ปญหาพเศษ

เรอง การตรวจสอบเชอ Escherichia coli จากตวอยางอาหารพรอมบรโภค ผกสดและผลไม ภายในมหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตกาแพงแสน โดยวธ MPN Technique และ

ปฏกรยาลกโซโพลเมอเรส Detection of Escherichia coli from Food Samples in Kasetsart University

Kamphaengsaen Campus by MPN Technique and Polymerase Chain Reaction

โดย

นางสาวชตรตน อศวเทพ

สาขาวชาเทคโนโลยชวภาพทางการเกษตร คณะเกษตร กาแพงแสน

PROGRAM IN AGRICULTURAL BIOTECHNOLOGY FACULTY OF AGRICULTURE

KAMPHAENGSAEN

มหาวทยาลยเกษตรศาสตร KASETSART UNIVERSITYพ.ศ. 2546

ปญหาพเศษปรญญาตร สาขาวชาเทคโนโลยชวภาพทางการเกษตร

เรอง

การตรวจสอบเชอ Escherichia coli จากตวอยางอาหารพรอมบรโภค ผกสดและผลไม ภายในมหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตกาแพงแสน โดยวธ MPN Technique และ

ปฏกรยาลกโซโพลเมอเรส Detection of Escherichia coli from Food Samples in Kasetsart University Kamphaengsaen

Campus by MPN Technique and Polymerase Chain Reaction

โดย นางสาวชตรตน อศวเทพ

ควบคมและอนมตโดย

……………………………………………………. วนท …….. เดอน มนาคม พ.ศ. 2547 (ผศ.ดร. พสสวรรณ เจยมสมบต) …………………………………………………….. วนท …….. เดอน มนาคม พ.ศ. 2547 (อ.ดร. มณ ตนตรงกจ)

การตรวจสอบเชอ Escherichia coli จากตวอยางอาหารพรอมบรโภค ผกสดและผลไม ภายในมหาวทยาลยเกษตรศาสตรวทยาเขต กาแพงแสน โดยวธ MPN Technique และ

ปฏกรยาลกโซโพลเมอเรส

นางสาวชตรตน อศวเทพ

บทคดยอ

ในปจจบนอาหารพรอมบรโภคมบทบาทมากในชวตประจาวนของคนไทย อาหารเหลานไดแก ผกและผลไมสดพรอมรบประทาน และผลตภณฑอาหารจากสตวทผานการปรงดวยความรอนมาแลว เนองจากความสะดวกในการจดเตรยมรบประทาน อาหารดงกลาวมทงทเปนอาหารดบและอาหารท ปรงดวยความรอนระดบตาจงไมสามารถทาใหอาหารนนปลอดภยจากเชอจลนทรยทปนเปอนอยไดโดยสมบรณ ดงนนหากมการปนเปอนของเชอในอาหารกอาจทาอนตรายตอผบรโภคได การทดลองนทาการคดแยกเชอแบคทเรย Escherichia coli จากอาหารพรอมบรโภคทจาหนาย ณ รานคาภายในมหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตกาแพงแสน และอาหารอนๆจากหางสรรพสนคา ในอาเภอเมอง จงหวดนครปฐม ผลการศกษาดวยวธ MPN technique ตวอยางสวนใหญพบเชอฟคอลโคลฟอรมมคาในหนวย MPN/100 กรมหรอมลลลตร ในระดบทสง คดเลอกแบคทเรยทงทมและไมมสเขยวเหลอบแสงคลายรอยตดของชนโลหะบนอาหารแขง EMB จานวน 108 ไอโซเลท นาไปทดสอบคณสมบตทางชวเคมดวยปฏกรยา IMViC พบวา ปฏกรยา IMViC ใชตรวจสอบเชอ E. coli ไดถกตองมากกวาการตรวจสอบโดยใชลกษณะโคโลนบนอาหาร EMB วเคราะหดเอนเอทสกดจากเชอทเปนและไมเปน E. coli ทวเคราะหไดจากปฏกรยา IMViC อยางละ 4 ไอโซเลท ดวยปฏกรยาลกโซโพลเมอเรส (พซอาร) และวธ เจลอเลคโตรโฟลซสพบวาดเอนเอทไดจากเชอ E. coli 4 ไอโซเลท ทวเคราะหไดจากปฏกรยา IMViC เกดแถบดเอนเอขนาด 167 กโลเบส ของยน uidA สวนอก 4 ไอโซเลท ทไมใชเชอ E. coli ไมเกดแถบดเอนเอ และการวเคราะหดวยเทคนคเรยลไทมพซอารใหผลเชนเดยวกน จงคาดหวงวาจะใชยน uidA เปนยนเครองหมายในการตรวจสอบเฉพาะเชอ E. coli ตอไป คาสาคญ : Escherichia coli, E. coli, อาหารสด,

ปฏกรยาลกโซโพลเมอเรส, MPN Technique, IMViC test, อาหารพรอมบรโภค, ยน uidA

สาขาวชา : เทคโนโลยชวภาพทางการเกษตร ปญหาพเศษ : ปรญญาตร สาขาวชาเทคโนโลยชวภาพทางเกษตร

มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตกาแพงแสน

อาจารยทปรกษา : ผศ.ดร. พสสวรรณ เจยมสมบต อาจารยทปรกษารวม : ดร.มณ ตนตรงกจ ปทพมพ : พ.ศ. 2547 จานวนหนา : 54 หนา

Detection of Escherichia coli from Food Samples in Kasetsart University Kamphaengsaen Campus by MPN Technique and Polymerase Chain Reaction

Miss Chutiratt Asawathep

Abstract

Ready-to-eat foods, including fresh fruits and vegetables have been involved with daily life of Thai people because of their convenient process to eat. Food cooked with low level of heat and raw food are not safe from microorganism. Contaminated pathogenic bacteria in ready-to-eat foods may be harzardous to consumer health.This study concerned with isolation of Escherichia coli from ready-to-eat foods which were sold by convenient stores and shops at Kasetsart University Kamphaengsaen campus. E. coli was found at the high level of MPN/100 g or ml unit in most of food samples by MPN technique. Totally 108 isolates of bacteria were selected from both isolates with and without metallic sheen on EMB agar plate in completed test. Based on biochemical properties, IMViC test of these isolates were more reliable than EMB agar plate test in completed test. Only DNA profiles from 4 isolates, which were presumed that they were E. coli, were analysed by polymerase chain reaction followed by agarose gel electrophoresis, resulting in a single band size of 167 kb of uidA gene. Analysis of the same selected samples by real time PCR was also performed. The obtained results lead for the use of uidA gene as selective marker for E. .coli detection from foods by PCR or real time PCR in the future. Key words : Escherichia coli, E. coli, food, detection,

polymerase chain reaction, PCR, ready-to-eat food, uidA gene Field : Agricultural Biotechnology Degree : B.S. (Agricultural Biotechnology), Program in Agricultural Biotechnology, Kasetsart University, Kamphaengsaen Campus Adviser : Assist. Prof. Pissawan Chiemsombat Dr. Manee Tantirungkij Year : 2004 Page : 54

คานยม

ขอกราบขอบพระคณ ผชวยศาสตราจารย ดร.พสสวรรณ เจยมสมบต อาจารยทปรกษาการทาปญหาพเศษ และ ดร.มณ ตนตรงกจ อาจารยทปรกษารวม เปนอยางสงในความกรณาใหความร คาปรกษา คาแนะนาสงสอน และชวยเหลอในการทาปญหาพเศษอยางดยงตลอดมาดวยความเอาใจใสและเปนกาลงใจให ขอขอบพระคณคณาจารยคณะเกษตร กาแพงแสน และคณาจารยทกทานทไดประสทธประสาทวชาจนขาพเจาประสบความสาเรจในการศกษา ขอขอบพระคณ ผชวยศาสตราจารย ดร.กมท สงขศลา อาจารยทปรกษา ทใหคาปรกษาทางดานการเรยนและดแลเอาใจใสอยางดเสมอมา ขอขอบพระคณ หนวยจลชววทยาประยกตฝายปฏบตการวจยและเรอนปลกพชทดลอง มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตกาแพงแสน และเจาหนาทของหนวยทกคน คณอรวรรณ ชวนตระกล คณภมารน คณสมชาย ทองปรชา คณปรชา ชวนตระกล คณโสภา คณรจกาญจน นาสนท คณชมนาถ และหองปฏบตการภาควชาโรคพช อาคารศนยเทคโนโลยชวภาพเกษตรคณะเกษตร กาแพงแสน มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตกาแพงแสน ทอานวยความสะดวกในดานสถานท และ เออเฟอการใชอปกรณ เครองมอ และสารเคมดวยดเสมอมา ขอขอบคณ คณนโลบล สจสนธ ทกรณามอบเชอ Erwinia carotovora subsp. carotovora เพอใชในการทดลอง คณวมล สเทา คณจรภา กรตวรพงศ พนสตปรญญาโทภาควชาโรคพชทกคน และ เพอนสาขาวชาเทคโนโลยชวภาพทางการเกษตรทกคน ทชวยเหลอใหกาลงใจระหวางการทาปญหาพเศษครงนและเปนมตรทดตลอดมา ประโยชนและคณคาอนพงมจากปญหาพเศษน ขอมอบแด คณปชยยะ คณยาเกยง (แซตง) คณพอเกรยงศกด และคณแมอญชล (พลสวสด) อศวเทพ ทใหการอบรมเลยงด และใหโอกาสในการศกษา และนองสาว จรสฉาย อศวเทพ ทเปนกาลงใจอนสาคญยงของขาพเจาตลอดมา และขออทศใหแกบรรพบรษ เจากรรมนายเวร และบรรดาสตวโลกทงหลายดวยเทอญ

ชตรตน อศวเทพ มนาคม 2547

(1) สารบญ

หนา สารบญ (1) สารบญตาราง (2) สารบญภาพ (3) คานา 1 ตรวจเอกสาร 3 อปกรณและวธการ 19 ผลและวจารณ 26 สรปผลการทดลอง 47 เอกสารอางอง 48 ภาคผนวก 53

(2)

สารบญตาราง

ตารางท หนา

1 การจาแนกชนดของแบคทเรยใน ตระกลเอนเทอโรแบคทรเอซ 5 2 ชนดของตวอยาง และสถานทเกบตวอยางทใชในการแยก

เชอแบคทเรย Escherichia coli เกบตงแต เดอน เมษายน ถง เดอน ตลาคม พ.ศ. 2546 เวลา 10:30 น. – 13:00 น. 28

3 ผลการวเคราะหเชอ E. coli ทแยกไดจากตวอยางอาหาร ดวยวธ MPN technique และสมบตทางชวเคม 32

4 ผลการตรวจวเคราะหเชอแบคทเรย E. coli ดวยวธพซอาร 40

(3) สารบญภาพ

ภาพท หนา

1 ผงแสดงวธการตรวจสอบเชอแบคทเรย Escherichia coli ในตวอยาง 20 2 แสดงยน uidA ทผลตเอนไซม β-glucuronidase และ ยนตางๆ

ในพลาสมด pBI121 21

3 แสดงการเกดแกสในหลอดดกแกสของหลอดอาหารเหลว EC medium เมอนาไปบมทอณหภม 44.5 องศาเซลเซยส นาน 24 ชวโมง 30

4 แสดงลกษณะการเจรญของเชอทแยกไดจากอาหาร EC medium บนอาหารแขง EMB เมอเพาะเลยงในอณหภม 35 องศาเซลเซยส เปนเวลา 24 ชวโมง 30

5 แสดงผลการทดสอบปฏกรยา IMViC กบเชอแบคทเรย E. coli และ Enterobacter spp. 31

6 ผลการเพมปรมาณยน uidA ของเชอ E. coli โดยเทคนคพซอาร และตรวจสอบขนาดดเอนเอใน 1.7% agarose gel, 100 โวลต, 40 นาท 41

7 ผลการสกดดเอนเอจากไอโซเลทของ เชอ E. coli และ เชอ Enterobacter spp. ดวยวธ CTAB 42

(4) 8 (ก) กราฟการเรองแสงระหวางการเกดปฏกรยา real-time PCR

ในแตละรอบเมอปรบความเขมขนของ MgCl2 เปน 2, 3 และ มลลโมลาร ตามลาดบ ใชพลาสมด pBI121 เจอจางเปน 1 ตอ 100 จากความเขมขน เรมตนทสกดได เปนดเอนเอตนแบบ และใชไพรเมอร UAL-1939 และ UAR-2105 (ข) แสดง melting curve เมอปรบความเขมขนของ MgCl2 เปน 2, 3 และ มลลโมลาร ตามลาดบ ใชพลาสมด pBI121 เจอจางเปน 1 ตอ 100 จากความเขมขนเรมตนทสกดได เปนดเอนเอตนแบบ และใชไพรเมอร UAL-1939 และ UAR-2105 (ค) ผลการเพมปรมาณยน uidA ของพลาสมด pBI121 โดยเทคนค เรยลไทมพซอาร และตรวจสอบขนาดดเอนเอใน 1.7% agarose gel, 100 โวลต, 40 นาท 44

9 กราฟการเรองแสงระหวางการเกดปฏกรยา real-time PCR ในแตละรอบ เมอปรบความเขมขนของดเอนเอตนแบบ (พลาสมด pBI121) ใช 3 ความเขมขน ไดแก ความเขมขนเรมแรกทสกดได และ ปรบความเขมขน เปน 1:10 และ 1:1000 ตามลาดบ เสนสนาเงน เปน control (ไมใสดเอนเอตนแบบ) เสนสเขยว, สแดง และ สดา ใชความเขมขนเรมแรกทสกดได และปรบความเขมขนเปน 1:10 และ 1:1000 ตามลาดบ และใชไพรเมอร UAL-1939 และ UAR-2105 46

1

คานา

ในปจจบนอาหารพรอมบรโภค เชน ผกและผลไมทปอกและหนจาหนายพรอมบรโภค และ ผลตภณฑจากเนอสตวทผานการปรงดวยความรอนไมสงมากนกเปนทตองการของผบรโภคทตองการความสะดวกรวดเรวและจดเตรยมเพอการบรโภคไดงาย ผลตภณฑอาหารมกไดมาจากผลตผลทางการเกษตรมกจะมการปนเปอนของจลนทรยชนดตางๆ บอยครงทประชาชนบรโภคอาหารเหลานโดยไมไดผานกระบวนการปรงอาหาร หรอผานความรอนทสงมากพอทจะทาลายจลนทรยและสปอรของจลนทรยทกอใหเกดโรคทปนเปอนมากบอาหารนนได ในชวง 5-6 ป ทผานมานมรายงานการเกดโรคระบาดสผทบรโภคอาหารเหลาน เชน ผกสลด ตรวจพบการปนเปอนของจลนทรยททาใหเกดโรคหลายชนดซงอาจปนเปอนในระหวางขนตอนการผลต อาจปนเปอนจากดน ฝน อากาศ นาทใชในการเกษตร แมลงและสตว (มนทกานต, 2545) กลมจลนทรยสาคญทมกจะทาใหเกดโรคเกยวกบระบบทางเดนอาหารโดยเฉพาะเชอในกลม Escherichia coli เปนเชอชนดหนงททาใหอาหารเปนพษ ใชเปนดชนสาหรบตรวจสอบการปนเปอนของเชอทพบในอจจาระ (กญจนา, 2542) เชอนพบไดในผลตภณฑหรออาหารสดประเภทเนอสตว เชน เนอกง เนอไก เนอบดสกๆดบๆ (นรนาม, 2545; Anonymous, 2002) เปนตน เปนทแนชดแลววาไฟออนๆซงใชทาแฮมเบอรเกอรแบบสกๆดบๆนนไมสามารถฆาเชอ E. coli O157:H7 ได (นรนาม, 2545)

มาตรฐานดานจลนทรยของผลตภณฑอาหารทสงออกไปจาหนายตางประเทศอาจมความ แตกตางกนในแตละประเทศ เชน รายการทจาเปนตองตรวจของกงแชแขงจะตองไมพบเชอ E. coli (จารวรรณ, 2537) ปจจบนประเทศไทยมการนาระบบ HACCP (Hazard Analysis Critical Point) ซงคณะกรรมาธการมาตรฐานอาหารระหวางประเทศ (CAC-Codex Alimentarius Commission) ยอมรบใหใชในอตสาหกรรมอาหาร เพอใหผลตภณฑอาหารมคณภาพดตรงตามมาตรฐานถกสขลกษณะและปลอดภยตอผบรโภค โดยเฉพาะการตรวจสอบความปลอดภยของจลนทรยเปนสงสาคญ ซงกาหนดให E. coli เปนแบคทเรยทใชเปนดชนในการบงชคณภาพของผลตภณฑ การตรวจสอบเชอ E. coli ในอาหารเปนดชนสขาภบาล (Sanitary index) ทแสดงวาอาจมการปนเปอนจากอจจาระ ทาใหผลตภณฑอาหารนนมโอกาสทจะมเชอโรคทางเดนอาหารปะปนอยดวยหากมการปนเปอนยอมแสดงถงสขลกษณะการผลตอาหารทไมไดคณภาพมาตรฐานสากล เนองจากการประเมนคณภาพความปลอดภยของ ผลตภณฑอาหารเพอการสงออกตองวเคราะหหาปรมาณปนเปอนของเชอ E. coli ตามขอกาหนดของประเทศผนาเขาทกตวอยางเพอออกหนงสอรบรองคณภาพ (นงลกษณ และนตยา, 2544) ความถกตองและรวดเรวของการตรวจสอบการปนเปอนของเชอโรคจงเปนสงสาคญทงในดานการควบคมการระบาดของโรค การจดการดานสขาภบาลการผลตอาหาร และการสงออกผลตภณฑอาหารไปขายยง ตางประเทศ หากผลการตรวจสอบผดพลาดหรอใชเวลาในการตรวจสอบนาน ยอมสงผลกระทบตอการ

2

สงออกผลตภณฑอาหารของประเทศไทยได นอกจากนการตรวจพบเชอนแสดงถงการแพรระบาดของโรค ไดมการพบยน uidA ในเชอแบคทเรยหลายชนดรวมทงเชอ E. coli จงมการผลตไพรเมอรสาหรบตรวจสอบเชอน ดงนนจงไดทาการศกษาการใชเทคนค MPN (Most Probable Number) การทดสอบ คณสมบตทางชวเคมดวยปฏกรยา IMViC และการใชปฏกรยาลกโซโพลเมอเรสหรอพซอาร (Polymerase chain reaction หรอ PCR) เพอศกษาประสทธภาพการตรวจสอบการปนเปอนของ เชอ E. coli สาหรบพฒนาวธการทรวดเรวและเหมาะสมตอไป

วตถประสงค เพอศกษาการตรวจสอบเชอ Escherichia coli ทปนเปอนในอาหารพรอมบรโภคโดยใชวธ

MPN technique และปฏกรยาลกโซโพลเมอเรส สาหรบนามาใชประโยชนเปนแนวทางในการปรบปรง วธการตรวจสอบตอไป

สถานททาการทดลอง 1. หนวยจลชววทยาประยกตฝายปฏบตการวจยและเรอนปลกพชทดลอง

มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตกาแพงแสน จงหวดนครปฐม 2. หองปฏบตการภาควชาโรคพช อาคารศนยเทคโนโลยชวภาพเกษตร คณะเกษตร กาแพงแสน

มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตกาแพงแสน จงหวดนครปฐม

ระยะเวลาในการทาวจย เรมตงแตเดอน เมษายน–เดอน ธนวาคม พ.ศ. 2546

3

ตรวจเอกสาร

1. ลกษณะโดยทวไปของเชอแบคทเรยทใชในการทดลอง

1.1 ลกษณะโดยทวไปของเชอ Escherichia coli จนส Escherichia เปนจนสทอยในตระกลเอนเทอโรแบคทรเอซ (Family Enterobacteriaceae)

เชอ E. coli เปน type species ของจนสน ลกษณะเปนเซลลรปทอน ขนาด 1.1-1.5 x 2.0-6.0 ไมโครเมตร แกรมลบ ไมสรางสปอร อาจเคลอนทดวยแฟลกเจลลาหรอไมเคลอนท เปนพวก facultatively anaerobic บางสายพนธทแยกไดจากนอกลาไสสรางแคปซลได ใหโคโลนเรยบ ไมมส มเสนผาศนยกลาง 2-3 มลลเมตร ในเวลา 18 ชวโมง เมอเลยงในอาหาร MacConkey agar โคโลนมสแดงชมพขนาดใหญเนองจากเฟอรเมนตแลกโตส และโคโลนมสมนวาวคลายโลหะเมอเลยงในอาหาร Eosin methylene-blue agar (EMB) และ Endo agar ถาเลยงบนอาหารผสมเลอดบางสายพนธเกดการยอยสลายเมดเลอดแดงแบบบตาฮโมไลซส เชอนเจรญไดในอณหภมชวงกวาง (15-45 องศาเซลเซยส) บางสายพนธทนความรอน 60 องศาเซลเซยส 15 นาท หรอ 55 องศาเซลเซยส 60 นาท สมบตทางชวเคมทสาคญ ไดแก การทดสอบ IMViC ไดผล + + - - คอ สามารถใชทรปโทเฟนใหอนโดล และใหผลบวกกบเมทลเรดแตไมสรางอะซตลเมทลคารบนล (acetyl methyl carbinol) และไมใชซเตรทเปนแหลงคารบอน นอกจากนยงมไลซนดคารบอกซเลส (lysine decarboxylase) และสามารถใชอะซเตต (acetate) เปนแหลงคารบอนได (นงลกษณ, 2544; Brenner, 1984) สมบตทางชวเคมทใชวเคราะหเชอ E. coli และ เชอแบคทเรยอนๆ ทใชในการศกษาแสดงในตารางท 1 mol% G + C ของดเอนเอ คอ 48-52 (สายพนธ ATCC 11775)

การศกษาลาดบเบสทงจโนมของเชอ E. coli คอ รวมทงโครโมโซม และพลาสมด เรมตงแตป ค.ศ. 1997 โดย Blattner และคณะ มสวนชวยพฒนาเครองมอทางพนธกรรม และสรางวธการใหมในการกาหนดบทบาทของสวน open reading frame (ORFs) อกมากมายทยงไมทราบหนาท ในป ค.ศ. 1997, ค.ศ. 2000 และ ค.ศ. 2001 ศกษาลาดบเบสได 4.6, 5.5 และ 5.6 เมกกะเบส ดวยความสนใจทจะนาไปใชทางดานเทคโนโลยชวภาพ หาขอมลเพมเตมไดท www.tigr.org/tdb/mdb/ (Nierman, 2002) 1.2 ลกษณะโดยทวไปของ Enterobacter spp.

จนส Enterobacter อยในตระกลเอนเทอโรแบคทรเอซ เดมมชอวา Aerobacter ประกอบดวย 8 สปชส ทอาศยอยในดนและนา และลาไสคนและสตว ม 6 สปชส ทเกยวของกบโรคในคน คอ E. cloacae, E. aerogenes, E. agglomerans, E. gergoviae, E. sakazakii และ E. taylorae (นงลกษณ, 2544) เซลลเปนรปแทง ขนาด กวาง 0.6-1.0 ไมโครเมตร x ยาว 1.2-3.0 ไมโครเมตร แกรมลบ เคลอนทดวยแฟลกเจลลา เปนพวก facultatively anaerobic เจรญไดงายบนอาหารเลยงเชอธรรมดา ใชนาตาลกลโคสไดกรดและแกส แตไมเกดแกสจากกลโคสทอณหภม 44.5 องศาเซลเซยส สายพนธสวนใหญใหผลลบกบการทดสอบ methyl red แตใหผลบวกกบการทดสอบ Voges-Proskauer

4

คอสามารถสรางอะซตลเมทลคารบนล (acetyl methyl carbinol) ได สามารถใชซเตรตและมาโลเนทเปนแหลงคารบอนและพลงงานได ไมเปลยนไธโอซลเฟต (thiosulfate) ไปเปน ไฮโดรเจนซลไฟด (hydrogen sulfide) ไมสรางเอนไซม deoxyribonuclease (Dnase), Tween 80 esterase และ ไลเปส สมบตทางชวเคมแสดงในตารางท 1 เจรญไดดทอณหภม 30 องศาเซลเซยส สายพนธทเกยวของกบโรคของคนสวนใหญเจรญไดท อณหภม 37 องศาเซลเซยส mol% G + C ของดเอนเอ คอ 52-60 (Brenner, 1984) 1.3 ลกษณะโดยทวไปของ Erwinia caratovora subspecies caratovora

เปนสบสปชส ทอยใน Class Schizomycetes, Order Eubacteriales, Family Enterobacteriaceae, Genus Erwinia, Species caratovora เซลลเรยบกลม หรอเปนทอนทรงกระบอก ขนาด 0.5-1.0 x 1.0-3.0 ไมโครเมตร แกรมลบ เคลอนทโดยแฟลกเจลลารอบตว เปนพวก facultatively anaerobic อณหภมทเหมาะสม คอ 27-30 องศาเซลเซยส ยอยนาตาลกลโคสในสภาพทไมใชอากาศ (ออกซเจน) สรางกรดจากนาตาล ฟรคโตส กาแลคโตส ด-กลโคส บตา-เมทลกลโคไซด และ ซโครส ใช อะซเตท ฟมาเรท กลโคเนท มาเลท และ ซคซเนท เปนแหลงคารบอน และพลงงาน การผลต gas จากคารโบไฮเดรตไมสมาเสมอ บางชนดไมผลตกาซ บางชนดผลตนอย แตเมอเลยงไปนานๆจะไมผลตเลย สมบตทางชวเคมแสดงในตารางท 1 เชอสามารถทาใหเกดการเนาของเนอเยอสะสมในพชหลายชนด ทาใหเกดโรคแกพชในอาการแบบ นโครซสแหง ปม เหยวและเนาเละ mol% G + C ของดเอนเอของ 11 สายพนธ อยในขอบเขต 50.5-53.1 (สายพนธ ATCC 15713) (Krieg, 1984)

5

ตารางท 1 การจาแนกชนดของแบคทเรยใน ตระกลเอนเทอโรแบคทรเอซ1 (ปรบปรงจาก Brener, 1984)

Esch

erich

ia co

li

Esch

erich

ia co

li, ina

ctive

Esch

erich

ia ad

ecarb

oxyla

ta

Esch

erich

ia bla

ttae

Enter

obac

ter ae

rogen

es

Enter

obac

ter ag

glome

rans

Enter

obac

ter cl

oaca

e

Enter

obac

ter ge

rgovia

e

Enter

obac

ter in

terme

dium

Enter

obac

ter sa

kaza

kii

Shige

lla bo

ydii

Shige

lla dy

sente

riae

Shige

lla fle

xneri

Shige

lla so

nnei

Erwinia

carot

ovora

2

การสรางกรดจากนาตาลแลคโตส + [-] - + d + d + + - - - - + การสรางอนโดล + [+] + - - [-] - - - [-] [-] d d - - Methyl red + + + + - d - d D [-] + + + + N Voges-Proskauer - - - - + d + + + + - - - - N การใชซเตรท - - - d + d + + + + - - - - + ยน uidA + + - - - - - - - - + + + + - หมายเหต 1 +, 90-100% ใหผลเปนบวก; [+], 76-89% ใหผลเปนบวก; d, 26-75% ใหผลเปนบวก; [-], 11-25% ใหผลบวก; -, 0-10% ใหผลบวก;

N, ไมมขอมล 2+, 80% หรอมากกวาใหผลเปนบวก; -, 20% หรอนอยกวาใหผลเปนบวก; N, ไมมขอมล

5

6

2. การทาใหเกดโรคของเชอ Escherichia coli Dupont และคณะ กลาววา ปรมาณของเชอ EPEC (Enteropathogenic E. coli) ททาใหเกด

โรคทองเสยในคนอยชวง 107-108 เซลลตอกรมของอาหาร กลมทเปนสายพนธททาใหเกดโรคบดโดย ไมสรางสารพษอยชวง 106 ถง 107 มระยะฟกตวประมาณ 6-36 ชวโมง (ปรารถนา, 2543) เชอ E. coli ททาใหเกดโรคในคนและสตวอาจทาใหเกดโรคดงน (นงลกษณ, 2544; Nataro และ Kaper, 1998) 2.1 ทองรวง (Gastroenteritis)

2.1.1 Enterotoxigenic E. coli (ETEC) สรางเอนเทอโรทอกซน 2 ชนด คอ ทอกซนชนดไมทนความรอน (heat-labile enterotoxin, LT) และ ทอกซนชนดทนความรอน (heat-stable enterotoxin, STa และ STb) พบความสาคญครงแรกวาเปนสาเหตของโรคทองรวงของลกสกร การศกษา ETEC ใน ลกสกรทาใหทราบกลไกการเกดโรความพลาสมดสงเคราะหเอนเทอโรทอกซน 2 ชนด ปจจบน ETEC ทาใหเกดโรคทองเสยรนแรงในเดกทารก และทองรวงออนๆ ในคนทวไป เมอกนนาและอาหารทมเชอปนอย ตองมเชอ 108 จงเกดโรคได

2.1.2 Enteropathogenic E. coli (EPEC) เปนกลมทสาคญเนองจากเปนสาเหตโรคทองรวง รนแรงในเดกทารก จนถง 2 ขวบ ในประเทศกาลงพฒนา ไมเกดโรคในผใหญ ไมสรางทอกซน มพลาสมดสรางสารเพอการจบแนนกบเซลลของลาไสเลก

2.1.3 Enteroinvasive E. coli (EIEC) ลกษณะทางชวเคม พนธกรรม และการเกดโรคคลายกบ เชอ Shigella ไมยอยนาตาลแลคโตส สราง Shiga-like toxin-I (SLT-I) และ Shiga-like toxin-II (SLT-II) ทาใหเกดโรคทองรวงคลายโรคบด ปวดทอง มหนอง และเลอดออกในอจจาระ เกดไดกบคนทกวย

2.1.4 Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) พบครงแรกทสหรฐอเมรกา เปน E. coli O157 สายพนธทพบมากคอ E. coli O157:H7 ทาใหเกดทองรวงอาการตกเลอดทลาไส (Hemorrhagic colitis) ทองเสย และปวดทองรนแรง พบไดในคนทกวย และโรค hemolytic uremic syndrome (HUS) ซงพบไดในคนทกวยแตพบมากในเดกและทารก สาเหตไตวายในเดก ถายอจจาระเปนเลอด อาเจยน ซดขาว เนองมาจากทอกซน เรยกวา เวอโรไซโททอกซน (Verocytotoxin) หรอ เวอโรทอกซน (Verotoxin) จงอาจเรยกเชอนวา เวอโรไซโททอกซเจนก E. coli (Verocytotoxigenic E. coli หรอ VTEC) ทอกซนนมสมบตทางแอนตเจนคลายกบ เชอ Shigella จงเรยกทอกซนนวา Shiga-like toxin (SLT) การระบาดเกดจากการรบประทานอาหารปนเปอนเชอทไดรบความรอนไมเพยงพอ เชน แฮมเบอรเกอร เนอบดดบ นมดบ รวมทงนาดมนาใช 2.2 ทางเดนปสสาวะอกเสบเนองจาก E. coli

กลมทกอใหเกดโรค ไดแก ซโรไทป 1, 2, 4, 6, 7, 9, 15, 16, 18 และ 75 สราง ฮโมไลซนเกาะตดเยอบผวทางเดนปสสาวะ ผหญงมโอกาสเปนมากกวาผชาย ทาใหเกดโรคกระเพาะปสสาวะอกเสบ ภาวะไตและกรวยไตอกเสบ

7

2.3 เยอหมสมองอกเสบในเดกทารก สาเหตของโรคในเดกทารกอาย 1 เดอนแรก เกดมากทสดจากเชอ E. coli เกดจากสายพนธ K1

มากทสด และ streptococci group B โดยรบมาจากมารดา 3. การปนเปอนจาก E. coli

ในระหวางป ค.ศ. 1973-1987 มรายงานการเกดโรคระบาด เนองจากการบรโภคอาหาร เปน 2% ของการเกดโรคทงหมด 2% ของโรคระบาดทางเดนอาหาร มสาเหตมาจากการบรโภคผกและ ผลไมสด ตอมาระหวางป ค.ศ. 1988 และ ค.ศ. 1991 สดสวนของการเกดโรคระบาดจากการบรโภคอาหาร เพมขน เปน 5% และ 8% ตามลาดบ สาเหตสวนใหญเกดจากการรบประทานผลไมทม การปนเปอนจลนทรยชนดทเปนสาเหตของโรค IFT (1995) รายงานวาในระหวางป ค.ศ. 1973-1987 มรายงานการเกดโรคระบาดในสหรฐอเมรกา 7,458 ครง สาเหตเนองจากอาหารเปนพาหะจานวน 237,545 ราย และในการเกดโรคระบาด 7,219 ครง มสาเหตมาจากงานบรการอาหาร 79% และ การเตรยมอาหารภายในบาน 21% (มนทกานต, 2545)

มาลยและคณะ รายงานวา ประเทศไทยมการสารวจอาหารหาบเรแผงลอยจานวน 216 ตวอยาง พบวามการปนเปอนของเชอจลนทรยเกอบทงหมด โดยเฉพาะอาหารทสามารถบรโภคไดทนท และควรหลกเลยงอาหารทบรโภคกบผกสด อาหารครงสกครงดบ เพราะมการปนเปอนของเชอจลนทรยสงมาก ระหวางป พ.ศ. 2535-2539 กรมวทยาศาสตรการแพทยกระทรวงสาธารณสข ไดทาการวเคราะหอาหารปรงสาเรจทวางขายในเขตกรงเทพมหานคร มการเกบตวอยางอาหารเพอนามาวเคราะหในแตละป พบวาอาหารปรงสาเรจผดมาตรฐานปรมาณ จลนทรยทกาหนดไว อยระหวาง 23-37% และสาเหตท ผดมาตรฐานพบเชอโรคอาหารเปนพษ เชน E. coli สวนอาหารพรอมบรโภคมขอมลปรากฏ ในป พ.ศ. 2539 ผดมาตรฐานรอยละ 25.2 % สาเหตทผดมาตรฐานมการตรวจพบเชอโรคอาหารเปนพษ เชน E. coli เปนตน เกณฑคณภาพทางจลชววทยาของอาหารปรงสกทวไป คอ นอยกวา 3 MPN ตอกรม (ปรารถนา, 2543) ปรารถนา (2543) พบเชอ E. coli ในทกตวอยางจากการสมตรวจไกตมสก กอนนามาทาขาวมนไก

4. การใชยน uid เพอตรวจเชอ E. coli ยน uid เปนยนทอยในโครโมโซมของ เชอ E. coli มผทาการศกษาไวดงน Jefferson และคณะ (1986) ทาการหาลาดบเบสทงหมดของยน uidA (β - Glucuronidase

gene) จากการโคลนยน uidA ใน E. coli K-12 โดยใชยน lac ควบคมการแสดงออกของยน uidA ท สรางเอนไซม β-glucuronidase (β-D-glucuronoside glucuronoso hydrolase, EC 3.2.1.31) เปนเอนไซมในตระกล hydrolase ทมสภาพเปนกรด เรงการสลายตวของ glucuronides นาหนก 68200 เปน เอนไซมทคงทน มความไว ละลายนาได และงายตอการตรวจสอบดวยสบสเตรททจาหนายเปน การคา กอนหนานในป ค.ศ. 1973 และ ค.ศ. 1976 Novel และคณะ ไดวเคราะหยน uidA พบวา

8

เปน structural gene ตอมา ในป ค.ศ. 1982 และ ค.ศ. 1985 Blanco และคณะ ตพมพลาดบเบสของสวนควบคมของยน uidA (uidA regular region หรอ uidR)

Cleuziat และคณะ (1990) ตรวจยน uidA ดวยเทคนคการใชตวตรวจจบ (probe) และ เทคนคพซอาร การใชตวตรวจจบยน uid มความไวในการตรวจเชอแบคทเรย 3.1x 104 colony forming units (CFU) สวนการตรวจสอบยน uid ดวยวธพซอาร มความไว 8 CFU ตอ 1 หลอดปฏกรยา พบวา ตวตรวจจบและไพรเมอรของยน uidA ทออกแบบขนไมสามารถแยกความแตกตางระหวาง เชอ E.coli และ Shigella spp.ได แตสามารถแยกเชอ S. baydii, S. dysenteriae, S. flexneri และ S. sonnei และ E. coli ออกจากแบคทเรยสายพนธอนทสามารถสรางเอนไซม β-glucuronidase ได เมอใชตวตรวจจบของ 3 สวนของยน uid ไดแก ตวตรวจจบของยน uidR (uidA regulatory region) สวนของ intercistronic region และ สวนของยน uidA สามารถตรวจ 93% ของ E. coli และ 94% ของสายพนธของ Shigella spp. ได ทเหลอเปนเชอสายพนธทไมสามารถสรางเอนไซม β-glucuronidase และไมเกดการสงสญญาณจากตวตรวจจบ คดเปน 7% และ 6% ตามลาดบ สวนเชอ Enterobacteria ชนดอนไมทาใหเกดการสงสญญาณจากตวตรวจจบ ยกเวน เชอ Esherichia vuneris สายพนธหนงซงสามารถสรางเอนไซม β-glucuronidase ได ผลการตรวจ ยน uid ใน E.coli และ Shigella สายพนธตางๆดวยการใชวธพซอารเพมปรมาณดเอนเอของ uidA open reading frame (1.806 กโลเบส) พบวายน uid เหลานมความจาเพาะเจาะจงสงกบเชอ E.coli และ Shigella เกดการเพมปรมาณยน uid เหลานเฉพาะกลมของเชอ E.coli กบ Shigella spp. เทานน มเชอ E. coli บางสายพนธทไมสรางเอนไซม β-glucuronidase แตสามารถตรวจพบยน uid ได 15% ของ สายพนธของเชอ E. coli และ 58% ของสายพนธของเชอ Shigella spp. ตรวจไมพบกจกรรมของเอนไซม β-glucuronidase สวนเชอ Salmonella arizonae และ Enterobacter cloaceae สามารถสรางเอนไซม β-glucuronidase แตตรวจไมพบยน uid

ปกตการจาแนกเชอ E. coli ในอาหารและนาใชวธการวเคราะหโดยใชสารเรองแสงเปนพนฐาน การเรองแสงเกดจากเอนไซม β-glucuronidase (GUD) ทสงเคราะหมาจากยน uidA ใน E. coli ทสามารถยอยสบสเตรท 4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG) เพอปลอยอนมลทเรองแสงได Feng (1982), Hartman (1989) และ Moberg (1988) พบวา 94% ของ E.coli สายพนธตางๆ และ 44% ของ Shigella spp., 44% ของ Salmonella spp. และ 29% ของตระกล Enterobactericeae สามารถสรางเอนไซม GUD ได ยกเวนเชอ Enterohemorrhagic E.coli ซโรไทป 0157:H7 ททาใหเกดโรครนแรงนนไมสรางเอนไซม GUD

Feng และคณะ (1991) ออกแบบตวตรวจจบขนาด 18 ลาดบเบส ทมความจาเพาะกบยน uidA ของเชอ E. coli ซงสามารถตรวจจบไอโซเลทเชอ E. coli ได 112 ไอโซเลท จาก 116 ไอโซเลท ทแยกไดจากตวอยางอจจาระของมนษยและสงแวดลอม ประกอบดวยเชอ E. coli ทไมสรางเอนไซม GUD

9

31 ไอโซเลท และ Enterohemorrhagic E. coli ซโรไทป O157:H7 12 ไอโซเลท การใชเทคนค Southern hybridization กบทกไอโซเลททนามาตรวจสอบพบชนสวนดเอนเอขนาด 900 คเบส ทไดจากการตดยน uidA ดวยเอนไซมตดจาเพาะ HinfI แสดงวา เชอ E. coli สวนใหญ รวมทง E. coli ซโรไทป O157:H7 มลาดบเบสของยน uidA แตกมเชอ E. coli บางไอโซเลท ตรวจพบการสราง เอนไซม GUD แตตรวจไมพบการเรองแสงจากตวตรวจจบ หรอพบการเรองแสงนอย การทดลองนใหผลสอดคลองกบการทดลองของ Bej และคณะ ในป ค.ศ. 1990 ทใชวธพซอารใชไพรเมอรทออกแบบเพอตรวจสอบยน uidA โดยเฉพาะ ปรากฏวา ดเอนเอตนแบบจากไอโซเลทของเชอ E. coli ทไมพบกจกรรมของเอนไซม GUD แตพบการเพมปรมาณของยน uidA แสดงวา การทไมพบกจกรรมของเอนไซม GUD อาจเนองมาจากลาดบเบสของยน uidA เปลยนไป หรอยน uidA สรางเอนไซม GUD ทไมทางานขน

วธทดสอบ Colilert เปนวธการตรวจสอบคณภาพนาทเสนอใหใชแทนวธการเลยงเชอในอาหารเลยงเชอเดม ซงสามารถตรวจ total coliform โดยใชการตรวจสอบกจกรรมของเอนไซม β-galactosidase ดวยปฏกรยาททาใหเกดสขน และใช O-nitrophenyl-β-galactopyranoside (ONPG) ทาใหสามารถตรวจเชอ E. coli ซงเปนแบคทเรยทอาศยอยในอจจาระ โดยใชการเกด transformation ของเอนไซม β-D-glucuronidase ใช 4-methyllumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG) เปนสบสเตรททเรองแสงได (MMO-MUG test) วธเลยงเชอแบบเกาใชเวลา 48-72 ชวโมง สวนวธทดสอบ Colilert ใชเวลา 24 ชวโมง ตรวจไดทงเชอ E. coli และ เชอแบคทเรยโคลฟอรม แต E. coli บางสายพนธใหผลลบกบ MUG ทาให E. coli ทกอใหเกดโรคอาจตรวจไมพบ ดงนนการทดสอบ MUG อาจประมาณการมอยของเชอ E. coli ตากวาความเปนจรง องคกรพทกษสงแวดลอมของสหรฐอเมรกา (U.S. Environmental Protection Agency) ยอมรบใหใช วธทดสอบ Colilert ตรวจสอบเชอโคลฟอรมทงหมด (total coliform) ได และเคยยอมรบการใชพนฐานการทดสอบเชงโครงสรางโดยใชสบสเตรท MUG ในป ค.ศ. 1990 Bej และคณะ รายงานวาวธพซอารและการใชตวตรวจจบของ ยน lacZ สามารถใชตรวจสอบแบคทเรยโคลฟอรมทงหมดได และตรวจสอบเชอ E. coli, Salmonella spp. และ Shigella spp. ไดดวยการเพมจานวนดเอนเอสวนของยน lamB ซงสงเคราะหเอนไซม β-galactosidase

Bej และคณะ (1991 ก) ตรวจสอบคณสมบตของยน uid ดวยวธพซอาร และการใชตวตรวจจบของยน uid เพอตรวจสอบเชอ E. coli เปดโอกาสใหสามารถใชเปนการตรวจสอบเฉพาะเชอ ฟคอลโคลฟอรม (fecal coliform) ได ทาการตรวจสอบโดยใชวธพซอาร และตวตรวจจบของ ยน lacZ และยน uid ควบคไปกบเอนไซมเปาหมายของ Colilert test เพอตรวจสอบโคลฟอรมทงหมด และฟคอลโคลฟอรม ตามลาดบ ตรวจสอบ เชอ E. coli และ Shigella ชนดตางๆ รวมทง E. coli ทไมพบกจกรรมของเอนไซม β-glucuronidase ดวยการเพมปรมาณดเอนเอ และวธใชตวตรวจจบของ 3 สวนของยน uid ทตางกน ประกอบดวย ตวตรวจจบ UAP-1, UAP-2 สาหรบยน uidA และ URP-1 สาหรบยน

10

uidR ไพรเมอร UAL-754 กบ UAR-900 และUAL-1939 กบ UAR-2105 สาหรบยน uidA และ URL-301 กบ URR-432 สาหรบยน uidR ความไวของวธพซอารเมอใชไพรเมอร และตวตรวจจบของ ยน uidR สามารถตรวจสอบดเอนเอจากจโนมของ เชอE. coli ไดในปรมาณทนอยมาก คอ เทากบ 10 ฟโกกรม (fg) เทากบการตรวจสอบ 1-2 เซลล ของแบคทเรย ยงไปกวานนประมาณ 18% ของ จานวนครงทการทดสอบดวยตวตรวจจบ สามารถตรวจสอบไดถงระดบ 1 fg เลยทเดยว การใชยน lacZ และ ยน uidA หรอ ยน uidR ในการตรวจสอบฟคอลโคลฟอรม เปดโอกาสใหนาไปใชเปนวธการใหมทรวดเรวและนาเชอถอ เพอประเมนคาความปลอดภยจากแบคทเรยในนา และควรจะหาวธทเปนทางเลอกในการตรวจสอบเชอทยงมชวตอยแทนการเลยงเชอแบบเดม มการตรวจเชอ E. coli ดวยวธการพซอารของยน uid ดวยการนาดเอนเอหรอเซลลของเชออนทไมใชเชอ E. coli มาผสมกบดเอนเอหรอเซลลของเชอ E. coli เพอศกษาการรบกวนการตรวจสอบ เชอ E. coli จากดเอนเอสวนทไมใชยน uid ปลายของยน uidA ทสงเคราะหปลายทเปนหมอะมโนของเอนไซม และปลายของยน uidA ทสงเคราะหปลายคารบอกซลของเอนไซม GUD มความเฉพาะและอนรกษในเชอในกลม E. coli และ Shigella spp. 30% ของสายพนธของเชอฟคอลโคลฟอรมทไดมาจากตวอยางทางการแพทย และตวอยางจาก สงแวดลอม แมจะใหผลลบกบการทดสอบกบ MUG นนคอตรวจดวยวธทดสอบ colilert ไดผลเปนลบ กตาม แตสามารถตรวจพบยน uidA และ uidR ดวยวธพซอารได

Bejและคณะ (1991 ข) ตรวจสอบยนเปาหมายดวยวธพซอารโดยใชยนเปาหมายหลายยน (multiplex polymerase chain reaction) ไดแก ยน lacZ และยน uidA และตวตรวจจบ เพอตรวจสอบเชอแบคทเรยโคลฟอรมทงหมด (total coliform bacteria) และเชอ E. coli ตามลาดบ เพอตรวจสอบ คณภาพนา การทดสอบตวอยางนาจากสงแวดลอมดวยวธพซอารเพมปรมาณยน lacZ ใหผลทางสถต ทเทากนกบวธนบเชอจากจานอาหารเลยงเชอ และวธใชสบสเตรทตรวจ ซงทง 2 วธดงกลาว ไดรบการยอมรบจากองคการพทกษสงแวดลอมสหรฐอเมรกาสาหรบการตรวจคณภาพนา

Schlaman และคณะ (1994) หาลาดบเบส สวน open reading frame ของ ยน uidA ทแปลรหสไดเปนเอนไซม β-glucuronidase (GUS) พบลาดบนวคลโอไทดทแตกตางจากการรายงานของ Jefferson และคณะ (1986) กอนหนาน การกลายพนธตาแหนงแรกเกดการเปลยนแปลงลาดบเบส แตไมสงผลใหเกดการเปลยนแปลงกรดอะมโน (silent mutation) ของกรดอะมโนลวซน และอกตาแหนงหนงเปนกรดอะมโนตาแหนงท 279 เกดการเปลยนแปลงจากกรดอะมโนกลตาเมทไปเปนกรดอะมโน กลตามน การศกษาเรองการกลายพนธของยนนมความสาคญ เนองจากยน uidA ของ เชอ E. coli ใชเปนยนรายงานผล (reporter gene) ในการศกษาการแสดงออกของยนของพชชนสงทตองการศกษา และยงสามารถตรวจสอบเอนไซม GUS ในเนอเยอพชโดยตรงได

Fricker และคณะ (1994) ใชวธพซอารในการระบชนด (identification) ของเชอ E. coli และเชอโคลฟอรม หลงจากการปลอยใหเชอเจรญขามคนดวยไพรเมอร 2 ชด (multiplex PCR)

11

ชดแรกเปนไพรเมอรทไดมาจากยน uidA ไดแก URL-301 และ URR-432 (Bej และคณะ, 1991) ใชตรวจเชอ E. coli พบวาเชอ E. coli ทกสายพนธทนามาตรวจ สามารถตรวจพบยน uidA ดวยไพรเมอรชดนได แตลาดบเบสของยน uidA ปรากฎอยในเชอแบคทเรยโคลฟอรมทไมใชเชอ E. coli 5 สายพนธ ไดแก 3 สายพนธ ของ Hafnia alvei และ 2 สายพนธ ของ Serratia odorifera เกดแถบดเอนเอ 2 แถบ ขนาด 154 คเบส และ 264 คเบส ของยน uidA และ ยน lacZ ตามลาดบ การตรวจพบยน uidA ในเชอแบคทเรย 2 ชนดน ยงไมมการรายงานไว สวนไพรเมอรชดท 2 ทออกแบบขนใชระบวา เปนเชอแบคทเรยโคลฟอรมมความถกตองประมาณ 70% ของเชอโคลฟอรมทนามาทดสอบ ดงนนวธ พซอารสามารถใชตรวจสอบเชอ E. coli ไดอยางรวดเรวโดยการใชไพรเมอรชดน แตไพรเมอร ชดทใชตรวจสอบเชอแบคทเรยกลมโคลฟอรมสมควรออกแบบปรบปรงใหมใหมความถกตองมากขน การเพมปรมาณดเอนเอดวยวธพซอารนไมเหมอนการตรวจสอบโดยตรงดวยการเลยงเชอแบคทเรยจากนาดม เพราะปฏกรยาพซอารจะเพมจานวนดเอนเอทงของเซลลทมชวตอย และเซลลทตายแลว ดงนนจาเปนตองใชกลไกบางอยางเพอแยกระหวางเซลลทยงมชวตกบเซลลทตายแลว ปจจบนไพรเมอร ทใชตรวจสอบเชอ E.coli ใชตรวจโคโลนของ เชอ E. coli ทเจรญอยบนเมมเบรน (membranes) ทาใหประหยดเวลาและเปนประโยชนในการควบคมโรงงานอตสาหกรรมทผลตนา และปกปองผบรโภคจากการปนเปอนของเชอฟคอลโคลฟอรมทสามารถทาใหเกดโรคได

การตรวจแบคทเรยทเปนดชนบงชการปนเปอนของอจจาระในนาปจจบนใชปฏกรยาทางเคมภายใตสภาพการเจรญเตบโตทจาเพาะ ไดแก อณหภม อาหารเลยงเชอทจาเพาะ และมตวยบยงและผลตภณฑทไดจากปฏกรยาทางชวเคมทมความจาเพาะ วธการฆาเชอทใชกบนาบรโภคมโอกาสทาใหเซลลเชอโรคไดรบบาดเจบแตเซลลไมถกฆาและอาจฟนขนมาไดอกในระบบการสงนา เซลลทมชวตแตไมสามารถเพาะเลยงบนอาหารเลยงเชอไดน สามารถกลบมาเจรญไดอกครงจนกอใหเกดการแพรระบาดของโรคได ประเทศแคนาดากาหนดใหนาดมตองตรวจไมพบเชอฟคอลโคลฟอรมเลย (0 เซลลตอตวอยางนา 100 มลลลตร) จงจาเปนตองใชวธตรวจสอบทมความไวและนาเชอถอมากทสด วธทางชวโมเลกลเปนวธทตรวจสอบเชอไดนาเชอถอ และมความไวในการตรวจโดยไมจาเปนตองเลยงเชอกอนนามาตรวจ สามารถตรวจเชอทมชวตทงทสามารถเจรญในอาหารเลยงเชอไดและทเจรญบนอาหารเลยงเชอไมได ใชเวลาเพยง 1 ชวโมง แทนทจะตองใชเวลาหลายวนตรวจดวยวธทางชวเคมแบบเกา Juck และคณะ (1998) พฒนาวธการตรวจสอบเชอแบคทเรยในนาทใชบรโภคทมความรวดเรวและมความไวเมอมเชอแบคทเรยอยในระดบตา ใชวธ fitration concentration-nested polymerase chain reaction ประกอบกบสงเกตผลผลตพซอารดวยการยอมดวยเอธเดยมโบรไมดตรวจเชอฟคอลโคลฟอรม และเชอ E. coli ใชไพรเมอร 2 ชดทออกแบบขนจากยน uidA ไพรเมอรคแรกทาใหเกดแถบดเอนเอขนาด 486 คเบส ซงใชเปนดเอนเอตนแบบสาหรบไพรเมอรคทสอง ทาใหเกดแถบดเอนเอขนาด 186 คเบสวธการนสามารถตรวจสอบเชอแบคทเรย 1-10 เซลลในตวอยางนา 50 มลลลตร ภายในเวลา 6-8 ชวโมง เมอเทยบกบการ

12

เลยงเชอบนอาหารเลยงเชอ หรอวธ Southern hybridization ซงตองการ 2-3 วน จงสามารถทราบผลการตรวจได

McDaniels และคณะ (1996) เปรยบเทยบความสามารถในการทาการวเคราะหทางจโนไทป และฟโนไทปของ เอนไซม glutamate decarboxylase (GAD) และ เอนไซม β-glucuronidase (GUS) มาใชตรวจสอบ เชอ E. coli และแยกเชอนออกมาจากแบคทเรยชนดอน สายพนธ เชอ E. coli ทนามาทดสอบ ไดแก เชอ E. coli ทไมทาใหเกดโรค (nonpathogenic E.coli), เชอ E. coli ททาใหเกดโรคทางเดนอาหาร (diarrheagenic E. coli) 3 กลมใหญ, เชอสปชส Escherichia ทไมใช E. coli 3 สปชส และเชอแบคทเรยแกรมลบและเชอแบคทเรยแกรมบวกหลากหลายชนดทพบในนา การวเคราะหจโนไทปแสดงดวยการจบกบตวตรวจจบและเกดการเพมปรมาณดเอนเอขนาด 670 คเบส และ 623 คเบส ซงเปนชนสวนของยน gadA/B (GAD) และยน uidA (GUS) ตามลาดบ เอนไซม GAD ทาหนาทเรงการเกด γ-aminobutyric acid และคารบอนไดออกไซด จากการเกด α-decarboxylation ของกรดอะมโน L-glutamic acid ซงสามารถตรวจวเคราะหฟโนไทปโดยใชสบอกคา pH การวเคราะหทางฟโนไทปของเอนไซม GUD เกยวของกบการ transformation ของ 4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide ไปเปนสารประกอบทเรองแสงได 4-methylumbelliferone การวเคราะหทางฟโนไทปของเอนไซม GAD สามารถใชตรวจสอบเชอ E. coli สายพนธทเปนกลมหลกได ประกอบดวยเชอ E. coli ซโรไทป 0157:H7 และ เชอ E. coli สายพนธทไมทาใหเกดโรคหลายสายพนธซงใหผลลบกบการวเคราะหเอนไซม GUD ทางฟโนไทป การวเคราะหทางฟโนไทปของทงสองเอนไซมตรวจสอบเชอ Shigella ไดไมทกสายพนธจากแตละสปชสของเชอ Shigella สายพนธหนงของ Citrobacter treundii บางสายพนธตรวจไดดวยการวเคราะหเอนไซม GUS แตตรวจไมพบหากใชการวเคราะหเอนไซม GAD นาสายพนธทงหมดของ E. coli และ Shigella ตรวจดวยตวตรวจจบของยน gadA/B และของยน uidA เชอ Escherichia fergusonii สองถงสามสายพนธปรากฎเกดสญญาณขนเลกนอยจากการทตวตรวจจบของยนทงสองไปจบทอณหภม 65 องศาเซลเซยส แตไมเกดสญญาณเลยทอณหภม 68 องศาเซลเซยส นอกเหนอจากนไมพบแบคทเรยชนดอนทปรากฎสญญาณเมอตรวจดวยตรวจจบของยนทงสอง การศกษาครงนใหผลเชนเดยวกบรายงานกอนหนานทชใหเหนวา การวเคราะหเอนไซม GAD ทางฟโนไทปใชตรวจสอบเชอ E. coli ไดจานวนสายพนธทมากกวาการวเคราะหเอนไซม GUS ทางฟโนไทป และคอนขางมความจาเพาะกบเชอ E. coli มากกวา การวเคราะหทางจโนไทปของทงสองเอนไซม พบวาผลทไดมความนาเชอถอเทากนทงสองเอนไซม และมขอดเหนอกวาการวเคราะหเอนไซมทงสองทางฟโนไทป เมอพจารณาขอบเขตความสามารถในการตรวจสอบสายพนธเชอ E. coli และไอโซเลททแยกได สายพนธของเชอ C. freundii, E. vulneris และ H.alvei ตางไมสามารถตรวจสอบดวยตวตรวจจบของ ยน uidA ไดปรมาณดเอนเอเปาหมายทตวตรวจจบของทง 2 ยนสามารถตรวจสอบไดสญญาณทชดเจน คอ ระดบ 1

13

ไมโครกรม การใช multiplex PCR ของยนทง 2 มความเปนไปไดทจะสามารถเพมความเฉพาะเจาะจง และเพมขอบเขตในการการตรวจสอบสายพนธของเชอ E. coli

Igbal และคณะ (1997) ตรวจสอบเชอ E. coli โดยตรงจากนาจากแมนาทประสบปญหา มลภาวะเปนพษ ดวยการใชวธพซอารเพมปรมาณยน uidA การเพมปรมาณดเอนเอโดยใชดเอนเอจากตวอยางสงแวดลอมพบชนสวนดเอนเอทไมใชยน uidA อยในผลผลตดวย แตแกไขใหเกดเฉพาะยน uidA ทตองการดวยวธพซอารทเพมอณหภมในขนทใหไพรเมอรมาจบกบดเอนเอเปาหมาย (annealing temperature) 10 องศาเซลเซยส ในรอบแรก แลวจงลดอณหภมในขนนของแตละรอบถดไปรอบละ 2 องศาเซลเซยส รวม 5 รอบ แลวจงใชอณหภมระดบทเหลอใหคงทในรอบตอไป (touch down PCR) เมอใชยน uidA ซงเปน structural region ของยน uid เปน เปาหมายของไพรเมอร พบวาสามารถเพมปรมาณดเอนเอผลผลตไดดกวาเมอใชสวนของยน uidR ซงเปน regulatory region ของยน uid เปนเปาหมาย รายงานไดแสดงใหเหนสภาวะทเหมาะสมตอการตรวจสอบทจาเพาะกบเชอ E. coli ใชไพรเมอร URL-301 และ URL-432 (Bej และคณะ, 1991) เพมปรมาณยน uidR แลวตรวจสอบดวย ตวตรวจจบ URL-1 (Bej และคณะ, 1991 ก) และไพรเมอร UAL-1939 และ UAR-2105 (Bej และคณะ, 1991 ก) เพมปรมาณสวนทเปน structural region ของยน uidA แลวตรวจสอบดวยตวตรวจจบ UAP-2 (Bej และคณะ, 1991 ก) หลงจากวธ Southern blotting อยางไรกตามภายใตสภาวะทรายงานไว การเพมปรมาณของดเอนเอดวยวธพซอารเกดขนไดเมอใชดเอนเอทสกดจากเชอ E. coli 5.4 X 104 ถง 7.9 X 104 เซลลตอปรมาณเซลลของเชอแบคทเรยทงหมด ประมาณ 9.0 X 107เซลล ทไดจากการสนนษฐานเบองตนดวยวธ MPN technique ในตวอยางนาในสภาวะทเปนจรงตามธรรมชาต

Farnleitner และคณะ (2000) ใชวธ PCR-based denaturing-gradient gel electrophoresis (DGGE) ศกษาความแตกตางของเชอ E. coli สายพนธตางๆ ทมลาดบเบสของยน uidA ทมความ หลากหลายในประชากรของเชอน โดยใชบางสวนของลาดบเบสของยน uidA เพอการตรวจสอบทจาเพาะเจาะจง การตรวจสอบความหลากหลายของลาดบเบสดวยวธ PCR-DGGE และวธพซอาร ซงม ความสมพนธกบการหาลาดบเบสอยางสมบรณ นาเชอ E. coli 50 ไอโซเลท จากแหลงนาจด และ สายพนธทมการอางองทแนนอน 11 ชนด ซงมลาดบเบสตางกนมาตรวจสอบ แสดงใหเหน 9 ตาแหนงทเกดความแตกตางของลาดบเบส และจานวนเฉลยของคเบสทแตกตางกนระหวางชนสวนของยน uidA (ความยาวของดเอนเอทตรวจพบ คอ 126 คเบส) คอ 2.3% ในจานวนสายพนธทนามาวเคราะหขอบเขตของลาดบเบสขอบเขตหนงทมความสาคญทหายากมาก และ/หรอเปนลาดบเบสทมการอนรกษไวในลาดบเบสของเชอ E. coli แสดงไวในรายงาน ใช PCR-DGGE กบตวอยางนาทมมลพษจากการปนเปอนของอจจาระ พรอมกบตรวจเชอ E. coli และหาลายพมพดเอนเอของประชากรจลนทรยทผสมรวมกนอย โดยการแยกสวนของดเอนเอทเกดความแตกตางของลาดบเบสขน ไมมความแตกตางอยางมนยสาคญระหวางแถบดเอนเอทเกดจากการตรวจจากเชอทงทผานและไมผานการเลยงกอนนามาตรวจ แสดงวา

14

บางสวนของเชอทมลาดบเบสทตางกนแตละชนดสามารถเจรญในอาหารเลยงเชอได เนองจากเชอ E. coli ถกนามาใชเปนดชนบอกการปนเปอนของอจจาระ การศกษาครงนจงพจารณาถงขนตอนทสาคญตอไปในการใชเปนเครองมอทใหม และเหมาะสมในการแยกความแตกตางและตดตามมลภาวะการ ปนเปอนของอจจาระในตวอยางนาทกชนด โดยสามารถตรวจเชอ E. coli ดวยวธ PCR โดยไมตอง เลยงเชอในอาหารเลยงเชอ ใชไพรเมอร UAL-1939GC (เพม CG clamp) และ UAR-2105 เปนการพฒนาการตรวจเมอเชอ E. coli ปนอยกบเชออน ไพรเมอรไมจาเปนตองพฒนาจากยน uidA แตใชลาดบเบสทแตกตางกนของเชอ E. coli ทสรางเอนไซมตางๆได

Vorob’ev และคณะ (2000) เสนอการวเคราะหของขอมลททนสมยดวยระบบทดสอบการเพมปรมาณดเอนเอ เพอการระบการมอยของยนของ enterchemorrhagic E. coli (EHEC) เนนความสาคญของการใชไพรเมอรทมลาดบเบสใกลเคยงกนกบยนซงควบคมปจจยสาคญตอการเกดโรคของ EHEC ปจจยเหลานประกอบดวยการสงเคราะหทมจดมงหมายทแนนอน ไดแก เพอการเกาะยดกบลาไส และเพอการรกรานเซลล (ยนbfp, ยนeae, ยนtir) เพอสราง shiga-like toxics (ยนstx1, ยนstx2) เพอทาใหเกดการตกเลอด (ยนehx) สรางเอนไซม serine protease (ยนcpsA) และสราง LPS สวนทจาเพาะของโอแอนตเจน (O-antigen) (ยนrfb) มการวจารณเรองปญหาของการใชไพรเมอรซงมลาดบเบสทไมเกยวของกบยนทอนตรายเหลาน แตอาจใชเพอการระบการมอยของ E. coli 0157:H7 ได (ยนuid, ยนfliC)

Stander และคณะ (2001) ใชวธ Chemiluminescent in situ hybridization (CISH) ระบการมอยและจานวนของเซลลของเชอ E. coli ทเจรญบนอาหารเลยงเชอไดในตวอยางนา ปรมาตร 100 มลลลตร ภายใน 1 วน ตามวธการกรองผาน filter และเลยงเชอในอาหารเลยงเชอ tryptic soy agar 5 ชวโมง ทอณหภม 35 องศาเซลเซยส แตละไมโครโคโลนของเชอ E. coli ตรวจไดโดยตรงจากเยอกรอง (membrane filter) เสนผานศนยกลาง 47 มลลเมตร ใชตรวจจบ soybean peroxidase-labeled peptide nucleic acid (PNA) จบกบสวนเปาหมาย คอลาดบเบส 16S RNA ทมความจาเพาะกบ เชอ E. coli แตละไมโครโคโลนทจบกบ peroxidase labeled PNA probe เมอเตมสบสเตรทททาใหเกดการสองแสงทางเคมไดทาใหเกดแสงซงตรวจไดจากฟลม ดงนนแตละจดทเกดแสงจะแทนเชอ E. coli 1 ไมโครโคโลน ความไวและความจาเพาะเจาะจงของตวตรวจจบ Eco16S07C ทราบไดจากจดท เกดจากการจบกนของตวตรวจจบกบ RNA ของแบคทเรยทง 8 ชนด ตามการคดเลอกตวตรวจจบโดยพจารณาจากการนาลาดบเบสของ 16S ribosomal DNA (rDNA) มาเรยงกน และพจารณาความเหมอนและความแตกตาง มเพยง rDNA ของเชอ E. coli และเชอ Pseudomonas aeruginosa ทสามารถตรวจดวยตวตรวจจบ Eco16S07C ตอมานาไปลดการเกดการจบคกนผดของลาดบเบสดวยตวตรวจจบ PNA blocker probe ทมเปาหมายเปน 16S rRNA ของ P. aeruginosa ความไวและความจาเพาะตอการตรวจ เชอ E. coli โดยใชวธ PNA CISH ตดสนจากเชอ E. coli 8 สายพนธ และเชอแบคทเรยชนดอนอก

15

17 สายพนธ ซงประกอบดวยสปชสทมความเกยวของกนอยางใกลชด นอกจากเชอ E. coli และ Shigella spp. แลวไมมเชอแบคทเรยสายพนธใดเลยทตรวจพบไดดวยวธนซงเปนเรองทสอดคลองกบขอมลลาดบเบส 16S rRNA ยงไปกวานนการตรวจนบปรมาณของไมโครโคโลนของเชอ E. coli แทนดวยจดทเกดแสง ซงสมพนธกนกบ 92% ถง 95% ของโคโลนทสงเกตพบตามการเลยงเชอขามคน วธ PNA CISH ใชเทคนคการกรองดวยดเอนเอแบบเกา และเทคนคการเลยงเชอ และเพมความไวและความเฉพาะเจาะจงของตวตรวจจบ PNA เพมขน เพอใหเกดผลผลตไดเรว และไดผลลพธทนาเชอถอและสมบรณมากยงขน

Frahm และ Obst (2003) ใชเทคนคพซอาร (Taqman) ทอาศยกจกรรมของเอนไซม Taq DNA polymerase ตรวจเชอจลนทรยทเปนดชนในตวอยางนา เทคนคนวดการเพมปรมาณสญญาณ การเรองแสงดวยเครองคอมพวเตอรซงสามารถวเคราะหผลลพธไดโดยตรงหลงจากปฎกรยาพซอารสนสดลง โดยไมตองเพมขนตอนการตรวจสอบอนเขาไป การทดสอบเสรจสมบรณไดภายในประมาณ 5 ชวโมง ไพรเมอรทง 2 ชด และตวตรวจจบไดรบการออกแบบและทดสอบการตรวจสอบทจาเพาะเจาะจงในระดบจนสของจนส Enterococcus spp. การวเคราะหใชลาดบเบส 23 rRNA เปนพนฐาน และการวเคราะหทเฉพาะเจาะจงกบเชอ E. coli ใชลาดบเบสของยน uidA เปนพนฐาน ยนยน ความจาเพาะเจาะจงของการวเคราะหดงกลาว ดวยการทดสอบกบสายพนธตางๆของแบคทเรย เปาหมายทตองการตรวจ และทดสอบความเปนไปไดทจลนทรยชนดอนจะมารบกวนหรอขดขวาง การวเคราะห การประยกตใชเพอทดสอบตวอยางนาจากแหลงนาธรรมชาตจาเปนตองผานขนตอน การเลยงเชอขามคนกอน (enrichment step) เพอใหสามารถตรวจสอบเซลลทยงมชวตอยไดดยงขน เมอนามาเปรยบเทยบกบการตรวจสอบทางจลชววทยาททาคกนในแตละตวอยาง 96% ทวเคราะหวาเปนเชอ Enterococcus และ 98% ทวเคราะหวา เปนเชอ E. coli วธนเปนวธทมความรวดเรว และมความเปนไปไดทจะเปนประโยชนตอการวเคราะหนาดม โดยเฉพาะภาวะการณทเรงดวนและใชปรบปรงดานการสาธารณสข

Ibekwe และ Grieve (2003) ใชวธ real–time polymerase chain reaction ตรวจสอบและระบปรมาณของเชอ E. coli O157:H7 ในดน, ปยคอก, อจจาระและนาทงจากโรงรดนม เตมเชอ E. coli O157:H7 ลงไปในตวอยางดนทปลอดเชอ และผานขนตอนการเลยงเชอกอนนาไปตรวจดวย วธ multiplex PCR ซงเปนวธพซอารทใชไพรเมอรหลายชด นาตวอยางจาก สงแวดลอมตวอยางอนๆ ทนาสงสยวามเชอ E. coli O157:H7 มาตรวจวเคราะหความไวในการตรวจสอบของไพรเมอรทใชยนยนดวยดเอนเอจากเชอ E. coli O157:H7 สายพนธ 3081 ทเตมลงไปในดนแลวนาไปตรวจสอบดวย วธ multiplex PCR เกดเปนความสมพนธเชงเสนระหวางคาการเรองแสง( fluorescence threshold cycle ) และจานวนโคโลน (CFU/ml) ในตวอยางดนทเตมเชอ และตวอยางสงแวดลอมอนๆ ขอจากดสาหรบการตรวจสอบเชอ E. coli O157:H7 ทวเคราะหดวยวธ real–time PCR คอ 3.5 x 103 CFU/ml

16

เมอนาเชอบรสทธมาวเคราะห และ 2.6 x 104 CFU/g เมอนาตวอยางจากสงแวดลอมมาวเคราะห ใชเวลาในขนตอน enrichment step 16 ชวโมง เพอใหตวอยางดนทเตมเชอ E. coli O157:H7 เขาไปสามารถนามาตรวจสอบได คอ มปรมาณของเชอ < 10 CFU / ดน 1 กรม ใช real-time PCR วเคราะหจานวนเชอ E. coli ในปยคอก อจจาระ และนาเสยจากการชะลาง อยในขอบเขต 2.0 x104 ถง 6.6 x104

CFU/การเกดปฏกรยาพซอารหนงครง การวเคราะหดวยวธ real-time PCR สามารถระบปรมาณของเชอ E. coli 0157:H7 ในตวอยางดนและตวอยางสงแวดลอมไดอยางมความไวและรวดเรว ความสามารถ ในการระบปรมาณจานวนเซลลของเชอ E. coli 0157:H7 ทพบในตวอยางจากสงแวดลอมจานวนมาก ชวยในการพจารณาการเพมปรมาณของเชอโรคเพอการประเมนความเสยงและการศกษาเกยวกบการแพรกระจายของเชอได

5. เทคนคการเกบตวอยางเพอปองกนการปนเปอน สงทควรคานงถงในการเกบตวอยางอาหารเพอตรวจวเคราะหนน คอ เทคนคการเกบตวอยาง

แบบปลอดเชอ (aseptic technique) การเกบรกษาตวอยางใหคงสภาพเดมไมเปลยนแปลง และ ปรมาณตวอยางเพยงพอสาหรบการวเคราะห นอกจากน ยงขนอยกบลกษณะทางกายภาพของตวอยางดวย (วนทนา, 2544) เมอระบชอของตวอยาง ลกษณะของตวอยาง ชอผเกบตวอยาง ผผลต ทอยของผผลต วนท และเวลาทเกบตวอยางเสรจแลว ไมควรใหตวอยางทเนาเสยงายสมผสนาแขงโดยตรงเพราะอาจเกดการปนเปอนได ควรใสนาแขงไวในถงกอนแชกบตวอยาง บรรจตวอยางอาหารทเนาเสยไดยากในกลองกระดาษ หรอวสดอนทปองกนกระแทกได สวนตวอยางนาบาดาลผสงตรวจบรรจนาใสในขวดพลาสตกทตมนาเดอดเพอฆาเชอแลวดวยเทคนคปลอดเชอ เครองมอทใชในการสมตวอยาง เชน ปากคบ ตองผานการฆาเชอแลวเชนโดยการตมกบนาเดอด ในขณะเกบตวอยางไมเปดฝาภาชนะ ทงไวเมอบรรจตวอยางทสมเสรจแลวตองปดฝาภาชนะใหสนท หลงจากเกบตวอยางเสรจแลวควรรบนาสงหองปฏบตการเพอตรวจวเคราะหภายใน 36 ชวโมง อาหารทเนาเสยไดงายควรเกบรกษาไว ทอณหภม 0 ถง 4 องศาเซลเซยส บนทกไวขางกลอง กระตก หรอภาชนะของตวอยาง ดวยขอความระบสภาพ ในการเกบรกษา เชน ของเนาเสยงาย หรอระวงแตก เปนตน (วนทนา, 2544)

17

อปกรณและวธการ

1. การสารวจและเกบตวอยาง

สมเกบตวอยางผลตผลทางการเกษตรและผลตภณฑอาหารทคาดวาผบรโภคจะนาไปบรโภคสดโดยไมผานกรรมวธทผานความรอน ไดแก ผกสดและผลไมสดพรอมบรโภคนาผลไม ผลตภณฑจากสมนไพร และผลตภณฑจากเนอสตว รวมไปถงนาบาดาล รวมทงหมดจานวน 108 ตวอยาง จาก 7 แหลง (ตารางท 1 แหลง ก-ช) ประกอบดวยรานคาภายในโรงอาหารทหอพก โรงอาหารทอาคารศนยมหาวทยาลย และรานคาสหกรณ จานวน 3 แหลง ภายในมหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตกาแพงแสน จากแหลงนาในจงหวดนครปฐม 3 แหลง และจากหางสรรพสนคา อาเภอเมอง จงหวดนครปฐม 1 แหลง ระบชอของตวอยาง ลกษณะของตวอยาง ชอผเกบ ตวอยาง ผผลต ทอยของผผลต วนท และเวลาทเกบตวอยาง ตวอยางทเปนของแขงหรอของแขงกงเหลว ไดแก ผกและผลไมสด มะขามคลก มะมวงแผนหย มะขามเปยก ลกชน ไสกรอก กนเชยง แหนม หมยอ และหวชายโปว เกบใหไดประมาณ 25-50 กรม ใน 1 บรรจภณฑ หรอการตกใสถงบรรจถงเดยว เกบปรมาตรตวอยางนา ไดแก นาสบปะรด ผขายบรรจใสถงขายใหทหนารานทนททซอโดยไมใชวธปลอดเชอใหไดประมาณ 25-50 มลลลตร ใน 1 บรรจภณฑ และ นาออย บรรจขวดพาสเจอรไรซปดสนท สวนตวอยางนาบาดาล เกบใสขวดพลาสตกทตมฆาเชอแลวปรมาตร 1 ลตร เกบตวอยาง 3 ใน 4 ของภาชนะเพอปองกนตวอยางลนออกมา ใชเครองมอในการสมตวอยาง เชน ปากคบ ทผานการฆาเชอแลว เมอบรรจตวอยางทสมเสรจแลวตอง ปดฝาภาชนะใหสนท เฉพาะตวอยางยาขมชนดเมดและแคปซลสมนไพรเทานนทเกบใหมากกวา 10-20 กรม ใน 1 บรรจภณฑ เพราะมปรมาณการบรโภคตอครงนอย ตวอยางทสมเกบสวนใหญบรรจในภาชนะทปดสนท จงเกบตวอยางในลกษณะทยงไมไดเปดภาชนะ บรรจตวอยางอาหารทเนาเสยงาย ไดแก ผกและผลไมสด นาสบปะรด นาออย ผลตภณฑอาหารจากสตวพวก ลกชน ไสกรอก ในกระตกนาแขงทใสถงนาแขงไวทกนภาชนะเพอรกษาอณหภมไวท 0-4 องศาเซลเซยส บรรจตวอยางอาหารทเนาเสยไดยาก ไดแก กนเชยง ยาสมนไพร มะมวงแผนหย มะขามคลก มะขามเปยก หวชายโปว และนาพรกปลายาง ในกลองกระดาษหรอวสดอนทปองกนกระแทกได หลงจากเกบตวอยางเสรจแลว นาไปหองปฏบตการเพอตรวจวเคราะหทนท

2. การตรวจวเคราะหเชอแบคทเรย Escherichia coli โดยวธ multiple tube technique (MPN) และ การทดสอบคณสมบตทางชวเคม (กญจนา และคณะ, 2542)

2.1 การตรวจเบองตนเพอระบเชอแบคทเรยโคลฟอรม (presumptive coliform test) ใชเทคนคปลอดเชอในการเปดภาชนะบรรจตวอยางดงน ใชกรรไกรโลหะทจมเอทานอล 95%

ลนไฟฆาเชอแลวตดพลาสตกทบรรจตวอยางอาหารออกใชปากคบทลนไฟฆาเชอแลวเปดบรรจภณฑ ใชปากคบและชอนโลหะทลนไฟฆาเชอแลวชงตวอยางทเปนของแขงหรอของแขงกงเหลวจากภาชนะบรรจ

18

25 กรม ตวอยางทเปนผกผลไมพรอมบรโภคไมตองนาไปลาง ใชมดผาตดทลนไฟฆาเชอแลวสบตวอยางใหเปนชนเลกๆกอนบนจานเลยงเชอทอบฆาเชอแลว สวนมะเขอเทศลกเลก มะมวงแผนหย หวชายโปวหวาน และนาพรกปลายาง สามารถชงแลวนาไป เจอจางในนาทนงฆาเชอแลวไดเลย ใชปเปตตทอบฆาเชอแลวตวงตวอยางนา 25 มลลลตร ไมใหตวอยางและปลายปเปตตสมผสปากขวดหรอภาชนะท บรรจตวอยาง เจอจางตวอยางทชงและตวงไดลงในนาทนงฆาเชอแลวปรมาตร 225 มลลลตร ยกเวน ยาขมชนดเมดและแคปซลสมนไพรใหตกเมดตวอยางชง 10 กรม เจอจางในนานงฆาเชอแลวปรมาตร 90 มลลลตร ใชปเปตตทอบฆาเชอแลวตวงสารละลายเจอจางตวอยางในนา 1 ตอ 10 น ใสลงในอาหารเหลว lactose broth ทมความเขมขนเปน 2 เทา ของปกต (double-strength lactose broth) จานวน 5 หลอด หลอดละ 10 มลลลตร และตวงสารละลายเจอจางตวอยาง ปรมาตร 1 มลลลตร และ ปรมาตร 0.1 มลลลตร ใสลงในอาหารเหลว lactose broth ทมความเขมขนปกต (single-strength lactose broth) จานวน ปรมาตรละ 5 หลอด เขยาหลอดเบาๆนาไปบมทอณหภม 35 องศาเซลเซยส นาน 24 – 48 ชวโมง ตรวจผลโดยสงเกตการเกดแกสในหลอดดกแกสของหลอดอาหาร ถาเกดแกสแสดงวาผลเปนบวกคอ มเชอแบคทเรยโคลฟอรม 2.2 การตรวจเชอแบคทเรย fecal coliform

อนหลอดอาหาร EC broth ทอณหภม 44.5 องศาเซลเซยส ถายเชอ 1 ลป จากหลอดทไหผลบวกใน presumptive coliform test ลงในอาหาร หลงการถายเชอแลวภายใน 30 นาท รบบมเชอท 44.5 องศาเซลเซยส นาน 24 ชวโมง ตรวจผลโดยสงเกตการเกดแกสในหลอดดกแกสของหลอดอาหาร ถาเกดแกสแสดงวาผลเปนบวก นบจานวนหลอดทใหผลบวกไปหาคา MPN จากตาราง MPN 5-5-5 ไดปรมาณมากทสดของ fecal coliform 2.3 การตรวจขนสมบรณ (completed test)

ถายเชอ 1 ลป จากหลอดทใหผลบวกในการตรวจเชอแบคทเรย fecal coliform นาไป streak ลงบน Eosin methylene blue agar (EMB) บมท 35 องศาเซลเซยส เปนเวลา 24 ชวโมง ตรวจผลโดยสงเกตลกษณะโคโลนของเชอแบคทเรยโคลฟอรมบนอาหาร EMB มได 2 ลกษณะ ไดแก โคโลนทมสเขม ตรงกลางสเกอบดา ทผวมสเขยวเหลอบแสงคลายรอยตดของชนโลหะ เรยกวา เงาโลหะ (metallic sheen) ซงโคโลนลกษณะนมแนวโนมวาจะเปนเชอแบคทเรย E. coli อกลกษณะหนงคอ ทบแสง เยมเปนเมอกสชมพ ตรงกลางโคโลนสไมเขม โคโลนลกษณะนมแนวโนมวาจะเปนเชอแบคทเรย Enterobacter spp. 2.4 การแยกและเกบรกษาเชอบรสทธ (pure culture)

เขยเชอแบคทเรยโคลฟอรมจากอาหาร EMB เลอกโคโลน 2 กลมจากแตละตวอยาง คอกลมแรกเลอกโคโลนทมแนวโนมวาจะเปนเชอ E. coli 3 โคโลน และกลมท 2 เลอกโคโลนทมแนวโนมวาจะเปนเชอ Enterobacter spp. 2 โคโลน แตละโคโลนในแตละกลมมลกษณะคอนขางแตกตางกน นาแตละโค

19

โลนมาแยกจนไดเชอบรสทธ เลยงเชอนาน 24-48 ชวโมง แลวเกบรกษา 2 แบบ แบบแรกเกบรกษาลงในหลอดอาหารเลยงเชอ nutrient agar slant (วธ subculture) ใชหลอดแบบฝาเกลยวปดใหสนทเกบทอณหภม 4 องศาเซลเซยส ซงตองถายเชอสหลอดอาหารใหมทกเดอน และแบบท 2 เกบในสารแขวนลอยจลนทรย (suspending medium หรอ cryoprotective agent) (นรนาม, 2544) โดยเลยงเชอบรสทธในอาหารเหลว nutrient broth เขยาท 35 องศาเซลเซยส นาน 24 ชวโมง ผสมกบกลเซอรอล (glycerol) ทนงฆาเชอทอณหภม 121 องศาเซลเซยส นาน 15 นาท แลว ใหความเขมขนสดทายเปน 30 เปอรเซนต ปรมาตรสารละลายรวม 1 มลลลตร เกบในตแชแขงอณหภม –80 องศาเซลเซยส 2.5 การทดสอบปฏกรยา IMViC (indole, methyl red, Voges-Proskauer, citrate test)

เพาะเชอบรสทธหรอไอโซเลท (ทมอาย 24-48 ชวโมง) จากแตละโคโลนทคดเลอกไดลงในอาหาร tryptone broth, MR-VP broth และ Simmons Citrate agar slant เลยงไวทอณหภม 37 องศาเซลเซยส ทดสอบอนโดล (Indole test) โดยหยดนายา Kovac’s regent 2-3 หยด ลงไปในอาหาร tryptone broth ทเพาะเชอไวนาน 24-48 ชวโมง เขยาใหเขากน ตงทงไว 5-10 นาท ถาเกด ชนสแดงลอยอยในชนของแอลกอฮอล แสดงวาผลเปนบวกเชอนนมความสามารถสรางสารอนโดลได ทดสอบ methyl red (MR test) โดยหยดนายา MR solution 2-3 หยด ลงไปในอาหาร MR-VP broth ทเลยงเชอไว ตรวจผลทกวนนาน 4 วน โดยแบงมาทดสอบประมาณ 0.1 มลลลตร ถาเกดสแดง แสดงวาผลเปนบวก เชอนนมความสามารถสรางกรดจากนาตาลกลโคสไดในปรมาณทมากพอทจะทาให pH ลดลงถง 4.2 หรอตากวา ทดสอบ Voges-Proskauer (VP test) โดยหยดนายา VP solution 2-3 หยด ลงไปในอาหาร MR-VP broth ทเลยงเชอไวตรวจผลทกวนนาน 4 วน โดยแบงมาทดสอบประมาณ 0.1 มลลลตร ถาผลเปนบวกนายาจะเปลยนเปนสแดงภายใน 20 นาท เชอนนมความสามารถสรางกรดจากนาตาลกลโคสแลวเปลยนตอไปเปนสาร acetyl methyl carbinol ได ผลบวกของการทดสอบ citrate test นน อาหารวนเอยง Simmons Citrate agar slant ทเลยงเชอไวนาน 24-48 ชวโมง จะเปลยนจากสเขยวเปนสนาเงน เนองจากอาหารมสภาพกลายเปนดาง แสดงวา เชอนนสามารถใชซเตรทเปนแหลงคารบอนได (Buchanan และคณะ; Holt และคณะ, 2546) ผล IMViC ของ E. coli เปน + + - - หรอ - + - -

20

1. Presumptive coliform test ใสตวอยางนาในหลอดอาหาร Lactose broth บมท 35 องศาเซลเซยส 24-48 ชวโมง

เกดแกส = ผลเปนบวก มแบคทเรยโคลฟอรม ไมเกดแกส = ผลเปนลบ ไมมแบคทเรยโคลฟอรม

2. Fecal coliform test

ถายเชอจากหลอดเกดแกสลงใน หลอด EC broth บมท 44.5 องศาเซลเซยส 24 ชวโมง นบจานวนหลอดหาคา MPN จากตาราง

เกดแกส = ผลเปนบวก มแบคทเรย E. coli ไมเกดแกส = ผลเปนลบ ไมมแบคทเรย E. coli

3. ตรวจแบคทเรย E. coli (completed test)

Streak ลงบน Eosin methylene blue agar (EMB) บมท 35 องศาเซลเซยส เปนเวลา 24 ชวโมง E. coli ลกษณะโคโลนสเขมตรงกลางโคโลน Enterobacter spp. ลกษณะโคโลนทบแสง สเกอบดา และทผวมสเขยวเหลอบเปนเงาโลหะ เยมเปนเมอกสชมพ

4. แยกจนไดเชอบรสทธแลวนาไปทดสอบปฏกรยา IMViC

(indole, methyl red, Voges-Proskauer, citrate test)

E. coli ผลเปน + + - - หรอ - + - - Enterobacter spp. ผลไมเปน + + - -

5. นาไปตรวจสอบดวยปฏกรยา PCR หรอ real time PCR ภาพท 1 ผงแสดงวธการตรวจสอบเชอแบคทเรย Escherichia coli ในตวอยาง

21

3. การตรวจวเคราะหเชอแบคทเรยEscherichia coli ดวยวธพซอาร (PCR, Polymerase Chain Reaction) 3.1 การเตรยมพลาสมดสายผสมทมยน uidA (GUS) โยกยายเขาสเซลลแบคทเรยเจาบาน E. coli

(Transformation) ดวยวธ heat shock transformation (Sambrooke และคณะ, 1989) โดยดดสารละลายพลาสมด pBI121 (Clonetech, USA) ปรมาตร 5 ไมโครลตร ผสมกบแบคทเรย

เจาบาน E. coli สายพนธ DH 5α competent cell ปรมาตร 100 ไมโครลตร พลกหลอดไปมาเบาๆ แลวแชลงในนาแขงนาน 10 – 15 นาท นาหลอดจมลงในนาอณหภม 42 องศาเซลเซยส นาน 45 วนาท แชหลอดในนาแขงนาน 5 นาท เตมอาหารเหลว LB (Luria-Bertani Medium) ทไมเตมสารปฏชวนะ ปรมาตร 900 ไมโครลตร เขยาดวย shaker ความเรวรอบ 200 รอบตอนาท ทอณหภม 37 องศาเซลเซยส นาน 2 ชวโมง เมอครบเวลานาไปปนตกตะกอนทความเรวรอบ 10,000 รอบตอนาท นาน 1 นาท ดดอาหารออกใหเหลอ 500 ไมโครลตร ดดสารละลายขนลงเพอผสมใหเขากน แลวดดสารละลายผสมปรมาตร 50 ไมโครลตร ไปเกลยบนอาหารแขง LB ผสม Kanamycin 100 ppm เลยงเชอไวทอณหภม 37 องศาเซลเซยส นาน 16 ชวโมง นาโคโลนทเจรญไดมาเลยงบนอาหารแขง LB ผสม Kanamycin 100 ppm เพอเกบเปน stock เชอ ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส

ทมา: Clonetech catalogue 1996 / 97 ภาพท 2 แสดงยน uidA ทผลตเอนไซม β-glucuronidase และ ยนตางๆ ในพลาสมด pBI121

22

3.2 การสกดพลาสมดออกจากเซลลเจาบานดวยวธ Alkaline lysis (Sambrooke และคณะ, 1989) เขยเชอแบคทเรยเจาบาน E. coli สายพนธ DH5α ทไดรบการถายฝากพลาสมด pBI121

มาเลยงในอาหารเหลว LB ทผสม Kanamycin ปรมาตร 500 ไมโครลตร นาไปเขยาทความเรวรอบ 200 รอบตอนาท ทอณหภม 37 องศาเซลเซยส นานขามคน แลวปนตกตะกอนเซลลแบคทเรยทความเรวรอบ 10,000 รอบตอนาท นาน 1 นาท เทอาหารเหลวออก ทาใหเซลลแบคทเรยแตก ดวยการเตม solution I (50 mM glucose, 25 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM EDTA pH 8.0) ปรมาตร 50 ไมโครลตร ผสมใหเขากนดวย vortex mixer แชนาแขงนาน 5 นาท และ solution II (0.2 M NaOH, 1% SDS) ทเตรยมขนใชทนท ปรมาตร 100 ไมโครลตร ผสมโดยพลกหลอดขนลงเบาๆ แชนาแขงนาน 10 นาท จากนนเตม solution III (5 M potassium acetate, glacial acetic acid 1.15 ml, H2O 38.85 ml) ปรมาตร 75 ไมโครลตร ผสมใหเขากนดวย vortex mixer นาน 3 วนาท แชนาแขงนาน 10 นาท หมนเหวยงทความเรวรอบ 12,000 รอบตอนาท นาน 15 นาท ดดนาใสสวนบนซงมพลาสมดอย ปรมาตร 200 ไมโครลตร ใสหลอดใหม ตกตะกอนพลาสมดดวย 3 M sodium acetate (CH3COONa) pH 5.2 ปรมาตร 0.1 เทา ของสารละลายทมอย และ absolute ethanol ปรมาตร 2.5 เทา ของสารละลายทมอย ผสมใหเขากน เกบท –80 องศาเซลเซยส เปนเวลา 20 นาท หมนเหวยงทความเรวรอบ 12,000 รอบตอนาท นาน 15 นาท เทสารละลายออก ลางตะกอนพลาสมดดวย 70% Ethanol ปรมาตร 500 ไมโครลตร หมนเหวยงท ความเรวรอบ 12,000 รอบตอนาท นาน 5 นาท ทาตะกอนใหแหงโดยควาหลอดทงไวจนแอลกอฮอลแหง แลวละลายตะกอนดวยนานงฆาเชอ ปรมาตร 30 ไมโครลตร เกบท –20 องศาเซลเซยส 3.3 การสกดดเอนเอจากเซลลแบคทเรย (Ausubel และคณะ, 1999)

นาเชอแบคทเรยบรสทธของ E. coli และ Enterobacter spp. ทแยกไดจากตวอยางอาหาร และ Erwinia carotovora subsp. carotovora (นโลบล สจสนธ หองปฏบตการศนยเทคโนโลยชวภาพเกษตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตกาแพงแสน แยกไดจากตนขนน และ ใชเครอง Biolog Microlog System, Release 4.2 จาแนกเชอ) มาเลยงในอาหารเหลว LB ปรมาตร 1 มลลลตร เลยงเชอไวทอณหภม 37 องศาเซลเซยส นาน 16 ชวโมง แลวนาไปปนตกตะกอนเซลลแบคทเรย ทความเรวรอบ 10,000 รอบตอนาท นาน 1 นาท เทอาหารเหลวออก ละลายตะกอนใน TE buffer 567 ไมโครลตร เตม 10% SDS ปรมาตร 30 ไมโครลตร และเอนไซม proteinase K ความเขมขน 20 มลลกรมตอไมโครลตร ปรมาตร 3 ไมโครลตร ทงไวทอณหภม 37 องศาเซลเซยส นาน 1 ชวโมง เตม 5M NaCl ปรมาตร 100 ไมโครลตร ผสมใหเขากนดวย vortex mixer เตม CTAB / NaCl solution (10% CTAB/0.7 M NaCl) ปรมาตร 80 ไมโครลตร ผสมใหเขากนดวย vortex mixer แชไวใน water bath ทอณหภม 65 องศาเซลเซยส นาน 10 นาท เตม 24:1 chloroform/isoamyl alcohol ปรมาตรเทากบปรมาตรของสารละลายทมอย ผสมใหเขากนดวย vortex mixer หมนเหวยงทความเรวรอบ 5,000 รอบตอนาท นาน 5 นาท ดดนาใสสวนบนใสหลอดใหม เตม 25:24:1 phenol/chloroform/isoamyl alchohol

23

ปรมาตรเทากบปรมาตรของสารละลายทมอย ผสมใหเขากนดวย vortex mixer หมนเหวยงทความเรวรอบ 8,000 รอบตอนาท นาน 5 นาท ดดนาใสสวนบนใสหลอดใหม เตม isopropanol ปรมาตร 0.6 เทา ของปรมาตรสารละลายทมอย กลบหลอดเบาๆจนดเอนเอตกตะกอน หมนเหวยงทความเรวรอบ 10,000 รอบตอนาท นาน 10 นาท เทสารละลายทง ลางตะกอนดวย 70% Ethanol ปรมาตร 500 ไมโครลตร หมนเหวยงทความเรวรอบ 5,000 รอบตอนาท นาน 5 นาท เทสารละลายทง ทาตะกอนใหแหงโดยควาหลอดทงไวจนแอลกอฮอลแหง แลวละลายตะกอนดวย TE buffer ปรมาตร 100 ไมโครลตร ละลายตะกอนดเอนเอโดยแชไวใน water bath ทอณหภม 65 องศาเซลเซยส นาน 15-30 นาท หมนเหวยงทความเรวรอบ 10,000 รอบตอนาท นาน 10 นาท เกบดเอนเอท –20 องศาเซลเซยส 3.4 การสงเคราะหดเอนเอของยน uidA ดวยวธพซอาร

ใชดเอนเอ (DNA) ทสกดไดมาจากโคลนของแบคทเรยทมพลาสมด pBI121 เปนตนแบบ (template DNA) ในการเพมจานวนดเอนเอของยน uidA ดวยปฏกรยาพซอาร โดยใช ไพรเมอร UAL-1939 และ UAR-2105 ทเปน specific primer มความจาเพาะเจาะจงกบดเอนเอบางสวนขนาด 167 bp บนยน uidA ของเชอ E.coli และเชอ Shigella sp.ทไดมรายงานไวแลว (Bej และคณะ , 1991 ก) ไพรเมอรทใชมลาดบเบส ดงน UAL-1939 5’TATGGAATTTCGCCGATTTT 3’ UAR-2105 5’TGTTTGCCTCCCTGCTGCGG 3’

ปฏกรยาพซอารดดแปลงจาก Bej และคณะ (1991 ก) ใชชดนายาของ บรษท Qiagen โดยเตรยมสารละลายรวม 100 ไมโครลตร เพอแบงใชกบ 5 ตวอยาง ประกอบดวย 10X PCR buffer 10 ไมโครลตร, 25 มลลโมลาร (mM) MgCl2 4 ไมโครลตร, 10 mM dNTP 5 ไมโครลตร, 100 พโคโมล (pmol) ไพรเมอร UAL-1939 1 ไมโครลตร, 100 pmol ไพรเมอร UAR-2105 1 ไมโครลตร, 5U/ไมโครลตร เอนไซม Taq DNA polymerase 0.5 ไมโครลตร, ดเอนเอจากตวอยางๆละ 1 ไมโครลตร และเตมนากลนนงฆาเชอจนมปรมาตรครบ 100 ไมโครลตร นาสวนผสมทไดไปเพมปรมาณดเอนเอ ดวยเครอง PTC-100Tm Programmable (MJ Research, INC.) โดยตงโปรแกรม ดงน (ดดแปลงจาก Iqbal และคณะ, 1997) คอ 95 องศาเซลเซยส 3 นาท 1 รอบ 95 องศาเซลเซยส 1 นาท, 50 องศาเซลเซยส 1 นาท, 72 องศาเซลเซยส 1 นาท 30 วนาท 35 รอบ, 72 องศาเซลเซยส 10 นาท 1 รอบ เกบผลผลตทไดไวท -20 องศาเซลเซยส ตรวจสอบขนาดของดเอนเอผลผลตจากปฏกรยา PCR โดยใชเทคนค agarose gel electrophoresis โดยใช 1.7% agarose gel ใน 0.5X TBE buffer ความตางศกย 100 โวลต เวลา 40 นาท ยอมดแถบของดเอนเอดวยการแชเจลในสารละลาย ethidium bromide 10 ถง 15 นาท แชนานาน 10 นาท ถายภาพและบนทกภาพ

24

3.5 การสงเคราะหดเอนเอของยน uidA ดวยเทคนค real-time PCR สงเคราะหดเอนเอจากยน uidA ดวยปฏกรยาเรยลไทมพซอาร (real-time PCR) โดยใชไพรเมอร

UAL-1939 และ UAR-2105 การทาปฏกรยาใชเครอง LightCycler 3 ของ บรษท Roche โดยเตรยม สารละลายรวม 20 ไมโครลตรตอตวอยาง เตรยมสารละลายผสมรวมของไพรเมอร UAL-1939, ไพรเมอร UAR-2105 กบสารผสมของเอนไซมและสไซเบอร กรน (SYBR Green I dye) ทบรษทใหมา โดยใช 10 ไมโครโมลาร ไพรเมอร UAL-1939 0.4 ไมโครลตร, 10 ไมโครโมลาร ไพรเมอร UAR-2105 0.4 ไมโครลตร และสารผสมของเอนไซมและสไซเบอร กรน 2.0 ไมโครลตร

ทดลองปรบใชความเขมขนของ MgCl2 ใหตางกน 3 ความเขมขน คอ 2 มลลโมลาร 1 หลอด, 3 มลลโมลาร จานวน 2 หลอด สาหรบใชเปนหลอดควบคมคอไมใสดเอนเอตนแบบ (negative control) 1 หลอด และ 4 มลลโมลาร อก 1 หลอด โดยเตม 25 mM MgCl2 0.8 ไมโครลตร, 1.6 ไมโครลตร และ 2.4 ไมโครลตร ตามลาดบ จากนนเตมดเอนเอตนแบบ เจอจาง 1 ตอ 100 จากความเขมขนเรมแรกทสกดได หลอดละ 1 ไมโครลตร และเตมนานงฆาเชอจนมปรมาตรครบ 20 ไมโครลตร นาสวนผสมทไดไปเพมปรมาณดวยปฏกรยาเรยลไทมพซอาร โดยตงโปรแกรมดงนคอ 95 องศาเซลเซยส 10 นาท 1 รอบ แลวจงตง 95 องศาเซลเซยส 5 วนาท 50 องศาเซลเซยส 5 วนาท และ 72 องศาเซลเซยส 7 วนาท 40 รอบ วเคราะหผลจากกราฟทไดจากซอฟทแวร (software) เกบผลผลตทไดไวท -20 องศาเซลเซยส

ทดลองเจอจางดเอนเอ เปน 3 ระดบความเขมขน คอ ความเขมขนทไดจากการสกดเรมแรก 1 หลอด เจอจางดเอนเอในนานงฆา 1 ตอ 10 และ 1 ตอ 1,000 อกอยางละ 1 หลอด โดยเตม 25 มลลโมลาร MgCl2 1.6 ไมโครลตร และจากนนเตมสารละลายดเอนเอ หลอดละ 1 ไมโครลตร เตรยม 1 หลอด ทไมใสดเอนเอตนแบบใชเปนหลอดควบคม และเตมนากลนนงฆาเชอจนมปรมาตรครบ 20 ไมโครลตร นาสวนผสมทไดไปเพมปรมาณดวยปฏกรยาเรยลไทมพซอาร โดยตงโปรแกรม ดงนคอ 95 องศาเซลเซยส 10 นาท 1 รอบ แลวจงตง 95 องศาเซลเซยส 5 วนาท, 50 องศาเซลเซยส 5 วนาท และ 72 องศาเซลเซยส 7 วนาท 50 รอบ

ตรวจสอบขนาดของดเอนเอผลผลตจากปฏกรยา PCR โดยใชเทคนค agarose gel electrophoresis โดยใช 1.7% agarose gel ใน 0.5X TBE buffer ความตางศกย 100 โวลต เวลา 40 นาท ยอมดแถบของดเอนเอ ดวยการแชเจลในสารละลาย ethidium bromide 10 -15 นาท แชนา นาน 10 นาท บนทกภาพ 3.6 ปฏกรยาพซอารของดเอนเอจากแบคทเรยทแยกจากตวอยาง

นาดเอนเอทสกดไดจากไอโซเลทของโคโลนทมการทดสอบเบองตน วาเปนเชอ E.coli และ เชอ Enterobacter spp. มาเจอจาง จนไดความเขมขนทเหมาะสมในการเกดปฏกรยาพซอาร โดยเทยบกบความเขมขนของดเอนเอทสกดได จากไอโซเลทททาปฏกรยาพซอารแลวเกดแถบดเอนเอชดเจน ใชเชอ Erwinia carotovora เปนเชอควบคมทไมใชเชอ E.coli (negative control) ทาปฏกรยาพซอาร โดยใช

25

ไพรเมอร UAL-1939 และ UAR-2105 โดยการทาปฏกรยาพซอารเชนเดยวกน ใชความเขมขนสดทายของไพรเมอร 0.2 ไมโครโมลาร เชนเดยวกบการทาปฏกรยาเรยลไทมพซอาร DNA และใชดเอนเอจากตวอยางๆละ 1 ไมโครลตร นาสวนผสมทไดไปเพมปรมาณ DNA ดวยเครอง PTC-100Tm Programmable (MJ Research, INC.) ตรวจสอบขนาดของดเอนเอผลผลตจากปฏกรยา PCR โดยใชเทคนค agarose gel electrophoresis แชเจลในสารละลาย ethidium bromide และบนทกภาพ

26

ผลและวจารณ 1. ผลการวเคราะหเชอ fecal coliform ทแยกไดจากตวอยางอาหาร

ผลของการวเคราะหหาเชอ fecal coliform ในตวอยางอาหารพรอมบรโภคโดยวธ MPN technique พบเชอ fecal coliform จานวน 22 ตวอยาง จากตวอยางทงหมด 28 ตวอยาง (79%) เกณฑกาหนดของมาตรฐานทางจลชววทยาของอาหารทใชบรโภคกาหนดโดยกรมวทยาศาสตรการ-แพทย คอ ตองไมมเชอ E. coli ซงเปนเชอ fecal coliform เลย หรอมจานวนนอยกวา 3 MPN/กรม หรอ มลลลตร ตรวจพบตวอยางทมคา MPN เกนเกณฑคณภาพในระดบสง คอ > 24000 MPN / 100 กรม หรอ 100 มลลลตร จานวน 10 ตวอยาง (44%) ไดแก นาสบปะรด สมเชง สบปะรด มะเขอเทศ ผกสด ยาขมชนดเมด สลดบาร ผกกาดหอม และไสกรอกหม สวนตวอยางทมคา MPN < 20 MPN/100 กรม หรอ 100 มลลลตร คอตรวจไมพบเชอ จานวน 6 ตวอยาง (26%) ไดแก กนเชยง มะมวงแผนหย มะขามคลก และ มะขามเปยก เมอตรวจยนยนผลแลว เปนเชอ E. coli จานวน 17 ตวอยาง จาก 28 ตวอยาง (61%) จากการสมเกบตวอยาง 7 แหลง พบเชอ E. coli ในทกตวอยาง (100%) ทสมเกบจาก 5 แหลง ไดแก โรงอาหารอาคารศนยมหาวทยาลย โรงอาหารหอพก และแหลงนาแหลงท 1-3 และพบเชอ E. coli ในตวอยางอาหารจาก 2 แหลง คอ รานสหกรณ และหางสรรพสนคาฯ จานวน 13 ตวอยาง (76.47%) และ 3 ตวอยาง (60%) ตามลาดบ การตรวจพบเชอ fecal coliform ในตวอยางอาหารสวนใหญ แสดงถงขนตอนกรรมวธการผลตอาหาร การขนสงสนคา และการบรรจหบหอภาชนะ ทไมถกสขลกษณะ ขาดการควบคมทดในขนตอนของการแปรรป แกปญหาดวยการควบคมคณภาพ และความสะอาดของผลตผลกอนการผลต หรออาหารทผานการแปรรปแลว รวมถงการเกบรกษา การควบคมคณภาพในขนตอนการขนสงกอนทาการแปรรป โดยเฉพาะตวอยางทเปนผกพรอมบรโภค การตรวจพบการปนเปอนของเชอในทกตวอยาง อาจมาจากการใชปยคอกทไดจากมลสตวทมเชอปนเปอนอย การใชอณหภม 50 องศาเซลเซยส ในการหมกปยคอกจะชวยลดปรมาณเชอ E. coli ได (Jiang และคณะ, 2003) ควรใชสารฆาเชอประเภทคลอรนลดการปนเปอนของเชอ fecal coliform ระหวางการเตรยมผกเพอนาไปบรโภคสดดวยการลางหรอแชไว (มนทกานต, 2545)

ตรวจพบเชอ fecal coliform ในปรมาณทสงมาก คอ ≥ 24000 MPN/100 กรม หรอ 100มลลลตร จากตวอยางทเกบไวทอณหภมตาระหวางการจาหนาย ไดแก สมเชง สบปะรด ผกสด และ ผกกาดหอม แตตวอยางทเกบไวทอณหภมแชแขง ไดแก ลกชน ไสกรอกหม แหนมหม และ หมยอ พบปรมาณเชอปนเปอนเลกนอยถงปานกลาง คอ < 20 MPN/100 กรม หรอ 100 มลลลตร ถง 16000 MPN/100 กรม หรอ 100 มลลลตร แสดงใหเหนวาอณหภมทตาอาจทาใหการเจรญของเชอชาลง แต ไมสามารถทาใหปราศจากเชอได สอดคลองกบการรายงานโดย Palumbo (1986) พบวา การเกบรกษาอาหารโดยใชความเยนท 5 องศาเซลเซยส (41 องศาฟาเรนไฮต) สามารถยดอายการเกบอาหาร

27

โดยทาใหจลนทรยทกอใหเกดการเสอมเสยของอาหารเจรญชาลงหรอหยดการเจรญ และปองกน การเจรญและการผลตสารพษจากจลนทรยทกอใหเกดโรคได ปจจบนมการศกษาพบวา การใชความเยนเพอยดอายการเกบรกษาอาหารไมสามารถปลอดภยจากจลนทรยกอใหเกดโรคได ซงเชอ E. coli สายพนธทผลตสารพษกอยในกลมนดวย เชอนเปนเชอทเจรญไดในทอณหภมตา (psychrotrophic bacteria) นนคอเราสามารถยดอายการเกบอาหารไวไมใหเนาเสยได แตเชอจลนทรยทเปนอนตรายตอการบรโภคยงคงตรวจพบในอาหารทเกบไวทอณหภมตานน กอนการบรโภคจงจาเปนตองมการปรงใหสก หรอลางดวยสารฆาเชอเสยกอน

ตวอยางอาหารดอง ไดแก หวชายโปวหวาน ซงมการใชเกลอเปนสวนผสม และตวอยางอาหารทมรสเปรยว มสภาพเปนกรด มคา pH ตา ไดแก มะมวงแผนหย มะขามคลก และ มะขามเปยก ตรวจไมพบเชอ fecal coliform คอ มจานวน < 20 MPN/100 กรม หรอ 100 มลลลตร แมวาไมไดแชไวทอณหภมตาเวลาจาหนาย และเกอบทกตวอยางไมไดผานความรอน เปนไปไดทสภาพเปนกรดและ ความเคมของอาหารมผลกบการเจรญเตบโตของเชอ fecal coliform หรอตวอยางเหลานมกรรมวธ การผลตทถกสขลกษณะ แตตวอยางนาจากผลไมทมความเปนกรด ไดแก นาสบปะรด และตวอยาง ผลไมทมความเปนกรด ไดแก สมเชง และสบปะรด กลบตรวจพบเชอ แสดงวากรรมวธการผลตอาหารทถกสขลกษณะมผลอยางมากกบปนเปอนของเชอ fecal coliform ในอาหารทไมผานความรอน แมวาอาหารนนมสภาพเคมหรอมความเปนกรดสงกตาม

การพบเชอ fecal coliform ตวอยางทเปนยาสมนไพรทาเปนเมดและบรรจแคปซล ไดแก ตวอยางท 9 และ 10 ตามลาดบ แสดงถงขนตอนการผลตทขาดสขลกษณะทด สามารถใชรงส เชน รงสแกมมาฆาเชอสาเหตโรคกอนจาหนายได

ตรวจพบเชอ E. coli ในตวอยางนาบาดาลทกตวอยาง ดงนนตามแหลงนาทวไปหากขาดกระบวนการผลตนาดมนาใชทด อาจมการปนเปอนของเชอโรคเปนการแพรกระจายโรคไดอยางด สามารถฆาเชอในนาดวยสารฆาเชอประเภทคลอรนแลวตรวจคณภาพนากอนนาไปใชตอไป

การแยกใหไดเชอบรสทธของ เชอแบคทเรย E.coli และ Enterobacter spp. ทเจรญบนอาหาร EMB นน ทาไดยากและใชเวลานาน เนองจากโคโลนของเชอ Enterobacter spp. มเมอกเยม ทาใหปนอยกบโคโลนของเชอ E. coli (ดงภาพท 4) ตองใชการแยกเชอบรสทธหลายๆครง

28

ตารางท 2 ชนดของตวอยางและสถานทเกบตวอยางทใชในการแยกเชอแบคทเรย Escherichia coli เกบตงแต เดอน เมษายน ถง เดอน ตลาคม พ.ศ. 2546 เวลา 10:30 น. – 13:00 น.

แหลง ตวอยางท ชนดของตวอยาง ลกษณะของตวอยาง อาคารศนยมหาวทยาลย 1 นาสบปะรดสด ตกใสถงขายหนาราน 2 สมเชง ปอกเปลอกผาครงไวหนารานแลวหนกอนขาย โรงอาหารหอพก 3 สบปะรด ปอกเปลอกผาครงไวหนารานแลวหนกอนขาย รานสหกรณสาขาใหญ 4 มะเขอเทศลกเลก รบประทานสดทงลก 5 ผกสดหลากชนด ขายคกบนาพรกบรรจโฟมหอพลาสตกปดสนท 6 ลกชนไก บรรจถงพลาสตกปดสนท 7 ไสกรอกหม บรรจถงพลาสตกปดสนท 8 กนเชยง บรรจถงพลาสตกปดปากถง เจาะรขางถง 9 ยาขมชนดเมด บรรจซองพลาสตกแบบแกะได บรรจกลอง 10 สมนไพรหญาหนวดแมว ชนดแคปซลบรรจขวดพลาสตกปดสนท 16 ผกกาดหอม บรรจถงพลาสตกปดปากถง เจาะรขางถง 17 หมยอ หอพลาสตกปดสนท 18 แหนมหม หอพลาสตกปดสนท 19 หวชายโปวหวาน บรรจถงพลาสตกปดสนท 20 มะขามเปยก บรรจถงพลาสตกปดสนท

28

29

ตารางท 2 (ตอ)

แหลง ตวอยางท ชนดของตวอยาง ลกษณะของตวอยาง สหกรณสาขาใหญ (ตอ) 23 ผกกาดหอม บรรจถงพลาสตกปดสนท 24 หมยอ หอพลาสตกปดสนท 25 ผกสดหลากชนด ขายคกบนาพรกบรรจโฟมหอพลาสตกปดสนท 26 นาพรกปลายาง บรรจขวดแกวปดสนท 27 นาออย ผานการพลาสเจอรไรซ หางสรรพสนคาแหงหนง ในอาเภอเมอง จงหวดนครปฐม 11 ลกชนเอนหม แบบตกซอเอง 12 ไสกรอกหม แบบตกซอเอง 13 มะมวงแผนหย แบบตกซอเอง 14 มะขามคลก แบบตกซอเอง 15 สลดบาร แบบตกซอเอง แหลงนา แหลงท 1 21 นาบาดาล มผสงตวอยางมาตรวจ แหลงนา แหลงท 2 22 นาบาดาล มผสงตวอยางมาตรวจ แหลงนา แหลงท 3 28 นาบาดาล มผสงตวอยางมาตรวจ

29

30

ภาพท 3 ลกษณะการเกดแกสในหลอดดกแกสของหลอดอาหารเหลว EC medium เมอนาไปบมท

อณหภม 44.5องศาเซลเซยส นาน 24 ชวโมง

ภาพท 4 ลกษณะการเจรญของเชอทแยกไดจากอาหาร EC medium บนอาหารแขง EMB

เมอเพาะเลยงในอณหภม 35 องศาเซลเซยส เปนเวลา 24 ชวโมง (ก) โคโลนทเกดลกษณะ metallic sheen มแนวโนมเปน Escherichia coli (ข) โคโลนทบแสง เยม เปนเมอกสชมพ มแนวโนมเปน Enterobacter spp.

ก ข ก ข

31

2. การทดสอบปฏกรยา IMViC (indole, methyl red, Voges-Proskauer, citrate test) นาเชอบรสทธทแยกไดจากตวอยางจานวน 103 ไอโซเลท มาทดสอบดวยปฏกรยา IMViC จาก

เชอทงหมดทมลกษณะ metallic sheen บนอาหารวนแขง EMB จานวน 41 ไอโซเลท จานวน 39 ไอโซเลท ใหผลของ เชอ E.coli (+ + - - และ + + +/w - (+/w แทนการเกดผลบวกเลกนอย)) คดเปนความถกตองเทากบ 95.12% และ มจานวน 2 ไอโซเลท เกดผลทไมใชเชอ E.coli (- + - +) คดเปน ความผดพลาดในการยนยนผลเชอทเปน E coli บนอาหารวนแขง EMB เทากบ 4.88% เชอทงหมดท ไมปรากฎลกษณะ metallic sheen บนอาหารแขง EMB จานวน 62 ไอโซเลท ใหผลของเชอทไมใช E.coli (- - + + , - - +/w +, - - +/w +/w, - + - +, - - + -, - - +/w -, - - - +, และ - - - -) จานวน 60 ไอโซเลท และมจานวน 2 ไอโซเลท เกดผลทเปน E. coli (+ + - - และ + + +/w –) คดเปนความผดพลาดในการยนยนผลเชอทไมเปน E coli บนอาหารแขง EMB เทากบ 3.23% นนคอ การตรวจยนยนผลเชอ E.coli ดวยการดจากลกษณะ metallic sheen บนอาหารวนแขง EMB เชอทไมใชเชอ E.coli บางชนดสามารถแสดงลกษณะ metallic sheen บนอาหารวนแขง EMB ได และบางกรณเชอ E.coli อาจไมแสดงลกษณะ metallic sheen บนอาหารวนแขง EMB

การตรวจวเคราะหเชอ E. coli ดวยปฏกรยา IMViC นน มความยงยากในการเตรยมอาหาร และสารทดสอบ (reagent) นอกจากนการสงเกตลกษณะทางชวเคมทปรากฏ ไดแก การเปลยนสของอาหาร (ดงภาพท 4) ในการทดสอบ Voges-Proskauer (VP test) สทไดลาบากในการตดสนวาเปนผลบวกหรอผลลบ ทาใหโอกาสทจะระบชนดของไอโซเลททนามาทดสอบผดพลาดเกดขนไดงาย อกทงสารทดสอบยงอาจเสอมสภาพไดเรวเมอเกบไวนาน

ภาพท 5 ผลการทดสอบปฏกรยา IMViC กบเชอแบคทเรย E. coli และ Enterobacter spp.

(ก) เมอผลเปน (+ + - -) และ (ข) เมอผลเปน (- - + +) ตามลาดบ

ก ข

32

ตารางท 3 ผลการวเคราะหเชอ E. coli ทแยกไดจากตวอยางอาหาร ดวยวธ MPN technique และสมบตทางชวเคม1

แหลง ตวอยางท ทดสอบ fecal coliform (MPN/100 กรมหรอมลลลตร)

Confirmed test3 (EMB)

ไอโซเลทท การเกด Metallic sheen

ผล IMViC test

อาคารศนยมหาวทยาลย 1 ≥24000 + 1 - - - +/w + 2 - - - +/w + 3 + N 4 - - - - + 5 - N 2 ≥24000 + 6 + + + - - 7 - - - + + 8 - - - + + 9 - - - + + 10 - N

โรงอาหารหอพก 3 ≥24000 + 11 + + + - - 12 + N 13 + N 14 + + + - - 15 - - - + +

32

33

ตารางท 3 (ตอ)

แหลง ตวอยางท ทดสอบ fecal coliform (MPN/100 กรมหรอมลลลตร)

Confirmed test 3 (EMB)

ไอโซเลทท การเกด Metallic sheen

ผล IMViC test

รานสหกรณสาขาใหญ 4 ≥24000 - 16 - - - + + 17 - - - - + 18 - - - + - 19 - - - + + 20 - - - + - 5 ≥24000 + 21 - - - - + 22 - - - + + 23 - - + - + 24 - - - + + 25 + + + - - 6 330 + 26 + - + - + - 27 - - - + + 28 - - - + + 29 - - - +/w - 30 - - - +/w +/w

33

34

ตารางท 3 (ตอ)

แหลง ตวอยางท ทดสอบ fecal coliform (MPN/100 กรมหรอมลลลตร)

Confirmed test 3 (EMB)

ไอโซเลทท การเกด Metallic sheen

ผล IMViC test

รานสหกรณสาขาใหญ 7 <20 N N N N 8 <20 N N N N 9 ≥24000 - 31 - - - + + 32 - - - +/w + 33 - - - +/w + 34 - - - + + 35 - - - + + 10 20 - 36 - - - + - 37 - - - + - 38 - - - +/w - 39 - - - + + 40 - - - + - 16 ≥24000 + 56 + + + +/w - 57 + + + +/w - 58 + + + - -

34

35

ตารางท 3 (ตอ)

แหลง ตวอยางท ทดสอบ fecal coliform (MPN/100 กรมหรอมลลลตร)

Confirmed test 3 (EMB)

ไอโซเลทท การเกด Metallic sheen

ผล IMViC test

รานสหกรณสาขาใหญ 16(ตอ) 59 - - - + + 60 - - - + + 17 ≥202 + 61 + - + - + 62 + + + +/w + 63 + + + +/w + 64 - + + +/w - 65 - + + - - 18 20 - 66 - - - +/w - 67 - - - + + 68 - - - +/w - 69 - - - + + 70 - - - + + 19 <20 N N N N 20 <20 N N N N 23 ≥24000 + 79 + + + - -

35

36

ตารางท 3 (ตอ)

แหลง ตวอยางท ทดสอบ fecal coliform (MPN/100 กรมหรอมลลลตร)

Confirmed test 3 (EMB)

ไอโซเลทท การเกด Metallic sheen

ผล IMViC test

รานสหกรณสาขาใหญ 23(ตอ) 80 + + + - - 81 + + + - - 82 - - - +/w + 83 - - - +/w + 24 16000 + 84 + ++ - - 85 + + + - - 86 + + + - - 87 - - - + + 88 - - - + + 25 ≥24000 + 89 + + + - - 90 + + + - - 91 + + + - - 92 - - - + + 93 - - - + + 26 N N 94 + + + - -

36

37

ตารางท 3 (ตอ)

แหลง ตวอยางท ทดสอบ fecal coliform (MPN/100 กรมหรอมลลลตร)

Confirmed test 3 (EMB)

ไอโซเลทท การเกด Metallic sheen

ผล IMViC test

รานสหกรณสาขาใหญ 26(ตอ) 95 + + + - - 96 + + + - - 97 - - - + + 98 - - - +/w + 27 N N 99 + + + - - 100 + + + - - 101 + + + - - 102 - - - +/w + 103 - - - +/w +

หางสรรพสนคาแหงหนง 11 790 + 41 + + + - - ในอาเภอเมอง 42 + + + - - จงหวดนครปฐม 43 + + + +/w - 44 - - - + +

45 - - - + - 12 40 - 46 - - - +/w +

37

38

ตารางท 3 (ตอ)

แหลง ตวอยางท ทดสอบ fecal coliform (MPN/100 กรมหรอมลลลตร)

Confirmed test 3 (EMB)

ไอโซเลทท การเกด Metallic sheen

ผล IMViC test

หางสรรพสนคาแหงหนง 12(ตอ) 47 - - - - + ในอาเภอเมอง 48 - - - + + จงหวดนครปฐม 49 - - - +/w -

50 - - - + + 13 <20 N N N N 14 <20 N N N N 15 ≥24000 + 51 + + + +/w - 52 + + + - - 53 + + + +/w - 54 - - - - - 55 - - - +/w +

แหลงนา แหลงท 1 21 N N 71 + + + +/w - 72 + + + - - 73 + + + - - 74 - - - + +

38

39

ตารางท 3 (ตอ)

แหลง ตวอยางท ทดสอบ fecal coliform (MPN/100 กรมหรอมลลลตร)

Confirmed test 3 (EMB)

ไอโซเลทท การเกด Metallic sheen

ผล IMViC test

แหลงนา แหลงท 1 21(ตอ) 75 - - - + + แหลงนา แหลงท 2 22 N N 76 + + + - - 77 + + + - - 78 + + + - - แหลงนา แหลงท 3 28 N N 104 + + + - - 105 + + + - - 106 + + + - - 107 - - + - + 108 - - + - +

หมายเหต 1+ คอ ผลเปนบวก, - คอ ผลเปนลบ, N คอ ไมมขอมล

2ได 0-0-3 อานคาจากตาราง MPN 5-5-5 ไมได 3เครองหมาย - คอ ตรวจไมพบโคโลนทเปน metallic sheen พบเฉพาะโคโลนสชมพ สนาตาลแดงหรอมวงเขมทบแสง

39

40

3. การตรวจวเคราะหเชอแบคทเรย E. coli ดวยวธพซอารและเรยลไทมพซอาร จากการวเคราะหดเอนเอทสกดจากไอโซเลททใหผลจากการทดสอบปฏกรยาIMViC ระบวาเปน

เชอ E.coli เทานน (+ + - -) ทเกดแถบดเอนเอขนาด 167 คเบส (ตารางท 4) ตารางท 4 ผลการตรวจวเคราะหเชอแบคทเรย E. coli ดวยวธพซอาร

แหลง ไอโซเลทท Metallic

sheen IMViC test ความเขมขน ยน uidA

โรงอาหารหอพก 14 + + + - - 1:40 + 15 - - - + + 1:50 - รานสหกรณสาขาใหญ 65 - + + - - ไมเจอจาง + 89 + + + - - 1:20 + 92 - - - + + 1:50 - หางสรรพสนคาแหงหนง 52 + + + - - 1:40 + ในอาเภอเมอง จงหวดนครปฐม 55 - - - +/w + 1:20 - แหลงนา แหลงท 2 76 + + + - - ไมเจอจาง + 77 + + + - - ไมเจอจาง + 78 + + + - - ไมเจอจาง + แหลงนา แหลงท 3 104 + + + - - 1:50 + 105 + + + - - ไมเจอจาง + 107 - - + - + 1:50 -

แมวาไอโซเลทท 65 จะไมเกด metallic sheen กตาม แตผลจากการตรวจสอบยน uidA ดวย

ปฏกรยา PCR ปรากฏวาเปน E.coli เชนเดยวกบผลของการทดสอบปฏกรยา IMViC ทเปน (+ + - -) แมวาจะยงไมไดเจอจางความเขมขนของดเอนเอ ใหเทากบเมอเจอจาง ดเอนเอของไอโซเลทท 89 เปน 1 ตอ 20 กตาม ซงความเขมขนในระดบนทาใหเกดผลผลตด เกดแถบดเอนเอชดเจน แสดงวาวธการตรวจสอบเชอ E.coli ดวยปฏกรยา IMViC นน มความถกตองเทากนกบวธการตรวจสอบดวยวธพซอาร

41

ภาพท 6 ผลการเพมปรมาณยน uidA ของเชอ E. coli โดยเทคนคพซอาร และตรวจสอบขนาด ดเอนเอ

ใน 1.7% agarose gel, 1x TBE, 100 โวลต, 40 นาท ชองท 1 : พลาสมด pBI121 ชองท 2 : control (ไมมดเอนเอตนแบบ) ชองท 3 : ดเอนเอจาก Erwinia carotovora ชองท 4 : ไอโซเลทท 15 เปน Enterobacter spp. จากการทดสอบปฏกรยา IMViC ชองท 5 : ไอโซเลทท 55 เปน Enterobacter spp. จากการทดสอบปฏกรยา IMViC ชองท 6 : ไอโซเลทท 92 เปน Enterobacter spp. จากการทดสอบปฏกรยา IMViC ชองท 7 : ไอโซเลทท 107 เปน Enterobacter spp. จากการทดสอบปฏกรยา IMViC ชองท 8 : ไอโซเลทท 14 เปน Escherichia coli จากการทดสอบปฏกรยา IMViC ชองท 9 : ไอโซเลทท 52 เปน E. coli จากการทดสอบปฏกรยา IMViC ชองท 10 : ไอโซเลทท 89 เปน E. coli จากการทดสอบปฏกรยา IMViC ชองท 11 : ไอโซเลทท 104 เปน E. coli จากการทดสอบปฏกรยา IMViC ชองท 12 : DNA marker (100bp+500bp DNA ladder)

42

Chromosomal DNA

ความเขมขนของดเอนเอทเหมาะสมตอการเกดปฏกรยาพซอาร ใชความเขมขนทเจอจางจากความเขมขนเรมตนของดเอนเอจาก ไอโซเลทท 89 เปน 1 ตอ 20 เทา เปนหลกในการกาหนด ความเขมขนของดเอนเอจากไอโซเลทอน โดยเจอจางความเขนขนเรมตนของไอโซเลทอนๆดวย TE buffer (ภาพท 7) เพอนาไปทาปฏกรยาพซอารตอไป ดงภาพท 8 (ก) เปนความเขมขนกอน การเจอจางของไอโซเลทตางๆ ภาพท 8 (ข) เปนความเขมขนหลงการเจอจาง 1 ตอ 20 เทา ของไอโซเลทในภาพท 8 (ก) เพอปรบความเขมขนใหเหมาะสมกอนการเกดปฏกรยาพซอาร

(ก)

(ข)

(ค)

ภาพท 7 ผลการสกดดเอนเอจากไอโซเลทของเชอ E. coli และเชอ Enterobacter spp. ดวยวธ CTAB

(ก) ความเขมขนของดเอนเอทสกดไดเรมแรก (ข) เมอปรบความเขมขนของดเอนเอทสกดได (ภาพ ก) ดวย TE buffer ใหมความเขมขน 1 ตอ 20 เทา ไอโซเลทท 89 เกดแถบดเอนเอของ ยน uidA ทชดเจน (ค) แสดงความเขมขนของดเอนเอเรมแรกทสกดได ของไอโซเลทตางๆ (ตวเลขดานบนแสดงลาดบทของไอโซเลท)

Chromosomal DNA

Chromosomal DNA

43

ผลการใชปฏกรยา real-time PCR ดวย LightCycler System ในการเลอกสภาพทเหมาะสมในการทาปฏกรยาพซอาร เมอใชพลาสมด pBI121 เปนดเอนเอตนแบบ และผลผลตพซอาร คอ สวนของยน uidA ซงขนตอนนสาคญมากสาหรบการทดลองทาปฏกรยาเรยลไทมพซอารครงแรก สามารถตรวจสอบการเพมปรมาณของผลผลตในแตละชวงเวลาการเกดปฏกรยา ดวยการใชสไซเบอร กรน (SYBR Green I dye) แลวตรวจผลจากสญญาณฟลออเรสเซนสทเกดขนทกๆ รอบของปฏกรยา ความเขมของสญญาณแปรผนโดยตรงกบผลผลตพซอารทเพมขน ผลการตรวจวดแสดงขนทหนาจอคอมพวเตอรทนท เปนการวดผลแบบ log-linear phase analysis สามารถคานวณความเขมขนเรมตนของสาดบเบสเปาหมายทตองการเพมปรมาณไดแมนยามากกวาการวดผลเมอสนสดปฏกรยาแลว ปฏกรยา 30-40 รอบ ใชเวลาเพยง 20-30 นาท หลงทาปฏกรยาเสรจแลวนาขอมลสญญาณทวดไดไปวเคราะหตอดวย analysis software ซงสามารถคานวณปรมาณของผลผลต และทา melting curve ได

ผลการวเคราะหเชงปรมาณของผลผลตพซอาร พบวา ความเขมขนของ MgCl2 ทเหมาะสมกบการเกดผลผลต (สวนของยน uidA) คอ 3 มลลโมลาร เนองจากสามารถตรวจวดสญญาณการเรองแสงไดมากทสดเมอสนสดปฏกรยา อกทงเสนกราฟยงมความชนสงกวา ความเขมขนของ MgCl2

2 มลลโมลาร และมากเทาๆกบความเขมขนของ MgCl2 4 มลลโมลาร แมวาเมอพจารณาจานวนรอบทเรมเกดผลผลตพซอาร (crossing point) แลวพบวา ความเขมขนของ MgCl2 4 มลลโมลาร จะมคานอยทสด แตเมอใช ความเขมขนของ MgCl2 3 มลลโมลาร กใหคาจานวนรอบทเรมเกดผลผลตพซอารสงกวา เมอใชความเขมขนของ MgCl2 2 มลลโมลาร ดวย ดงภาพท 9 ก

ผลการวเคราะหผลผลตพซอารโดย melting curve ตรวจไมพบผลผลตทไมตองการ (non-specific product) เนองจากขนาดของชนดเอนเอทตางกนจะมคาอณหภมททาใหดเอนเอจานวนครงหนงแยกเปนสายเดยวตางกน เรยกวา melting temperature (Tm) ดงนน คา Tm ของแตละความเขมขนของ MgCl2 ไดคาทใกลเคยงกนมาก (ตางกนนอยกวา 1 องศาเซลเซยส) ไดแก 87.01 , 87.44 และ 87.65 องศาเซลเซยส เมอใชความเขมขนของ MgCl2 2, 3 และ 4 มลลโมลาร ตามลาดบ (ภาพท 9 ข) แสดงวาไดผลผลตพซอารแบบเดยวกนทง 3 ความเขมขน ไพรเมอรมความบรสทธ และไมเกดไพรเมอรไดเมอร (primer dimer) ซงเปนดเอนเอทมขนาดเลก Tm จงมคาตากวาดเอนเอสายยาว (ผลผลตพซอาร) ดเอนเอทมขนาดเทากนแตมปรมาณเบส G + C ตางกน Tm ทไดกมคาตางกนดวย ปรมาณเบส G + C แปรผนโดยตรงกบคา Tm ดวยวธนสามารถหาการเกดการกลายพนธได

ผลการตรวจสอบขนาดดเอนเอ ทเพมปรมาณยน uidA ของของพลาสมด pBI121 โดยเทคนคเรยลไทมพซอาร ใน 1.7% agarose gel, 100 โวลต, 40 นาท พบวาไดผลผลตพซอารปรมาณมาก แต ไมสามารถบอกความแตกตางของผลผลตพซอารเมอปรบความเขมขนของ MgCl2 แตละความเขมขนได

44

ค

ก

ข

45

ภาพท 8 (ก) กราฟการเรองแสงระหวางการเกดปฏกรยา real-time PCR ในแตละรอบ แกนตงแสดงปรมาณการเรองแสง แกนนอนแสดงจานวนรอบทเกดปฏกรยา กราฟสนาเงนเปน control (ไมใสดเอนเอตนแบบ) กราฟสเขยว, สแดง และสดา เมอปรบความเขมขนของ MgCl2 เปน 2, 3 และ 4 มลลโมลาร ตามลาดบ ใชพลาสมด pBI121 เจอจางเปน 1 ตอ 100 จากความเขมขนเรมตนทสกดได เปนดเอนเอตนแบบ และใชไพรเมอร UAL-1939 และ UAR-2105 (ข) แสดง melting curve แกนตงแสดงผลลบของดฟเฟอเรนเชยลของปรมาณการเรองแสงเมอเทยบกบอณหภม แกนนอนแสดงอณหภมททาใหดเอนเอจานวนครงหนงแยกเปนสายเดยวตางกน (Tm) กราฟสนาเงนเปน control (ไมใสดเอนเอตนแบบ) กราฟสเขยว, สแดง และสดา เมอปรบความเขมขนของ MgCl2 เปน 2, 3 และ 4 มลลโมลาร ตามลาดบ ใชพลาสมด pBI121 เจอจางเปน 1 ตอ 100 จากความเขมขนเรมตนทสกดได เปนดเอนเอตนแบบ และใชไพรเมอร UAL-1939 และ UAR-2105 (ค) ผลการเพมปรมาณยน uidA ของพลาสมด pBI121 โดยเทคนคเรยลไทมพซอาร และ ตรวจสอบขนาดดเอนเอใน 1.7% agarose gel, 100 โวลต, 40 นาท

ชองท 1 : DNA marker ชองท 2 : control (ไมมดเอนเอตนแบบ) ความเขมขนของ MgCl2 เปน 3 มลลโมลาร ชองท 3 : ใชพลาสมด pBI121 เจอจางเปน 1 ตอ 100 ความเขมขนของ MgCl2 2 mM ชองท 4 : ใชพลาสมด pBI121 เจอจางเปน 1 ตอ 100 ความเขมขนของ MgCl2 3 mM

ชองท 5 : ใชพลาสมด pBI121 เจอจางเปน 1 ตอ 100 ความเขมขนของ MgCl2 4 mM

ผลการวเคราะหเชงปรมาณของผลผลตพซอาร พบวา ความเขมขนของดเอนเอตนแบบ (พลาสมด pBI121) ทเหมาะสมกบการเกดผลผลต (สวนของยน uidA) คอ ความเขมขนของดเอนเอตนแบบ 2 ความเขมขน ไดแก เมอเจอจางเปน 1 ตอ 10 และ 1 ตอ 1000 เนองจากเมอพจารณาจานวนรอบท เรมเกดผลผลตพซอาร (crossing point) ของทง 2 ความเขมขน พบวาอยในชวงจานวนรอบการทาปฏกรยา 10-30 รอบ(ภาพท 11) ซงจานวนรอบทเรมเกดผลผลต พซอารในชวงน เปนชวงทม ความเขมขนทเหมาะสมตอการทาปฏกรยา ไมจาเปนตองเจอจางเพมขนหรอใชความเขมขนสงกวานอก สวนความเขมขนของดเอนเอตนแบบเรมแรกทสกดได แมวามจานวนรอบทเรมเกดผลผลตพซอารอยในชวงทเหมาะสม แตเสนกราฟทไดมความชนนอยทสด และเมอสนสดปฏกรยาไดผลผลตพซอารนอยทสด สวนความเขมขนของดเอนเอตนแบบทเจอจางเปน 1 ตอ 10 ไดกราฟมความชนใกลเคยงกนกบเมอเจอจางเปน 1 ตอ 100 แตเมอสนสดปฏกรยาสามารถตรวจวดสญญาณการเรองแสงไดนอยกวาเมอเจอจางเปน 1 ตอ 100 นนคอ ความเขมขนของดเอนเอตนแบบเพยง 1 ตอ 1000 สามารถเกดผลผลตทตองการและเมอสนสดปฏกรยาใหผลผลตพซอารมากทสด แตใชจานวนรอบในการสนสด

46

การทาปฏกรยามากกวา เมอเจอจาง 1 ตอ 10 ดงนน หากตองการทราบผลการวเคราะหโดยเรว ควรเลอกใชความเขมขนเมอเจอจาง 1 ตอ 10 ซงใหผลผลตใกลเคยงกน ผลการวเคราะหผลผลตพซอารโดย melting curve ตรวจ ไมพบผลผลตทไมตองการ (non-specific product) เชนเดยวกน เนองจากใชความเขมขนของ MgCl2 ทเหมาะสม คอ 3 มลลโมลาร ภาพท 9 กราฟการเรองแสงระหวางการเกดปฏกรยา real-time PCR ในแตละรอบ แกนตงแสดงปรมาณ

การเรองแสง แกนนอนแสดงจานวนรอบทเกดปฏกรยา เมอปรบความเขมขนของดเอนเอตนแบบ (พลาสมด pBI121) ใช 3 ความเขมขน ไดแก ความเขมขนเรมแรกทสกดได และปรบความเขมขนเปน 1:10 และ 1:1000 ตามลาดบ เสนสนาเงนเปน control (ไมใสดเอนเอตนแบบ) เสนสเขยว, สแดง และ สดา ใชความเขมขนเรมแรกทสกดได และปรบความเขมขนเปน 1:10 และ 1:1000 ตามลาดบ และใชไพรเมอร UAL-1939 และ UAR-2105

47

สรปผลการทดลอง

ผลของการวเคราะหหา เชอ fecal coliform ในตวอยางอาหารพรอมบรโภคโดยวธ MPN technique ปรากฏวา พบเชอ fecal coliform ถง 79% จากตวอยางทงหมด พบตวอยางทมคา MPN เกนเกณฑคณภาพในระดบสงถง 44% สวนตวอยางทตรวจไมพบเชอม 26% เมอตรวจยนยนผลแลว เปนเชอ E. coli จานวน 61% จากตวอยางทงหมด จากการสมเกบตวอยาง 7 แหลง ทกตวอยางทสมเกบจาก 5 แหลง พบเชอ E. coli ทงหมด สวน 2 แหลง ทเหลอตรวจพบ 76.47% และ 60% ตามลาดบ แสดงถงขนตอนกรรมวธการผลตอาหาร การขนสงสนคา และการบรรจหบหอภาชนะ ภายในมหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตกาแพงแสน ทไมถกสขลกษณะ ขาดการควบคมทดในขนตอนของการแปรรป ควรแกปญหาดวยการควบคมคณภาพ และความสะอาดของผลตผลกอนการผลต หรออาหารทผาน การแปรรปแลว รวมถงการเกบรกษา การควบคมคณภาพในขนตอนการขนสงกอนทาการแปรรป โดยเฉพาะตวอยางทเปนผกพรอมบรโภคควรลางใหสะอาด และปรงใหสกดวยความรอนทสงมากพอ ในการศกษาการแยกเชอแบคทเรยทปรากฏและทไมปรากฏลกษณะ metallic sheen บนอาหารแขง EMB ไดแบคทเรยจานวนทงหมด 108 ไอโซเลท ซงเมอนามาทดสอบลกษณะทางชวเคมดวยปฏกรยา IMViC รวมกบการใชการสงเกตลกษณะโคโลนของ เชอ Escherichia coli บนอาหารแขง EMB agar ไดผลการทดสอบไมตรงกบการทดสอบทางชวเคมดวยปฏกรยา IMViC และการตรวจสอบยน uidA โดยใชปฎกรยาลกโซโพลเมอเรส (PCR) ใหผลตรงกนกบการทดสอบดวยปฏกรยา IMViC การใชปฎกรยาลกโซโพลเมอเรส (PCR) มความรวดเรวมากกวาปฏกรยา IMViC แตคาใชจายสงกวา ดงนนการ ตรวจสอบเชอ E. coli ในอาหาร หรอนาควรเลอกวธการตรวจสอบใหถกตองเหมาะสมกบชนดของตวอยางอาหาร และความเรงดวนในความตองการผลการวเคราะห สาหรบการศกษาในขนตอไป ไดแก การพฒนาวธการตรวจสอบเชอ E. coli จากตวอยางอาหาร โดยไมตองเสยเวลาในขนตอนการเลยงเชอ เชน นาตวอยางอาหารมาเจอจางในนาทนงฆาเชอแลวนาไปทาปฏกรยาลกโซโพลเมอเรสโดยตรง หรอการพฒนาไพรเมอรทมความจาเพาะกบชนดของเชอ E. coli และเชออน ทเปนสายพนธทกอใหเกดโรคได ทงนเพอการตรวจสอบและควบคมการแพรกระจายของโรคทมประสทธภาพ หรอการใชเทคนค real-time PCR ในการบอกปรมาณของเชอ E. coli ทปนเปอนมากบตวอยางอาหารได ซงทาไดรวดเรวและสามารถระบปรมาณเชอไดดกวาการใชวธ MPN technique

48

เอกสารอางอง

กญจนา ธระกล และคณะ. 2542. จลชววทยาปฏบตการ. พมพครงท 2. มหาวทยาลยเกษตรศาสตร,

กรงเทพฯ. 330 น. จารวรรณ อภมณฑรกษา. 2537. ผลของการใหความรอนดวยไมโครเวฟตอเชอ Staphylococcus

aureus ในตวอยางกงแชแขง. วทยานพนธปรญญาโท. มหาวทยาลยเกษตรศาสตร, กรงเทพฯ. นงลกษณ พสทธลาภ. 2544. ศกษาการวเคราะห Escherichia coli ในอาหารทะเลแชแขงดวยวธ MPN

technique. วารสารกรมวทยาศาสตรการแพทย. 43(2) : 95-101. นงลกษณ สวรรณพนจ. 2544. แบคทเรยทเกยวของกบโรค. พมพครงท 2. Noble Print, กรงเทพฯ.

400 น. นรนาม. 2544. การเกบรกษาจลนทรยโดยวธแชแขง, น. 2. ใน หนวยปฏบตการเกบรกษาสายพนธ

จลนทรยเฉพาะทาง ศช. (ผรวบรวม). คมอการเกบรกษา และตรวจสอบคณภาพจลนทรยของหนวยปฏบตการเกบรกษาสายพนธจลนทรยเฉพาะทาง ศช.. มปท..

นรนาม. 2545. อาหารปลอดภยเพยงใด. เนชนแนล จโอกราฟฟก. 2(10) : 69.

มนทกานต บญยการ. 2545. การลดการปนเปอนขามของ Salmonella Typhimurium ระหวางการเตรยมผกสลดโดยสารฆาเชอประเภทคลอรน. วทยานพนธปรญญาโท. มหาวทยาลยเกษตรศาสตร, กรงเทพฯ.

วนทนา ออนภรมย. 2544. เทคนคในการเกบตวอยางอาหารเพอสงตรวจทางจลชววทยา.วารสาร

กรมวทยาศาสตรการแพทย. 43(2) : 171-176. Anonymous. 2002. Fairbank Farms recalls ground beef. Meat & Poulty. 48(12) : 18. Anonymous. 2002. Emmpak reeling from recall. Meat & Poulty. 48(12) : 3.

49

Anonymous. 2002.F.S.I.S. to strengthen E. coli O157:H7 policy. Meat & Poulty 48(10) : 79. Ausubel, F. M., R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith and K. Struhl.

1999. Short Protocols in Molecular Biology.4th ed. John Wiley & Sons, Inc., New York. Bej, A.K., J.L. Dicesare, L. Haff and R.M. Atlas. 1991. Detection of Escherichia coli and

Shigella sp. in Water by Using the Polymerase Chain Reaction and Gene Probes for uid. Applied and Environmental Microbiology. 57 : 1013-1017.

Bej, A.K., S.C. Mccarty and R.M. Atlas. 1991. Detection of Coliform Bacteria and Escherichia

coli by Multiplex Polymerase Chain Reaction: Comparison with Defined Substrate and Plating Methods for Water Quality Monitoring. Applied and Environmental Microbiology. 57 : 2429-2432.

Brenner, D.J..1984. In Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology Vol. 1. Willians and Wilkins,

London. Buchanan, R.E. and N.E. Gibbons. 1974. Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology 8th

ed. Williams and Wilkins company, Baltimer. Cleuziat, P. and J. Robert-Baudouy. 1990. Specific Detection of Escherichia coli and Shigella

Species Using Fragments of Genus Coding for β-Glucuronidase. FEMS Microbiology Letters. 72 : 315-322.

Farnleitner, A. H., N. Kreuzinger, G. G. Kavka, S. Grillenberger, J. Rath and R. L. March. 2000.

Simultaneous Detection and Differentiation of Escherichia coli Population from Environmental Freshwaters by Means of Sequence Variations in a Fragment of the β-D-Glucuronidase Gene. Applied and Environmental Microbiology. 66 : 1340-1346.

50

Feng, P., R. Lum and G. W. Chang. 1991. Identification of uidA Gene Sequences in β-D-Glucuronidase-Negative Escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology, 57 : 320-323.

Frahm, E. and U. Obst. 2003. Application of the Fluorogenic Probe Technique (Taq Man PCR)

to the Detection of Enterococcus spp. and Escherichia coli in Water Samples. Journal of Microbiological Methods. 52 : 123-131.

Fricker, E. J. and C. R. Fricker. 1994. Application of the Polymerase Chain Reaction to the

Identification of Escherichia coli and Coliforms in Water. Letters in Applied Microbiology. 19 : 44-46.

Holt, J.G. and N.R. krieg. 1993. Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology 9th ed. Williams

and Wilkins company, Baltimer. Ibekwe, A. M. and C. M. Grieve. 2003. Detection and Quantification of Escherichia coli

O157:H7 in Environmental Samples by Real-time PCR. Journal of Applied Microbiology. 94 : 421-431.

Iqbal, S., J. Robinson, D. Deere, J.R. Saunders, C. Edwards and J.Porter. 1997. Efficiency of

the Polymerase Chain Reaction Amplification of the uid Gene for Detection of Escherichia coli in Contaminated Water. 24 : 498-502.

Jefferson, R.A., S.M. Burgess and D. Hirsh. 1986. β-Glucuronidase. From Escherichia coli as a Gene–Fusion Marker. Proc. Natl. Acad. Sci. 83 : 8447-8451. Jiang, X., J. Morgan, and M. Doyle. Fate of Escherichia coli O157:H7 during composting of

bovine manure in a laboratory-scale bioreactor. J. Food Prot. 66 : 25-30.

Juck, D., J. Ingram, M. Prevost, J. Coallier and C. Greer. 1996. Nested PCR Protocol for the Rapid Detection of Escherichia coli in Potable Water. Can. J. Microbiol. 42 : 862-866.

51

Krieg, N.R.. 1984. A Publication of the Bergey’s Manual Trust “T.P. One of a Series of

Wordbooks Associated Stedman’s Medical Dictionary” Vol.1. Willians and Wilkins, London.

McDaniels, A. E., E. W. rice, A. L. Reyes, C. H. Johnson, R.A. Hanglang and G. N. Stelma, Jr.

1996. Confirmational Identification of Escherichia coli, a Comparison of Genotypic and Phenotypic Assays for Glutamate Decarboxylase and β-D-Glucuronidase. Applied and Environmental Microbiology. 62 : 3350-3354.

Nataro, J. P. and J. B. Kaper. 1998. Diarrheagenic Escheichia coli. Clinical Microbiology

Reviews. 11 : 142-201. Nierman, W. C. and K. E. Nelson. 2002.Genomics for Applied Microbiology. Advances in

Applied Microbiology. 51 : 202,213. Palumbo, S.A. 1986. Is refrigeration enough to restore food borne pathogen. J. Food Prot. 49 :

1003-1009. Sambrooke, J., E.F. Fristsch and T. Manistis. 1989. Molecular Cloning. 2nd ed. Cold Spring

Habor Laboratory Press, New York. 545p.

Schlaman, H.R.M., E. Risseeuw, M. E. I. Franke-van Dijk and P. J. J. Hooukaas. 1994. Nucleotide Sequence Corrections of the uidA Open Reading Frame Encoding β-Glucuronidase. Gene. 138 : 259-260.

Stender, H., A. J. Broomer, K. Oliveira, H. Perry-O’keefe, J. J. Hyldig-Nielsen, A. Sage and J.

Coull. 2001. Rapid Detection, Identification and Enumeration of Escherichia coli Cells in Municiple Water by Chemiluminescent In situ Hybridization. 67 : 142-147.

52

Vorob’ev, A. A., V. M. Bondarenko, N. A. Shabanova and S. V. Fialkina. 2000. PCR Test Systems for Genetic Identification of Enterohemorrhagic Escherichia coli. Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol. 6 (Suppl.) : 90 (Abstr.).

53

ภาคผนวก

สตรอาหารเลยงเชอ

1. Lactose broth Beef extract 3.0 กรม Lactose 5.0 กรม Peptone 5.0 กรม นากลน 1000.0 มลลลตร การเตรยม Lactose broth double-strength นนใหเพมปรมาณสวนผสมทใชอก 1 เทา ใน 1 ลตร นาไปนงฆาเชอทอณหภม 121 องศาเซลเซยส ความดนไอ 15 ปอนดตอตารางนว เปนเวลา 15 นาท 2. LB medium, ตอ 1 ลตร Bacto tryptone 10 กรม Yeast extract 5 กรม NaCl 10 กรม ปรบ pH ดวย 1 N NaOH ใหเปน 7.5 ถาเตรยมอาหารเหลวใหปรบปรมาตรดวยนากลนนงฆาเชอจนครบ 1 ลตร ถาเตรยมอาหารแขงใหเตม Agar 20 กรม แลวจงปรบปรมาตร 3. Nutrient agar, Nutrient broth Beef extract 3.0 กรม Peptone 5.0 กรม Agar 15.0 กรม (ถาเตรยม Nutrient broth ไมตองใส) นากลน 1000.0 มลลลตร ปรบ pH เปน 6.8-7.0 4. Simmons citrate agar (NH4)H2PO4 1.0 กรม K2HPO4 1.0 กรม NaCl 5.0 กรม

54

Sodium citrate 2.0 กรม MgSO4.7H2O 0.2 กรม Bromthymol blue 0.08 กรม Agar 15.0 กรม นากลน 1000.0 มลลลตร บรรจอาหารใสหลอดประมาณ 5 มลลลตร นงฆาเชอ เสรจแลววางเอยงใหมทงสวนลกตรงกนหลอดเลกนอย และสวนบนเปนผวเอยง 5. Tryptone broth (peptone water) Peptone from casein (tryptone) 10.0 กรม NaCl 5.0 กรม นากลน 1000.0 มลลลตร สารทใชในการทดลอง 1. TBE electrophoresis buffer , 10X stock solution: Tris base 108 กรม Boric acid 55 กรม 0.5 M EDTA, pH 8.0 40 ml 2. Methyl red Methyl red 0.1 กรม

Ethyl alcohol 95% 300.0 กรม นากลน 200.0 มลลลตร 3. Voges-Proskauer test reagents สารละลาย A CusO4.5H2O 1.0 กรม NH4OH conc. 40.0 มลลลตร สารละลาย B KOH 16.0 กรม นากลน 100.0 มลลลตร ผสมสารละลาย A 40 มลลลตร กบสารละลาย B 690 มลลลตร