a. mailloux, a.cortey cnrhp, hôpital st antoine génotypage rhésus d fœtal sur sang maternel...
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A. Mailloux, A.Cortey CNRHP, Hôpital St Antoine
Génotypage Rhésus D fœtal sur sang maternel
Bénéfice de la technique chez la femme RhD négatif
immunisée ou non
A. Mailloux, A.Cortey CNRHP, Hôpital St Antoine
LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL LE COMPLEXE Rh
Protéine RHD :protéine transmembranaire du Globule Rouge15000 sites par GR RhD+
A. Mailloux, A.Cortey CNRHP, Hôpital St Antoine
LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL LE LOCUS RH
Isolement et séquençage du gène RHD par l’équipe française INSERM U76, Y. Colin et al. Genetic Basis of the RhD-Positive and RhD-Negative Blood Group Polymorphism as determined by Southern Analysis . Blood 1991 ; 28 : 2747-52
Gène(s) hybride(s) D-CE-D
Gène(s) D muté(s) non fonctionnels
Gène D délété
CaucasiensRhD Négatif
(15 %)
< 1%
< 1 %
> 99 %
Noirs AfricainsRhD Négatif
(3%)
10-20 %
60-70 %
10-25 %
LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL PROFIL GENOTYPIQUE
RHDPersonnes RhD négatif
Gène DHaplotype
cDeduplication
I X IXIVIII VI
Gène HybrideD-CE-D
(C)ces/ce
I X IXIII IX
Gène Ddélété
cdeCdecdE
IX
Rh box hybride
Stop
A. Mailloux, A.Cortey CNRHP, Hôpital St Antoine
LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL ADN fœtal dans le plasma maternel
ADN fœtaldans le plasma
Quantité de Génomes
(copies par ml de plasma maternel)
25 (3 à 70) à 15 S.A.290 (77 à 769) à terme
Isolement
Rapide, simple
Persistance in vivo
Demi-vie< 1 heure
Suite à la découverte de la présence d’ADN fœtal dans le plasma des femmes enceintes (1 à 6 % d’ADN d’origine fœtale sous forme acellulaire)LO Y.M. et al. Am J Hum Genet, 1998, 62 : 768-775.
Génotype RHD fœtal à partir du sang des femmes enceintes RhD –
- Diagnostic non invasif
A. Mailloux, A.Cortey CNRHP, Hôpital St Antoine
Amplification par PCR des séquences spécifiques du gène RHD
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LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL EN PRATIQUE
Sang maternel collecté sur EDTA ( 5 à 7 ml)
72h max entre prélèvement et réception au laboratoire
Centrifugation puis décantation plasma
1Extraction de l’ADN plasmatique
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A. Mailloux, A.Cortey CNRHP, Hôpital St Antoine
LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL EN PRATIQUE
- Amplification par PCR des séquences spécifiques du gène RHD :
- EXON 10 (plus sensible mais moins spécifique)
- EXON 7 ( plus spécifique mais moins sensible)
- EXON 5 (permet l’exclusion d’un maximum de variants du gène D silencieux)
- Les 3 amplifications distinctes permettant d’augmenter la sensibilité du test et détecter un maximum de variant du système RH
A. Mailloux, A.Cortey CNRHP, Hôpital St Antoine
LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL EN PRATIQUE
Si DISCORDANCE entre les EXONS : problème de variants RHD (identification possible en fonction de la positivité de chacun des exons ou INDETERMINE)
EXON 7
+
ORIGINE DE L’ADN AMPLIFIE
Maternelle
Fœtale
ININTERPRETABLE
RHD POSITIF
EXON 10
+
GENOTYPAGE FOETAL
+ +
EXON 5
+
+
EXON 7
-
VERIFICATIONEXTRACTION
ADN traceur négatif
RHD NEGATIF à vérifier
Sur un second prélèvement
EXON 10
-
GENOTYPAGE FOETAL
- - ADN Traceur positif
RE-EXTRACTION
EXON 5
-
-
A. Mailloux, A.Cortey CNRHP, Hôpital St Antoine
LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL EN PRATIQUE
PREVENTION DES FAUX- NEGATIFS
REPETER LE TEST SUR UN SECOND PRELEVEMENT POUR ECARTER LE RISQUE « LOURD » DE FAUX NEGATIF
1) Concentration plus élevée d’ADN fœtal
2) Rattraper une erreur d’étiquetage
3) Rattraper un croisement pré-analytique des échantillons
FAUX- POSITIFS
1 % dans la population caucasienneSpécificité du test en tant que facteur prédictif du phénotype n’est pas parfaite : présence de variants silencieux fœtal du gène RHD hérité du père
A. Mailloux, A.Cortey CNRHP, Hôpital St Antoine
Equipes Génotypages réalisés
Concordance Génotype RhD -Phénotype
Fass et coll.(1998) 31 31 Lo et Coll. (1998) 57 55 Finning et Coll. (2004)
359 347
Rouillac et Coll. (2004)
851 842
Van der Schott et Coll. (2004)
1257 1249
Gautier et Coll. (2005)
283 283
97,4%
LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL SERIE DE LA LITTERATURE
A. Mailloux, A.Cortey CNRHP, Hôpital St Antoine
LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL Kit de 1ère génération
Coopération RECHERCHE –INDUSTRIE
(INSERM – INTS- CNRHP - J.BOY)
Trousse développée en 2006-2007
Kit de 1ère génération pour PCR en Temps Réel avec reporter fluorescent. Marquage CE obtenu en JUIN 2007
Cibles: exons X et VII (amorces CNRHP)Sonde Taqman
ADN marqueur : maïs
Free DNA Fetal Kit® RhD
Kit de génotypage foetal RHD à partir d’ADN foetal libre du sang maternel(Technique PCR Temps réel)
Réf. : 502080133
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LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL REGLEMENTATION
Depuis le décret 1661 du 22 décembre 2006 le génotypage fœtal RHD peut être effectué uniquement :
Dans un laboratoire autorisé par l’Agence Régionale d’Hospitalisation, après avis de l’Agence de Biomédecine.
Par des praticiens agrées par l’Agence de Biomédecine.
OBLIGATION D’UN CONSENTEMENT DE LA PATIENTE (préalable à une analyse de biologie moléculaire en vue d’établir un diagnostic prénatal in utero)
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LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL BENEFICE
FOETUS RHD +INCOMPATIBILITE FOETO-MATERNELLEMise en place d’une surveillance anténatale : BIOLOGIQUE (dosage pondéral)OBSTETRICALE (vélocité-doppler à l’artère cérébrale moyenne du fœtus)
FOETUS RHD –Confirmer sur un second prélèvementPas de surveillance spécifiquePAS DE SITUATION D’INCOMPATIBILITE
PERMET DE LEGITIMER OU NON UNE SURVEILLANCE ANTENATALE OBSTETRICALE ET BIOLOGIQUE
PARTICULIEREMENT CONTRAIGNANTE
FEMME RHD – IMMUNISEE ANTI- D
INDICATION DU GENOTYPAGE RHD FŒTAL DES 12 SA
A. Mailloux, A.Cortey CNRHP, Hôpital St Antoine
LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL BENEFICE
FEMME RHD – NON IMMUNISEE
AmniocentèsePonction de trophoblaste
FOETUS RHD +
Traitement de la patiente au décours immédiat de l’amniocentèse
FOETUS RHD-
Abstention de traitement sous couvert de confirmer le génotype RHD fœtal sur LA dans les 72h.
au minimum 1 semaine avant le geste invasif
INDICATION DU GENOTYPAGE RHD FŒTAL
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LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL BENEFICE
Réception résultat en moyenne 7 jours aprèsEtude Siham Boujida, sage femme maternité St Antoine Concordance génotypage LA/ sang maternel : 99 %
SANS GENOTYPAGE NON INVASIF 102
AVEC GENOTYPAGE NON INVASIF208
117 SAT 48 ROT 43 RDB
386 dossiers de femmes RHD- candidates à une amniocentèse
Etude sur 3 maternités
342 dossiers étudiés 32 exclus car refus PLA ou urgent
310
100 % traitées
100 % traitées12,5 % traitées
55,5 % RHD+39,3 % RHD-1,71 % Indéterminé3,42 % Ininterprétable
A. Mailloux, A.Cortey CNRHP, Hôpital St Antoine
LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL BENEFICE
FEMME RHD – NON IMMUNISEE
A partir de 12 SA
AmniocentèsePonction de trophoblaste
Sans Amniocentèse
FOETUS RHD +
Traitement de la patiente au décours immédiat de l’amniocentèse
FOETUS RHD-
Abstention de traitement sous couvert de confirmer le génotype RHD fœtal sur LA dans les 72h.
au minimum 1 semaine avant le geste invasif
Cibler l’immunoprophylaxie Rh anténatale et les RAI itératives (environ 120.000 femmes / an en France avec 65% de fœtus RH+)
FOETUS RHD +
INDICATION DU GENOTYPAGE RHD FŒTAL
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LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL GENIFERH
Projet STIC 2009-2010 : Génotypage RHD fœtal non invasif systématiqueParis-CNRHP / Marseille / Lille / Poissy / Nantes
Objectif principalÉvaluer le rapport coût-efficacité (4000 patientes) de
l’application systématique du génotypage RhD fœtal non invasif sur l’application de l’immunoprophylaxie RhD et la pratique habituelle de suivi des femmes enceintes RhD négatif des maternités en France (RPC 2005)
Objectifs secondairesFaisabilité de la stratégie de génotypage RhD fœtal systématiqueAnalyser les génotypages « indéterminés » et les discordances
génotypes-phénotypes Aide à la décision publique de diffusion du génotypage RHD
fœtal non invasif au sein du réseau français de soin en obstétrique et du tarif de remboursement du test.
A. Mailloux, A.Cortey CNRHP, Hôpital St Antoine
LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL CONCLUSION
FEMME IMMUNISEE
FEMME ENCEINTE RHESUS D NEGATIF
FEMME NON IMMUNISEE
AMNIOCENTESE SANS AMNIOCENTESE
PERMET DE LEGITIMER OU NON UNE SURVEILLANCE
ANTENATALE
DEVRAIT PERMETTRE D’EVITER INJECTION D’IgRHD SI LE GENOTYPE RHD FOETAL EST NEGATIF (40%)
PERMET D’EVITER INJECTION D’IgRHD SI LE GENOTYPE RHD FOETAL EST NEGATIF
A. Mailloux, A.Cortey CNRHP, Hôpital St Antoine
SCHEMA de l’ETUDE GENIFERH 112
RAI 3e
trimestre
26 27 28 29 30
RAI (4 dernières semaines)
Accouchement + 72h
LABORATOIRE : SAISIE des données biologiques mère (extemporané) et nouveau-né (phénotype à la naissance) TRANSMISSION des résultats génotypage non invasif à la maternité (tel +fax investigateur)
Prélèvement N°1 pour GÉNOTYPAGE
Prélèvement N°2 (si N°1 RhD-) pour GÉNOTYPAGE
GROUPE MATERNITE GENOTYPAGE
GROUPE MATERNITE TEMOIN
INCLUSIONÉQUIPE
OBSTÉTRICALE
- Vérification critères.Femme > 18 ans.Grossesse de 8 à 26 SA.Rh D Négatif non immunisée.pas ATCD génotype invasif.Accoucht prévu Mater réseau- Information-Signature consentement-Remise ordonnance au groupe « génotypage »
Recueil N°1 données:Démographie, suivi de grossesse,immunohématologiques,Immunoprophylaxie
A ENVOYER: FAX INCLUSION- à URCEST : 01 49 28 28 13- au LABORATOIRE
ACCOUCHEMENTÉQUIPE OBSTÉTRICALE
Recueil N°2 données:* Patiente- Prophylaxie Rh ciblée et systématique- Données immuno-hématologiques- Consultations / hospitalisations* Nouveau-né- Démographie- Données immuno-hématologiques- Phénotype
A ENVOYER: FAX ACCOUCHEMENT-à URCEST-au LABORATOIRE
. Suivi de grossesse selon les pratiques de la maternité
. Immunoprophylaxie RhD en fonction du résultat du génotypage
CALENDRIER DE LA GROSSESSE EN SEMAINES D’AMÉNORRHÉE
.Suivi de grossesse selon les pratiques de la maternité
. Immunoprophylaxie RhD selon RPC 2005