9/16/19 ts. vũ bích ngọ[email protected] 1...hasc và rbmmsc biệt hoá thành dòng tế...

9/16/19 TS. Vũ Bích Ngọ[email protected] 1

SINH HỌC CỦA TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

Đặc điểm sinh học củatế bào

Các yếu tố ảnh hưởngđến sự thành công củanuôi cấy tế bào

9/16/19 TS. Vũ Bích Ngọc- [email protected]

ĐẶC ĐIỂM CỦA TẾ BÀO ĐỘNG VẬT


Tăng trưởng và phân chia chậm

Tính chất cần giá đỡ

Tính cơ học yếu

Thay đổi kiểu gen và kiểu hình

Cơ chế kìm hãm ngược

Có thể được bảo quản lâu dài bằng phương pháp lạnh sâu

..9/16/19 TS. Vũ Bích Ngọc- [email protected]

Phân chia chậm

Tăng trưởng, phân chia chậm (20-40 giờ)Hiệu suất sinh chất có hoạt tính sinh học thấp


Chu kì tế bào

MMitosis

G1Gap1

G2Gap2

G0

SSynthesis Điểm kiểm soát G2

• cell big• environment suitable

Điểm kiểm soát G2• DNA replicated• cell big• environment suitable

Điểm kiểmsoátMetaphase• NST sắp xếptrên mặt phẳngthoi vô sắc

Interphase: • Kéo dài từ 12-14 giờ trong mô động

vật có vú• Tế bào đang tổng hợp RNA,tạo protein

và phát triển về kích thướco Gap 0 (G0): tế bào thoát ra khỏi

chu kì tế bào và không phân chia o Gap 1 (G1): tế bào gia tăng kích

thước, tổng hợp RNA và protein, có 1 G1 Checkpoint

o S Phase: sự nhân đôi DNA xảy rao Gap 2 (G2): tế bào sẽ tiếp tục

phát triển và sản xuất các protein mới. Có 1 G2 Checkpoint

Mitosis hay M Phase: • Sự phát triển và tổng hợp protein• Tế bào chia thành 2 tế bào giống nhau.• Mitosis thường xảy ra từ 1-2 giờ• Có Checkpoint trong giữa kì của

Mitosis (Metaphase Checkpoint) đểđảm bảo tế bào hoàn thành xong sựphân chia.

• Là điểm quan trọng quyếtđịnh sự phân chia của tế

• Khi tế bào vượt qua điểm này, đi vào phase S, quá trìnhphân chia không thể đảongược.

Điểm kiểm soát G1

• Đảm bảo tế bào phân chia thuận lợi

• Nếu tế bào bị lỗi hoặc tổnthương, G2 checkpoint sẽdừng lại để sửa chữa

• Nếu tổn thương không thểđảo ngược, tế bào đi vàoquá trình apoptosis à đảmbảo DNA hư hỏng tế bàokhông truyền cho thế hệsauà quan trọng trong ngănngừa ung thư

Điểm kiểm soát G2

Điểm kiểm soát thoi vô sắc

Tính chất cần giá đỡ

-TB bám vào giá đỡ để có thể sống sót, phân chia- Ngoại trừ: hồng cầu, TB ung thư, 1 số dòng TB liêntục


Tính cơ học yếu

Không có vách tế bàoè tế bào dễ tổn thương


è Tế bào dễ biến đổi

Thay đổi kiểu gen và kiểu hìnhDung hợp, biến nạp, tải nạp… à tếbào thay đổi kiểu gen và kiểu hình

• Ở mỗi tế bào phân chia, sự tự làm mới và biệt hoáđược quyết định bởitương tác của yếu tố bêntrong và tín hiệu hướngdẫn hoặc tín hiệu chọn lọcbên ngoài


1

MSC của các loài có khả năng biệt hoá thành tế bào mỡ như nhau ở pass 5 (6-8 ngày)

2

rASC và hBMMSC thời gian tạo giọt mỡ dài hơn ở pass10; không có khả năng tạo mỡ sau pass 15

3

rBMMSC và hASC: ít thay đổi khảnăng biệt hoá, thời gian hìnhthành giọt mỡ không khác nhaucho đến pass 20


hASC và rBMMSC biệt hoá thành dòng tế bào tạo xương trong suốt quá trình nuôi cấy

rASC và hBMMSC mất khả năng biệt hoá thành dòng tế bào tạo xương sau pass 10

KÌM HÃM TIẾP XÚC

- ĐIỀU HOÀ SỰ TĂNG

SINH

• Kìm hãm tiếp xúc• Kích thích sự tăng sinh

– Mật độ thấp – Các tín hiệu từ môi trường:

các nhân tố tăng trưởng• Ức chế sự tăng sinh

– Giới hạn mật độ: mật độ tế bào cao

– Kìm hãm tiếp xúc: tương tác tế bào

– Các tín hiệu từ môi trường: p53 gene product

14

Các yếu tố ảnh hưởng đến sự thành công của

nuôi cấy tế bào (tăng sinh invitro)

9/16/19TS. Vũ Bích Ngọc- [email protected]

SỰ TĂNG SINH IN VITRO CỦA TẾ BÀO

– phụ thuộc vào trạng thái tự nhiên của tế bào:• Vai trò của bộ gen – Giới hạn Hayflick• Vai trò của sự biểu hiện gen

– phụ thuộc Môi trường nuôi cấy• Cơ chất tế bào bám• Thành phần sinh lí và sinh hoá của môi trường nuôi• Thành phần của phase khí• Nhiệt độ nuôi• Tương tác tế bào-tế bào và tế bào-chất nền

16

Vai trò của bộ gen -giới hạn HayFlickLeonard Hayflick (1965)

Tế bàophânchia 50-70 lần

Vai trò của bộ gen

Chiều dài telomere giảm theo tuổi

1Hoạt tính của telomerase cao nhất ở các pass đầu tiên

2Mức độ hoạt động củatelomerase khác nhaugiữa các loài và cácnguồn thu: giảm nhiềunhất ở rASC vàhBMMSC

3

Thời gian nhân đôi của rBMMSC không thay đổitrong suốt quá trình nuôi trong khi ở hASC, rASC,

hBMMSC thời gian này tăng gấp 2

Izadpanah R, Trygg C, Patel B, et al. Biologic Properties of Mesenchymal Stem Cells Derived From Bone Marrow and Adipose Tissue. Journal of cellular biochemistry. 2006;99(5):1285

Yếu tố phiên mã

Chịu trách nhiệm điều hoà đặc tính sinhhọc của tế bàoPOU được mã hoá bởi Oct-4

Oct-2 , Sox-2 và Rex 1 điều hoà chặt chẽ trong quátrình phát triển phôi

Duy trì tính đa tiềm năng của tế bào

Các yếu tố khác (bổ sung từ ngoài): địnhhướng sự biệt hoá của tế bàoBMP-6, TGF-β3, dexamethasone, ascorbate 2-phosphate, proline, pyruvate, insulin, transferrin, selenous acid, 5aza-cystidine

22

SỰ BÁM DÍNH IN VITRO• Sự bám dính tế

bào là cần thiếtcho sự tăngsinh và biệthóa

• Các phân tửbám dính tếbào: – Tương tác tế

bào-tế bào: CAMs, cadherins

– Tương tác tếbào-chất nền: integrin, transmembrameproteoglycan

• Phức hợp nối chặt (Tight junctional complex) trong tế bào biểu mô cho sự tương tác tếbào-tế bào.

Các nhân tố ảnh hưởng đến sự bám

dính

23

• Sự phân tách bằng enzyme: tiêu hủy các phântử bám dính và chất nền ngoại bào

• Hầu hết tế bào từ mô rắn phát triển dạng lớpđơn (monolayer)

• Bề mặt bao phủ với Matrix kích thích sự tăngsinh và biệt hóa của tế bào

Experimental Methods 2006

Các yếu tố ảnh hưởng đến sự thành công của nuôi cấy tế bào

Experimental Methods 2006 24

Tế bào thích hợp Điều kiện thích hợpPhase rắn• Cơ chất hay phase mà tế bào phát triển

eg. glass, plastic, collagen, agarPhase lỏng• Các đặc tính sinh lí và lí hóa của thành

phần môi trường nuôiPhase khíNhiệt độĐộ vô trùng của môi trường

Pha rắn

• Tế bào cần bám dính vào một giá thể để sinh trưởng và di chuyển

• Dụng cụ phổ biến nâất là polystyrene plastic• Những cơ chất khác như glass, filter wells• Bề mặt có têể được xử lí với:

• Phủ với cơ chất nền như Collagen, poly-l-lysine, matrigel

• Lớp feeder: monolayer of supporting cells, perhaps promote cell growth and differentiation by cell contact and substance secreted• Neurons on glial cell feeder layers

Phase lỏng

• Thành phần của môi trường– Muối vô cơ

• Cân bằng áp suất thẩm thấu • Điều hòa điện thế màng: sodium, potassium và calcium ions. • Cần thiết cho sự bám dính như enzyme cofactor.

– Carbohydrate• Hầu hết chứa 4-20 mM glucose• Nguồn năng lượng: glycolysis

Phase lỏng

– Proteins and Peptides• Được sử dụng để thay thế hiện diện trong huyết thanh eg. transferrin,

fibronectin – Amino acids

• Quan trọng cho sự tăng sinh và biệt hóa • glutamine có thể đi vào chu trình Kreb’s cycle

– Fatty Acids and Lipid• Quan trọng trong môi trường serum free media e.g. cholesterol and

steroids cần thiết cho các tế bào đặc biệt.

Phase lỏng

– Vitamin• vitamins B cần thiết cho sự phát triển và sự tăng sinh• Tiền chất cho các co-factors• Vitamins thường sử dụng là thiamine, riboflavin and biotin

– Trace Element• zinc, copper, selenium và tricarboxylic acid intermediates. • Selenium is a detoxifier và giúp tách các gốc O2 tự do

Phase lỏng

– Hệ đệm• Hầu hết các tế bào cần pH tối ưu: 7.2 - 7.4 • Kiểm soát pH cần thiết cho nuôi cấy tối ưu:

– Hệ thống đệm bicarbonate/CO2

– Hệ đệm hóa chất: HEPES• Môi trường nuôi cấy thương mại như pH indicator

– vàng (acid) hay hồng (alkali)– Áp suất thẩm thấu

• Tương tự áp suất thẩm thấu 290 mOsm

Phase lỏng

– Huyết thanh• Nhân tố không xác định: albumins, growth factors và growth inhibitors • Gia tăng khả năng đệm • Tăng khả năng bám dính và trung hòa chất độc• Quan trọng cho các tế bào phát triển chậm hay khi nuôi mật độ thấp• Biến thiến từng mẻ• Huyết thanh bất họat nhiệt (incubation at 56ºC for 30 minutes) có thể giúp

giảm rủi ro nhiễm


Phase khí

– Carbondioxide• Quan trọng cho hệ đệm

– 5-10% CO2

– Sản xuất sản phẩm: pyruvate

– Oxy• Hầu hết tế bào cần thiết phân áp oxy thấp• anaerobic glycolysis• Nồng độ oxy cao có thể gia tăng gốc O2 tự do

H3C C C O-

O O

C S

O

H3C CoA

HSCo A

NAD+ NADH

+ CO2

Pyruvate Dehydrogenase

pyruvate acetyl-CoA


Hình dạng tế bào khi nuôi• Hình dạng tế bào khi nuôi cấy ở 2 dạng chính:

– Phát triển huyền phù (như một tế bào đơn hay các cụm nhỏ tế bào) • Dòng tế bào thu từ máu (leukaemia, lymphoma)

– Phát triển dạng monolayer bám dính vào dụng cụ nuôi. • Tế bào thu từ các mô rắn (lungs, kidney), endothelial, epithelial, neuronal,

fibroblasts

Hela-Epithelial

MRC5-Fibroblast SHSY5Y-Neuronal

BAE1-Endothelial

Nhiệt độ

– Nhiệt độ tối ưu phụ thuộc vào loài• Nhiệt độ cơ thể mà tế bào được thu nhận• Nhiệt độ của của vùng mô thu nhận tế bào (skin temperature may be

lower than the rest of the body)


9/16/19 ts. vũ bích ngọ[email protected] 1...hasc và rbmmsc biệt hoá thành dòng tế...

Documents