl hcre duvar rekombinant DNA aktarm iin uygun olmamas yansra DNAnn mitokondriye yada kloroplastlara konmas imdilik genetik mhendislii iin zor hedeftir. Yakn zamanlarda hem mitokondrial ve kloroplastlarla transfeksiyon iin biolistik (Biyolojik Balistik) yntemler gelitirilmitir. Bu yntemde rekombinant DNA Tungsten mikro projectle kaplanr. Sonra bu organizmalara gen tabancas ad verilen frlatc ile frlatlr. NAKAUT (KNOCKOUT) FARE Belli bir lokustaki belli bir fonksiyonu olmayan allel iin homozigot klnm transgenik fareyi tanmlar. Normal olarak bir fareyi transfekte etmek iin kullanlan gen fare genomunda ise tesadf bir yere inkorpore olur. (eklenir)Ancak bazen, eer yabanc gen Krossingover olmadan homologunun aksi ynnde yer alrsa yabanc gen orijinal genle yer deitirir. Bu avantaj dikkate alarak Knockout Fare (Nokaut Fare) teknii oluturulmutur. Bu teknik de normal fare oositi kusurlu genle transfekte edilir ve baz vakalarda bu normal kopyas ile yer deitirir ve sonuta fare bu gen iin heterozigot olur. Byle iki heterozigotun dllerinin 20si homozigot olacaktr ve transfekte edilen genin fonksiyonlar gzlenmemi olacaktr. Bylece bilim adamlar bir genin fare yaam iin hayati olup olmadn, deilse kusurlu fenotipin ne olduunu anlam olacaklardr. Bu teknoloji gelime ve imminoloji almalar iin ok uygundur.

316

Klonlanm normal genn arasna antbyotk drenc gen gb marker katp fonksyonu bozulduktan sonra fare embronk koken hucrelerne verlrse baz hucrelerde bu gen normal genle yer degstrr.Daha sonra bu hucreler blastomer safasnda embrolara njekte edlerek homozgot mutant gen tasyan fareler elde edlms olur. Mesela Mulleran engelleyici unsuru iin gen knock out edilirse erkekler ksr olur. nk dii genital organlarna sahip olur. Bu deneyler cinsiyet belirlemesi genetik ynlere daha nem verilmesini salayacaktr. Halen her yl 150-200 knock out deneyi sergilenmektedir.Ayrca nakavt genler nsanlarda genetk hastalklar calslmasnda model hayvan olarak kullanlr. BLDRC SSTEMLER Bu sistemler bir genetik yap olup aratrcya belli bir l ilikili lokusun fenotipik aklamas suretiyle aktif olup olmadn belirtir. Mesela Luciferaz isiml bildirici(reporter) genn yada urununun varlg Luciferin ile ykandnda parltl kzark grn vermesi ile belrlenr. Ksaca bu sistemler transfeksiyon (Yabanc DNAnn eukaryotik hcreye sokulmas) deneyinin baarl olup olmadn belirleyen sistemlerdir. Bitkilerin Agro Bakterium Tumofaciensin (Ti) plazmidi ile transfekte edildiini dnelim. Eer bir bitki (Ti) plazmidi ieren A.Tumofaciens ile infekte edilmi ise konuku bitkiye T-DNA blgesini transfer ederek onu tranfekte eder. Bu ekilde T-DNAy alan hcreler T-DNA ile transfekte edilmi olan ve opin maddesi ad verilen bir eit aminoasit trevinin retimi zendirilir. Bu madde bakterinin gdasdr. (Ti) plazmidi hakknda yaplan deneylerin ou konuku bitkiye aktarlan dier genleride iermektedir. Bylece aktarlan genler iin transgenik bitkiler oluturulmu olur. Byle bir denemede de Ttn bitkisi ate bceinden alnan Luciferaza genini ieren (Ti) plazmidi ile transfekte edilmitir. Bu genin rn ATP baml Luciferin oksidasyonunu katalize eder ve darya k salar. Transfekte bitki Luciferin ile sulanrsa ate bcei gibi ldar. Byle denemelerin nemi ldayan bitkilerden ziyade, bu ldamann belli zel genin etkisini bildirmesini saladg hususudur. Daha ileri denemelerde belli zel genlerin promatr ve enhancer (zenginletirilmi) blgeleri Luciferaze genine ekleneblr. Sonuta Luciferaze sadece promatrler aktive edilince ilev grmtr, retilmitir. Bu durumda bitkinin ldayan blgesi transfekte genin aktif olduu yerleri gsterir. Daha yakn zamanlarda incelene bildirici sistemler Jle bal (Jelly Fish)den gelen geni kullanr. Bu gen yeil floresans proteinidir. Bu sistemin nemi Luciferazda olduu gibi bir ey katmaya gerek olmakszn ultraviole nda parlar. Yeil floresans protein geni incelenen gen ile kombine edilip transfeksiyon yaplr. Eer istenen gen baar ile geirildiyse ultraviole ile aktive edildiinde bildirilmesi yani sonucun grlmesi gerekir.

317

RESTRKSYON HARTALAMA Restriksiyon enzimlerinin bir ift kollu DNAda yaptklar kesik says bu DNA segmentinin uzunluuna, dizili srasna, belli enzimin tanma dizili srasnda baz ifti saysna baldr. Prokaryot ve eukaryotlarda gen faaliyetlerinin unsurlar aada ksaca zetlenmitir. Prokaryotlar ve eukaryotlarda transkripsiyon sonras (post transcription) ve translasyon sonras (post translasyon) modifikasyonlarda farkllklar olabilmektedir. Gen aklamasnn kontrolnde en nemli yer trankripsiyonun balad, RNA polimerazn bagland yer olan promotordur. DNA zincirinde transkripsiyonun biti yeri terminatr (sona erdirici) dizili sras ile belirlenir. Promotor yan sra eukaryotlarda DNA ularndaki enhancer blgesi promotorun ilem ynne ters ynde yer alr ve transkribe edilen yerden belli bir mesafede bile olsa ilgili blgenin transkripsiyonunu arttran ayarlayc blgedir. Klon DNAsn tanmlamann lk adm onun Rstrksyon hartasn yapmaktr.Restrksyon hartas klonlanms br DNA parcas uzernde RE kesme bolgelernn saysnn sralansnn ve aralarndak uzaklgn jel elektroforez le parca buyuklugu blnen br molekul le karslastrlarak belrlenmesdr. Dizili sras buyuklugunun ans etkisi oluma ihtimali ilgili sra uzunluunun fonkiyonudur bazlk dizili srasnn tesadfen oluma olasl :(1/4)3 =1/64 baz iftidir. Alt bazlk dizili srasndan :(1/4) =1/4096 bp daha oktur. Mesela Hnd II enzimi (SV40) tmr virs halka DNAsn iki paraya bler. Baz restriksiyon enzimleri E.Coli DNAsn yzlerce paraya bler Restriksiyon enzimlerinin DNA rnei zerine etkisinin rnlerine restriksiyon kesintileri (restriction digest) ad verilir. Elektroforez kullanarak bu restriksiyon kesintilerinin byklk srasna gre ayrabiliriz. Bu teknik aada anlatlacaktr. Bu teknik sayesinde orijinal gendeki yada DNA parasndaki restriksiyon yerlerinin yeri belirlenmi olur. Bylece restriksiyon tanma yerlerine gre bir harita yaplabilir. Sonuta bu tanma yerleri arasndaki fiziksel mesafe hesaplanr. Byle restriksiyon haritalar eitli nedenlerden olduka nemlidir. Sz gelimi (SV40) unsurunda (DNA) replikasyon balangcnda ksa srede radyoaktif nkleotid trifosfatl timidin katldnda radyoaktiflik sadece bir restriksiyon parasnda gzlenir. Bu durum (SV40) replikasyonunun bir zgn noktadan baladn ve bu noktann (SV40) belli yer kromozomunun, belli yerinde yer aldn gsterir. Ayrca bu ekilde restriksiyon haritalar aratrclara genetik haritalar ile kromozom fiziksel haritalarn ilikilendirme olana verir. DNAdaki Delasyon, inversiyon ve restriksiyon deiimleri gibi baz fiziksel deiimler genetik haritalardaki yeri bakmndan belirlenebilir.

318

Restrksyon hartalar klonlanan parcann uzunlugu hakknda fkr verdg gb RE kesm bolgelernde belrtr. Bu bilgiler DNA deiikliliklerini anlamamz salar. Ayrca trlerin farkllamasnn anlalmas bu almalarla anlalmas daha iyi anlalr. Parack boyutundaki farkllklar, restriksiyon parack ebat polimorfizmi (R.F.L.PRestriksiyon Fragment Length Polimorfizim) olarak adlandrlr ve genlerin tam yerlerinin belirlemesinde nemli bilgiler salar. Ayrca bireylerin akrabal yada benzerliini anlamaya yardmc olur. Restriksiyon kesintileri ksa DNA segmentlerinin izole edilmesi ve dizili srasnn analiz edilmesi bakmndan mmkn olur.

ekil 23. Restriksiyon endonkleazlar ile sindirilmi paralarn elektroforesi le restriksiyon haritalar. (a)- (A) ile gsterilen restriksiyon yerlerini gsteren orjinal DNA paras. (b) ksmi ve toplam sindirilmi ksmlarn bandlarn gsteren agaroz jel bandlar. Yldzlar ise ular iaretlenmi segmentler araclyla retilen radyoaktif bandlar gsterir. Soldaki skala, baz iftleri iin molekl agrl deerlerini gsterir.(rnein: 800bp,700bp). Toplam sindirilmi(keslms) ksmlar 400.200.100 ve 50bplik fregmentler retir. Ayrca 200 ve 100bplik fregmentler iaretlenmitir ksmi sindirilmi unsurlar alt ilave bant verir. NOT; Ksm kesim (RE) yerlerinin tm deil bir ksm kesilmis olmay tanmlar. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.)

319

(R.E.)ler ile kesmeden nce DNAnn (5 ) ucu polinkleotitkinaz enzimi kullanlarak radyoaktiflenerek (32P) ile iaretleyecektir. Bu enzim ift kollu DNAya etki ederek iaretleneceklerdir. DNAlarn kesiminden sonra uygulanan elektroforezi sonucu 200 baz ifti ve 100 baz ifti (bp) uzunlukta bantlar radyoaktif iaretlenmi olacaktr. Bu durum bu segmentlerin (DNA) paralarnn termini (ucu) olduunu gsterir. Ancak ortalardaki paralarn dizili sras hakknda hibirey bilinmemektedir. Dier segmentlerin dizili sras bu paralanma srecini yavalatr.Ksmi kesim ilemi yaplarak bunlarda belirlenebilir. (RE) ile kesim tamamlanmasna izin vermeden (RE) kesim yerleri henz ayrlmam paralardan oluuyorsa buna ksmi (partial) kesim (Digest) ad verilir. Eer reaksiyon soutulur yada ksa sre srdrlrse btn restriksiyon yerlerinin kesilmemesi salanm olur. Baz DNA paralar btn yerlerinden kesilmez iken bazlar bir, bazlar iki, bazlar yerde olmak zere restriksiyon yerlerinden kesilmi olacaktr. Byle bir ksmi kesimin sonucu 24. eklin sanda gsterilmitir. RESTRKSYON HARTALARININ YAPIMI Bu maksatla brcok usul bulunur .Ancak prensp sozgelm 2 RE enzm kullanlyorsa bunlarn her ksn ayr ayr ve her ksn brlkte kullanarak elde edlen kesklerin buyuklukler yorumlanarak enzm kesme yerlernn sralamas(hartas)eklindedr. Yukardaki ekil 24de gsterildii gibi Hipotetik bir DNA parasn, (A) isimli restriksiyon enzimi ile keselim. Bu kesilme paralarn Agaroz jelde elektroforeze tabi tutalm. Agaroz jel zellikle nispeten byk DNA paracklarnda hareket etmesini salayacak poroziteye sahiptir.(R.E) DNAy yerden keser ve 200,50,400,100 baz ifti uzunlukta paracklar oluur. eklin solunda grlen band deiimi modeli sz edilen paralarn elektroforezi sonucu oluan grnmdr. Burada daha kk paracklarn daha byk olanlardan daha hzl hareket ettiine dikkat edilmelidir. Segmentlerin bykl, ebad bilinen standartlarla karlatrlarak tayin edilir. ekilde solda bir skala kolu verilmitir. Ancak bykl bilinen standartlarn bantlar ekilde gsterilmemitir. Kromozom zerinde bu segmentlerin dizili sras jelden aka belirlenerek, eitli metodlar kullanlarak orjnal DNA paras zerindeki restriksiyon segmentlerinin sralar saptanr. Bu jelden segmentlerin dizili sras belirlenebilir. Bu jel (4) orjinal segment ile beraber (6) yeni segment ierir ve her biri en azndan kesilmemi restriksiyon yeri ierecektir. Toplam kesinti jelinden dolay biliyoruzki 200 ve 100bplik segmentler dar taraflardadr. Bunlar radyoaktif iaretlidir. Ayrca 50 ve 400 bplik i taraflardadr.

320

ekil 24.ekil 23teki ekiller yeniden yaplanmalarn basamaklarn gsteriyor. Bunlar toplam ve ksmi restriksiyon kesiklerinden oluur. Yldzlar (32p )u iaretlerini gsterir. Toplam kesiklerden 100 ve 200 bplik ve u segmentler oluur.(a)- 50 ve 400 bplik segmentlerde olduundan toplam kesiklerden elde edilen DNA iinde sadece baz bandlar (fragmentler) ksmi kesiklerden oluur. Bunlarda 200 bplik fregmentlere bitiik,50(Birlkte,200+50=250) ve 100 bpye bitiik, 400 bp(brlkte,400+100= 500) fregmentleri oluturur. (b) ve (c) basama ksmi kesiklerde iaretlenmemi 450 bplik ksmlarn varl, 50 ve 400 bplik(birlikte,50+400=450lk ksmlar izole eder.(d) Nihai yap oluur.(e)-Btn fregmentler bu dzenlemeye uyar. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.)

321

ekil 25. Ayn DNA paras zerinde iki farkl restriksiyon endonkleaz ile (A ve B) ile oluturulan tanma yerlerinin yaylm. (a)-Gerek dzenleme, (b)-Hipotetik alternatif dzenleme, (c )-Sadece (a) veya sadece (b) den oluan veya her ikisinden oluan toplam restriksiyon kesikleri (digest)nin elektro forezi. Yldz iareti radyoaktivite iaretlenmesine ilikin bandlar gsterir.(a)-Buradaki sralar, btn kesiklerde bulunan tm bandlara uyumludur. (b)-Buradaki dzende uyum yoktur. Szgelimi (b) nin sralanma dzeninde ve iaretlemede 150bp paracklar anlalr. Oysa bu ksm toplam kesikte yoktur. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.) ekil 25 de bu durum gsterilmektedir. Ksmi kesimde 250 bplik segment deil 150 bplik segment bulunur. Bu durum bize 50 bplik segmentin biraz ieride yer aldn ve 200 bplik uca bitiik olduunu syler.

322

Burada 500 bplik segmentlerde vardr ancak 600 bplik segment yoktur. Bu durum bize 400 bplik segmentin 100 bplik uca bitiik olduunu syler. aretlenmemi 450 bplik segment ise 400 ve 50 bplik segmenlere bitiik olduunu , DNAnn iinde yer aldn gsterir. Bu durumda ak anlam olan orijinal DNAnn sralamas belirlemi oluruz. Neticede belirli bilinen DNA uzunluklar ile ayrlm restriksiyon enzimlerin tanma yerlerini gsteren bir harita yaplm olur. ekil 24 ile 25i karlatrdmzda durum daha ak olarak belli olmaktadr.

ekil 26: 7 kb byklndeki bir DNA parasnn restriksiyon haritasnn elde edilmesi. Bir DNA rnei HindIII, dier bir DNA rnei SalI ile ve bir dieri de hem HindIII, hem de SalI ile beraber kesilir. Sonuta oluan paralar jel elektroforezi ile birbirinden ayrlr. Ayrlan paralarn byklkleri bitiik hatta yrtlen ve para byklkleri bilinen bir DNA markeri ile karlatrarak saptanr. HindIII, ve SalI ile oluabilecek kesim paralarnn byklklerinden yararlanarak iki tane restriksiyon kesim modeli nerilir. nerilen para byklkleri ile jelde gzlenen byklkler karlatrldnda, Model 1 in doru olduu grlr. (William S. Klug, Prof Dr. Cihan ner. Genetik Kavramlar, Palme Yaynclk, 2003ten modifiye edilerek alnmtr.)

323

FT KESNT Pratikte restriksiyon haritalar birok farkl restriksiyon enzimi ile yaplr. ekil 26da ekil 24teki kullanarak baka bir alma sonularn gsteriyor. Burada ikinci olarak endonkleaz (B) enzimi kullanlmtr. Biraz nce belirtilen metodu kullanarak, endonkleaz kullanlarak iki kesimden (B) segmentinin 350,250,150 baz ifti ebadnda segmentler elde edilir. Bu iki haritann nasl bir arada inceleneceini anlamak iin (B) segmentinin (A)ya gre solda yada sada yer alp almadna baklmaldr. Eer orijinal DNAy her iki enzimle ayn anda muamele edersek, ift kesinti oluturursak dizili sras aka belirlenmi olur. Bu iki sra ekil 30da gsterilmitir. Burada ift kesimle farkl bir tahmin yaplmtr. lk dizili srasnda (a) 200bplik radyoaktif iaretlenmi segment olduu tahmin edilmitir. kinci dizili sras (b) ise iaretlenmi 200 bplik segment. 150 baz ifti geriden kaslm olup 200 bplik iaretlenmi segment deildir. ift kesim ise iaretlenmi 200 bplik segmentler (a)da belirtilen sray gsterdii anlalr.(a)daki btn dier hususlar ift kesim sonular ile ilgilidir. Restriksiyon haritalar bize DNA paralarnn fiziksel haritalarn verir ve belli baz bilinen DNA uzunluklar ile ayrlm (R.E.)lerin etkiledii yerleri gsterir. Bu teknik bilinen bir pozisyondaki ksa DNA segmentlerinin dizili sralarnn bilinmesini salar. Ayrca DNAnn fiziksel haritalanmasnn genetik harita ile karlatrlmasn ve mutasyon gibi baz dier zel iaretleyicilerin yerlerinin anlalmasn salar. RESTRKSYON PARACIK UZUNLUU POLMORFZM Ksaca R.F.L.P.( Restriksiyon Fragment Length Polimorfizim) olarak bilinen teknik restriksiyonun enzimleri ile oluturulmu kesintilerin elktroforezi ile elde edilmi bant modelini tanmlar.

324

ekil 27. Restriksiyon fregmentlerinin uzunluklar polimorfizmi (RFLP) denilen analiz. A1 alleli(kromozomu) 750 bplik ksma balanma ile anlalan bir gen segmentidir. Allel (kromozom) ikide (A2) , allelin (A1) solundaki restriksiyon yeri deimitir. Bu sonda ile hbrdze olma dolaysyla 750 bp yerine, 1400 bp uzunlukta paralar tannr. Southern Blotting (Southern isimli aratrmacnn gelitirdii bant aktarm) srecinde bu iki allelden iki farkl band grlr. Oklar restriksiyon yerlerini gsterir. Buna gore heterozgot br brey soz konusu se her k bandda gorulur(Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.) ekil 28. DNA parmak izinin (adli)kullanm. Bir cinayet ileminde, bir madur(kurbann) (v), savunmacnn (D) Southern Blotting teknii ile elktroforez DNA bantlar oluturulmu. Savunmacnn gmlek ve pantolon yapsndan alnan(shrt ile gosterlen sutundak bantlr) kan rneklerini gsterir. Bu model aka kurbann kanna uyar. Savunmacnn ise kendi kanna uymaz .Btn dier lekeli kanlar dalm eritleri , kontrol ve ebat bykl tayin standartlarn ierir.Pantoldaki Kan lekesnn kurbandan olmama ihtimali otuz milyonda birdir.Bu da yeryzndeki bir insana tekabl eder. Ancak bu olaslk rklar ii ve etnik alt populasyonun deikenlii hakknda, varsaymlara bal olarak zt uyumludur. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.)325

Bu teknik zellikle insan gen haritalar ve Adli Tpta nemli kolaylklar salar. nsann tm genomunu restriksiyon enzimi ile kesilmi kesikleri oluturduu bir restriksiyon enziminden binlerce parack oluur. Bu kesintilerin Southern isimli aratrmacn gelitiri Blottingi ve ( DNA-RNA yada DNA-DNA birlemesi iin DNAy agaroz jelden nitrselloze aktarp bantlar halnde gormek) iin eitli zgn sonda (probe)lar gelitirilmitir. Genetik varyasyon genellikle ikinci bir allel formundan kaynaklanr. Herhangi bir mutasyon sonucu Restriksiyon yeri eksildiinde DNAnn byk bir paras eksilmi olur. Baz problar birok alleli olan Hyper Varyabl (deiken) lokuslar ortaya koymutur(herhangi bir kii bu birok mmkn allelden ikisini tar). Bylece populasyon iinde bu lokuslar bakmndan varyasyon sz konusu olacaktr. Byle Hyper deiken lokuslar birok ksa, 10 ile 60 arasnda deien baz ift sayda ikili tekrarlar ierir. zellikle eit olmayan Krossing-over dolaysyla bu lokuslardan biri araclyla ok varyasyon gzlenir. Bu lokuslara ksaca VNTR sembolu le gosterlerek (Variable Number Tandem Repeat) Deiken sayda ikili tekrarl lokus ad verilir. Yani ksaca ikili tekrarlar nedeniyle Hyper deiken lokus. s z konusudur. Muhtemelen deikenlik eit olmayan krosingoverden kaynaklanr. Bu eit deikenlik sonucu, bu VNTR lokuslarndan birini sondalama birok adan varln ortaya koyacaktr. Byle kesintilerin Southern Blotting ileme maruz braklmas DNA parmak izi elde edilmesine yol aar. Bu olgu adli tpta nemli kullanm alan bulur. Bir cinayet ardnda braklan semen (ersuyu) yada kan rneinin DNA modeli ile karlatrlabilir. Baz vakalarda ayn prob (sonda) ile ok sayda farkl doku belirlenir. Bunlarn herbiri Southern Blottda birok bant verirken insanlarn ou zgn bant modeli gsterir. A.Jeffrey gelitirdii bir sistemde bir probe her kiide 50 yada daha ok band oluturur. Eer Jeffreyin sonraki bant modelini kesinletirmek iin kullanlrsa iki modelin tam tamna benzer olma olasl neredeyse son derecede kktr. Bu teknik kanda parmak izinden elde edilen bilgiye gre daha byk tanmlama gcne sahiptir. POLMERAZ ZNCR REAKSYONU Mze rnekleri, kurumu rnekler, cinayet yeri kalntlar, fosil gibi birok vakalar, mevcut DNA rnekleri ok kk miktarlarda yani laboratuvar almasnn gerektirdii minimum miktardan azdr. Kary Mulin 1983 te Polimeraz Zincir Reaksiyon (P.C.R.= Polimeraz Chain Reaksion) ad verilen yntemle bu ok kk miktarlar oaltma tekniini bulmutur.

326

Burada tek ihtiya duyulan, ilgi duyulan ksmn hangi yannda olursa olsun nkleotid dizili srasdr. Bu bilgi bir primer oluturmak iin gereklidir. Primer oluturulduktan sonra primerler arasndaki dizili sras oaltlr. Primer deyimi DNA replikasyonunda 3-5 ynnde tek kollu ula devam eden ift kollu DNA uzunluunu tanmlar. Bu teknikte, rnee baz primerler ve eitli maddeler katlr. Karm 20 saniye 95C de stlarak DNA denatre edilir. Sonra scaklk 20 saniye 55C ye drlerek primerlerin kendi btnler dizili srasna eklenmesi salanr. Sonra scaklk 20 saniye 72C ye karlarak DNA replikasyonu salanr. Daha sonra replikasyon yeni bir dngs tekrar balatlr. Bu durum ekil 29ta gsterilmitir. Bu dngnn eitli safhalar scaklk ile kontrol edilir. nk denatrasyonda primer eklemesi, DNA replikasyonu farkl scaklklarda gerekleir. Yaklak yirmi dngde bir milyar kopya yaplr. Bu teknik kaplca bakterisi olarak bilinen Thermophylus Aguaticusden elde edilir. Scakla dayankl DNA polimeraz yardm ile daha da etkin yrtlebilmektedir. Bu yzden her dng sonunda reaksiyon ortamna yeni unsur katlmaz. Bunun yerine dng (PCR) aygtna mdahale edilmeksizin balca su banyosunu programlayarak bylece isabetli bir ekilde reaksiyon karmn saran su scakln hzla deitirerek dng devam ettirilir. Baz zel PCR aygtlar ayn anda 96 rnekle alabilir. (P.C.R) teknii mikrosatellit DNA ad verilen yaplar oaltlarak, DNA fingerprint (parmak izi) oluturmada kullanlabilir. DNA parmak izi eitli deiken lokuslar iin sondalanm DNA kesintilerine uygulanr. (Jel) elektroforezi ile oluturulan band modeli tanmlanr. Mikrosatellit DNA ise genom boyunca dalm ksa DNA dizili sras tekrarlar demektir. Mesela Sitozin-Adenin (CA) eukaryotlarda onbinlerce kere tekrarlanr. VNTR lokuslarnda insanlar arasnda bu eit tekrarlarn says bakmndan temel crossingover hatalarndan ileri gelen saysz lde varyasyon vardr. VNTR lokuslarndan farkl olarak, bu lokuslardan birinin (PCR) ile oaltlmas Restriksiyon kesimi, Southern Blotting sondalama olmakszn salanabilir. P.C.R. direk elektroforez sonularn verir. Gerekli olan tek ey, herhangi bir mikro satellit lokusunu saran primer dizilie sahip olmaktr. P.C.R. halen molekl genetiinin nemli bir laboratuvar arac olmutur. Bylece aratrc yada adli tp iin ihtiya duyulan DNA bulgularnn oaltlmas mmkn olur. Rekombinant DNA tekniinin en nemli sonucu DNA dizili sras belirlenmesidir.Rekombinant DNA teknolojisi,le kk iyi tanmlanan, kromozom blgelerinin izole edebilme yetenei DNA dizili sras tekniklerinin gelimesine neden olmutur.

327

ekil 29. Polimeraz zincir reaksiyonu.(DNA) denatre edilir.Her iki kolon ucundaki dizili sra sra btnler,primer ad verilen oligonkleotitler katlarak replikasyon srdrlr.Bu basamaklar (DNA) denatrasyonu veya primer balama ya da (DNA)replikasyonuna uygun scaklklar oluturularak salanr. Replikasyondan sonra yeni bir dng balar. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGrawHill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.)

328

DNA DZL SIRASI BELRLENMES Harvard niversitesinden Walter Gilbert ve Stansford niversitesinden Paul Berg, Kambri (ngiltere) Tp Aratrma Konseyinden Frederik Senger, 1980 kimya dln Lamda Fajna (SV40) genomuna sokarak oluturduklar ilk klonlama (DNA) molekl nedeniyle paylamlardr. Gilbert ve Senger DNA dizili sras belirtmek iin, bamsz bir metod gelitirdikleri iin dllendirildiler. W. Gilbret ve A.Maxam Kimyasal Metod (chemiqual degiadation) ad verdikleri DNA dizili sras tayini metodunu ortaya koydular. Kimyasal metot halen neredeyse hi kullanmamaktadr. Bu metod DNAnn belirli bazlarda kimyasal olarak krlmasn ierir. nslin protein unsur dizili srasndan tr, 1950 Nobel dl sahibi Senger, daha sonra RNA dizili sras belirlemesi zerine almtr. Bu ekilde Sengerin isimli aratrmac, Alan Coulson isimli aratrmac ile gelitirdii DNA dizili sras metodu, DNA sentezini ierir ve art-eksi (plus-minus) yeya zincir sonlandrma metodu olarak bilinir. Daha sonra Senger ve Coulsen sonlandrc nkleotid kullanarak plus-minus metodu modifiye etmilerdir. Bu metod dideoksi metodu diye bilinir. Aada bu metodnu aklanmtr. D DEOKS METODU LE DZL SIRASI BELRLEME Enzimatk dizi analz metodu adda verilen bu metodla dizili sras analizi DNA sentez ilemleri ile salanr. Hatrlanaca zere DNA sentezi primer ad verilen, ift kollu olup, tek kollu (3-OH) ile nihayetlenen yapdan balar. Dier tek kol ise tek kollu DNA ile devam eder. Dideoksi metodunda dizili sras bulunacak DNAnn bir primer yaps oluturulur ve replikasyonun ilerlemesi salanr. Zincir sonlandrc bir nkleotid kullanarak yaplan bir yanltma mdahalesi ile DNA sentezi bilinen pozisyonda durdurulur. Bu zincir sonlandrc nkleotidler (2) ve (3) karbon atomlarnn ikisinde de (OH) eksik olan ekerler ile oluturulur. Bu sebeple di deoksi ad verilir (ki kere deokside). (3-OH) grubu olmayan dideoksi nkleotidler DNA polimerizasyonunda kullanlamaz. Yani oluan klon eklenir fakat kendisine yeni nkleotid eklenemediinden zincir oluumu sonlanr. Zincir sonlandrcnn varlg nkleotid sentezinin istenen bazda durmasn salar. Dizili sras belirlenen rnek (4) ayr reaksiyon karmnda ayr ayr yerletirilir. Her bir karm (4) nkleotidi ve bunun yan sra zincir sonlandrc dideoksi nkleotidi de belli bir oranda ierir.

329

ekil 30. Dideoksi nkleotidler DNA replikasyonuna zarar verilmesine(durmasna) yol aar. Dideoksi primer konfigrasyonu 3-OH grubu eksiklikleri gsterir. Primer konfigrasyonunda 3-OH vardr ve zincir uzatma iin ihtiya duyulur. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.) Mesela Timin ieren Trifosfat nkleotid havuzunda bir ksm dideoksi Timidin Trifosfat var ise byyen tek koldaki sentez bir sre sonra, Jablonda Adenin belirdiinde (Adenin Timinin btnleridir) sentez sona erer. Bylece sonu Timin olan deiik uzunlukta deiik uzunlukta birok parac meydana gelmi olur. Benzer reaksiyonlar ayr test tplerinde her nkleotid iin yaplr ve neticede ilgili btnler nkleotidi ieren uca sahip paracklar oluur. Anak reaksiyon her zaman bu Timin sr olduu pozisyonda kesilemez. nk ddATPden baksa ortamda d ATPdebulunur. Bu edenle yeni zincir sentezi tm Timinlerin bulunduu pozisyonlarda sonlanarak kalp zerinde her Timin nkleotidi bulunduu

330

pozisyonlar uzunluunda DNA altornekler(tapier) de de oluur.

paralar

sentezlenir.

Benzer

reaksiyonlar

dier

Her karmda sonuta elde edilen paracklar elektroforeze tabi tutulursa meydana gelen band modeli yeni sentezlenen DNAya gre (Jel) den okuyabilir. ekil 31te bu durum gsterilmitir. Dizili sras belirlenecek DNAnn kk bir blmesi (9) baz ifti uzunluktadr. Bu dizili srasn belirlemek iin bu ift kolun bir kolu ekilde gsterilen yapya getirilmelidir. Dizili sras belirlenecek (DNA), yeni (DNA) sentezi iin model olmaldr. Bu yapya Primer Konfigirasyonu oluturma denir.

ekil 31. Dideoksi metodla DNA dizili sras analizinin balang basamaklar.Yldzlar dideoksi nkleotidleri gsterir.Sras saptanacak primer konfigrasyon iine yerletirilir.(a,b) drt reaksiyon karm oluturulur.Her biri btn (4) normal nkleotidin yansra dideoksi nkleotidlerden birini ierir.Bylece her reaksiyon karmnda DNA sentezi,model () dan dideoksi nkleotidlere btnler yaplar oluma annda durdurulur.(c). (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.)

331

Bu ilem ayrca aklanacaktr. Gerekli primer yap oluturulduktan sonra her biri (4) nkleosid Trifosfat ile birlikte DNA polimeraz I ieren (4) alt rnek alnr. Bu nkleosit trifosfatlarn biri radyoaktif iaretlidir. Bu ilem genellikle (32P Radyoaktif fosfat) ile salanr. Bu iaret bize yeni sentezlenen DNAnn otoradyoaktivite ile grlmesini salar. (4) alt rnein her birine dideoksit nkleotidlerden (dd) sadece biri az miktarda katlr. Yani mesela her hangi bir rnekde sz gelimi 4 deoksi NTP de olmak zere hangisi radyoaktif ise o nkleotiden dideok formu karma katlr. Mesela 4 alt rneklerden biri ddTTPyi, aldysa dieri dd ATPalr, dier nc ddCTPyi, dier drdnc ddGTPyi alr. Bu dideoksi nkleotidler, olaan deoksi nkleotidlerle birlikte katlarak zincir sona erdirme, ileminin her uygun pozisyonda oluturulma olasl dikkate alnm olur. Bu olgu da ddNTPleri ok az miktarda olduundan zinci sentezi rasgele sonlandrarak deiik uzunlukta bir ok DNA paras oluur. Eer zincir oluumunda Deoksi nkleotidlarn yerine dideoksi nkleotid katlnca, nce bu bazn btnleri ablon kolda belirince zincir sona erdirilir. Dideoksi nkleotidin ve deoksi nkleosidleri kartrarak sona erdirmenin her uygun pozisyonda olumas salanr. ekil 35te Jablonun iki Adenine sahip olduu grlmektedir. Bu yzden ddTTP reaksiyonu karm iin Adeninin btnlerine de iki misli ihtiya duyulur. Bylece ddTTP iin iki mhtemel nokta vardr. Ayn ekilde iki mmkn zincir sona erdirme ve dolaysyla dideoksi Timidinle sona erecek iki mmkn fragment vardr. Bunlarda iki ve yedinci bazlarda benzer ekilde ve adeninle sona eren mmkn parack vardr. Bunlar bir, ve sekizinci bazlardr. Ayn ekilde Sitozinle biten parack vardr. Bunlar drdnc, beinci ve dokuzuncu bazlardr. Guaninle sona eren bir parack vardr, o da altnc bazdr. Bu durum ekil 32de gsterilmitir.

ekil 32. Dideoksit metodu ile DNA dizili sras tespiti ile retilmi segmentlerin elektroforezi.Byle bir elektroforez sra lamann direk oluumunu mmkn klar. Yldz iareti dideoksi nkleotidi gsterir.(Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.)

332

Yeni sentezlenen rnler ekil 31 de gsterilen reaksiyon rnleri olup primer ve jablon uzaklatrlarak elde edilmitir. Her reaksiyon karm (mesela ddTTP) dideoksitidine trifosfat ieren karm olup zel ve belirli uzunlukta, elektroforezde anlalabilen zel unsurlar retir. Yan tuplerde uzunluklar brbrden br nukleotd farkl degsk uzunlukta DNA molekuller brkr. (ddTTP) reaksiyon karm dizili sras Timinle neticelenen iki eit oluum ierir. Bunlardan biri iki bazlk uzunlukta ,dieri yedi bazlk uzunluktadr.Bylece Timin ve Adeninin btnleri orijinal DNA parasnn 2. ve 7. pozisyonunda belirir. Ancak hem orijinal kol , hemde btnler kol (yeni sentez)orijinal dizili srasn verir.nk (DNA) iki sral olup bir koldaki dizili sras btnler koldaki dizili sras ile belirlenir. Okuma islem bandlar aagdan yukar dogru okuyarak mesela en alttak band (A) dr cuku ust hzasndak o bandn bulundugu tupler (A) tasyor eklnde yaplr. DNA sentezi bittikten sonra eski primer daha sonra anlatlacak olan bir metoda gre uzaklatrlr ve sadece yeni sentezlenen DNA paras kalr. Yeni replike olacak segment her reaksiyon karm iin deiik boyutlarda olup poliakrilamid Jel zerinde elektroforeze tabi tutularak mevcut segmentin boyutu belirlenir. Sadece yeni sentezlenen (DNA) segmenti radyoaktif iaretli olduundan otoradyografi yeni sentezlenen DNAnn izini gsterecektir. Jelin otoradyografisinde bu durum grlecei gibi her alt rnek primer yaplanma (sentez balama yeri) da balayan, zincir bitirici dideoksi baz ise neticelenen uzunlukta paracklar retir. Bylece aadan balayarak yukar ve geriye doru Jel okunmak suretiyle (DNA) parasnn dizili sras olarak belirlenir. nk bunlar, ekil 33de gsterildii gibi her biri merdiveni andrdndan bu Jellere genellikle Merdiven Basama Jeli yada Merdiven Jel denir.

333

ekil 33. Dideoksit metoduna gre DNA dizili srasnn tespiti. (Dideoksi dizilim jelinin autoradyografisi). Altta yer alan G, A, T ve C harfleri srasyla ddGTP, ddATP, ddTTP ve ddCTP reaksiyon karmlarmlarn gstermektedir. Ayn karm birden fala yrtlerek (mesela solal ve suter6) bant tanmlama kolayl amaclar. dorulama iin btnler kolur dizi aralklarda yapar. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.) Bu teknik orijinal Plus-Minus metodunda ilk kez x174 DNA fajnn genomunun analizinde kullanlmtr. Bu yap Faj klf iinde bir kollu DNAya sahiptir. Bakteri iine girdikten sonra DNA ift kollu hale gelir. Bu Jel yapsnda primer yap (balama yeri) oluturulmas nisbeten daha kolaydr. Konukuda ift kollu halka form restriksiyon endonkleazle muamele edilerek, ift kollu paracklar oluturulur. Bu paracklar denatre edilir. Bu karmdan belki zel fragment elektroforezle izole edilir. zole edilen kol Faj bandan alnan, tek kollu DNA ile birleir ve yeni byme iin primer oluumu salanm olur.

334

(5387) Baz ifti uzunlukta X174 Fajnn ddeoksi metodunu kullanarak dzlmnn belrlenmes nisbeten kolay olmutur.

ekil 34. x176 fajnn genomu dideoksi dizili sras analizine maruz kalr. nk faj hem bir, hem de iki kollu ekilde olabilir.Bylece dizili sras analizi iin ilem grebilir. ift kollu form endonkleazlar ile fregmentlere ayrlr. Bir fregment elektroforezle izole edilir ve hibrize edilerek yeni DNA sentezi iin, primer oluturmak iin bir kol ile hibridize edilir. Bylece dideoksi dizili sras yaplm olur. Yeni sentezlenen DNA ayn restriksiyon enzimi ile muamele edilerek izole edilebilir.Bylece orjinal ile ayn kesik uc olumu olur.Yeni izole edilen paralar ekil 33deki gibi elektroforeze tabi tutulur. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.) DZL SIRASI ANALZNDE GEREKL OLAN PRMER (BASLAMA YER) KONFIGURASYONU OLUUMUNUN MEYDANA GETRLMES Dideoksi metodunu etkili bir biimde uygulamak iin genel nitelikte bir primerin oluturulmas gerekir. Bu ama E. Coli vektrnn tek kollu Faj (M)-13 DNAsn kullanarak uygulanan rekombinant DNA ilemleri ile saglanr. (M)-13 Faj x174 Fajna benzer. Her ikisi de bir kollu DNA biiminde kaltsal ierie sahip olup, her ikisi de konuku iinde ift kollu sarmal biiminde oalr. Bu yzden konuku iinde ift kollu forma replike olma formu (R.F)denir. Bu form standart metotlarda dzenlenebilir. Bir kollu form ise dizili sras analizinde kullanlr. Bu sistem aada belirtilen ekilde alr.

335

J.Messir ve arkadalarnn ok dikkatli dzenlenmi almalar ile Lac(Z) isimli bakteriyel genlerde (R.E) iin birok kesm yeri oluturulmutur. Klonlanan unsur (M-13) iine sokulmutur. -galaktsidoz enziminden sorumlu gen laktozu paralar. Bu enzim ayn zamanda enzimin suni substrat (etkilenen madde) olan X-gali de paralar. X-gal normal olarak galaksidoz aracl ile ayrlp paralandnda, X-gal mavi renkli olur. Bu yzden fonksiyonel (Lac Z) geni mevcut ise (M-13) plakalar mavidir. Eer gen iine klonlanan yabanc ierik ile engellenmi ise (X-gal) paralanmaz ve plakalar renksiz olur. nk (M-13) gerek plakalar oluturmaz ve E.Coli hcrelerini lisize edemez. Bylece bakterinin azalm bymesi nedeniyle bulank, amurlu yerler oluur. Faj DNAsnn klonlama yerinin ters akm ynndeki Faj DNAs blgesinde btnler oligonkleotid primerler sentezlenebilir. Klonlanm yabanc ksm ieren, bir kollu Faj DNAs izole edilir. Sentetik oligonklotidler ile hibridize edilebilir.

ekil 35. (M13) Faj ,hem bir kollu ve hemde iki kollu formlar olduundan Dideoksi Metodu ile klonlanm (DNA) paralarnn dizili sras analizi iin yararl bir vektr (tayc) dr. Ayrca (lacZ) geni iinde restrksyon enzimleri iin tanma yerleri ierir. Bu zellik yabanc (DNA) paralar ile araya sokulmu ksmlar ieren klonlarn seilmesini salar. Klonlarn yerine bitiii ile hibritleecek oligonkleotitler yeni sentez iin, ihtiya olan primerleri salar. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabndan modifiye edilerek alnmtr.)

336

Bu ilem klonlanm DNAnn dideoksi sra analizi iin primer oluumunu (balama yeri) oluturur. Hemen hemen klonlanabilen btn DNA segmentleri bu genel metodu kullanarak dizili sras analizine tabi tutulabilir. Merdiven basama jel ilemi sadece 400 baz ifti uzunluuna kadar etkilidir. Bunlar daha byk blgelere sra analizleri st ste akan segmentlere aminoasit dizili sras analizne benzer ekilde st ste akan modellerin sra analizi ve yeniden yaplmas suretiyle belirlenir. st ste akan DNA segmentlerinin dizili sras analizinde iki yada daha fazla R.E kullanlr. DNA sra analizi konusundaki yakn zaman keifleri drt florosens boyay ierir. Her boyann dalga boyu farkldr. (505, 512, 519, 526 nanometre). Her bir 4 dideoksinkleotidler farkl boya balama yerine sahiptir. Yeni sentezlenen fregmentler izole edildikten sonra drt replikasyondan elde edilen rnler birlikte ayn poliakrilamid jelde elektroforeze tabi tutulur. Sonra jel argon lazerde taranarak boya moleklnn yerleri kesilip karlr. Bir aygt da renk zayflama yerlerini belirler ve direk olarak, dizili srasn otomatik olarak okur. Bu metod byk lde dizili analizini basitletirir. Bu yntem radyoaktif iaretleyici ihtiyacn hafifletir ve azaltr. ster dideoksi metodu, ister kimyasal metodla dizili sras analizi yaplr. Her iki yntem bir jelde yzlerce nkleotidi okumamz salar. Tm viral prokaryotik ve eukaryotik virus genomunun bylece analizi ve dizili sras belirtilebilir. Gilbertin Nobel dlnde dedii gibi, DNA molekl yaps zldke btn canl hcrelerin tm hcrelerinde esas olan unsurlar anlam olacaz. GEN KLONLAMANIN PRATK SONULARI TIP: Tpta genetik mhendislii ile nemli ilerlemeler salanmtr. te yandan genlerin nasl altna dair bilgiler, bu almalarla artmtr. te yandan rekombinant DNA metodolojisi gelitirilmi, daha nce eksiklii ekilen nemli unsurlarn bolca elde edilmesi salanmtr. Mesela inslin interforez byme hormonu, byme faktrleri, kan phtlama faktrleri, hepatit-B Herpes, kuduz gibi hastalklara kar alar gelitirilmitir. Genetik mhendislii hastalklarn tehis ve tedavisi iin Anti body retimini mmkn klmtr. nsan genomunun dizili sras analizi ile daha ileri dzeyde genlerin, eitli hastalklardan sorumlu genlerin yerlerinin belirlenmesi iin daha ayrntl bilgileri salayacaktr. Bugne kadar nemli genlerin yeri klonlanm ve dizili sras analizi yaplmtr. Ayrca R.F.L.P. tekrar ve P.C.R. ile eitli bireylerin yapsnn almalar yaplmtr. te yandan transgenik fare, klonlanm koyun olgusunun sonular taksonomik bakmdan yksek canllarnda klonlanabileceini gstermitir.

337

Bu teknolojinin insan hastalklarna uygulanma sreci henz balang halindedir. 1990da Milli Salk Enstits insanlarda gen terapisi fikrini onaylamtr. Agr combne bagsklk eksklg(SCID) hastalg adenozn deamnaz(ADA) enzm eksklgndendr. Normal ADA gen klonlanms plazmt tasyan etks retrovrus lar araclg le SCID hastasnn T hucrelerne verlerek bir ocuk infzyona maruz braklmtr. Daha sonraki tedavi baarl olmu ve ADA deer dzeyi arttrlmtr. Tedaviler ile eksikliinde immun sistemi fonksiyon bozukluu, Adenosindeaminazdan sorumlu hcreler AIDS, hemofili, Sistik Fibrosis, eker gibi dier hastalklar belkide yakn gelecekte gen terapisi ile tedavi edilebilecektir. TARIM: Tarmda Pseudomonas syrngae adl bakteri modifiye edilerek bitkilerin dondan ar olmas maksad ile buz kristal formasyonunda ekirdek rol gren proteinle ilgili genetik bakmdan delasyon gsteren bitkiler zerinde allmtr. Bu dzenlenmi bakteriler baar ile normal olarak mevcut olanlar ile deitirilirse, s donma noktasna dtnde bitkide kolayca buz kristalleri ekillenmeyecektir. Dier bakteriyel projelerde Rhizobium melliloti de azot tespit yeteneinin arttrlmas bitki kklerini korumak iin Pseudomores fluoreker bcek toksininin sokulmas gibi uygulamalar biimindedir. Bu almalarda pamuk yuvarlak kurdu Dougles gvesi gibi deiik zararl eitleri ldrecek viral ve bakterial soylar gelitirmek amalanr. Bitki ve hayvanlar direk olarak genetik mhendislii ile dzenlenebilir. Bitkiler kuraklk ve virse dayankllk iin daha iyi kaliteli rnler genetik olarak dzenlenebilir. Mesela paralanan hcre duvarnn Polygalaktorinaz enzimi aktiviteleri azalm. Mesela domateste olgunlama ile Polygalaktorinaz enzim aktivitesi azalr ve hcre duvar krl