A mikrobiológiai laboratórium felépítése, berendezései (GLP)

A mikrobiológiai laboratórium felépítése

• Mikrobiológiai laboratórium „légzsilip” előtérrel• Járulékos helyiségek:

előkészítő, mérlegszoba, (táptalaj készítő és tároló ) mosogató, sterilező.

A szűkebben értelmezett mikrobiológiai munka céljára szolgáló steril övezetet el kell különíteni a már elszaporodott mikroorganizmusokat tartalmazó edények és eszközök kezelését szolgáló helyiségektől.

Mikrobiológiai vizsgálatokkal foglalkozó laboratóriumokban zajló főbb

munkafolyamatok

Táptalaj főzés (és sterilezés)Mintaelőkészítés

LeoltásInkubálás

KiértékelésIdentifikálás

SterilezésMosogatás

Eszközök sterilezéseTörzsfenntartás

A táptalajkészítés és -tárolás berendezései

• Hőmérsékletkompenzációs pH mérő

• Automata adagoló

• Hűtőszekrény

• Mérlegek

• Desztilláló berendezés vagy ioncserélő gyantát tartalmazó patron

• Főzőlap, vagy vízfürdő

Táptalajok típusai

- eredet (természetes, mesterséges, szintetikus)

•- halmazállapot (szilárd, folyékony, félfolyékony)

•- funkció (általános, szelektív, differenciáló)

Mintaelőkészítés berendezései

• Homogenizáló berendezés: – régebben un. forgókéses homogenizáló berendezés– ma már (főleg az élelmiszer-mikrobiológiában) a Stomacher-készülék

alkalmazása az általános

• Rázókeverő

• Fagyasztó

Mintaelőkészítés folyamata

• CÉL: összetétele ne változzon meg • minta megfelelő hűtése (4 °C) közvetlenül a mintavételtől egészen a

vizsgálatig.• mintavétel és a vizsgálat ideje között nem telhet el több, mint 24 óra • reprezentatív minta legalább 200 g ill. ml• A szilárd halmazállapotú minta:

– fel kell aprítani és összekeverni. – az előkészített mintából 10 0,1 g-ot a vizsgálathoz steril Stomacher-

tasakba kell mérni, – 9-szeres mennyiségű hígítóoldattal kiegészíteni (A hígítófolyadék

hőmérséklete 10-20°C) – hogenizálni.

• A folyékony minta– a vizsgálati minta kivétele előtt alaposan át kell keverni, majd rövid

ideig állni hagyni, hogy a légbuborékok felszállhassanak.– Ezt követően a minta, steril pipettával kimért 10 ± 0,1 ml

mennyiségéből el kell készíteni a törzsoldatot (kiindulási hígítás) a szilárd mintáknál leírtakkal azonos módon.

Az elkészített törzsoldat képezi a további vizsgálathoz az alapot.

A steril munkavégzés berendezései(biológiai biztonsági szekrények)

Cél: mikrobamentes környezet biztosítása. A laborban keletkező kis légörvények kivédésére I.- II.- III.-kategóriájú biológiai biztonsági szekrényeket alkalmazunk.

I.- kategóriájú biológiai biztonsági

szekrény

II.- kategóriájú biológiai biztonsági szekrény

Lamináris box: A levegő szűrése révén mikrobamentes légteret biztosít a berendezés munkaterében. Elnevezését a lamináris (turbulenciamentes) légáramlás megvalósítása alapján nyerte. Előnye, hogy kis helyigényű, munkatere lehetővé teszi a steril munkát.

HEPA (High efficiency particulate air) szűrő

II. - kategóriájú biológiai biztonsági szekrény

A légáramlás iránya szerint megkülönböztetünk függőleges (vertikális) és vízszintes (horizontális) légáramlású lamináris boxokat.

III. - kategóriájú biológiai biztonsági szekrény

• Hermetikusan zárt belső tér

• A munkálatok a belső térben rögzített, karhosszúságú gumikesztyűk segítségével folynak.

Alkalmas nagyon veszélyes fertőző

anyagok kezelésére

• Anyagok bevitele, csak légzáró zsilipen keresztül lehetséges• Az anyagok eltávolítása autoklávon vagy folyékony fertőtlenítőszerrel

töltött merítő tankon át történik.

Az inkubálás berendezései

• Termosztátok: a mikroorganizmusok tenyésztésére szolgáló, kívánt hőmérsékletre beállítható szekrények.

• Vízfürdő

• Rázógépek: Főleg aerob mikroorganizmusok tenyésztésénél használják. Vízfürdős változatban, vagy légtermosztáttal egybeépítetten elterjedten alkalmazzák mikroorganizmusok laboratóriumi léptékű szaporítására.

Automata telepszámláló

•80%-al csökken a leolvasásra fordított idő

•600 lemezt olvas le óránként

A sterilezés

Sterilezés módszere Sterilezés eszköze

Túlnyomásos, telített vízgőzzel autokláv Hőhatás

Forró levegővel hőlégsterilizáló

Etilénoxid gázzal gázsterilizátor

Formaldehides gázzal gázsterilizátor Kémiai

Antimikrobiális anyagok oldatában hidegsterilizátor

Hidrogénperoxid plazmában Plazmasterilizátor (hőre, nedvességre érzékeny anyagok, eszközök, műszerek csíramentesítsére alkamlmas)

Mechanikus módszerrel mikrobamentesítő szűrő

UV-fénnyel UV lámpa

Radioaktív sugárzással generátorok, gyorsítók

A sterilezés nedves levegővel I. • Autoklávok (sterilezés gőzzel, nyomás alatt)

– táptalajok és szennyes (kontaminált) edények gőzzel való sterilezésére szolgáló eszközök

– A táptalajok sterilezésénél figyelembe veszzük azok alkotóelemeinek hőérzékenységét és tömegét (1000 ml-nél nagyobb volumenben ne, ne töltsük színültig, kupakokat lazítsuk meg)

– csomagolás nélkül eszközt, anyagot sterilizálni nem szabad– Az üzemeltetés lépései:

• Vízfeltöltés (desztillált vagy ioncserélt vízzel) • Felfűtés • Légtelenítés (levegő eltávolítása a légtelenítő szelepen át-5perc, ha elérte

a 100 °C-ot, ekkor a rakomány még csak 50-60°C-os)• Hőmérséklet-kiegyenlítés (a rakománybak el kell érnie az előírt 121°C,

vagy 134°C hőmérsékletet) • Csírátlanítás (1AT – 121°C 30perc, de 15 minimum,, pl táptalajoknál

2AT – 134 °C 10 perc)• Túlnyomás megszüntetése, szárítás

Az autoklávok csoportosítása

Működés szerint:kézi szabályozásúrészben automatikusautomatikus Kivitel szerint:

álló helyzetűfekvő helyzetű egyoldalikétoldali (ún. átadós rendszerű)

Típus szerint:egyfalúkettősfalú

A sterilezés nedves levegővel II.

Frakcionált sterilezés (tindallozás)Az Bacillus és Clostridium nemzetségbe tartozó baktériumok igen nagy ellenállóképességgel rendelkező endospóráinak elpusztítására szolgál áramló gőzben. Általában hőérzékeny anyagok és eszközök sterilezésekor alkalmazzák. A bakteriális endospórák azt a hőkezelést, amin minden vegetatív baktérium elpusztul, túlélhetik. Ezért a sterilezendő anyagot vagy eszközt 3 napon át napi fél órára áramló gőzbe kell helyezni. Az első napon a hevítés elpusztítja a vegetatív baktériumokat, a további hőkezelések pedig a spórákból kicsírázó baktériumokat.

A sterilezés nedves levegővel III.

Sterilezés áramló gőzbenA sterilezés áramló gőzben légköri nyomáson 100 °C-on 30 percen át történik. A behatási időt attól a pillanattól kell számítani, amikor a sterilezendő eszköz vagy anyag elérte a 100 °C-os hőmérsékletet. A sterilezésnek ez a módja végezhető autoklávban (fúvatás), vagy Koch-fazékban. Ezt az eljárást kell alkalmazni szénhidrátot vagy ennél magasabb hőmérsékletre érzékeny anyagot tartalmazó táptalajok sterilezésekor.

A sterilezés berendezései II.Hőlégsterilező:

– száraz eszközök (lombikok, Petri-csészék, edények) sterilezésére kialakított szárítószekrény típusú berendezések

160°C 180 °C 200 °C

Gravitációs 120 perc 60 perc 30perc

Cirkulációs 45 perc 25 perc 10 perc• Előkészítés, csomagolás (alumínium

fólia , fémtok), munkatér megtöltése

• Felfűtés

• Hőmérséklet kiegyenlítés

• Csírátlanítás

• LehűtésGázégő: a laboratóriumi munka során használtfémeszközök (oltókacs, oltótű, csipesz) sterilezésére szolgál.

Sterilezés kémiai módszerekkel

A kémiai anyagok hatás alapján csoportosíthatók: bakteriosztatikus hatás

baktericid hatás.A hatás az anyagi minőségen kívül függ a koncentrációtól és a hatóidőtől . Kémiai sterilezésre csak cid hatású anyagok alkalmasak.Követelmény:

– hatásuk széles spektrumú legyen, – emberre, állatra és növényre ártalmatlanok, környezetkímélők, – könnyen kezelhetőek és gazdaságosak legyenek.

A kémiai sterilezésre használt anyagok: – folyékony – gáz halmazállapotúak. PL: etilén-oxid

Az etilén-dioxid előnye, hogy 500 mg/1 koncentrációban 20 °C-on (hideg sterilezés) 4-5 óra alatt sterilez, így hőérzékeny eszközök(pl. hőre lágyuló műanyagok) csíramentesítésére is alkalmas. Hátránya, hogy az etilén-oxid belélegezve tüdőödémát okoz.

Plazmasterilizáló

A gázalakú plazmát általában az anyag negyedik halmaz-állapotának tekintik, amely ionfelhőből, elektronokból és semleges atomi részecskékből áll. Az anyagnak ez a halmazállapota elektromos erőtér, vagy mágneses erőtér hatására jön létre. (A természetes úton létrejövő plazmára példa a jól ismert természeti jelenség, mely a Föld északi pólusán észlelhető, az aurora borealis, azaz az északi fény.)

A eljárás alacsony, mintegy 464C hőmérsékleten , elektromos erőtér hatására létrehozott hidrogénperoxid plazma-állapotát alkalmazza alacsony páratartalmú közegben csíramentesítésre.

Az alacsony hőmérsékletű H2O2 plazma aktív szabad gyökei hatékonyan elpusztítják a vírusokat, baktériumokat, spórákat, steril állapotot hozva létre. A folyamat végén vízpára és O2 marad vissza, a rakomány száraz, azonnal használható, illetve a hatékony csomagolás révén szállítható és a kívánt ideig tárolható.

Sterilezés szűrővelFolyékony és gáz halmazállapotú anyagok szűréssel is sterilezhetők. Pórus átmérők:

– bakteriológiában: 0,22-0,65 m között változik– virológiai laboratóriumok 25-100 nm közötti, ami alkalmassá teszi ezeket a

szűrőket a vírusok nagyság szerinti differenciált visszatartására (ultraszűrés).

Korábban a szűrőket égetett agyagból, kovaföldből vagy mázatlan porcelánból készítették, ma már:

– A Seitz-féle szűrők azbesztből préselt korongok, egyszer használatosak.– Az üvegszűrők szűrőfelülete préselt üveghab vagy üvegszál. – A membránszűrők cellulóz-észterből készült vékony filterek. Egyszer használatos

szűrők. Előnyük, hogy pórusátmérőjük szabályozható, egy-egy szűrőnél valamennyi pórus azonos méretű, a szűrés rajtuk keresztül gyors, a szűrendő folyadékból keveset adszorbeálnak, felhasználásuk sokrétű. Kaphatók ipari szűrésre megfelelő méretű és laboratóriumban használatos formában is (fecskendőre rögzíthető, vákuumszűrésre alkalmas stb). A membránszűrők segédeszközként felhasználhatók kis baktériumtartalmú folyadékok csíraszámának meghatározásakor is.  

Sterilezés UV fénnyel

A nem ionizáló sugárzások közül az. ultraibolya sugárzást használjuk csíramentesítésre Az UV-sugárzás teljes spektruma (136-400 nm) károsítja a sejteket, de a legjobb baktericid (baktériumölő) hatást a 250-280 nm hullámhosszú sugarakkal érhetjük le, ami főként a DNS-molekulák károsításával magyarázható. Az UV (germicid)-lámpákat elterjedten alkalmazzák kórházakban, laboratóriumokban a légtér és felületek csíramentesítésére. Alkalmazhatóságának határt szab, hogy hatékonysága a fényforrástól távolodva négyzetes arányban csökken, áthatolóképessége kicsi, és hatékonyságát a felületeken található szennyeződések a sugárelnyelés révén jelentősen csökkentik. Mindemellett tekintettel kell lenni arra, hogy az UV-sugárzás károsítja a szemet, és karcinogén hatása van, ezért az UV-lámpa üzemeltetésekor lehetőség szerint a helyiséget el kell hagyni. Amennyiben erre nincs mód, UV-fényt szűrő szemüveget kell viselni.

Sterilezés ionizáló sugárzással ()

• A nagy energiájú ionizáló sugárzások közül ipari méretekben a jó áthatolóképességű, rendszerint kobalt-izotópból származó gamma-sugárzást használják injekciós tűk, fecskendők, kötszerek, gyógyszerek és egyes élelmiszerek (fűszerek) sterilezésére.

• A gamma-sugárzás előnye, hogy a csomagoláson is áthatol, hátránya, hogy - mint minden radioaktív sugárzás - permanens, és minden irányba szóródik, ezért csak speciális körülmények között alkalmazható.

A MIKROBIOLÓGIAI MŰVELETEK ESZKÖZEI

A mintavétel és előkészítés eszközei•Szilárd mintákból : steril szike, olló és csipesz.

•A folyékony minták beméréséhez 10 vagy 20 ml-es steril pipetta

•A mintákat sugárzással sterilezett polietilén tasakban homogénezzük

A MIKROBIOLÓGIAI MŰVELETEK ESZKÖZEI

Tenyésztőedények

1. Kémcső2. Widal-cső3. Erlenmeyer-lombik4. Álló lombik5. Táptalaj üveg6. Roux-palack7. Petri-csészék8. Durham féle

fermentációs cső

A MIKROBIOLÓGIAI MŰVELETEK ESZKÖZEI

Oltóeszközök• oltókacs• oltótű,• pipetta• szélesztőbot• automata adagoló pipettákat

A MIKROBIOLÓGIAI MŰVELETEK ESZKÖZEI

A mikroszkópos vizsgálat eszközei– tárgylemez– fedőlemez– tárgylemez-csipesz– festőkád vagy festőtálca– számlálókamra