9/24/18 ts. vũ bích ngọ[email protected] 1 · stt ngày nỘi dung 1 10/9 bài 1. giới...

9/24/18 TS. Vũ Bích Ngọ[email protected] 1

STT Ngày NỘI DUNG

1 10/9 Bài 1. Giới thiệu về kĩ thuật nuôi cấy tế bào động vật (TS. Vũ Bích Ngọc)

2 17/9 Bài 2. Sinh học tế bào nuôi cấy (TS. Vũ Bích Ngọc)

3 24/9 Bài 3. Kĩ thuật nuôi cấy sơ cấp (TS. Vũ Bích Ngọc)

4 1/10 Bài 4. Kĩ thuật cấy chuyền và tạo dòng (ThS. Trương Châu Nhật )

5 8/10 Bải 5. Kĩ thuật bảo quản tế bào (Cô. Lê Thị Ngân Hà)

6 15/10 Bài 6. Kỹ thuật nhận diện tế bào (ThS. Phan Lữ Chính Nhân)

7 22/10 Bài 7. Kĩ thuật phân tách tế bào (ThS. Phan Lữ Chính Nhân)

8 29/10 Bài 8. Kĩ thuật sản xuất kháng thể đơn dòng (ThS. Lê Thị Hạnh )

9 5/11 Bài 9. Kĩ thuật biến đổi gen trên tế bào (ThS. Đào Thị Thanh Thuỷ)

10 12/11 Bài 10. Ứng dụng của kĩ thuật nuôi cấy tế bào trong y học và nông nghiệp- Ôn

tập (TS. Vũ Bích Ngọc)


• thi giữa kì (40%): trắc nghiệm

• thi cuối kì (60%): Trắc nghiệm


Mục tiêu môn học

• Sau khi học xong môn học này, sinh viên: – Hiểu được cấu trúc và chức năng và đặc tính của tế

bào– Hiểu được các vấn đề liên quan đến nuôi cấy tế bào

động vật, công nghệ tế bào gốc như kỹ thuật, quytrình, các yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến tế bàotrước, trong và sau quá trình phân lập, nuôi cấy, tăng sinh, bảo quản, định danh, phân tách tế bào

– Liên hệ được các kiến thức về công nghệ nuôi cấy tếbào sự phát triển của lĩnh vực chăn nuôi và y học


PTN

Sinh học của tếbào động vật

Kỹ thuật nuôicấy tế bào

Một số kỹ thuậtliên quan

Ứng dụng củatế bào động vật

9/24/18 TS. Vũ Bích Ngọc- [email protected]

PHÒNG THÍ NGHIỆM

NGUYÊN TẮC VÀ

TIÊU CHUẨN

NHÀ XƯỞNG

THIẾT BỊ

DỤNG CỤ

ĐIỀU KIỆN LÝ-HOÁ

TRONG KTNC

MÔI TRƯỜNG

NUÔI CẤY TBĐV


Nguyên tắc

• Phải là phòng sạch (clean room, sterile room), vệ sinh tốt…

• Phải đảm bảo an toàn cho người làm việc, tránh lây nhiễm bệnh tật.

• Phải đảm bảo tinh sạch cho các mẫu vật, hóachất hữu cơ.

• Phải đảm bảo tính chính xác các kết quả thínghiệm.


Một số tiêu chuẩn của một phòng thínghiệm sạch

(1) Ap lực trong phòng cao hơn bên ngoài không khí.(2) Độ vô trùng (có 5 cấp bậc 1, 2, 3, 4, 5 - tương ứng với cácmức độ vô khuẩn từ 99; 99,9; 99,99; 99,999; 99,9999%).(3) Độ ẩm (30-45%), hạn chế tối đa đưa nước vào phòng.(4) Độ rung. (5) Độ sạch bụi.(6) Nhiệt độ (điều khiển được).(7) Luồng không khí lưu thông (400m3/giờ).(8) Độ sáng.(9) Mật độ nhân sự làm việc có giới hạn.(10) Không gian hợp lý.(11) Có đủ hệ thống xử lý vệ sinh, hệ thống an toàn.


Khu vực phòng đệm

Khu vực hành lang

Khu vực sản xuất tế bào

Panel và hệ thống khí

Lối đi

Autoclave

THIẾT BỊ

Kính hiển vi Tủ ATSH Máy li tâm góc Máy li tâm văng

Water bath

TS. Vũ Bích Ngọc- [email protected]

Máy pH

9/24/18

Cân phân tích Máy đo ASTT

Máy khuấy từ

THIẾT BỊ

TS. Vũ Bích Ngọc- [email protected]/24/18

THIẾT BỊ

pipet bán tự độngTS. Vũ Bích Ngọc- [email protected]

9/24/18

THIẾT BỊ

Dụng cụ nuôi cấy

Đĩa 35-60-100mm, bình Flask, đĩa nhiều giếng (4-6-24 giếng), bình quay, spinner…Ống ly tâm, pipette


Dụng cụ thủy tinh

• Becher• Chai trung tính• Cá khuấy từ• Pipette thủy tinh


Một số dụng cụ thủy tinh

Bercher ErlenBình định mức

Lam và lamelle9/24/18 TS. Vũ Bích Ngọc- [email protected]


Pipet

9/24/18

Chỉ tiêu Điều kiệnNhiệt độ Hầu hêt là 370C (ĐV có vú, người; trừ tinh trùng-330C); 38,50C

(chim); 25-280C (côn trùng)>20C so với điều kiện tối ưu từng loại TB

Có thể chịu đến -1960C; Sử dụng tủ ấm (incubator) trong nuôi in vitro

pH Duy trì cân bằng Ion, chức năng enzym nội bào, gắn kết hormone với GF lên receptorCó thể làm thay đổi chuyển hoá tế bào gây apoptosis, sản xuấtprotein shock nhiệtNgưỡng: 6,5-7,8, thường được điều chỉnh 7-7,4

Áp suất thẩm thấu Tác nhân chính: muối, glucose Tác động đến sự tăng trưởng và chức năng tế bàoThích hợp 290-310 mOsm

Các loại khí CO2 (5%-10%), O2, N2

Điều kiện Lý - Hoá


Môi trường nuôi cấy TBĐV


Thành phần môi trường

Thành phần Vai trò

Muối vô cơ Cân bằng ASTT, điều hoà điện thế màngCần trong nền chất tế bào (bám gắn và hoạt độngnhư cofactor

Hệ đệm Bicarbonat/phosphat/hepes

Carbonhydrate Glucose, galactose, maltose, fructose (1-4,5 g/l)

Vitamin Cơ chất cho nhiều cofactorThường là riboflavin,thiamin, biotin

Protein và peptide Albumin, transferrin, fibronectin, fetuin

Acid béo và lipid Dạng: cholesterol và steroid Cần trong môi trường không huyết thanh

Yêu tố vi lượng Kẽm, đồng, selenium, tricarrboxylic acid trung gian

Huyết thành Cung cấp chất dinh dưỡng, GF, chống oxy hoá, cải thiện tính dính củatế bào


SINH HỌC CỦA

TBĐV

Đặc điểmcủa tế bàođộng vật

Một số kháiniệm dòng

tế bào

Các cấp độnuôi cấy mô

và tế bàođộng vật


28

Chu kì tế bào

MMitosis

G1Gap1

G2Gap2

G0

SSynthesis

G1 check point• cell big• environment suitable

G2 check point• DNA replicated• cell big• environment suitable

Metaphase check point• chromosome align on spindle

ĐẶC ĐIỂM CỦA TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

29

Chu kì tế bào

• Interphase: – Nhìn chung kéo dài từ 12-14 giờ trong mô động vật có vú– Tế bào đang tổng hợp RNA,tạo protein và phát triển về kích thước

• Gap 0 (G0): tế bào thoát ra khỏi chu kì tế bào và không phân chia• Gap 1 (G1): tế bào gia tăng kích thước, tổng hợp RNA và protein, có 1 G1

Checkpoint• S Phase: sự nhân đôi DNA xảy ra• Gap 2 (G2): tế bào sẽ tiếp tục phát triển và sản xuất các protein mới. Có 1 G2

Checkpoint • Mitosis hay M Phase:

– Sự phát triển và tổng hợp protein ngừng – Tế bào chia thành 2 tế bào giống nhau.– Mitosis thường xảy ra từ 1-2 giờ– Có Checkpoint trong giữa kì của Mitosis (Metaphase Checkpoint) để đảm bảo

tế bào hoàn thành xong sự phân chia.


30

SỰ TĂNG SINH IN VITRO

• Sự TĂNG SINH của tế bào trong nuôi cấy phụ thuộc: – Trạng thái tự nhiên của tế bào:

• Vai trò của bộ gen – Giới hạn Hayflick• Vai trò của sự biểu hiện gen

– Môi trường nuôi cấy• Cơ chất tế bào bám• Thành sinh lí và sinh hoá của môi trường nuôi• Thành phần của phase khí• Nhiệt độ nuôi• Tương tác tế bào-tế bào và tế bào-chất nền



Tính cơ học yếu (dễ vỡ)

Tăng trưởng, phân chia chậm (20-40 giờ)Hiệu suất sinh chất có hoạt tính sinh học thấp9/24/18 TS. Vũ Bích Ngọc- [email protected]


Dung hợp, biếnnạp, tải nạp… tếbào à Thay đổikiểu gen và kiểuhình

Tính chất cần giá đỡ-TB bám vào giá đỡ để có thể sốngsót, phân chia- Ngoại trừ: hồng cầu, TB ung thư, 1 số dòng TB liên tục



Tính cơ học yếu

Tăng trưởng và phân chia chậm

Cơ chế kìm hãm ngược

Tính chất cần giá đỡ

Thay đổi kiểu gen và kiểu hình

Có thể được bảo quản lâu dài bằng phương pháp lạnh sâu

..9/24/18 TS. Vũ Bích Ngọc- [email protected]

• Dòng tế bào

• Dòng tế bào liên tục

• Dòng tế bào tạm thời

• Tế bào sơ cấp

• Tế bào thứ cấp

Một số khái niệm dòng tế bào


(Regenerative Medicine, 2006)

Tăng sinh


Thu nhậncơ quan

Tế bàothứcấp

Cấy chuyền

Cấy chuyền

Tế bào sơ cấp

Nuôi mô

CắtnhỏThànhtế bàođơn

Tế bào sơ cấp


39

Các kiểu nuôi cấy tế bàoàLoại tế bào

1. Nuôi cấy sơ cấp (Primary Culture)– Thu nhận trực tiếp từ các mô và nuôi cấy theo kiểu như

• Sự phát triển ra của các mô trong nuôi cấy• Tách thành tế bào đơn (bằng enzyme hay cơ học)

– Thuận lợi:• Thường giữ được nhiều các đặc tính đã được biệt hóa của

tế bào in vivo.– Bất lợi:

• Ban đầu hỗn tạp nhưng sau đó trở nên nổi trội ở cácfibroblast

• Các nuôi cấy sơ cấp thường tốn công sức• Có thể duy trì in vitro trong thời gian giới hạn

40

2. Nuôi cấy thứ cấp– Cấy chuyền (or passage, or transfer) từ nuôi cấy sơ cấp • Cấy chuyền = quá trình thu nhận và tái nuôi cấy tế bào

sau khi chúng gia tăng số lượng bản sao trong nuôi cấy– Thường chứa kiểu êế bào đơn– Có thể tăng sinh liên tục trong nhiều thế hệ– Có hai kiểu dòng tế bào khi nuôi cấy:• Dòng tế bào• Dòng tế bào liên tục

Các kiểu nuôi cấy tế bào

41

1) Dòng tế bào• Có đời sống hạn định, lão hóa sau một số âần cấy

chuyền nhất định (chừng 30 lần phần chia)

• Thường là lưỡng bội và duy trì một số mức độ biệt hóa

• Cần thiết để thiết lập một hệ thống ngân hàng Master và ngân hàng làm việc để duy trì những dòng này trong thời gian dài

Các kiểu nuôi cấy tế bào

Dòng tế bào liên tục(CHO, Schneider-2, COS1, hela. Vero…: khả năng phân bào vĩnh viễn/dài; không thay đổiđặc tính


43

2) Dòng tế bào liên tục• Có thể tăng sinh không hạn định• Chúng thường là những tế bào chuyển dạng:

– Tế bào từ khối u. – Nhiễm với các viral oncogenes – Xử lí hóa chất (chemical treatments).

• Bất lợi của những dòng này là giữ lại rất ít các đặc tính in vivo.

44

Chuyển dạng (Transformation) Và Chuyển nhiễm (Transfection)

• Chuyển dạng– Cảm ứng thay đổi kiểu hình ban đầu thông qua ưự thay đổi DNA

và sự biểu hiện gen • Tốc độ phát triển• Kiểu phát triển (loss of contact inhibition) • Hình thành sản phẩm chuyên biệt• Kéo dài tuổi thọ• Mất khả năng bám dính

• Chuyển nhiễm– Đưa DNA vào trong tế bào (like viral DNA)

*


46

Tại sao cần nuôi cấy mô/tế bào?• Nghiên cứu– Vượt qua các vấn đề trong nghiên cứu như: • Các tác động của các mô xung quanh• Các biến đổi mà do các điều kiện của động vật

– Giảm các động vật sử dụng• Sản xuất các sản phẩm thương mại– vaccine, antibody, hormone– Tế bào sử dụng cho cấy ghép

NUÔI TẾ BÀO SƠ CẤP

NUÔI CẤY PHÁT TRIỂN MẢNH MÔ SƠ CẤP

CẤY CHUYỀN

*


THU NHẬN MẪU MÔ

CẮT NHỎ (chọn lọc mẫu mô quan tâm, cắt bỏ phần mô chết)

Cắt nhỏ(mảnh nhỏ để

nuôi)

Nuôi mẫu môsơ cấp

Thu nhận tếbào mới

Thu mảnh môthứ cấp

Tách tế bàobằng cơ học(nghiền, ép)

NUÔI SƠ CẤP

Cấy chuyền

DÒNG TẾ BÀO

Tách tế bàobằng enzym

(ủ…)

Trypsin lạnh Trypsin ấm

Ly tâm

Collagenase

Tái huyền phù


Thu nhậncơ quan

Cell lineCấy chuyền

Cấy chuyền

Nuôi sơ cấp

Nuôi mô

CắtnhỏThànhtế bàođơn

Nuôi sơ cấp


Tách tế bào bằng phương pháp khác

Ly tâm đẳng tỷ trọng

Dựa vào marker bề mặt


TẠO DÒNG TẾ BÀO

KỸ THUẬT CHỌN DÒNG TẾ BÀO

CÁC PHƯƠNG PHÁP XÂY DỰNG ĐƯỜNG CONG TĂNG TRƯỞNG VÀ ĐO SỰ

PHÁT TRIỂN


MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY TẾ BÀO MÔI TRƯỜNG HUYẾT THANH MÔI TRƯỜNG KHÔNG HUYẾT THANH Cung cấp hormone và GF cần thiết cho chứcnăng tế bào

Bổ sung hormone, GF

Cung cấp các nhân tố bám dính (fibronectin, vitronectin…)

Phủ đĩa với các nhân tố bám dính hay polylysine

Hoạt động như một đệm pH Sử dụng các hệ đệm hữu cơ…Gắn, bất hoạt hay tách ra các chất độc (hợpchất hữu cơ gắn kim loại…)

Sử dụng nước tinh sạch, chuẩn bị môi trườngtươi, bổ sung albumine…

Chứa các protein bám làm ổn định và/hay giúpvận chuyển các hormone, chất dinh dưỡng vàtế bào

Bổ sung các protein bám như transferrin, eruloplasm…

Cung cấp các chất dinh dưỡng Sử dụng các môi trường phức tạpChứa các chất ức chế protease Sử dụng chất ức chế trypsin khi cấy chuyền và

thêm các chất ức chế protease thích hợpChứa các nhân tố biệt hoá Bổ sung hay không, để điều hoà sự phát triển

tế bào và biệt hoáChứa các nhân tố gây sự lão hoá trong các tếbào chuột bình thường

Không có tác dụng lên sự già yếu tế bào, các tếbào phát triển liên tục9/24/18 TS. Vũ Bích Ngọc- [email protected]

MỘT SỐ KỸ THUẬT LIÊN QUAN

KỸ THUẬT VÔ

TRÙNG

QUAN SÁT TẾ BÀO

KIỂM SOÁT

NHIỄM

ĐÔNG LẠNH TẾ

BÀO


– Khử trùng bằng nhiệt ẩm (nồi autoclave) • Áp suất autoclave và nhiệt độ• 5 psi 1070C • 7 psi 1100C • 10 psi 1150C • 15 psi 1210C • 20 psi 1260C

– Khử trùng bằng nhiệt khô• Nhiệt độ và thời gian khử trùng• 1200C 8 giờ• 1400C 3 giờ• 1600C 1 giờ• 1800C 20 phút

¤ Khử trùng bằng hoá chất: ethanol 70%; formaldehyde…

¤ Một số phương pháp vô trùngthường dùng khácØ Chiếu tia UV: sử dụng cho tủ thao tác

hoặc phòng thao tácØ Chiếu tia Gamma: dùng để vô trùng

các dụng cụ nhựaØ Lọc vô trùng: sử dụng phin lọc với

đường kính lỗ lớn nhất là 1 nm, thường dùng cho các môi trường hoặcchất lỏng dễ bị biến tính ở nhiệt độcao


Kỹ thuật vô trùng

9/24/18

Quan sát tế bào

Sự đổi màu môi trường nuôi tế bào

Kính hiên vi

- Đánh giá sức khoẻ tế bào

- Hình thái tế bào

- Định danh tế bào

- …..


Phát hiện nhiễm Ngăn ngừa nhiễmNguồn: nấm, vi khuẩn, mycoplasma, virus, tế bàoNhận biết: độ acid bất thường, môi trườngđục, xuất hiện quả cầu, dây, quan sát dướiKHV, nhuộm huỳnh quang, kháng thể, phântích PCR

Vệ sinh dụng cụ, khu vực thao tácThao tác độc lập trên mỗi dòng tế bàoLoại bỏ nhiễm: - bỏ vật dụng/mẫu đã bị nhiễm- Dùng kháng sinh/nấm- Tái thiết lập bằng PP pha loãng tới hạn- Ly tâm percoll (nấm mốc/men)

Kiểm soát nhiễm

Mycoplasma Nấm Vi khuẩn9/24/18 TS. Vũ Bích Ngọc- [email protected]

Đông lạnh Giải đôngGiữ tế bào ở trạng thái ngủ (Lưu trữ tế bào

sống trong thời gian dài)

Đưa tế bào về trạng thái sinh lý bình

thường (hoạt hoá tế bào)

Cần có chất bảo quản đông lạnh (DMSO,

glycerol, PEG, trehalo, dextro…)

Cần có môi trường dinh dưỡng

Nên đông lạnh chậm: T0 mát (2-80C) à âm (-

15- -800C)à âm sâu (-1960C)

Nên giải đông nhanh (370C)

Đông lạnh – giải đông tế bào


ỨN

G D

ỤN

G C

ỦA

KỸ

TH

UẬ

T N

CTB

ĐV

MÔ HÌNH THỬ NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BỆNH

SẢN XUẤT CÁC HỢP CHẤT SINH HỌC

CÁC TẾ BÀO ĐỘNG VẬT LÀM NGUYÊN

LIỆU CẤY GHÉP

TẠO CƠ QUAN TỪ TBĐV

SẢN XUẤT CÁC VIRUS DIỆT CÔN TRÙNG 9/24/18 TS. Vũ Bích Ngọc- [email protected]

Mô hình thử nghiệm – chẩn đoán bệnh

Thử nghiệm chất kháng ung thư


Công nghiệp thẩm mỹ


9/24/18TS. Vũ Bích Ngọc- [email protected]

Sinh học tế bàoChẩn đoán tiền sinh



Sản xuất các hợp chất sinh học

- Vaccin virus - Interferone- Kháng thể đơn dòng- Hoạt chất sinh học (nhân

tố chống đông máu, hoạthoá plasminogen…)


Cấy ghép tế bào – cơ quan

Tạo cơ quan từ tế bào động vật nuôi cấy

Tế bào làm vật liệu cấy ghép


9/24/18 ts. vũ bích ngọ[email protected] 1 · stt ngày nỘi dung 1 10/9 bài 1. giới...

Documents