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Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosis moderadamente bajasde ácido acetilsalicílico.
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A mis padres
A Joaquín
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosis moderadamente bajasde ácido acetilsalicílico.
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Casi sin darme cuenta, ha llegado el momento de terminar esta etapa, con la
ambigua tristeza y alegría que tal situación produce: tristeza por el tiempo tan
maravilloso que he pasado y que concluye, alegría por todo lo demás,
especialmente por la oportunidad que me brinda de recordar a aquellas personas
que han contribuido a que este trabajo llegue a su fin.
En primer lugar le agradezco a D. Felipe Sánchez de la Cuesta haberme
concedido realizar la Tesis dentro de su Cátedra, hecho que me ha permitido
conocer día a día la gran labor que se desarrolla en este Departamento que desde
que conozco, admiro y respeto.
Para D. José Pedro de la Cruz Cortés no tengo palabras, admirable tanto en
el plano profesional como personal, trabajador y luchador incansable, siempre me ha
apoyado, ayudado y guiado en este proyecto de investigación sin descuidarlo ni un
momento, a pesar de sus otras numerosas obligaciones. Sin él esto no hubiera sido
posible. Gracias.
A D. Antonio Moreno Guerrero no puedo decirle menos, él me enseñó a
operar y trabajar con las ratas, ayudándome siempre que lo necesité; junto a él he
pasado ratos muy agradables, gracias a su siempre buen humor.
Al lado de Antonio Pino aprendí todo lo que sé de laboratorio y me ayudó con
las ratas siempre que lo solicité. Él y mis compañeros Fran, Loli, Eva, Rosa,
consiguieron convertir las horas de trabajo y también de descanso en gratificantes y
buenos momentos.
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosis moderadamente bajasde ácido acetilsalicílico.
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Quiero recordar a todos los miembros de este Departamento que,
amablemente y en todo momento, me ofrecieron su colaboración.
A mis compañeros del Servicio de Anatomía Patológica del Complejo
Hospitalario Carlos Haya agradecerles que me hayan permitido dedicar parte de mi
escaso tiempo a escribir este trabajo. Así mismo quiero pedir disculpas a mis
amigos, que por el mismo motivo no he atendido con el esmero que se merecen.
A Dios agradezco la familia en la que nací, muy en especial mis padres, a los
que debo TODO. Con su amor, su paciencia y la ilusión que han puesto siempre en
todo proyecto que he emprendido han conseguido que una vez más obtenga el
reconfortante fruto de mi esfuerzo. Gracias de corazón.
Como no, agradecerle a Joaquín su comprensión y su cariño en todo
momento. Él me animó a comenzar este proyecto, que con su incondicional apoyo
hoy culmino.
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosis moderadamente bajasde ácido acetilsalicílico.
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INDICE
INTRODUCCION 1
1. RECUERDO FISIOPATOLOGICO Y CLINICO DE LA DIABETES
MELLITUS
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1.1. Diabetes, concepto y datos históricos 1
1.2. Clasificación de la Diabetes Mellitus 3
1.3. Etiopatogenia 5
1.4. Clínica de la Diabetes Mellitus no complicada 13
1.5. Tratamiento de la Diabetes Mellitus no complicada 17
2. COMPLICACIONES DE LA DIABETES MELLITUS 25
2.1. Complicaciones no vasculares 25
2.2. Complicaciones vasculares 29
3. RETINOPATIA DIABETICA 32
3.1. Introducción 32
3.2. Características clínicas 33
3.3. Clasificación de la Diabetes Mellitus 44
3.4. Fisiopatología de la retinopatía diabética 47
4. PLAQUETAS Y DIABETES MELLITUS 57
4.1. Recuerdo bioquímico del funcionalismo plaquetario 57
4.2. Alteraciones plaquetarias en la Diabetes Mellitus 76
5. DESCRIPCION DE LOS FARMACOS UTILIZADOS EN NUESTRO 83
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosis moderadamente bajasde ácido acetilsalicílico.
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ESTUDIO: ACIDO ACETILSALICILICO
5.1. Introducción 83
5.2. Química 83
5.3. Mecanismo de acción y acciones farmacológicas 84
5.4. Farmacocinética 92
5.5. Toxicidad y reacciones colaterales 94
5.6. Interacciones medicamentosas 95
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosis moderadamente bajasde ácido acetilsalicílico.
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OBJETIVOS 96
MATERIAL Y METODOS 99
1. MATERIAL 99
1.1. Instrumental y aparataje 99
1.2. Fármacos 103
1.3. Reactivos 103
2. METODOS 106
2.1. Animal de experimentación 106
2.2. Diseño del estudio 106
2.3. Método de producción y control de la Diabetes experimental 108
2.4. Metódica seguida al finalizar el periodo de tratamiento 110
2.5. Técnicas analíticas plaquetarias 113
2.6. Técnicas analíticas retinianas 125
2.7. Valoración del grado de cataratas 129
2.8. Método estadístico 131
RESULTADOS 132
1. Grupo control no diabético de un mes de seguimiento 132
2. Grupo control no diabético de dos meses de seguimiento 137
3. Grupo control no diabético de tres meses de seguimiento 142
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosis moderadamente bajasde ácido acetilsalicílico.
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4. Grupo diabético no tratado de un mes de evolución 147
5. Grupo diabético no tratado de dos meses de evolución 152
6. Grupo diabético no tratado de tres meses de evolución 157
7. Grupo diabético de un mes de evolución tratado con AAS 162
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosis moderadamente bajasde ácido acetilsalicílico.
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8. Grupo diabético de dos meses de evolución tratado con AAS 167
9. Grupo diabético de tres meses de evolución tratado con AAS 172
DISCUSION 189
CONCLUSIONES 219
BIBLIOGRAFIA 222
Introducción
1
1. RECUERDO FISIOPATOLOGICO Y CLINICO DE LA DIABETES MELLITUS
1.1. DIABETES. CONCEPTO Y DATOS HISTORICOS.
La OMS, en su última reunión de expertos sobre diabetes, definieron
este proceso como "un estado crónico de hiperglucemia que a veces se
acompaña de síntomas (sed intensa, orina profusa, adelgazamiento, estupor,
coma y muerte, en ausencia de tratamiento); aunque más a menudo estos
síntomas son menos severos o faltan. La hiperglucemia y demás
anormalidades bioquímicas resultan de una deficiencia en la producción o
acción de la insulina, hormona que controla los metabolismos de la glucosa,
pero también de las grasas y de los aminoácidos".
La OMS, añade que "muchos procesos pueden causar el estado
diabético" y que "la intensidad de los síntomas está determinada
principalmente por el grado en que la acción insulínica es deficiente".
Por último, esta amplia definición nos aporta que todo esto lleva
"característicamente el riesgo a largo plazo de desarrollar enfermedades en la
retina y riñones, daño en los nervios periféricos y agravación de la enfermedad
aterosclerótica del corazón, piernas y cerebro"(76).
DATOS HISTORICOS.
Si bien es sabido que la diabetes es una enfermedad que acompaña a la
humanidad desde tiempos remotos, la primera referencia histórica se encuentra
en el papiro de Ebers que data del año 1500 a. de C., aunque el término
Introducción
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"DIABETES" no fue introducido hasta el siglo II a. de C., por Areteus de
Capadocia.
En el siglo XI, el médico árabe Avicena describió algunas complicaciones
de la enfermedad como la gangrena, y en el siglo XVI Paracelso inició el
estudio de la química de la orina. Algo más tarde, en 1675, T.Willis describió la
orina "como si estuviera impregnada de azucar", siendo Dobson quien realizó la
primera comprobación química de esta propiedad, lo que permitió plantear por
primera vez el tratamiento dietético de la enfermedad (92).
En 1686, Morton demostró el carácter hereditario de la diabetes, hecho
que ya había sido descrito por Rondelet sesenta años antes, quien escribió la
famosa frase: "la diabetes persigue a las familias". El primero en determinar los
niveles elevados de glucosa en sangre fue C.Bernard en 1859, quien además
consideró a la hiperglucemia como el signo fundamental de la enfermedad.
Diez años después, en 1869 P.Langerhans, describía los islotes pancreáticos
cuando todavía era estudiante de medicina, recibiendo más tarde su nombre en
honor a su descubridor (195).
La insulina, denominada en un principio "isletina", fue purificada por
primera vez por Banting y Best en 1921 en Toronto siendo utilizada en el ser
humano en 1922, lo que supuso un avance extraordinario en la terapéutica y en
el pronóstico hasta entonces infausto de la enfermedad (92).
1.2. CLASIFICACION DE LA DIABETES MELLITUS
1.2.1. INTRODUCCION.
El estado actual de la investigación acerca de la diabetes mellitus, tiende
Introducción
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a considerar que no se trata de una sola entidad clínica, sino más bien un
grupo heterogéneo de trastornos, es decir, un verdadero síndrome que
responde a diversas etiologías.
La OMS, en 1964 establecía que la enfermedad tenía una serie de
etapas, por todos conocidas tales como: prediabetes, diabetes latente, etc, que
con el tiempo daban lugar a la etapa sintomática de la enfermedad: la diabetes
clínica. Hoy día este concepto ha cambiado, habiéndose comprobado que un
buen número de pacientes, jamás progresaban de una fase a otra, e incluso a
muchos de ellos les desaparecía su intolerancia a los hidratos de carbono.
Además la clásica división en diabetes juvenil y diabetes del adulto tiende a
desaparecer, ya que cada vez son más los casos de diabetes juvenil clásica
que se presentan en las primeras décadas de la vida, obligándonos a
reconsiderar la enfermedad de forma global.
Hoy en día por tanto se habla de un nuevo concepto, ESTADO
DIABETICO, el cual puede tener su origen en diversas entidades nosológicas y
al que se puede llegar por diversas vías. El nexo final es siempre la
hiperglucemia crónica y mantenida, que dará lugar a síntomas, que serán más
severos en función del grado de deficiencia insulínica y de los años de
evolución de la enfermedad.
De todas formas el cambio actual es m�s doctrinal que práctico, pues en
el ejercicio diario de la Medicina, la diabetes tipo I (equivalente a la juvenil) y
tipo II (equivalente a la del adulto) son abrumadoramente más frecuentes
constituyendo el 95% del total de los diabéticos en consulta (74).
La OMS, en 1985 a través de los diversos comités de expertos, promovió
un consenso internacional, dando a conocer la más reciente clasificación de la
diabetes que es esencialmente idéntica, excepto algunos puntos a la de 1980.
A) Clases clínicas.
Introducción
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A.1.) Diabetes mellitus.
- Diabetes mellitus insulin dependiente (DMID).
- Diabetes mellitus no insulin dependiente (DMNID).
a) No obeso.
b) Obeso.
- Diabetes mellitus relacionada con malnutrición (DMRM).
- Otros tipos de diabetes asociada con ciertas condiciones y síndromes:
1) Enfermedad pancreática.
2) Enfermedad de etiología hormonal.
3) Estados diabéticos inducidos por ciertos medicamentos o sustancias
químicas.
4) Anormalidades de la insulina o de sus receptores.
5) Ciertas condiciones y síndromes genéticos.
6) Grupo miscelánea.
A.2.) Tolerancia alterada a la glucosa (TAG).
a) No obeso.
b) Obeso.
c) Asociado a ciertas condiciones y síndromes.
A.3) Diabetes mellitus gestacional (DMG).
Introducción
5
B) Clases con riesgo estadístico. (Personas con tolerancia normal a la
glucosa pero con alto riesgo de desarrollar diabetes).
- Anormalidad previa de la tolerancia a la glucosa.
- Anormalidad potencial de la tolerancia a la glucosa.
1.3. ETIOPATOGENIA.
A) ETIOPATOGENIA DE LA DIABETES MELLITUS TIPO I.
A.1.) INTRODUCCION.
Si bien hoy día es aceptada por todos la idea de que la interacción entre
factores genéticos y algún factor ambiental da lugar a una respuesta
inadecuada del sistema inmune resultando la destrucción de las células beta
pancreáticas, permanece aún en el campo de la investigación la determinación
exacta, tanto de las alteraciones genéticas como del factor ambiental así como
del mecanismo exacto de la autolisis de las células pancreáticas.
A continuación analizaremos brevemente las directrices actuales sobre
los aspectos etiológicos que mayor interés despiertan en la actualidad.
A.2) HERENCIA EN LA DIABETES TIPO I.
La DMID no se hereda. Los padres diabéticos pueden transmitir a sus
hijos una determinada predisposición a adquirir la enfermedad, heredarían una
"susceptibilidad" peculiar a diversos agentes ambientales que desencadenaría
Introducción
6
una respuesta del sistema inmunitario responsable de la destrucción de las
células beta.
En la DMID, la "susceptibilidad" aludida, parece determinada
genéticamente, ya que el locus HLA-DR y dentro de él, el HLA-DR3 y
HLA-DR4, aparecen inequívocamente asociados a la condición de diabético
tipo I (24).
El concepto de susceptibilidad atribuido a la herencia es aún objeto de
diversas controversias, aunque se acepta unánimemente la existencia de algún
antígeno diabetógeno en el desencadenamiento de la enfermedad.
A.3.) EL FACTOR AMBIENTAL: LOS VIRUS.
Los datos estadísticos muestran una tasa de concordancia de solo un
36% en gemelos univitelinos respecto al padecimiento en ambos de la diabetes
tipo I. Lo cual habla a favor de que necesariamente existe algún otro evento
casual o ambiental que intervenga en la etiología de la DMID (74).
Son muchos los argumentos que nos llevan a considerar a los virus
como responsables de la aparición de la enfermedad. Se ha podido comprobar
por ejemplo, que existe cierta estacionalidad en el diagnóstico "de novo" de
pacientes diabéticos. Hecho que se acompaña de un aumento paralelo de las
cifras de anticuerpos antivirales.
La mayoría de los datos, acerca de la implicación vírica en el origen de la
enfermedad, proceden de la experimentación animal (258). En el ser humano,
los virus que pueden inducir diabetes son: el virus de la parotiditis (129), el virus
de la rubeola (176), el citomegalovirus (199), y el virus cocxsakie B
(12,140,257).
Introducción
7
A.4.) ALTERACION DEL SISTEMA INMUNITARIO.
En la DMID se ha podido comprobar que cuando el paciente presenta
los primeros síntomas, es decir cuando se le diagnostica de diabético, el
85%-90% de las células beta pancreáticas están destruidas, permaneciendo
aún sin aclarar la naturaleza de tal circunstancia. Hoy día se tiende a pensar
que la "susceptibilidad" referida anteriormente, está vinculada a la herencia de
una respuesta inmunitaria alterada que incluso sin la mediación de los virus u
otros agentes podría desencadenar la aparición de la enfermedad.
Las células beta como la mayoría de las células epiteliales no suelen
expresar en su superficie de membrana moléculas de la clase II del CMH, como
ocurre en la población diabética (25). Estas células se convertirían así en
presentadoras de autoantígenos al sistema inmunitario, iniciándose una
respuesta autoinmune lenta o rápida según la estirpe celular implicada.
El autoantígeno expresado en la superficie celular, podría proceder del
genoma de la célula beta, en cuyo caso su origen sería endógeno, pudiendo
incluir virus integrados en el genoma, o tener carácter exógeno, siendo la
expresión de virus no integrados u otros agentes infecciosos (160).
Para Botazo y cols., el elemento clave en la destrucción de las células
beta, sería el reconocimiento por parte de las células T citotóxicas de estos
antígenos de la clase II (HLA-DR, HLA-DQ) (24).
Los principales cambios en el sistema inmunitario presentes en la etapa
clínica de la enfermedad incluyen alteraciones tanto a nivel celular como a nivel
humoral: un incremento de linfocitos T activados, alteraciones en el número y
función de las células T supresoras naturales, presencia de autoanticuerpos
contra los islotes (ICA), anticuerpos antiinsulina... Respecto a los ICA, se ha
podido comprobar que la mayoría de los pacientes diabéticos y prediabéticos
Introducción
8
de reciente diagnóstico presentan este tipo de autoanticuerpos. Sin embargo
los antígenos con los que reaccionan los ICA, parecen ser endógenos, ya que
se encuentran igualmente en las células de los islotes de un páncreas normal
(232).
En la actualidad se están estudiando los ICSA (anticuerpos contra la
superficie de los islotes) que parecen cumplir todos los requisitos para ser
considerados "diabetógenos", ya que reaccionan con la membrana celular, fijan
el complemento y presentan alta afinidad por las células beta. Los ICSA se han
encontrado en el 77% de los diabéticos tipo I, y en el 5% de las personas
sanas, sin haberse determinado exactamente su papel en la patogenia de la
enfermedad (212).
B) ETIOPATOGENIA DE LA DIABETES TIPO II.
B.1.) INTRODUCCION.
La etiopatogenia de la diabetes tipo II permanece aún muy confusa. Ello
se debe a diversos factores, entre ellos la complejidad de su estudio, pues la
diabetes tipo II es un trastorno multimetabólico en el que la hipertensión arterial
la hipertrigliceridemia y el hiperinsulinismo, adquieren un protagonismo tan
importante en la práctica clínica como la hiperglucemia, llegando en muchos
casos y como punto final de la enfermedad a provocar la muerte por cardiopatia
isquémica. (82) Además la diabetes tipo 2, es un trastorno en el cual se
encuentran implicados distintos mecanismos etiológicos, estando exenta de
algún marcador epidemiológico que permitiera una selección de la población a
estudiar como ocurre en la diabetes tipo I.
Introducción
9
B.2.) HERENCIA EL LA DIABETES TIPO II.
Día a día está tomando m�s fuerza el convencimiento de que la
transmisión de determinados caracteres genéticos juegan un papel
determinante en la diabetes tipo II si bien esta transmisión no está ligada al
CMH, como ocurre con la diabetes tipo I.
A pesar de ello, la localización del defecto genético heredado se
desconoce. Se ignora en realidad qué se hereda. Lo cierto es que los estudios
realizados en gemelos idénticos o monocigóticos en la diabetes tipo II,
presentan una concordancia (ambos gemelos afectados), del 91% (14),
mientras que dicha concordancia es solo del 36% en la diabetes tipo I (161).
Por otra parte, los estudios realizados por Kobberling y cols., predicen
que entre un 43% y un 45% de los hermanos, padres e hijos de pacientes
diabéticos tipo II, acabarán padeciendo la enfermedad si llegan a la edad de 80
años, porcentaje sugestivo de un modelo de herencia autosómica dominante.
Además, los pacientes que adquieren la enfermedad antes de los 40 años
(diabetes tipo II de presentación precoz) frecuentemente tienen padres
diabéticos lo que para O'Rahilly podría significar la presentación homocigótica
de un gen o genes diabetógenos (194).
En 1974, se describió la diabetes mellitus de la edad adulta en el joven
(DAJ) o MODY (Matury Onset Diabetes in the Young) o síndrome de Mason,
que constituye un grupo de población diabética en los que la mayoría de los
miembros de las familias adquieren la enfermedad antes de los 25 años y que
son la expresión de una herencia autosómica dominante al menos durante tres
generaciones (92).
B.3.) ALTERACIONES PANCREATICAS EN LA DIABETES TIPO II.
Introducción
10
En la actualidad los avances en anatomía patológica han permitido la
identificación de los cambios pancreáticos específicamente asociados a la
diabetes tipo II : disminución del tamaño pancreático, fibrosis de la glándula,
cambios cuantitativos en la densidad de las células insulares (de hasta un 50%
en las células beta) y depósito de amiloide en los islotes. Cambios
interpretados anteriormente como efectos inespecíficos del envejecimiento y no
relacionados con la diabetes.
El mayor interés reside actualmente en el depósito de amiloide en los
islotes (hialinosis), que se encuentra en el 51-72% de los diabéticos tipo II
mayores de 40 años, representando en algunos de ellos un 90% de ocupación
en los islotes, los cuales se encuentran deplecionados de células insulares
(41,230), lo que daría lugar a los trastornos de la secreción hormonal
característicos de la diabetes tipo II.
Ya desde los años sesenta se había podido comprobar que la liberación
de insulina tras un bolo intravenoso de glucosa estaba marcadamente reducida
en los diabéticos tipo II (165).
En 1987 dos grupos de investigadores por separado consiguieron
determinar la composición del peptido fibrilar denominándole "peptido asociado
a la diabetes" o PAD el cual no se detectó en los extractos pancreáticos de
sujetos no diabéticos(40,48).
Un compuesto similar el "polipeptido amiloide insular" (PPAI) o amilina
es secretado por la célula beta según un patrón bifásico, al mismo tiempo que
la insulina, en respuesta a la hiperglucemia, si bien se ha descubierto en otros
tejidos como el pulmón, ganglios o tracto gastrointestinal, ignorándose su
significado.
En el momento actual se especula con la posibilidad de que el PPAI,
fuera una forma sustitutiva de algún peptido normal segregado por la célula
Introducción
11
beta, con alguna modificación en su molécula, dando lugar a un acúmulo
progresivo durante años de fibrillas que poco a poco interferirían el mecanismo
secretor del islote, explicándose de este modo la aparente existencia de una
herencia autosómica dominante (193).
B.4.) RESISTENCIA A LA INSULINA.
La existencia de defectos en la acción de la insulina en los tejidos
periféricos es un hecho evidente que hoy por hoy permanece sin aclarar. Se ha
comprobado que en los obesos no diabéticos existen menos receptores para la
insulina tanto en los monocitos, hematíes como en los adipocitos (60); siendo
mayor la resistencia si el obeso es también diabético.
Algunos investigadores plantean la posibilidad de que tal resistencia se
encuentre a nivel post-receptor por defecto de algún transportador intracelular
de glucosa, debido a que la isoforma GLTU4, que parece ser el transportador
en el músculo y en la célula adiposa, se encuentra disminuido en ciertos
estados de ayuno, obesidad y diabetes (16,18,186).
B.5.) NIVELES HEMATICOS DE INSULINA COMO FACTOR
ETIOPATOGENICO
El posible protagonismo de la insulinemia y la glucemia como factores
primarios en la etiología de la DMNID, ha dado lugar a diversas hipótesis. La
primera de ellas se basa en el hecho demostrado de que la función insular y
por tanto la respuesta insulínica mejora considerablemente al disminuir la
hiperglucemia, ya sea con dieta, antidiabéticos orales o con terapia insulínica.
En esta hipótesis se plantea que la hiperglucemia ejercería una acción tóxica
Introducción
12
sobre la célula beta mediada por la hipertrigliceridemia derivada de la falta de
regulación insulínica, induciendo resistencia a la acción de la insulina en los
tejidos periféricos por el aumento de ácidos grasos libres en plasma (89,105).
La segunda, es la conocida hipótesis de Raeven (212), que presupone
que la resistencia a la insulina asociada con la obesidad y la herencia, darían
lugar a una hiperinsulinemia que culminaría con el agotamiento de la célula
beta, originando secundariamente una hipoinsulinemia responsable de la
aparición de hiperglucemia y de la diabetes como tal (211).
Ultimamente, el hallazgo sobre estudios "in vitro" de que el PPAI,
diminuye el consumo de glucosa en el tejido muscular de rata (157), ha
planteado una última hipótesis: el incremento en la producción y liberación
extracelular del PPAI, por las células beta, daría lugar en una primera fase a
incrementar la resistencia insulínica y a promover la tolerancia alterada a la
glucosa, y posteriormente tras el progresivo depósito como amiloide en los
islotes y la subsiguiente alteración en la secreción de insulina, facilitaría la
aparición de la diabetes (131).
1.4. CLINICA DE LA DIABETES MELLITUS NO COMPLICADA
La diabetes es "un estado crónico de hiperglucemia que a veces se
acompaña de síntomas," "aunque más a menudo estos síntomas son menos
severos o faltan". Por tanto, la presencia de manifestaciones clínicas estará
vinculada a los casos de diabetes aún sin diagnosticar, a las fases de comienzo
de la enfermedad o a etapas posteriores de descompensación por inadecuado
tratamiento. Exponemos a continuación un breve recuerdo de las tres formas
de presentación más habituales en la práctica médica.
Introducción
13
A) Síntomas derivados de las alteraciones metabólicas.
En este primer apartado incluimos aquellos cuadros cuya sintomatología
es consecuencia de la alteración del metabolismo hidrocarbonado, en los que
la poliuria, la polifagia y la polidipsia, acompañadas o no, de astenia y
adelgazamiento, constituyen los síntomas cardinales de este grupo en donde
los diabéticos tipo I son su principal exponente (73).
Normalmente desde que hacen su aparición los primeros síntomas hasta
el momento del diagnóstico, transcurre muy poco tiempo, semanas o meses,
debido a que la sintomatología es muy brusca desde el principio. En los niños
por ejemplo, no es infrecuente que la primera manifestación de la enfermedad
sea un cuadro de cetoacidosis, ya que el déficit insulínico suele instaurarse a
estas edades en un periodo relativamente corto.
La poliuria es muy evidente desde el principio, llegando en algunos
casos a 3-5 litros diarios, lo que obliga al paciente a evacuar constantemente
incluso durante la noche. A este respecto es de destacar, que el dintel renal
para la glucosa establecido en 180 mg/dL muestra gran variabilidad en los
diabéticos, presentándose en la práctica glucosurias significativas con niveles
en sangre de 160 mg/dL e incluso inferiores mientras que otros pacientes con
glucemias entre 200-300 mg/dL no las presentan (73).
La polidipsia se instaura como mecanismo compensador, y si bien no es
un síntoma tan llamativo como la poliuria, la constante necesidad de ingerir
líquidos constituye un agravante del cuadro al beber, entre otras, gran cantidad
de bebidas azucaradas elevando aún más la glucemia (89).
En general la severidad de la polidipsia y la poliuria, es variable y
frecuentemente no correlacionada con la hiperglucemia, lo cual hace posible
variaciones muy importantes de estos par�metros y de los síntomas
acompañantes (73).
Introducción
14
La polifagia que es casi constante, llama especialmente la atención
cuando el paciente, sobre todo joven, observa que a pesar de tener muy buen
apetito no solo no engorda, sino que además pierde peso, circunstancia que
puede pasar desapercibida en un niño en fase de crecimiento, pero que en el
adulto constituye una importante señal de alarma (89).
La astenia es un síntoma, que en el adulto es difícil de valorar, por falta
de sueño u otras circunstancias. Pero en un niño que pierde actividad y
muestra indiferencia ante sus juegos es una anormalidad que llevará a los
padres al médico, diagnosticándose la enfermedad.
El cuadro puede llegar a ser muy llamativo, pudiendo presentar náuseas,
vómitos, alteraciones de la conciencia, taquipnea, deshidratación y coma,
consecuencia del desorden metabólico existente.
B) Sintomatología derivada de las alteraciones secundarias
Si la alteración metabólica es decir la hiperglucemia y el déficit de
insulina fundamentalmente no son muy severos, los síntomas clásicos pueden
faltar o expresarse mínimamente como ocurre en la DMNID. El diagnóstico será
por tanto, de sospecha ante las complicaciones e infecciones repetidas que con
carácter crónico sufren este grupo de población.
Por todo ello, la enfermedad se diagnosticará meses o años después de
la aparición de los primeros síntomas, siendo frecuente que el médico
especialista al observar lesiones compatibles con la diabetes sospeche y
diagnostique la enfermedad. Así por ejemplo, el dermatólogo al observar
lesiones características como la necrobiosis lipoide o la dermopatía diabética,
Introducción
15
solicitará una analítica confirmándose el diagnóstico. En otras ocasiones será el
oftalmólogo el que descubra lesiones en la retina , o el médico general ante una
paciente con sobreinfecciones genitourinarias de repetición.
Pero la hiperglucemia mantenida a lo largo del tiempo, llevará a la
aparición de diversas alteraciones vasculares principalmente en retina, riñón y
sistema nervioso periférico, que se harán más evidentes en pacientes mal
controlados o que no cumplen la medicación prescrita. A esta sintomatología se
añaden las enfermedades que inciden habitualmente en la población general,
tales como la caries arterioesclerosis, infecciones, hipertensión, obesidad, etc,
afectando con mayor intensidad y frecuencia a los diabéticos (73).
C) Diabetes mellitus asintomática.
En los últimos tiempos en los países industrializados y debido por una
parte al mayor control de la población laboral mediante exámenes médicos
periódicos y de otra a los distintos tipos de pólizas de las compañías
aseguradoras en función de la salud del asegurado, estamos asistiendo a un
aumento en la prevalencia de enfermedades como la diabetes, llegando a ser
hoy día la forma más frecuente de diagnóstico de esta afección.
Igualmente es de destacar que la frecuencia en la práctica de analíticas
por punción venosa en la población general y por tanto en los familiares de
diabéticos, ha permitido diagnosticar precozmente muchos casos todavía
asintomáticos de verdaderas DMID o de diabetes mellitus del adulto en el joven
(89).
1.5. TRATAMIENTO DE LA DIABETES MELLITUS NO COMPLICADA
Introducción
16
La OMS en 1986, establecía que los objetivos principales en el
tratamiento de la D.M. son : 1) preservar la vida del paciente y aliviar sus
síntomas; 2) capacitar al diabético para llevar a cabo una vida social todo lo
normal que le sea posible; 3) establecer y mantener un buen control
metabólico; y 4) prevenir las complicaciones de la diabetes.
Para conseguir tales objetivos, el médico ha de tener en cuenta las
características tanto clínicas como sociales del paciente, adaptando el
tratamiento a cada situación, ya que en la diabetes se requiere un abordaje
multidisciplinario y no solo un enfoque clínico que en la mayoría de los casos
llevaría al fracaso terapéutico.
Por este motivo, y ante la imposibilidad del profesional de ser al mismo
tiempo médico, psicólogo, pedagogo..., surge la figura del educador en
diabetes, que intenta completar la labor asistencial y educacional del médico.
Centraremos nuestra exposición, solo en uno de los objetivos del
tratamiento integral del diabético, el control metabólico, por ser éste el más
importante desde el punto de vista biológico.
Para ello, analizaremos la dieta, el ejercicio físico y la terapéutica
farmacológica.
A) La dieta.
El tratamiento dietético persigue básicamente dos objetivos: normalizar
el peso, habitualmente excesivo en la DMNID en sus inicios y en ocasiones
deficitario en la DMID, y contribuir a la consecución de la normoglucemia (89).
La diferente capacidad de segregar insulina de unos pacientes a otros,
establece importantes diferencias en las pautas dietéticas. En la diabetes tipo I,
Introducción
17
y según el tipo de insulina utilizado, deber� sincronizarse la ingesta de
alimentos con la dosis de insulina a fin de evitar, tanto la hiper como la
hipoglucemia. En la diabetes tipo II en cambio, y si el paciente es obeso, la
disminución del peso mediante dieta hipocalórica, será nuestro principal
objetivo (106).
En la dieta del diabético se pueden incluir todo tipo de alimentos y solo
se excluir�n aquellos con alto contenido en azucares refinados tales como los
utilizados en repostería, azúcar de remolacha o caña, miel, etc. Las
necesidades calóricas y la proporción de los distintos principios inmediatos son
semejantes al sujeto no diabético, 55-60% de carbohidratos, 15-20% de
proteinas y 25-30% de grasas, si bien en la práctica se ha comprobado que los
médicos, suelen prescribir una dieta más baja en hidratos de carbono (en torno
al 45%), a pesar de que la experiencia a demostrado que incluso dietas con un
contenido del 65-70%, se acompañan de cifras de glucemia normales
disminuyendo además las necesidades de insulina (89).
Las proteinas y las grasas de la dieta, se mantendrán en la proporción
estandarizada para la población general, excepto para las dietas hipo o
hipercalóricas, procurando que los alimentos proteicos sean de alto poder
biológico y que las grasas sean de origen vegetal.
El consumo de bebidas alcohólicas se reducirá al máximo o se suprimirá,
por el riesgo a corto plazo de producir hipoglucemias en periodos de ayuno, y
por la tendencia a producir hipertrigliceridemia, a la que ya está predispuesto el
diabético, por el déficit insulínico.
El diabético dispondrá, para el uso de la dieta como tratamiento o
coadyuvante del mismo, del método adoptado por la ADA (American Diabetes
Association), denominado "sistema de intercambio de unidades", mediante el
cual se dividen los alimentos en seis categorías: lácteos, verduras, cereales,
frutas, carnes y grasas; incluyendo un listado de alimentos equivalentes en sus
nutrientes básicos, que constituyen las distintas "unidades", de gran utilidad en
Introducción
18
el diseño de un plan específico de alimentación (8).
B) El ejercicio físico.
La práctica de algún tipo de deporte, en los sujetos diabéticos, se acepta
unánimemente como beneficiosa, aunque tal práctica estará siempre
supeditada a la valoración individual e integral del diabético, considerando tanto
su situación metabólica como física e intelectual (190,246).
En la actualidad, la mayor parte de los diabetólogos aconsejan, que la
práctica del deporte debe reservarse a los diabéticos sin complicaciones y que
voluntariamente acepten el cambio de vida que el ejercicio supone para ellos
(19,260).
Es un hecho comprobado, que el deporte practicado con regularidad por
el diabético, conlleva un aumento de la sensibilidad a la insulina tanto exógena
como endógena, lo cual se traduce en el diabético tipo I en una reducción de
sus necesidades diarias de insulina, y en una importante mejoría del estado
metabólico de conjunto, en el diabético tipo II (123).
El diabético insulin-dependiente, debe de tomar una serie de
precauciones para evitar tanto la hipo como la hiperglucemia durante el
ejercicio. Debe comer antes, durante y después del ejercicio, inyectarse insulina
en una zona de baja actividad muscular ajustando el resto de las tomas, vigilar
su glucemia aprendiendo y acostumbrándose a las variaciones que sufre según
el ejercicio, y demorarlo cuando la glucemia sea superior a 250 mg/dL (246).
El diabético no insulin-dependiente deberá adaptarse igualmente a la
Introducción
19
práctica del deporte, modificando tanto la dieta como su tratamiento
farmacológico si es necesario.
A continuación exponemos un resumen de los principales efectos
beneficiosos que un entrenamiento constante puede ejercer sobre el
metabolismo según los trabajos realizados por Horton en 1989, en la diabetes
tipo II (122):
1) Reducción de la glucemia durante y a continuación del ejercicio.
2) Reducción de la insulinemia basal y postprandial.
3) Aumento de la sensibilidad a la insulina.
4) Reducción de los niveles de hemoglobina glucosilada.
5) Mejoría del perfil lipídico: reducción de triglicéridos, marcada disminu-ción
de las proteinas LDL-colesterol y aumento de las HDL-colesterol.
6) Reducción de la hipertensión leve y moderada.
7) Incremento del gasto calórico, reduciendo el peso.
8) Favorable condicionamiento cardiovascular.
9) Aumento de la fuerza y flexibilidad del organismo.
10) Mejoría del sentimiento de bienestar y calidad de vida.
C) Terapéutica farmacológica.
Desde el punto de vista farmacológico, el tratamiento de la diabetes
tiene tres posibilidades terapéuticas, la utilización de las sulfonilureas, las
biguanidas y la insulina.
Introducción
20
a) Sulfonilureas.
Las más utilizadas en la actualidad son la tolbutamida, la clorpropamida,
la glibenclamida, y los derivados de esta : glipizida, glibornurida, glicazida y
glipentida. Su utilización está muy limitada debido de una parte a la aparición
frecuente de efectos secundarios y de otra, y sobre todo, a los resultados del
UGDP (University Group Diabetes Program) que demostraron una menor
mortalidad cardiovascular en el grupo de pacientes tratados con insulina o dieta
sola (89).
En la práctica, el uso clínico de las sulfonilureas, se limita a los pacientes
afectos de DMNID, con cierto grado de reserva insular pancreática y de edad
avanzada, que viven solos y en los que su situación metabólica es estable
estando exentos de síntomas clínicos importantes, en los que el tratamiento a
base de insulina puede ser peligroso si no se realiza con el rigor y exactitud
necesarios (89).
b) Biguanidas.
Actualmente en nuestro medio, se usan la metformina, la fenformina y la
butformina. En EE.UU., y en algunos países europeos se retiraron del mercado,
al observarse que una gran parte de los pacientes tratados con fenformina,
sobre todo los afectos de insuficiencia cardíaca, respiratoria o renal,
presentaban con facilidad acidosis láctica.
Además los resultados del UGDP, demostraron que la fenformina en
tratamientos a largo plazo era insuficiente para mantener unos niveles de
glucosa adecuados, así como, que la mortalidad cardiovascular era superior a
otros grupos tratados con dieta o con insulina, al igual que las sulfonilureas.
Introducción
21
Su utilidad actual está muy limitada y se suelen reservar para pacientes
obesos claramente hiperinsulinémicos debido al efecto anorexígeno que
poseen, además de no producir hiperinsulinismo como ocurre con las
sulfonilureas (89).
c) Insulina
"La insulina está formalmente indicada, en todos los casos de DMID y en
los casos de DMNID cuando se produce el fracaso primario o secundario de los
hipoglucemiantes orales. Así mismo, debe utilizarse insulina en los comas
diabéticos y en determinadas situaciones de la diabetes del adulto, como la
cirugía, el embarazo, las infecciones agudas y el infarto de miocardio"(89).
La utilización de la insulina en el tratamiento de la diabetes, intenta
reproducir de la manera más exacta posible el ciclo normal de secreción
endógena que tiene lugar en el páncreas de un sujeto normal. Para ello, es
necesario adaptar el tratamiento a cada persona según las necesidades de
insulina, considerando tanto el estado físico como la actividad diaria, así como
los h�bitos alimenticios del paciente.
La farmacopea actual ofrece hoy día, una amplia gama de insulinas, que
según su naturaleza se dividen en: soluble o regular, NPH, lenta y ultralenta, y
según la duración de sus efectos, en rápida, lenta y retardada. Pudiendo elegir
el médico una u otra, o mezclas, según las necesidades de cada enfermo.
En los últimos años, la utilización de las insulinas humanas, ha
desplazado por completo a las insulinas de origen animal -porcina y bovina-
tradicionales.
Las diferencias entre unas insulinas y otras, son prácticamente
inexistentes, siendo todas ellas de una gran calidad y pureza. Se acompañan
Introducción
22
por tanto de un escaso poder antigénico y presentan además ventajas
adicionales como la desaparición, salvo excepciones, de la lipodistrofia inducida
por la insulinas tradicionales (75).
La actual concepción de la diabetes, en el sentido de considerar que la
hiperglucemia mantenida durante años, es la causa de las temidas
complicaciones tardías (retinopatías, nefropatías,etc), lleva a los diabetólogos a
buscar métodos cada vez mejores para mantener la normoglucemia de forma
constante.
La insulinoterapia intensiva es hoy por hoy, la mejor esperanza ante
estas perspectivas (59). Se consideran en la actualidad tres métodos: los
regímenes de dosis múltiples, la infusión continua de insulina y el implante de
islotes pancreáticos.
Un modelo de régimen de dosis múltiple es el propuesto por
Holman-Turner, que utiliza una insulina de acción prolongada, para las
necesidades basales, añadiendo una insulina regular, antes de cada comida.
Este método, es adoptado cada vez por más diabéticos, sobre todo jóvenes ya
que permite un control más exacto de la glucemia y permite utilizar las "plumas"
de inyección subcutánea, que resultan muy prácticas en el manejo de la
insulina. El segundo método, la infusión contínua de insulina, mediante los
sistemas de asa cerrada, de asa abierta y los sistemas implantables continúan
sin dar los resultados esperados en Europa y EE.UU. (210,226,231,239). El
tercer método, mediante el transplante de islotes pancreáticos, implantables a
nivel subcutáneo se ha realizado aisladamente sobre pacientes dializados que
seguían el régimen de dosis múltiple, y ha permitido como una de sus primeras
ventajas, la reducción de la dosis diaria de insulina (1).
2. COMPLICACIONES DE LA DIABETES MELLITUS.
Introducción
23
El paciente diabético está sometido a riesgos y complicaciones propias
de su situación metabólica. Vamos a considerar en este apartado tanto las
complicaciones agudas de carácter metabólico como las alteraciones
vasculares degenerativas, objeto estas últimas de nuestro estudio.
En el primer apartado, se consideran los cuadros de coma
específicamente diabéticos como son el cetoacidótico, el hiperosmolar y el
hipoglucémico y en segundo lugar las complicaciones vasculares donde
expondremos brevemente las complicaciones tanto macro como
microvasculares, desarrollando en otro capítulo la retinopatía diabética.
2.1. COMPLICACIONES NO VASCULARES.
Las complicaciones no vasculares, sobre todo la cetoacidosis diabética
(CAD), constituían antes de la aparición de la insulina, la principal causa de
muerte en los pacientes diabéticos seguida por las infecciones y las
enfermedades cardiovasculares. En la actualidad la CAD supone menos del
1%, siendo la enfermedad vascular la primera causa de muerte en los países
desarrollados (89).
A) CETOACIDOSIS DIABETICA (CAD).
La CAD, es una complicación que si bien es característica de la diabetes
tipo I, puede darse en cualquier paciente diabético ante determinadas
circunstancias favorecedoras. Y aunque su frecuencia ha disminuido
notablemente, continua siendo una causa importante de morbilidad en aquellos
Introducción
24
pacientes mal tratados o que adolecen de una insuficiente educación
diabetológica.
El cuadro se instaura normalmente de forma progresiva en varios días,
pero a veces la evolución es muy rápida, de 10 a 18 horas. Al principio
aparecen síntomas propios de una diabetes mal regulada, síntomas que si son
bien conocidos por el paciente, podrá frenar mediante la ingestión de hidratos
de carbono y la administración de insulina.
El cuadro clínico aparece cuando la insulina desciende notablemente
alterando el metabolismo graso e hidrocarbonado fundamentalmente. Este
déficit da lugar a un aumento importante tanto de los niveles de glucemia como
de ácidos grasos libres, que dan lugar por oxidación a un exceso de Acetil CoA
tal, que excede la capacidad oxidativa del ciclo de Krebs, acumulándose y
sirviendo de substrato para la formación de cuerpos cetónicos (Acetoacetato y
3-ß-hidroxibutírico).
El aumento de cuerpos cetónicos en sangre da lugar a una disminución
del pH sanguíneo y la acidosis generada da lugar a hiperemesis, hecho que
unido a la diuresis osmótica inducida por la intensa hiperglucemia llevan a una
situación de deshidratación de curso progresivo con caída de la tensión arterial
y entrada en coma si el proceso no se detiene (89).
En nuestro medio la causa desencadenante del cuadro en el 50% de los
casos, son las infecciones, si bien, siempre se dan un conjunto de factores en
el desarrollo de la CAD (5).
B) COMA HIPEROSMOLAR HIPERGLUCEMICO NO CETOSICO.
Este es un coma metabólico que se presenta con mayor frecuencia,
dada la fisiopatología del cuadro en diabéticos tipo II. Estos pacientes,
Introducción
25
generalmente de edad avanzada presentan una hiperglucemia muy alta del
orden de hasta 800-1000 mg/dL, deshidratación, a menudo hipernatremia y
ausencia de cuerpos cetónicos.
La mortalidad de este cuadro es muy elevada del orden del 40%, mayor
que la del coma cetoacidótico.
La intensa hiperglucemia sin acidosis y sin cetonemia, se intenta explicar
por la presencia de una secreción residual de insulina endógena, suficiente
para impedir la lipolisis y por tanto la formación de cuerpos cetónicos; aunque
esta hipótesis está en discusión pues la ausencia de cetosis podría deberse a
una disminución de la síntesis hepática por mecanismos hoy por hoy en
estudio.
Las causas desencadenantes son similares a las que llevan a la CAD, si
bien, la enfermedad infecciosa como factor etiológico es aún más
preponderante que en la CAD, y su frecuencia a medida que la población
envejece, aumenta proporcionalmente (89).
La forma de comienzo es insidiosa, y en el 60% de los casos el paciente
desconocía su enfermedad, desencadenandose tras una intervención
quirúrgica, infecciones, tratamiento con corticoides, infarto de miocardio, etc (5).
C) COMA HIPOGLUCEMICO.
La hipoglucemia es la complicación más frecuente de la diabetes. Se
considera que aproximadamente el 10% de los pacientes diabéticos sufren al
año un episodio de coma. La falta de glucosa es la responsable del 3-5% de las
muertes de los diabéticos.
El cuadro aparece cuando la glucemia desciende por debajo de 50
mg/dL, si bien esta cifra es muy discutible, pues a veces aparecen síntomas
con glucemias más altas o lo contrario, cifras inferiores sin sintomatología.
Introducción
26
Los síntomas, son muy similares a otros muchos procesos. Los más
precoces son los dependientes de la estimulación simpática como son:
ansiedad, taquicardia, sensación de hambre, gran sudoración..., síntomas que
a veces son poco llamativos y pueden pasar desapercibidos para el enfermo.
Después aparecen los síntomas propios de la neuroglucopenia,
afectándose primero la corteza cerebral, causando irritabilidad, somnolencia,
cefalea, falta de concentración y fatiga.
Si el cuadro continua: pérdida de conciencia, espasmos, signo de
Babinski, respiración superficial, bradicardia, miosis, atonía, pudiendo llegar
incluso a la muerte (6).
A diferencia con la CAD, todo este cortejo sintomático puede aparecer
en poco tiempo por lo que resulta imprescindible y de una importancia extrema
que el diabético aprenda a reconocer los síntomas propios de hipoglucemia,
que como es bien sabido presentan unas peculiaridades distintas en cada
enfermo, para detener el proceso con la ingestión de hidratos de carbono.
2.2. COMPLICACIONES VASCULARES.
2.2.1. MACROANGIOPATIA DIABETICA
Es bien conocido el hecho de que la población diabética presenta
ateroesclerosis con mayor frecuencia que la población general, además de
hacer su aparición a edades más tempranas de la vida, sufriendo de
hipertensión arterial, angina de pecho, claudicación intermitente y accidentes
cerebrovasculares antes que el resto de la población.
La mayor incidencia de estas enfermedades, se debe al parecer a
diversos factores entre los que destacan, la hiperglucemia mantenida, el
hiperinsulinismo y sus consecuencias, los trastornos de la coagulación y las
Introducción
27
alteraciones genéticas. En este sentido, hay estudios que plantean que los
factores de riesgo de las enfermedades cardiovasculares como pueden ser la
hipertensión o la hiperlipemia, son los responsables realmente de la aparición
precoz de la macroangiopatía al asociarse a la diabetes (47).
Hoy día, y dado el auge de los transplantes renales y la importante
disminución de muertes producidas por CAD, estamos asistiendo a un
incremento en la prevalencia de las enfermedades cardiovasculares al haber
aumentado la longevidad de los pacientes diabéticos.
2.2.2. MICROANGIOPATIA DIABETICA
A) NEFROPATIA DIABETICA
Si bien hay pacientes que con más de 60 años de evolución, no
presentan clínicamente alteraciones renales, se considera normal, que a los 17
años del comienzo de la enfermedad, alrededor de un tercio de los pacientes
presenten proteinuria como primera expresión de su nefropatía diabética(89).
Desde el punto de vista patogénico, no se conoce aún la secuencia real
de hechos que llevan al fallo renal, pero sí determinados par�metros que
permiten, si n� prevenirla, retrasar la evolución a insuficiencia renal crónica
terminal.
La microalbuminuria, entendiéndose como tal, la presencia en orina de
Introducción
28
24 horas de albúmina en cantidades solo detectables por radioinmunoensayo,
aparece desde las fases iniciales de la nefropatía diabética y sirven al internista
o diabetólogo para detectar la población diabética con mayor riesgo de
padecerla.
En la prevención de la nefropatía se considera fundamental un estricto
control metabólico, así como el mantenimiento de unas cifras tensionales en
sus límites normales, dado el paralelismo existente entre la presencia de
microalbuminuria y tensión arterial elevada (213).
El tratamiento con antiagregantes plaquetarios así como la normalización
de los perfiles lipídicos, estan considerados igualmente necesarios, debido a la
influencia de los microagregados y la hiperlipemia en la patogenia de la
nefropatía diabética (213).
B) NEUROPATIA DIABETICA.
Se presenta en un 7.5 % de los pacientes en el momento del diagnóstico
y tras 25 años de evolución de la diabetes en el 50 % de los casos, aunque
esta cifra disminuye hasta un 10 % en los grupos con un buen control
metabólico (208).
Respecto a la etiopatogenia existen en la actualidad dos teorías: La
vascular que postula que la alteración existente en las formas mononeuríticas
es de origen vascular dada la presentación brusca y la regresión posterior
característica de un proceso ateromatoso; y la teoría metabólica que
responsabiliza a la hiperglucemia de las diversas alteraciones que aparecen en
el nervio como el edema axonal y el acúmulo de sorbitol en las células de
Swhann (229,240).
Un estudio realizado sobre los nervios afectados mediante
espectroscopia por resonancia magnética (114), parece unificar ambas teorías,
pues el edema axonal podría deberse al gradiente osmótico producido por el
Introducción
29
incremento de sorbitol endoneural y éste, daría lugar a isquemia nerviosa por lo
que ambas teorías quedarían así unificadas (116).
Las formas de presentación son muy diversas afectándose uno o varios
troncos nerviosos y alterándose unas veces la sensibilidad táctil y nociceptiva,
otras los axones motores, y en otras ocasiones la inervación vegetativa;
además de presentarse formas mixtas, que configuran cuadros de difícil
diagnóstico.
3. RETINOPATIA DIABETICA.
3.1. INTRODUCCION.
La retinopatía diabética (RD) y la catarata, constituyen las
complicaciones más importantes del globo ocular en los pacientes diabéticos.
Aisladamente, la RD constituye la primera causa de ceguera en personas
menores de 65 años y se encuentra entre una de las cuatro causas más
frecuentes de ceguera en el mundo.
El tiempo de evolución de la enfermedad es un factor determinante en la
aparición de esta complicación, de forma que el 90% de los enfermos
diabéticos con 25 años de evolución, padecen alguna forma de RD (169).
Tan solo hace dos décadas, el 50% de los enfermos con RD quedaban
ciegos en el plazo de 5 años. En la actualidad, se puede prevenir más del 90%
de estos cuadros (97).
Introducción
30
Los primeros datos acerca de la importancia que para la salud pública
tiene la RD, se obtuvieron por medio de la Model Reporting Area for Blindness
Statistics, asociación de voluntarios de 16 estados que registraron los casos de
ceguera existentes entre 1965 y los primeros años de la década de los 70.
Este estudio demostró la importancia de esta complicación, pues cada
año registraron 5.000 nuevos casos de ceguera secundaria a la diabetes. Hoy
día, en E.E.U.U., unos 700.000 pacientes diabéticos están en peligro de perder
su visión debido a las complicaciones de la RD (97).
A través de un estudio a gran escala en la población general, el
Winsconsin Epidemiologic Study of Diabetic Retinopathy, llevado a cabo por
Ronald Klein et. al de la Universidad de Winscosin, se tomó verdadera
conciencia del problema realizándose un estudio prospectivo durante 4 años
participando 450 médicos de asistencia primaria con la colaboración de 2.990
pacientes diabéticos, valorando la presencia de cualquier grado de retinopatía.
El principal hallazgo fue una elevada frecuencia de RD proliferativa,
especialmente en el grupo de pacientes jóvenes con más de 5 años de
evolución.
En el grupo de inicio de la diabetes en la vida adulta, y con más de 20
años de evolución, se observó retinopatía proliferativa en el 25% de los tratados
con insulina, en comparación con únicamente el 5% de los que no recibían
insulina (97).
El problema de la RD hoy día se centra en la detección precoz de la
misma, lo cual corresponde al médico de atención primaria que debe realizar
controles periódicos a los pacientes diabéticos a su cargo, y derivarlos al
oftalmólogo ante la presencia de cualquier alteración del fondo de ojo.
Existen factores sistémicos que pueden influir en la incidencia y
progresión de la RD, además del tiempo de evolución y tipo de diabetes. Nos
referimos a la pubertad (148), la hipertensión, colesterinemia , arteriosclerosis e
Introducción
31
insuficiencia carotídea (169).
3.2. CARACTERISTICAS CLINICAS.
En la retinopatía diabética, encontramos una serie de alteraciones en la
retina que delimitan el estadío de evolución que tiene la enfermedad. Vamos a
exponer a continuación los posibles hallazgos del fondo de ojo, tanto a la
visualización simple con oftalmoscopio, como con las técnicas más sofisticadas
empleadas hoy en día en oftalmología.
A) SIGNOS VASCULARES
1- Cambios circulatorios.
2- Rotura de la barrera hemato-retiniana.
3- Alteraciones capilares.
- Dilatación capilar.
- Microaneurismas.
- Oclusión papilar.
- Anomaliasmicrovascularesintrarretinianas (AMIR).
4- Alteraciones venosas.
- Dilatación.
- Arrosariamiento.
- Asas vasculares.
- Reduplicación venosa.
- Envainamiento venoso.
Introducción
32
- Oclusiones venosas completas o incompletas.
- Exudados perivenosos.
5- Alteraciones arteriales y arteriolares.
- Estrechamientos.
- Envainamientos.
- Oclusión arteriolar.
B) SIGNOS RETINIAN0S
1- Hemorragias retinianas.
2__ Exudados duros.
3- Exudados blandos o algodonosos.
4- Edema retiniano.
5- Isquemia retiniana.
6- Neovascularización retiniana y papilar.
7- Proliferación fibrosa.
A) SIGNOS VASCULARES.
1- Cambios circulatorios.
La retina sufre una serie de cambios comenzando por una vasodilatación
capilar compensadora a la hipoxia relativa, alteraciones del volumen y
velocidad de flujo y demás cambios que analizaremos más adelante en la
fisiopatología de la retinopatía diabética.
2- Rotura de la barrera hemato-retiniana.
Ya que las lesiones estructurales que sufren los capilares retinianos,
Introducción
33
condicionan un aumento de permeabilidad, detectable por fluorofotometría, que
se objetiva incluso en sujetos diabéticos sin retinopatía.
3- Alteraciones capilares:
- Dilatación capilar.- La distensión que sufre la pared se atribuye a la
pérdida de pericitos (44), y probablemente a un aumento de la presión
sanguinea. Histológicamente aparece un incremento del número de células
endoteliales, a expensas de una disminución de pericitos (150).
A este respecto se sabe que en la retinopatía diabética, la primera
alteración morfológica de los capilares, es la pérdida gradual de los pericitos,
por lo que se considera a los mismos como los principales implicados en la
patogenia de la retinopatía diabética (97).
- Microaneurismas.- Como su mismo nombre indica, los
microaneurismas son pequeñas dilataciones saculares de un tamaño de 15 a
50 µm, siendo detectables oftalmoscópicamente a partir de los 30 µm. Fueron
descritos por primera vez por Mackenzie y Nettleship en 1979 (166).
Respecto a su etiología, existen dos hipótesis que tratan de explicar el
origen de estas dilataciones: la primera hace responsable al deterioro que sufre
el pericito, por lo que el control del flujo y del tono vascular del capilar se vería
alterado; y la segunda considera que la proliferación celular aneurismática, es
secundaria a la hipoxia local, basándose en que los aneurismas tienen como
localización preferente zonas de no perfusión capilar (169).
En la fase inicial de su evolución, se pueden observar mediante
oftalmoscopia directa en forma de pequeñas evaginaciones de la pared capilar.
Histológicamente suelen tener una pared fina, aunque con el transcurso de los
años pueden aumentar el grosor de su pared hasta ocluir la luz del vaso. A la
visión con oftalmoscopio, aparecen como pequeñas manchas rojas muy bien
delimitadas, cuya localización más frecuente es temporal a la m�cula. En la
angiografía se aprecian como pequeños puntos hiperfluorescentes. El aumento
Introducción
34
del número de aneurismas es un signo de mal pronóstico (144).
- Oclusión capilar.- Cuando uno o varios capilares se cierran, dan lugar
a una zona de no perfusión que se aprecia con el estudio angiográfico como
zonas de hipofluorescencia que suelen estar rodeadas de múltiples
microaneurismas y dilataciones capilares.
Con el oftalmoscopio se pueden observar hemorragias y en ocasiones
exudados duros. A nivel histológico, la membrana basal está engrosada y los
capilares dilatados. Se puede afectar cualquier zona del fondo de ojo, aunque
suelen afectarse con más frecuencia el polo posterior y la zona de la mácula,
comprometiendo la agudeza visual.
- Anomalias microvasculares intrarretinianas (AMIR).- Son
segmentos vasculares intrarretinianos tortuosos y dilatados, de aspecto
teleangiectásico, siendo considerados por algunos autores como shunt
arteriovenosos en zonas de no perfusión y por otros como neovasos en
respuesta a zonas de isquemia de la retina (145).
4- Alteraciones venosas.
Los hallazgos que aparecen en muchas ocasiones en el fondo de ojo
muestran una retina con un aspecto pretrombótico (88), que hace pensar en las
interrelaciones plaqueta-pared vascular como mediadores en la patogenia de la
RD. A saber :
- Dilataciones.- Signo relativamente inespecífico, muy precoz, y que
puede aparecer incluso en pacientes sin retinopatía.
- Arrosariamiento.- Son zonas del territorio venoso que presentan
estrechamientos y dilataciones muy localizadas y se considera que cuando
aparecen, hay un compromiso vascular grave.
- Asas vasculares.- Es una desviación curva y abrupta que se
caracteriza por su coloración más oscura que el resto de la vena (74).
Introducción
35
- Reduplicación venosa.- Es la dilatación de un canal preexistente o la
proliferación de un nuevo canal, de calibre similar, adyacente a la vena original
(80).
- Envainamiento venoso.- Son consecuencia del depósito de material
hialino, de la proliferación endotelial, o del engrosamiento difuso de la pared.
Se visualizan como lineas blanquecinas a uno, o a ambos lados de la vena y si
llegan a opacificar totalmente la vena, como cordones blanquecinos.
- Oclusiones venosas completas o incompletas.
- Exudados perivenosos.- que no son más que exudados duros que
aparecen a uno o a ambos lados de las venas.
5- Alteraciones arteriales y arteriolares.
Ya es sabido que la diabetes mellitus es una enfermedad que afecta a
los pequeños y grandes vasos. En el fondo de ojo las alteraciones arteriales y
arteriolares que se observan con más frecuencia son:
- Estrechamientos.- Que suelen ser más evidentes en el origen de la
arteria.
-.Envainamientos.- De características similares a los venosos.
- Oclusiones arteriolares.- Que tienen la peculiaridad de ser uno de los
fenómenos más tópicos de la retinopatía diabética (93), pudiendo aparecer
bruscamente y mostrándose como exudados algodonosos, o bien aparecer
más lentamente por lo que solo se expresarían como una oclusión vascular
aislada.
La angiografía con fluoresceina nos muestra una imagen de múltiples
espículas de pocas micras de longitud, que salen desde las arterias y arteriolas,
contrastando con una retina isquémica hipofluorescente.
Introducción
36
B) SIGNOS RETINIANOS
Una vez analizadas las diversas alteraciones que pueden aparecer en el
lecho vascular de la retina, vamos a analizar a continuación como se objetivan
dichos cambios en la R.D.:
1.- HEMORRAGIAS RETINIANAS.
Al producirse una hemorragia en la retina, por rotura de un
microaneurisma, capilar, vénula o incluso algún neovaso se pueden observar
dos tipos de imágenes según la profundidad de la hemorragia:
-Las hemorragias superficiales o "en llama" que tienen lugar en el plexo
capilar superficial, en la capa de fibras nerviosas, y que adoptan una
conformación estriada dada la disposición de las células. No siendo exclusiva
esta presentación de la R.D., pudiendo aparecer este signo en otras entidades
como en la retinopatía hipertensiva.
-Las hemorragias profundas, tienen forma redondeada y se consideran
m�s características de la R.D. Tienen lugar en el plexo capilar profundo, y son
de tamaño variable, bordes difusos y contorno regular.
La evolución normal de las hemorragias, es su desaparición por
reabsorción en un plazo comprendido entre 6 semanas y 3 meses.
2.- EXUDADOS DUROS.
Se observan con el oftalmoscopio como manchas blancas o amarillentas
de bordes irregulares y límites nítidos cuya localización preferente suele ser en
el polo posterior de la retina, estando habitualmente rodeados de edema.
Histológicamente son acúmulos grasos y lipoproteicos, localizados
fundamentalmente en el espacio extracelular, a nivel de la capa plexiforme
externa. Su evolución natural es aumentar de tamaño cambiando su
Introducción
37
morfología, o desaparecer, al ser fagocitados por macrófagos.
3.- EXUDADOS BLANDOS O ALGODONOSOS.
Este tipo de exudados son el signo o manifestación clínica de la oclusión
arteriolar. Se visualizan como manchas blancoalgodonosas o grisáceas, de
forma oval o redondeada y de límites mal definidos con estriaciones paralelas a
las fibras nerviosas y localización en las capas profundas de la retina.
Anatomopatológicamente, son auténticos infartos, más que exudados,
con tumefación de la capa de fibras nerviosas y formación de cuerpos cistoides.
Se pueden localizar en cualquier lugar de la retina, evolucionando a su total
reabsorción en 8-17 meses, o hacia la aparición de nuevos exudados, pero
nunca a un aumento de tamaño (168).
En la angiografía, se observan dentro de un área hipofluorescente, por la
isquemia vascular, y llaman la atención las alteraciones vasculares
circundantes.
4.- EDEMA RETINIANO.
Las alteraciones morfológicas que sufren los vasos de la retina dan
lugar, entre otras anomalías, a la alteración de la permeabilidad, acumulándose
fluidos y plasma preferentemente a nivel de la capa plexiforme externa y de la
nuclear interna. Como consecuencia de ello, la retina aumenta su grosor
pudiendo perder su transparencia, lo que implicará pérdida de la visión de
mayor o menor grado, según la zona afectada.
Si tiene carácter agudo, el edema es reversible y no requiere tratamiento
a menos que está comprometida la mácula. Pero su reversibilidad es casi
imposible cuando el acúmulo se hace crónico, pues se forman unos espacios a
Introducción
38
modo de quistes rodeados por células de Muller (191) lo que se conoce a nivel
histológico con el nombre de "degeneración cistoide". En este caso la
angiografía es de elección como método de estudio mostrándonos las típicas
imágenes en pétalos de flor o en dedo de guante
Es de destacar la especial importancia que tiene el edema cuando afecta
a la zona de la m�cula pues para algunos autores es la causa más importante
de pérdida de la visión en la retinopatía diabética de fondo (169). La
prevalencia del edema macular depende del tiempo de evolución y del tipo de
diabetes. Los diabéticos tipo 1 jóvenes, suelen estar exentos de edema
macular los 8 primeros años; mientras que los diabéticos tipo 2 presentan una
prevalencia del 5% en el momento del diagnóstico. El riesgo de padecer edema
macular en los pacientes con retinopatía proliferativa es del 72%, frente al 3%
tan solo en los pacientes con R.D. de fondo grado leve (143).
5.- ISQUEMIA RETINIANA
En muchos pacientes diabéticos la retinopatía no progresa más allá de la
fase de edema, pero a pesar de ello son también muy numerosos los casos en
los que aparecen oclusiones microvasculares y arteriolares determinando áreas
de isquemia.
La aparición de áreas de no perfusión, se considera el principio de las
complicaciones más importantes de la R.D. ya que normalmente evolucionará
hacia la proliferación fibrovascular.
La angiografía con fluoresceína, muestra falta de perfusión capilar en
forma de defectos de llenado, apareciendo por tanto como zonas
hipofluorescentes.
Si la isquemia se produce por cierre capilar, las �reas de no perfusión
Introducción
39
son limitadas y suelen estar rodeadas por abundantes microaneurismas. Pero
si la oclusión es arteriolar el área isquémica es mayor y se pueden visualizar
pequeñas espículas a modo de picos de flauta, saliendo de la pared de las
arterias (88).
6.- NEOVASCULARIZACION RETINIANA.
Cuando el oftalmólogo detecta la presencia de neovasos en la retina o
en la papila óptica, la R.D. ha alcanzado por definición la fase proliferativa.
La retinopatía diabética proliferativa (RDP), es una fase menos común
pero más grave, y puede llevar a la ceguera en el curso de 5 años al 50% de
los casos (169).
La formación de neovasos, similar en su génesis a los vasos normales,
es un intento de aporte sanguíneo a zonas que sufren isquemia debido a
oclusiones vasculares. Con frecuencia la neovascularización se produce en la
parte posterior de la retina, a unos 45 φ de la papila óptica, y especialmente en
la propia papila (97).
En este intento regenerador, prolifera no solo el tejido vascular, sino
también el tejido fibroso, y podremos observar los neovasos como finos
"pinceles" de disposición anárquica o formando redes u ovillos que pueden
invadir el vítreo. Cuando el tejido neovascular invade la cámara vítrea la
tracción que se ejerce sobre los vasos de la retina, puede dar lugar a uno de los
signos clínicos más característicos de la RDP, las hemorragias vítreas, que si
son abundantes pueden llegar a disminuir de forma importante la visión hasta el
punto de solo percibir la luz (169).
Pero la tracción ejercida desde el vítreo, puede dar lugar a una
complicación aún mayor, también característica de la RDP: los
desprendimientos de retina. Estos desprendimientos, pueden afectar a
pequeñas o a grandes zonas existiendo en tales casos un deterioro importante
Introducción
40
de la visión.
7.- PROLIFERACION FIBROSA.
Al proliferar el tejido fibroso, se observa, si es lo suficientemente
abundante, como un tejido opaco que puede acompañarse o no de neovasos.
El crecimiento a que da lugar el tejido fibrovascular suele obedecer a
unos patrones determinados:
.- a través de las arcadas para formar un anillo,
- con crecimiento anárquico tapizando la retina en meseta,
- y en sentido anteroposterior a través del canal de cloquet.
3.3.) CLASIFICACION DE LA RETINOPATIA DIABETICA.
La clasificación que exponemos a continuación es la clasificación que
propone la Sociedad Española de Retina y Vítreo del Prof. Dr.Fernandez Vigo.
A) RETINOPATIA DIABETICA DE FONDO.
1. Leve
2. Moderada
3. Severa
4. Muy severa
B) RETINOPATIA DIABETICA PROLIFERATIVA.
1. Sin signos de alto riesgo.
Introducción
41
2. Con signos de alto riesgo.
En cada una de estas formas de presentación, aparecen una serie de
características que describimos a continuación:
A.1. Retinopatía de fondo leve:
- Microaneurismas aislados.
- Exudados lipídicos (duros) aislados.
- Hemorragias puntiformes o "en llama" aisladas.
A.2. Retinopatía de fondo moderada:
- Microaneurismas en mayor número.
- Exudados lipídicos aislados o en circinada.
- Hemorragias puntiformes o "en llama" más numerosas o hemorragias
más oscuras y extensas.
- Edema macular clínicamente significativo (EMCS), entendiéndo-se
como tal, la apreciación de algunos de los siguientes hallazgos con la lámpara
de hendidura:
* Engrosamiento de la retina a menos de 500 µm del centro de la
zona avascular foveal (ZAF).
* Exudados lipídicos (con engrosamiento de la retina adyacente) a
menos de 500 µm del centro de la ZAF.
* Engrosamiento mayor o igual a 1 diámetro de disco (DD) a menos
de 1 DD del centro de la ZAF.
- Alguna microangiopatia intrarretiniana (AMIR).
Introducción
42
- Algún exudado algodonoso.
A.3. Retinopatía de fondo severa:
- Hemorragias extensas y oscuras.
- Arrosariamiento venoso.
- AMIR.
- Exudados algodonosos.
- EMCS, o edema macular de menor severidad.
Estos signos pueden encontrarse tanto en RD de fondo severa, como en
la muy severa.
A.4. Retinopatía de fondo muy severa.
Se consideran los signos anteriores y la coexistencia de dos o tres de los
siguientes signos:
- Hemorragias severas en cuatro cuadrantes.
- Arrosariamiento venoso en dos cuadrantes.
- AMIR moderadamente severa en un cuadrante.
B.1. Retinopatía proliferativa sin signos de alto riesgo.
- Neovasos en el disco o a menos de 1 diámetro de disco de la papila
(NVD), menores de 1/4 del área del disco sin hemorragia vítrea o prerretiniana.
- Neovasos en cualquier otro punto de la retina (NVE) menores de 1/2
área de disco con o sin hemorragia vítrea o prerretiniana.
Introducción
43
- Neovasos en cualquier otro punto de la retina (NVE) mayores de 1/2
área de disco sin hemorragia vítrea o prerretiniana.
B.2. Retinopatia proliferativa de alto riesgo.
- Neovasos en el disco o a menos de 1 diámetro de disco (NVD)
mayores de 1/4 del área del disco.
- Neovasos en el disco o a menos de 1 diámetro de disco de menor
tamaño, con hemorragia vítrea o prerretiniana.
- Neovasos en cualquier otro punto de la retina (NVE) mayores de 1/2
área de disco, con hemorragia vítrea o prerretiniana.
3.4.) FISIOPATOLOGIA DE LA RETINOPATIA DIABETICA
La fisiopatología de la retinopatía diabética (RD) no se conoce aún con
exactitud, así como tampoco se conoce en qué momento y dónde comienzan
las alteraciones que dan lugar a los signos clínicos tan graves y trascendentes
para la vida del diabético.
Hoy día, se acepta cada vez más la idea, de que la diabetes no es una
sola entidad clínica, sino más bien un grupo heterogéneo de trastornos, es
decir un verdadero síndrome, que responde a causas diversas. Este grupo de
trastornos participa de dos hechos comunes: una hiperglucemia crónica que se
objetiva en el estado de ayuno o sólo en respuesta a la sobrecarga de glucosa;
y un amplio abanico de daños tisulares o complicaciones tardías en la mayoría
de los órganos.
Tal es el caso de la retina, en la que se acepta por la mayoría de los
autores, que la afectación que sufre es una consecuencia de la hiperglucemia
mantenida basándose tal afirmación en las siguientes observaciones:
Introducción
44
- La frecuencia y gravedad de la RD aumenta con el tiempo de evolución y el
mal control de la diabetes.
- La reproducción de RD en modelos experimentales tanto de diabetes como de
pseudodiabetes por galactosemia, en los cuales, el único nexo en común es
una hexosa que activa la vía de los polioles (84).
- La existencia de retinopatía en diabetes secundarias (146).
- Los mecanismos bioquímicos implicados en determinadas complicaciones
crónicas de la diabetes que se activan, tras la exposición de los tejidos a la
hiperglucemia (43).
Junto a la hiperglucemia, existe una disfunción insulínica, en su
producción o acción, que condiciona otras alteraciones de tipo metabólico o
endocrino, que complican aún más el proceso, siendo su conocimiento esencial
para entender los signos clínicos que generan, así como las complicaciones
secundarias.
La opinión más generalizada, es que el órgano diana sobre el que
actúan los factores etiopatogénicos es la microcirculación, si bien algunos
autores como Frak (96), defienden la teoría de que la afectación de las células
gliales o neuronales precede a la vascular.
Otro investigador Merimée (177), considera que los cambios anatómicos
producidos en la RD tienen su origen en un conjunto de factores que podemos
agrupar en tres categorías: alteraciones bioquímicas, hemodinámicas y
endocrinas, siendo esta separación más teórica que práctica al estar
imbricados estos factores entre sí (Figura 1).
A) MECANISMOS BIOQUIMICOS.
Los altos niveles sanguíneos de glucosa determinan que el metabolismo
de la misma, especialmente si se asocia a déficit insulínico, se desvíe hacia
Introducción
45
otras rutas metabólicas no dependientes de la insulina. Estas vías son
principalmente la vía de la glicación proteica y la vía de la aldosa reductasa.
Introducción
46
1.- VIA DE LA GLICACION PROTEICA NO ENZIMATICA.
A través de esta vía, la glucosa se une a los grupos epsilon-amino del
aminoácido lisina, alterando la composición de la proteina afecta con la
particularidad de ser ésta una unión irreversible, proporcional a los niveles de
glucosa y que no necesita ser catalizada por una enzima. La consecuencia de
esta reacción es la desnaturalización de las proteinas por lo que se producirán
cambios estructurales y funcionales en dichas moléculas (96).
Los tejidos más comunmente afectados son: colágeno, proteinas del
cristalino, mielina, membranas celulares de los hematíes, plaquetas y células
endoteliales, proteinas del plasma como fibrina, fibrinógeno y antitrombina III, y
el ejemplo más conocido, la hemoglobina glicosilada (32).
Anatomopatológicamente la glicación proteica produce un
engrosamiento de la membrana basal del capilar retiniano, disminuyendo la luz
vascular y favoreciendo por tanto la agregación plaquetaria. Además se dificulta
la difusión de nutrientes y disminuye la elasticidad por lo que se imposibilita la
dilatación capilar compensadora (10,159).
Por último, destacar la alteración de la actividad catabólica normal de las
proteinas de la membrana basal que son menos susceptibles a proteolisis y la
alteración de la albúmina circulante que modifica el normal funcionamiento de
las células endoteliales que captan albúmina en cantidades excesivas (163).
2.- VIA DE LA ALDOSA REDUCTASA
Existen tejidos que no dependen de la insulina para la captación de la
glucosa y que utilizan distintas vías para su catabolismo. La más importante es
Introducción
47
la vía anaeróbica de Embden-Meyerhof. Pero cuando se satura, la glucosa es
metabolizada por otras vías alternativas de las que destacamos por ser más
estudiada, la vía de los polioles conocida como la del sorbitol.
Esta ruta metabólica, está mediada por la aldosa reductasa, enzima con
una escasa afinidad por la glucosa pero que con altos niveles de glucemia se
activa. La aldosa reductasa, convierte los azúcares en alcoholes, la glucosa en
sorbitol, la galactosa en fructosa..
El sorbitol puede incrementar la concentración tisular de mioinositol y
alterar disminuyendo la actividad de la proteinkinasa C, enzima necesaria para
la fosforilación de las proteinas. Aunque se da la circunstancia en determinadas
células, como las células endoteliales, de que la hiperglucemia puede activar a
la proteinkinasa C independientemente de la concentración de mioinositol
(156).
Se ha detectado actividad aldosa reductasa en múltiples tejidos entre los
que destaca el cristalino, pericitos de los capilares de la retina, y en las células
de Schwann. El acúmulo de sorbitol provoca alteraciones osmóticas que llevan
al engrosamiento de la membrana basal y a la formación de pericitos fantasmas
(189).
La relación del sorbitol con las complicaciones crónicas de la diabetes,
es más fácilmente demostrable en el cristalino, en el cual el efecto osmótico por
el acúmulo de sorbitol perece ser la causa de la formación de la catarata
(100,152).
Los f�rmacos inhibidores de la aldosa reductasa previenen el
engrosamiento de la membrana basal y los cambios estructurales de los
capilares retinianos (136), así como disminuyen la formación de pericitos
fantasmas (189,217).
B) MECANISMOS HEMORREOLOGICOS.
Introducción
48
Como hemos podido apreciar anteriormente, en la diabetes son diversos
los mecanismos que pueden dar lugar a alteraciones vasculares. A saber :
1- LA CIRCULACION OCULAR Y SUS MECANISMOS REGULADORES.
Existe un mecanismo regulador del flujo sanguíneo que mantiene una
perfusión adecuada de la retina a pesar de los cambios en la presión arterial
sistémica (216). Aunque el funcionamiento de este mecanismo regulador no es
del todo conocido, para Lanigan et al.(155), habría una relación entre
neuropatía autonómica y fallos en la regulación del flujo retiniano.
En la población diabética, el calibre de las arteriolas y de las vénulas es
mayor que en los no diabéticos, lo cual sería una respuesta compensatoria a
una situación de hipoxia relativa, considerándose un mecanismo compensador
(149).
Además en la diabetes, el coeficiente de cizallamiento está aumentado,
lo que por sí mismo podría ser origen de las lesiones que sufren las células
epiteliales (175). Este aumento de la viscosidad sanguínea es un 25% más alto
en los diabéticos que en los no diabéticos, lo que se produce por las
alteraciones de la serie roja, la elevación de albúmina y del fibrinógeno, así
como, por las alteraciones de la serie plaquetaria (13).
Este conjunto de alteraciones que tienen lugar en la diabetes, dan lugar
a alteraciones morfológicas en los capilares de la retina, siendo una de las
primeras en detectarse el aumento de la permeabilidad que parece tener su
origen en el deterioro progresivo del número de pericitos. La pérdida gradual
que sufren los pericitos tiene lugar incluso antes del desarrollo de los
microaneurismas (97).
Introducción
49
Al romperse por tanto, la membrana hematorretiniana el espacio
extravascular se ocupará de plasma y células sanguíneas, y dado el aumento
de viscosidad existente, tendrá lugar un enlentecimiento del flujo sanguíneo que
junto con las alteraciones de la pared, producirán oclusiones capilares y por
tanto zonas de hipoxia retiniana en el territorio perfundido.
2- ALTERACIONES EN LA SERIE ROJA.
Los hematíes tienen la propiedad de adaptarse a las distintas
circunstancias que se pueden dar en la circulación sanguínea. Cuando la
velocidad es alta, se separan y se orientan en dirección del flujo, pero cuando
esta disminuye en exceso, tienden a agregarse adoptando la forma de pilas de
monedas, por lo que aumenta la viscosidad de la sangre en el territorio afecto
(175).
De otra parte, la capacidad de deformabilidad de los eritrocitos está
alterada en los diabéticos, siendo esta propiedad muy importante para la
microcirculación, pues el hematíe necesita circular por capilares inferiores a su
diámetro. La rigidez del hematíe produciría aumento de la viscosidad, aumento
del flujo y obstrucciones, además de ser un factor que condiciona el daño sobre
el endotelio al aumentar las fuerzas de cizallamiento (235).
En los pacientes diabéticos con retinopatía se ha demostrado que la
deformabilidad de los hematíes está disminuida frente a individuos normales y
diabéticos sin retinopatía, apreciándose incluso en los estadíos iniciales de la
microangiopatía diabética (77).
3- ALTERACIONES EN LA LIBERACION DE OXIGENO.
Introducción
50
En los sujetos diabéticos, existen elevados niveles de hemoglobina
glicosilada, lo que dificulta la oxigenación de los tejidos dada la alta afinidad por
el oxígeno que presenta este tipo de hemoglobina
En los diabéticos mal compensados, con gran glucosuria, o en los casos
de administración de insulina (que hace que al tiempo que penetra la glucosa
en la célula entre el fosfato), disminuye la tasa plasmática de fosfatos,
disminuyendo el 2-3 difosfoglicerato y la liberación de oxígeno por los eritrocitos
(78).
4- ALTERACIONES EN LA SECRECION DEL ENDOTELIO.
Existen alteraciones funcionales en los capilares de la retina que
contribuyen sin duda a la degeneración precoz de la retina en los diabéticos.
Así por ejemplo, hay una producción aumentada de sustancias proagregantes
como colágeno, heparan-sulfatos, laminina, fibronectina y proteoglicanos (128).
El factor de Von Willebrand, proteina adhesiva implicada en la
agregación plaquetaria y sintetizada en parte por el endotelio vascular, se
encuentra igualmente aumentada (198). En cambio, la prostaciclina o PGI2,
inhibidora de la agregación plaquetaria, tiene disminuida su producción en los
sujetos diabéticos (65,185).
5- PLAQUETAS Y ALTERACIONES EN LA COAGULACION.
Son numerosos los estudios realizados en este sentido por lo que hemos
dedicado una sección para su análisis en la introducción de este trabajo.
C) MECANISMOS ENDOCRINOLOGICOS.
Introducción
51
En este sentido hacemos referencia a la existencia o no de factores de
crecimiento, pues se ha postulado la existencia de factores responsables de la
formación de neovasos en la retina aunque aún no se ha identificado ninguno
como inductor de tal formación.
Los llamados "heparin-binding growth factors", han centrado la atención
de los investigadores, pues se han identificado numerosos receptores para
estos factores en células endoteliales, fibroblastos 3T-3, en el epitelio del
cristalino de vaca (179) y en células ciliares de embrión de pollo (142).
Otro grupo son los denominados "insulin-like growth factors" (IGF), en
donde destacamos un mediador plasmático de la hormona de crecimiento, la
somatomedina C o IGF-I, que es sintetizado por el hígado y que interviene en la
maduración y el crecimiento de fibroblastos, músculo liso y otras líneas
celulares (98); pues se han identificado receptores para éste en los capilares
retinianos, en concreto en los pericitos, células endoteliales (139) y células
fotorreceptoras de la retina de vaca (172).
En el ser humano, en el suero de pacientes con retinopatía de rápida
evolución se detectaron niveles elevados de IGF-I y II (109), así como en el
humor vítreo en comparación con controles no diabéticos (110,227).
Introducción
52
4. PLAQUETAS Y DIABETES MELLITUS
4.1) RECUERDO BIOQUIMICO DEL FUNCIONALISMO PLAQUETARIO
Las plaquetas, son células que a pesar de su pequeño tamaño, tienen
una intensa actividad metabólica, no solo por su participación primordial en la
hemostasia primaria, sino por poseer además otras funciones menos conocidas
como son:
- Fagocitosis: los trombocitos fagocitan virus, bacterias, complejos
antígeno-anticuerpo..., siendo destruidas posteriormente en el bazo (113).
- Participan en el mantenimiento de la integridad de la pared vascular,
mediante la secreción desde los gránulos alfa del factor de crecimiento
derivado de las plaquetas (PDGF), el cual induce el crecimiento y multiplicación
de células musculares, fibroblastos del tejido conectivo, células subendoteliales
y células endoteliales (219).
- Interaccionan con células tumorales, por lo que favorecen el desarrollo
de metástasis. Motivo por el cual se ha estudiado el uso de fármacos
antiagregantes como antimetastásicos (126).
- Intervienen en la respuesta inflamatoria, ya que al ser estimuladas
liberan sustancias como serotonina e histamina, además de factores
quimiotácticos como son PF4, PAF, PDGF, 12-HETE.
Por todo lo anterior hay autores que consideran la hemostasia primaria
como un tipo de respuesta inflamatoria y a la plaqueta como una forma especial
de leucocito (188).
A continuación centraremos nuestra atención en la principal función de la
plaqueta: la hemostasia.
Introducción
53
4.1.1. LA PLAQUETA EN LA HEMOSTASIA PRIMARIA. SUSTRATO
MORFOLOGICO DE LA ACTIVACION PLAQUETARIA.
La propiedad que poseen las plaquetas de adherirse a la pared de un
vaso lesionado o entre ellas mismas, se atribuye a las características de su
superficie externa que esta configurada de fuera a dentro por tres estratos, la
atmósfera periplaquetaria, el glucocalix y la membrana citoplasmática.
La capa externa o atmósfera periplaquetaria, no tiene límites precisos y
esta formada por proteinas plasmáticas imprescindibles en el proceso de
activación plaquetaria como son : el fibrinógeno, IgM, y los factores V, VIII y XI
de la coagulación.
La capa intermedia o glucocalix esta formada por glucosaminoglucanos,
proteinas absorbidas procedentes del plasma y también por un alto contenido
de glucoproteinas que provienen de la membrana de las plaquetas y cuyo
componente glucídico principal es la combinación de N-Acetil Glucosamina y
Acido Siálico siendo este último el responsable de la electronegatividad de la
plaqueta (127).
Se han identificado más de 30 glucoproteinas (206) cuya misión principal
es servir de receptores, actuando como puentes entre las plaquetas y el tejido
vascular destruido.
La capa interna o membrana plaquetaria presenta una estructura
trilaminar similar al resto de las membranas celulares, con una doble capa
proteica y una lipídica, que presenta la particularidad de invaginarse dentro de
la plaqueta constituyendo el sistema tubular abierto que amplía
considerablemente la superficie activa de la membrana (251).
4.1.2. PUNTOS CLAVE EN LA ACTIVACION PLAQUETARIA
Introducción
54
En la membrana de la plaqueta existen numerosos receptores de forma
que la mayoría de los agonistas fisiológicos tienen su receptor específico (27).
Consideraremos en este breve recuerdo bioquímico, solo los receptores m�s
conocidos y estudiados.
La glucoproteina Ia (GPIa), representa junto a la glucoproteina IIa
(GPIIa) el receptor para el colágeno (207).
La glucoproteina Ib (GPIb), es la sialoglucoproteina más importante de la
membrana y aporta mayoritariamente la carga negativa de la superficie. En la
subunidad alfa de esta proteina parecen estar localizados los receptores para el
factor de Von Willebrand y para la trombina (252).
El complejo glucoproteico IIb-IIIa, se identifica como el receptor para las
denominadas proteinas adhesivas del plasma: fibrinógeno, fibronectina, factor
de Von Willebrand y la trombospondina (201,204). Las glucoproteinas IIb y IIIa
son las m�s abundantes y mayoritarias en la membrana de la plaqueta, pero al
igual que el resto de las glucoproteinas solo se expresan al ser activadas las
plaquetas.
4.1.3. MOLECULAS ESTIMULANTES O INHIBIDORAS DE LA ACTIVACION
PLAQUETAR.
Los agentes que pueden incidir sobre la plaqueta activándola son de
naturaleza variada:
Introducción
55
- Subendotelio vascular: fundamentalmente por la presencia colágeno y
factor de Von Willebrand.
- Coagulación: fibrinógeno, trombina.
- Leucocitos: PAF, radicales libres, peróxidos lipídicos
- Plasma: Adrenalina, vasopresina, anticuerpos, células tumorales.
- Hematíes: ADP.
- Otras plaquetas activadas: ADP, TxA2, endoperóxidos cíclicos,
serotonina, calcio.
Igualmente tenemos sustancias efectoras de los receptores plaquetarios,
que al unirse al receptor originan una respuesta inhibitoria sobre la función
plaquetaria:
- Células endoteliales : PGI2 o prostaciclina, óxido nítrico (NO o
EDRF),13-HODE.
- Hematíes : Adenosina.
- Plaquetas: PGE1.
4.1.4. MECANISMOS DE TRANSMISION INTRAPLAQUETARIOS.
REGULACION CITOPLASMATICA DEL CALCIO LIBRE.
Las diversas moléculas que actúan sobre los receptores de membrana
no atraviesan la misma existiendo para ello distintos sistemas biológicos
acoplados a los receptores que realizan la misión de actuar como mediadores o
transmisores del estímulo.
Introducción
56
La puesta en marcha de estos sistemas, tiene como finalidad, modificar
la biodisponibilidad citoplasmática del calcio, bien sea facilitando su salida
desde los depósitos intracelulares o la entrada desde el exterior celular, o por el
contrario, fijando el calcio a sus depósitos.
El Ca++ liberado al citoplasma se une a una kinasa, la calmodulina,
formando un complejo que actúa sobre el sistema contractil plaquetario. El
Ca++, tiene así mismo la capacidad de inducir todas las respuestas
plaquetarias conocidas de cambio de forma, secreción y agregación, siendo
numerosas las proteínas que dependen o están reguladas por él.
Para este fin, existen diversos sistemas acoplados a los receptores que
pueden cumplir este papel de transmisores o mediadores del estímulo.
A) VIA DE ACTIVACION PLAQUETARIA: CICLO DEL
FOSFATIDIL-INOSITOL (Figura 2).
El ciclo del Fosfatidil-inositol (PI) representa uno de los hechos más
tempranos tras la activación plaquetar y se considera el sistema más
importante en la amplificación del impulso receptorial.
El sustrato morfológico de esta ampliación se sitúa en la membrana en la
que el 50% son lípidos y dentro de éstos el 78% fosfolípidos, siendo el resto
lípidos neutros entre los que destaca el colesterol.
Los fosfolípidos de la membrana son : Fosfatidilcolina (PC),
Introducción
57
Fosfatidiletanolamina (PE), Fosfatidilserina (PS), Esfingomielina (SM), y
Fosfatidilinositol (PI). Este último y sus derivados forman el grupo de los
fosfoinositoles de membrana sobre los que actuará una lipasa específica la
fosfolipasa C (FL-C), encontrándose en la membrana :
- 80% en forma de Fosfatidilinositol (PI).
- 10% en forma de Fosfatidilinositol-5-fosfato (PIP).
- 10% en forma de Fosfatidil-4-5-difosfato(PIP2).
Cuando se produce la unión de ciertos agonistas (trombina, colágeno,
TxA2, etc.) con sus receptores, se produce la activación de la enzima FL-C, la
cual produce la hidrólisis de los fosfoinositoles, proceso que está regulado por
una proteina G. El factor activador de las plaquetas (PAF), que se libera de la
fosfatidilcolina, es también un potente activador de la FL-C (55).
La naturaleza de la proteina G se desconoce, si bien se ha propuesto
que pertenezca al grupo de proteinas heterotriméricas (clásicas proteinas G)
que constan de tres subunidades α, ß, y γ. De forma que la transducción de
señales se realiza cuando, a consecuencia de los cambios conformacionales
inducidos en el receptor por unión de un determinado agonista, la subunidad α
de la proteina G se une a GTP y se separa de las otras dos. El complejo
subunidad α-GTP, que constituye la señal que activa a la enzima acoplada,
hace uso de su actividad GTPasa e hidroliza el GTP unido, convirtiendolo en
GDP, con lo que la subunidad α-GDP se une de nuevo a la ß y γ, volviendo a su
situación inicial (86).
La activación de la FL-C, da lugar a la hidrólisis de los fosfoinositoles de
membrana dando lugar a :
- Inositol trifosfato (IP3). El cual actúa como ionóforo del calcio y puede además
liberarlo del sistema tubular denso (21).
- 1-2-Diacilglicerol (DAG). Que actuará como cofactor junto con el Ca ++ en la
Introducción
58
activación de la Protein Quinasa C (PKC), y dará lugar por la acción de lipasas
específicas, primero a monoacilglicerol y después a ácido araquidónico.
-Acido fosfatídico (PA), que deriva igualmente de la membrana actuará como
ionóforo del calcio e inducirá cambios bioquímicos en la misma que facilitarán
la fase de secreción de la plaqueta (151).
Introducción
59
Introducción
60
Como vemos, estos compuestos tienden a aumentar la concentración de
Ca++ citosólico y a la activación de la PKC y una de las consecuencias de ello
es la activación del enzima Fosfolipasa A2 (FL-A2) que escinde el ácido
araquidónico de los demás fosfolípidos de membrana; es decir de la
fosfatidilcolina, de la fosfatidilserina, y de la fosfatidiletanolamina (30,215,225).
La activación de la PKC da lugar a dos acciones directas y consecutivas
en el tiempo. En primer lugar conduce a agregación y secreción por su acción
sobre las proteínas contráctiles plaquetarias y en segundo lugar, ejerce un
retrocontrol negativo sobre el proceso de activación plaquetaria en el que se
halla implicada la FL-C. Si bien el mecanismo exacto por el que se ejerce esta
acción, no se conoce exactamente (102,192).
Las respuestas fisiológicas de las plaquetas están sometidas a un
estricto control bioquímico y para que la agregación y secreción se produzcan,
se necesita un aumento de Ca++ intracelular, potenciándose su efecto por la
activación de la PKC, estando determinada la intensidad de la secreción por el
sinergismo entre ambas vías ya que el aumento de calcio intracelular y la
formación de DAG inducen por separado una respuesta de secreción siempre
de menor intensidad que si actúan ambas vías simultáneamente (247).
A continuación, vamos a considerar dos sistemas enzimáticos de
carácter inhibidor, el sistema del AMP cíclico y el sistema del GMP cíclico.
B) VIAS INHIBIDORAS DE LA FUNCIÓN PLAQUETARIA
B.1.) SISTEMA DEL AMPc (Figura 3).
Introducción
61
El AMPc cumple un importante papel como segundo mensajero
mediante el control de la concentración intraplaquetaria de calcio libre.
El aumento citoplasmático de AMPc, es capaz de impedir la elevación de
calcio inducido por un estímulo, inhibe la formación de DAG e IP3 mediada por
la PLC, disminuye la unión de la trombina a su receptor, inhibe la liberación de
Ca++ del sistema tubular denso por fosforilación del receptor del IP3 y además
facilita la secuestración del calcio previamente liberado (238).
El mantenimiento del equilibrio del sistema del AMPc, se realiza en la
plaqueta, a través de dos sistemas enzimáticos, la ADENILCICLASA que
transforma el ATP en AMPc y la FOSFODIESTERASA que convierte el AMPc
en AMP, sin efecto este último sobre la agregación plaquetaria.
adenilciclasa fosfodiesterasa
ATP -----------------> AMPc -------------------> AMP
La adenilciclasa es un complejo enzimático localizado en el sistema
tubular denso, cuya liberación se realiza a través del sistema canalicular al ser
estimulados los receptores (4). Para mantener unos niveles constantes de
AMPc durante el proceso de activación, la plaqueta emplea el sistema de la
fosfodiesterasa, que es estimulada en parte por el calcio y la calmodulina (174).
La actividad de la adenilciclasa se inhibe con los agentes inductores de
la agregación (ADP, adrenalina, etc), y se estimula con los inhibidores de la
misma (prostaciclina o PGI2, PGD1, PGD2, PGF2α, PGE2, adenosina, etc).
El mecanismo exacto por el cual se activa este sistema enzimático
parece ser que radica en las proteínas globulares de la membrana (proteínas
G), de forma que si la molécula efectora es proagregante activa a una proteina
G inhibidora (Gi) que inhibe a la adenilciclasa, y si es antiagregante a una
proteina G estimulante (Gs) (20,23,108).
Introducción
62
B.2.) SISTEMA DEL GMPc (Figura 3)
Como acabamos de ver la principal función del AMPc es disminuir los
niveles de calcio intraplaquetario activando su transporte desde el citoplasma
hacia los depósitos. En este sentido también actúa el GMPc, el cual fija el
calcio a los depósitos así como evita la entrada de calcio extraplaquetario, por
lo que existe un efecto sinérgico entre ellos.
Este nucleótido intraplaquetario, tiene por tanto la propiedad de inhibir la
adhesión y agregación plaquetaria, acción que realiza aumentando la velocidad
de la bomba que expulsa Ca++ desde las plaquetas, m�s que por el efecto
sobre el sistema tubular denso como sucedía con el AMPc (130).
El aumento de GMPc se produce por la acción de la enzima Guanilato
ciclasa sobre el GMP, siendo el Oxido Nítrico el principal estimulante de la
misma (200).
Introducción
63
Introducción
64
4.1.5. METABOLISMO DEL ACIDO ARAQUIDONICO.
Continuando con el proceso de activación celular, veremos como
interviene el ácido araquidónico en la cadena de reacciones que comenzando
con la activación de la membrana por moléculas agonistas, darán lugar a
respuestas fisiológicas mediante cambios inducidos en las proteinas celulares.
A) LIBERACION DEL ACIDO ARAQUIDONICO.
El ácido araquidónico, es el único agonista fisiológico que no tiene
receptor específico en la membrana realizando su acción al ser liberado de los
fosfolípidos de membrana.
En condiciones fisiológicas se incorpora al organismo directamente en la
dieta o bien indirectamente a partir del ácido linoleico (117). Es un ácido graso
poliinsaturado de 20 Átomos de carbono y cuatro dobles enlaces en los
carbonos 5,8,11 y 14 (Acido eicosatetraenoico) siendo el compuesto lipídico
que más se esterifica en forma de fosfolípidos plaquetarios (26) y el que en
mayor proporción se libera de los mismos al ser estimulada la función
plaquetaria.
La metabolización del ácido araquidónico se realiza una vez liberado de
la membrana, acción que como ya se ha visto, realizan esterasas específicas la
FL-A2 y la FL-C, la primera escinde el ácido araquidónico de la PE, PS y PC
(225), y la segunda del PI (215,245).
El ácido araquidónico en forma libre al igual que el resto de los ácidos
grasos es tóxico para la célula, por lo que se metaboliza rápidamente sirviendo
de substrato a otros dos sistemas enzimáticos, el de la ciclooxigenasa y el de la
Introducción
65
lipooxigenasa, siendo estos responsables de la síntesis de prostanoides y
leucotrienos según la enzima que actúe.
B) VIA DE LA CICLOOXIGENASA (Figura 4).
Este sistema enzimático se encuentra localizado en sistema tubular
denso de la plaqueta y en retículo endoplásmico liso de la célula endotelial (17).
Su activación se produce con la presencia de ácido araquidónico libre dando
lugar a la oxigenación de los carbonos 11 y 15 del mismo y posterior
ciclamiento obteniéndose PGG2, que por medio de una peroxidasa se
transforma en PGH2. Ambas sustancias se conocen con el nombre de
endoperóxidos cíclicos (167).
A partir de este punto la metabolización de estos compuestos es distinta
en proporción, según se considere en la plaqueta o en el endotelio vascular.
En las plaquetas la gran mayoría de los endoperóxidos cíclicos
formados dan lugar a Tromboxano A2 (TxA2) por la acción de la tromboxano
sintetasa, siendo éste el agente biológico proagregante y vasoconstrictor más
potente conocido.
Este importante metabolito intermediario realiza su acción sirviendo de
transportador del Ca++ desde sus depósitos hacia el citoplasma, pero debido a
su labilidad, rápidamente se hidroliza dando lugar a un metabolito estable pero
biológicamente inactivo, el Tromboxano B2 (TxB2).
Introducción
66
Introducción
67
Simultáneamente al TxA2, a partir de los endoperóxidos cíclicos se
forman también otras prostaglandinas como la PGD2 por la acción de una
isomerasa, con la albúmina como acelerador de la reacción, la cual realiza una
acción bifásica, pues a bajas concentraciones actúa como antiagregante, y a
altas concentraciones como agregante, por lo que se considera que realiza una
función de autolimitación de la actividad plaquetaria (197).
Igualmente a partir de los endoperóxidos cíclicos y por la acción de otra
isomerasa, se forma la PGE2 que tiene una acción importante como inhibidor
plaquetar por su efecto estimulante sobre el AMPc. La PGE2 se transforma en
PGF2α sin acción en el metabolismo plaquetario.
Por último y también a partir de los endoperóxidos intermedios por la
acción de una hidrolasa, se sintetizan otros dos productos sin acción sobre la
plaqueta, el ácido 12-hidroxi-heptadecatrienoico (HHT) de 17 átomos de
carbono y el Malonildialdehido (MDA) de 3 átomos de carbono.
En la pared vascular, se sintetiza mayoritariamente la Prostaciclina o
Prostaglandina I2 (PGI2), gracias a la acción del enzima prostaciclinsintetasa
que no solo se encuentra en las células endoteliales sino también en las fibras
musculares lisas (180).
La PGI2 ejerce su potente acción antiagregante y vasodilatadora
estimulando al sistema de la adenilciclasa (211) aumentando por tanto los
niveles de AMPc por lo que se inhiben como sabemos los sistemas
transportadores de Ca++ quedando éste en sus depósitos, acción
completamente opuesta a la ejercida por el TxA2.
Es por esta razón, por lo que a nivel funcional, se habla de la
denominada "balanza tromboxano/prostaciclina" ya que ambos prostanoides
ejercen su acción a nivel del Ca++ intraplaquetario, considerándose que el
equilibrio entre ambas sustancias constituye el principal mecanismo de control
de la hemostasia primaria y de la formación del trombo (101).
Introducción
68
La PGI2 tiene una vida media muy corta transformándose por la acción
de una hidrolasa en 6-Keto-PGF1α (101).
C) VIA DE LA LIPOOXIGENASA.
Los ácidos grasos poliinsaturados constituyen también el substrato para
otro sistema enzimático, el de la lipooxigenasa (245); éste se ha identificado en
las plaquetas, en las células endoteliales, en determinadas células tumorales
humanas y en los leucocitos. En estos últimos se han realizado la mayor parte
de los estudios de esta vía enzimática por lo que sus compuestos derivados
reciben genéricamente el nombre de leucotrienos (33).
Existen distintos tipos de lipooxigenasas, y así según la lipooxigenasa
que actúe, 5,11,12 ó 15, sobre el ácido araquidónico, se formarán los
respectivos hidroxiderivados (HPETES):
- La acción de la 5-lipooxigenasa da lugar a la formación del
5-hidroxi-peróxido-eicosatetraenoico (5-HPETE), que por la acción de la
glutatión peroxidasa da lugar minoritariamente a 5-hidroxi- eicosatetraenoico
(5-HETE) y mayoritariamente por la acción catalizadora de la 5-lipooxigenasa a
Leucotrienos A4 (LTA4) que a su vez pueden originar Leucotrienos B4 (LTB4)
por la acción de una hidrolasa, o Leucotrienos C4 (LTC4) por la acción de la
glutatión trasferasa.
Los LTB4, actúan sobre los polimorfos nucleares (PMN), incrementando
la adhesividad de los mismos a las células endoteliales, favoreciendo la
quimiotaxis, generando la formación de aniones superóxidos, interviniendo en
definitiva sobre el fenómeno inflamatorio (28,88,205).
Los LTC4 y sus derivados LTD4 y LTE4, constituyen lo que se ha dado
por llamar Slow Release Subtance Allergy o SRL-A, o sustancias de reacción
Introducción
69
lenta de la anafilaxia, por su participación el los fenómenos alérgicos e
inflamatorios, ya que se ha podido comprobar que producen un aumento de la
permeabilidad vascular y broncoespasmo relacionándose por tanto con el asma
bronquial (125,222).
- La acción de la 12-lipooxigenasa transforma el ácido araquidónico en
12-HPETE, que es inmediatamente reducido a 12-HETE por la glutatión
peroxidasa. La acción de este derivado se considera un sistema de regulación
de la respuesta plaquetaria al inhibir la actividad agregante de PGH2 y TxA2 por
inhibición del enzima tromboxanosintetasa, además de actuar sobre la célula
endotelial impidiendo la formación de prostaciclina, por la inhibición de la
prostaciclinsintetasa (54).
- La acción de la 15-lipooxigenasa, da lugar a la formación de 15-HPETE
y 15-HETE por la acción de la glutatión peroxidasa, teniendo acciones similares
a los productos de la serie anterior. Siendo de destacar que la acción conjunta
de las enzimas 5 y 15 lipooxigenasa originan la formación de Lipoxinas A y B
con acción quimiotáctica (44,154).
4.1.6. OTRAS VIAS METABOLICAS.
Hasta el momento nos hemos referido al ácido araquidónico como el
único ácido graso esterificado en la posición 2 de las moléculas de los
fosfolípidos de membrana, pero hemos de recordar que otros ácidos grasos
pueden dar lugar a las mismas transformaciones metabólicas aunque se
produzcan estas en menor proporción. Es por ello por lo que se habla de las
series 1, 2 y 3 correspondiendo la serie 1 al ac. dihomo-γ-linoleico, la serie 2, al
ya conocido ácido araquidónico y la serie 3 al ac.eicosapentanoico.
De entre los prostanoides derivados de la serie 1 destacamos por
ejemplo el hecho de que en esta vía, no se forma TxA1, que los endoperóxidos
cíclicos formados tienen acción antiagregante, al igual que la PGE1 originada
Introducción
70
(101), y que a través de la vía de la lipooxigenasa se produce un derivado el
13-HODE, que tiene propiedades antiagregantes y antiadhesivas pues parece
ser que interviene de forma importante el la tromboresistencia endotelial
(33,85).
En la serie 3, el TxA3 formado no tiene acción sobre la agregación
plaquetaria, pero en cambio la PGI3 que se origina tiene un potentísimo efecto
antiagregante.
Estos hechos han llevado a intensificar enormemente los estudios a nivel
de investigación con el fin o la posibilidad de influir sobre el estado o función de
agregación de los individuos, si bien hasta ahora se ha comprobado que la
modificación de la dieta por sí sola, no consigue realmente provocar un cambio
en el estado protrombótico de los sujetos estudiados aunque si se consigue
cuando esta modificación se acompaña de la toma de determinados fármacos
antiagregantes (256).
Como punto y final ha este recuerdo bioquímico de la activación
plaquetar, solo destacar que lo desarrollado en las líneas precedentes
corresponde solo a una pequeña parte del complejo proceso que tiene lugar
cuando un vaso se rompe o una placa de ateroma altera la hemodinámica
normal de un vaso, pero la exposición tanto de los cambios morfológicos
producidos en las plaquetas tras su activación, como el funcionalismo de las
proteinas plasmáticas encargadas de la coagulación sanguínea, así como, las
implicaciones de la diversas estirpes celulares imbricadas en el complejo
proceso de la hemostasia sanguínea, escapan a las posibilidades y directrices
de esta tesis doctoral.
4.2. ALTERACIONES PLAQUETARIAS EN LA DIABETES MELLITUS.
4.2.1. INTRODUCCION.
Introducción
71
A continuación vamos a analizar otro de los aspectos importantes a tener
en cuenta en el paciente diabético, nos referimos a la alteración existente en
uno de los componentes celulares de la sangre: las plaquetas.
Las diversas alteraciones que presenta esta estirpe celular junto a las
que presentan el metabolismo lipídico, las lesiones endoteliales precoces y la
hiperinsulinemia, están consideradas como los principales factores de riesgo de
la degeneración vascular precoz del diabético (209,249). Por ello, el control y
prevención de estos factores podrían representar las claves para un correcto
abordaje del tratamiento integral de este tipo de pacientes.
A continuación vamos a desarrollar los principales hallazgos o
alteraciones del funcionalismo plaquetario que han sido encontrados en los
diabéticos, atendiendo a las fases morfológicas de la activación plaquetaria,
que como es bien sabido, solo podemos escindir de un modo didáctico, pues
"in vivo" estas fases se superponen en el tiempo:
- Fase de reposo o previa a la activación.
- Fase de adhesión.
- Fase de agregación reversible.
- Fase de agregación irreversible.
4.2.2. ALTERACIONES PREVIAS EN FASE DE REPOSO.
a) Alteraciones de la trombocitopoyesis
La cuantificación de los megatrombocitos, considerado como un
par�metro que mide la actividad plaquetaria en el ser vivo, se ha encontrado
aumentado en el 30% de los pacientes diabéticos afectados de retinopatía
Introducción
72
diabética (39) lo cual habla a favor de una hiperestimulación de la actividad
plaquetaria previa a la fase de activación, al ser los megatrombocitos, unas
células con un metabolismo muy activo.
Otro estudio realizado por Fuller et al. en los diabéticos tipo II, demuestra
todo lo contrario, es decir una disminución en el número de megatrombocitos,
lo que se interpreta en tal caso, como un aumento de consumo (99).
b) Alteraciones en la vida media plasmática.
En un trabajo realizado con plaquetas marcadas con 51Cr se demostró
que el 33% de los pacientes diabéticos, presentaban un excesivo recambio en
la estirpe celular plaquetaria, si bien los resultados no fueron estadísticamente
significativos al compararlos con la población general (2).
Para Colwel et al. el hecho aceptado de una sobrevivencia disminuida en
las plaquetas, es un fenómeno que depende de un defecto intrínseco de las
propias plaquetas y no de una influencia negativa derivada de la hiperglucemia
como ha sido planteado por otros autores (45,46).
c) Alteraciones en la síntesis de prostanoides.
El grupo de Colwell ha descrito también una actividad plasmática que
estimula la agregación plaquetaria, cualidad que se atribuye a los peróxidos
lipídicos que inhibirían la síntesis de PGI2 (46,152).
Este mismo grupo ha demostrado que las plaquetas de los diabéticos
liberan al agregar mayor cantidad de PGE2 y por ello se ha sugerido que el
metabolismo del ácido araquidónico plaquetario podría ser hiperactivo en los
diabéticos (118).
El grupo de Amado Señaris (7), ha demostrado que la concentración
umbral de ácido araquidónico mínima capaz de producir una agregación
Introducción
73
irreversible, es más baja en los diabéticos que en sujetos normales, sin existir
diferencia entre los que padecen retinopatía y los que no la tienen. Igualmente
han demostrado una disminución de la sensibilidad en las plaquetas de los
diabéticos al efecto antiagregante de la prostaciclina; datos que por otra parte
coinciden con los señalados por Johnson et al.(132).
Confirmando la hipótesis de la hiperactividad plaquetaria Johnson et al.
encontraron un incremento de la actividad de la ciclooxigenasa y de la
tromboxano-sintetasa en animales con diabetes experimental, al igual que
observaron un descenso en la síntesis de MDA en las plaquetas de estos
animales (132). Así como Giovanni et al.(58) encontraron un incremento en la
excreción urinaria del metabolito del TxA2 el TxB2, que disminuye cuando se
lleva a cabo un correcto control metabólico de la diabetes, o cuando se
administran bajas dosis de ácido acetilsalicílico diariamente.
Todos estos hechos refuerzan la tesis de que existe una hiperactividad
en la vía metabólica del ácido araquidónico intraplaquetario en los diabéticos.
Por otro lado, Harrison et al.(119) describieron en 1978 que la
producción de PGI2 arterial y venosa está disminuida en ratas con diabetes
experimental, hecho que más tarde ha podido ser comprobado en humanos
(133,234); estudios que han sido corroborados por otros trabajos posteriores
en los que se han detectado niveles aún más bajos del metabolito cuantificable
de la PGI2, el 6-Keto-PGF1α, en los sujetos diabéticos, en comparación a los
grupos controles (79).
4.2.3) ALTERACIONES EN LA FASE DE ADHESION.
a) Aumento del Factor 3 plaquetario.
El factor 3 plaquetario procedente de los fosfolípidos de la membrana
Introducción
74
plaquetaria al que se le atribuye una actividad procoagulante, tiene aumentada
su producción en la diabetes tipo I según estudios "in vitro" al comparar dicha
producción con la existente en la diabetes tipo II (158).
b) Aumento de la sensibilidad agregatoria plaquetaria.
Esta anormalidad ha sido vista primariamente en la diabetes complicada
con vasculopatía y posteriormente en la diabetes no complicada, aunque
también se ha visto en la intolerancia a los hidratos de carbono y en
vasculopatías no diabéticas como los pacientes con infarto agudo de miocardio
(28,29). Este aumento ha sido comprobado "in vitro" al añadir pequeñas
cantidades de ADP, adrenalina, colágeno o ácido araquidónico (28,118,171),
verificándose "in vivo" por Moreno (185) y De La Cruz (65) así como en
diabetes inducida con aloxano o estreptozotocina (121,187).
4.2.4.) ALTERACIONES EN LA FASE DE AGREGACION REVERSIBLE.
a) Aumento de la ß-tromboglobulina.
Esta proteína específica de las plaquetas, se encuentra en los gránulos
α plaquetarios y se libera normalmente de los mismos al ponerse en contacto la
célula con el colágeno subendotelial.
Se han encontrado niveles plasmáticos aumentados en la diabetes así
como en pacientes con trombosis venosas profundas, en el infarto agudo de
miocardio y en la preeclampsia (196).
El significado de la elevación de la ß-tromboglobulina es incierto, aunque
se piensa que pueda deberse a cambios difusos precoces del endotelio
vascular, los cuales pueden llegar a afectar la función plaquetaria antes de que
aparezcan lesiones clínicas evidentes (34).
En un ensayo realizado con un antiagregante plaquetario en concreto:
Introducción
75
Dipiridamol, se sugiere que el tratamiento con este fármaco, reduce las
concentraciones de ß-tromboglobulina en los pacientes diabéticos (174).
b) Hiperlipidemia.
Las plaquetas son hiperagregables en ciertos grados de
hiperlipoproteinemias y en alteraciones dietéticas en relación con los ácidos
grasos (53,248). Igualmente se ha demostrado que la agregación plaquetaria
aumenta en presencia de ácidos grasos libres y de colesterol (35,49,237).
c) Hiperglucemias.
En sangre total con experiencias "in vitro" los incrementos de la
glucemia, dan lugar a un aumento de la agregación plaquetaria. No ocurriendo
así, con las experiencias realizadas con plasma rico en plaquetas, ya que
según se ha demostrado, este incremento se produce a expensas de la serie
roja que aumenta la liberación de ADP (172).
4.2.5.) ALTERACIONES EN LA FASE DE AGREGACION IRREVERSIBLE
a) Aumento del Factor 4 plaquetario.
El factor 4 plaquetario (FP4) es una proteína de 70 aminoácidos que se
encuentra en los gránulos α de las plaquetas y que se libera al plasma durante
la agregación reversible. Su elevación en el plasma "in vivo" demuestra que se
produce un incremento de la actividad plaquetaria. Existen estudios que
demuestran niveles aumentados "in vitro" en sujetos diabéticos en relación a la
población sana (56,259).
En los trabajos realizados por Thunell et al. sobre la población sana, se
Introducción
76
demostró que el FP4 presentaba un incremento en relación con la edad, el cual
podría deberse a un incremento de la actividad plaquetaria originada en las
lesiones ateroescleróticas subclínicas del árbol vascular. Sin embargo este
incremento analizado en los diabéticos no presenta relación con la edad, lo cual
indicaría que en estos sujetos existe algún factor que favorece dicha activación
y por tanto la liberación del contenido granular (241)
Introducción
77
5. DESCRIPCION DE LOS FARMACOS UTILIZADOS EN
NUESTRO ESTUDIO: ACIDO ACETILSALICILICO.
A.1. INTRODUCCIÓN.
El ácido acetilsalicílico (AAS) es un derivado sintético del ácido salicílico.
Se introdujo en la terapéutica a finales del siglo pasado con objeto de paliar los
efectos irritantes gástricos del ácido salicílico y se convirtió en el analgésico-
antipirético más utilizado, en la actualidad es el patrón farmacológico de los
analgésicos no opiáceos. Pero además el descubrimiento de su modo de
acción, hace escasamente 26 años, ha permitido la extensión de su uso a la
prevención y tratamiento de fenómenos tromboembólicos, mejorando el
pronóstico de los pacientes afectados por estos procesos, y abriendo nuevas
vias de investigación de los procesos inflamatorios y trombóticos (120).
A.2. QUÍMICA.
El AAS es el prototipo de los derivados del ácido salicílico utilizados en la
práctica clínica. El ácido salicilico o ácido ortohidroxibenzoico es un ácido
carboxílico aromático que posee un grupo fenólico en posición orto; es una
sustancia altamente irritante y del mal sabor, lo cual dificulta su uso, salvo en
aplicación cutánea tópica. Por ello se han desarrollado derivados sintéticos
para uso sistémico. Estos pueden clasificarse en dos grandes grupos (202): a)
ésteres de ácidos orgánicos, obtenidos por sustitución del hidrógeno del
hidroxilo fenólico por un grupo acilo y b) ésteres alquílicos, derivados de la
sustitución del hidrógeno del grupo carboxilo por el grupo alquilo. El AAS se
Introducción
78
encuadra dentro del primer grupo, correspondiendo químicamente al éster
salicilato del ácido acético (Fig 5).
A.3. MECANISMO DE ACCION Y ACCIONES FARMACOLOGICAS.
En 1972 Vane describió el efecto inhibidor del AAS sobre la liberación de
prostaglandinas del bazo y plaquetas, y que el fármaco prevenía la síntesis de
prostaglandinas a partir del araquidonato en homogeneizados hísticos. Este
descubrimiento abrió la puerta hacia la comprensión de muchos de los efectos
farmacológicos del AAS y de los fármacos antiinflamatorios no-esteroideos. El
mecanismo de acción consiste en la acetilación de una molécula de serina
situada en posición 530 de la cadena polipeptídica de la ciclooxigenasa, lo cual
conduce a una inhibición irreversible del enzima. De esta forma se interrumpe
la transformación del ácido araquidónico en sus derivados ciclooxigenados,
interrumpiendo los mecanismos fisiopatológicos en los que éstos están
implicados.
a) Acción antiinflamatoria.
No se conocen con exactitud los mecanismos que subyacen a la acción
antiinflamatoria de los salicilatos, si bien existe una correlación directa entre la
potencia antiinflamatoria y la inhibición de la síntesis de prostaglandinas. Los
eicosanoides juegan un papel destacado en la mediación de los mecanismos
de inflamación tisular. Tanto la PGE2, como la prostaciclina (PGI2), potencian la
formación de edema vasogénico y la infiltración leucocitaria, debido a su
potencia como vasodilatadores. También potencian la acción algésica local de
la bradiquinina y probablemente de otros autacoides. Actúan además sobre la
Introducción
79
respuesta inmune promoviendo la síntesis y liberación de interleucinas, algunas
de las cuales son claves en las reacciones de hipersensibilidad. También
parecen actuar como activadores de los macrófagos, por lo que la inhibición de
la síntesis de prostaglandinas, sobre todo la PGE2, por el AAS originaria una
disminución de estas células, implicadas en muchos de los procesos
desencadenados en la inflamación tisular (243).
A dosis altas, los salicilatos inhiben la formación de anticuerpos mediada
por prostaglandinas, e incluso se ha comprobado una inhibición de las
reacciones antígeno-anticuerpo. Pero también existen acciones de los
salicilatos que pueden contribuir a sus propiedades antiinflamatorias, sin
depender del efecto inhibidor de la síntesis de prostaglandinas. A dosis
milimolares, in vitro, los salicilatos inhiben la agregación de neutrófilos inducida
por sustancias quimiotácticas. En este efecto ha sido implicada la interacción
de la molécula del ácido salicílico, dado su carácter lipofílico, con la membrana
celular, interfiriendo por esta vía la unión de diversas sustancias con sus
receptores celulares. Alteran también la síntesis de mucopolisacáridos
constituyentes de la matriz del tejido conjuntivo, la cual podría actuar entonces
como una barrera más eficaz contra la expansión del proceso inflamatorio.
Introducción
80
Introducción
81
b) Acción antipirética.
Los salicilatos producen una disminución de la temperatura corporal en
los pacientes febriles. Ello probablemente se deba a que impidan la acción de
la PGE2 como mediadora del pirógeno endógeno a nivel hipotalámico, al inhibir
la síntesis de aquella. En los procesos febriles ocurre un aumento en la
producción de citoquinas, como las interleukinas y el factor de necrosis tumoral,
por los neutrófilos y otras células, lo que induce a la síntesis de PGE2 en el
área preóptica del hipotálamo; y ésta parece actuar promoviendo el aumento de
la temperatura corporal. Debido a que el AAS no actúa de forma directa sobre
el centro termorregulador del hipotálamo, no induce hipotermia en los sujetos
sanos. Paradójicamente, dosis tóxicas de salicilatos originan hiperpirexia, a
través de un aumento del consumo de oxígeno y de la tasa metabólica basal
por desacoplamiento de los procesos de fosforilación oxidativa (203).
c)Acción analgésica.
Las prostaglandinas tienen un efecto sensibilizador de los receptores
cutáneos del dolor a estímulos mecánicos y a mediadores químicos, como las
sustancias autacoides (bradikinina, histamina, etc). Los salicilatos y fármacos
análogos no modifican la hiperalgesia provocada por la inyección intradérmica
de prostaglandinas, lo cual apoya a que la actividad antiálgica se debe a la
inhibición de la síntesis de eicosanoides. El efecto analgésico del AAS ha sido
comprobado en estudios experimentales sobre sujetos sanos, encontrándose
que modifica la respuesta central al dolor inducido por pulsos eléctricos
aplicados intradérmicamente. Además parece haber una acción analgésica
central, pues la inyección intratecal de acetilsalicilato de lisina, consegue paliar
el dolor carcinomatoso intenso (213).
Introducción
82
d) Acción antitrombótica.
El descubrimiento de los efectos del AAS sobre la actividad plaquetaria
han llevado al uso del mismo para el tratamiento profiláctico de distintos
procesos tromboembólicos, y en particular de la enfermedad cardiovascular,
cerebrovascular y periférica isquémicas. Pero aunque existe una amplia
evidencia clínica y experimental de su utilidad y seguridad, aún no se han
dilucidado por completo aspectos como dosis, formas de administración o
régimen terapeútico óptimo. Ello es debido en gran medida a lo que se ha
denominado como “dilema de la aspirina”, el cual tiene su origen en los efectos
contrapuestos del fármaco sobre la agregación plaquetaria y sobre la capacidad
antitrombótica del endotelio vascular (220).
El AAS produce una acetilación irreversible del complejo enzimático
cicloxigenasa en las plaquetas, con lo cual reduce la producción del
tromboxano A2 (TXA2) y tromboxano B2 (TXB2), sustancias proagregantes
liberadas por las plaquetas tras su activación por diferentes estímulos. La
reacción tiene lugar por la transferencia de su redical acetilo al grupo hidroxilo
de una molécula de serina situada en posición 530 de la cadena polipeptídica
del enzima. Esta reacción es altamente eficaz, y una dosis única de 325 mg de
AAS logra una tasa de inactivación enzimática cercana al 90%. Como las
plaquetas son células anucleadas, y por tanto incapaces de llevar a cabo la
síntesis proteica, no pueden reponer la actividad enzimática, por lo que la
inhibición plaquetaria se prolonga durante toda la vida de la plaqueta, de 8-9
días. Una dosis oral de 50 mg de AAS con recubrimiento entérico se ha
demostrado suficiente para inhibir la síntesis plaquetaria de TXA2 en varones
adultos sanos, manteniéndose el efecto inhibidor sobre la agregación
plaquetaria durante tres días después de una dosis única. Además esta acción
es ejercida también sobre los magacariocitos. La recuperación de la actividad
Introducción
83
enzimática de las plaquetas se produce posteriormente a un ritmo lineal, y
comienza a ser detectable a las 48 horas (213).
El AAS inhibe también la agregación secundaria inducida por colágeno
o ácido araquidónico, debido a que inhibe la producción plaquetaria de
diacilglicerol (DAG). Aunque este efecto es menos duradero que la inhibición de
la cicloxigenasa, y depende de la dosis. Así se ha encontrado un fallo en la
inhibición de la agregación plaquetaria in vitro, tras la administración de ADP y
ácido araquidónico, en el 16% de los pacientes que reciben dosis de AAS
inferiores a 650 mg/día, y en ninguno con dosis superiores a 975 mg/día. Otro
efecto del AAS sobre las plaquetas es que disminuye la secreción de gránulos
densos, secreción implicada en la liberación de sustancias proagregantes y
vasoactivas, como la serotonina, durante la activación plaquetaria (94,9).
La inhibición de la cicloxigenasa no excluye de forma absoluta el papel
trombogénico de las plaquetas, pues éstas pueden ser activadas a través de
otras rutas, como la vía del factor activador plaquetario (PAF); esto contribuye a
explicar algunos fracasos terapeúticos observados en ensayos clínicos y en la
práctica diaria en relación con el uso del AAS como profilaxis antitrombótica.
Sin embargo, a través del mismo mecanismo de acetilación de la cicloxigenasa,
el ácido acetilsalicílico inhibe la síntesis de prostaciclina (PGI2) por el endotelio
vascular. La PGI2 ejerce una acción antitrombótica, por inhibición de la
adhesión y agregación de las plaquetas al endotelio y por efecto vasodilatador.
El mecanismo por el cual esta relativa selectividad es dosis-dependiente no se
conoce con exactitud. Baenzinger y cols han señalado la existencia de una
sensibilidad diferente de la cicloxigenasa plaquetaria y vascular a su inhibición
por el AAS, pero estudios posteriores no lo han confirmado. Un factor a tener
en cuenta es la posibilidad de regeneración del complejo enzimático
cicloxigenasa del endotelio vascular, dado que las células endoteliales tienen
capacidad de síntesis proteica, a diferencia de las plaquetas carentes de núcleo
celular.
Introducción
84
Una explicación alternativa a esta selectividad bioquímica del AAS, se
apoya en sus características farmacocinéticas. La administración oral de dosis
bajas (50-75 mg) de AAS en forma de liberación retardada conduce a niveles
plasmáticos menores de acetilsalicilato y salicilato en plasma, en comparación
con una solución acuosa, pero produce un mismo grado de inhibición de la
síntesis plaquetaria de TXA2, y sin afectar a la síntesis vascular de prostaciclina.
Ello podría ser debido a que la acción antiplaquetaria sea ejercida en la
circulación portal, antes de que el AAS sea hidrolizado a su paso por hígado y
pulmón. A favor de la importancia del efecto presistémico del AAS están
estudios realizados sobre su administración intravenosa, y experimentos sobre
la administración de AAS oral a ratas a las que se la ha practicado un shunt
porto-cava. En ellas se observa una mayor inhibición de la síntesis de
prostaciclina en la pared vascular, que en las ratas a las que no se le practicó la
derivación, y por tanto alcanzan concentraciones plasmáticas menores de
acetilsalicilato en la circulación sistémica (213).
Por otro lado, dosis altas de AAS (1,5-6 gr/día) producen un
alargamiento del tiempo de protrombina de dos a tres segundos, debido a la
inhibición de la síntesis hepática de factores VII, IX y X; efecto que se corrige
con la administración de vitamina K y que no parece tener gran trascendencia
clínica, salvo en pacientes que padecen algún tipo de discrasia sanguínea (94).
A.4. FARMACOCINÉTICA.
Los salicilatos se absorben con rapidez una vez ingeridos, una pequeña
parte ya en el estómago, pero sobre todo en el intestino delgado superior. Sin
embargo, la biodisponibilidad real del AAS en su forma no hidrolizada es
menor, puesto que es parcialmente hidrolizada en la mucosa gastrointestinal y
en su primer paso a través del hígado antes de alcanzar la circulación
Introducción
85
sistémica. La administración oral de AAS demostró una absorción completa,
pero sólo el 70% alcanzó la circulación sistémica en forma no hidrolizada; y
administrada en forma de cápsulas, solamente un 50% se recuperó sin
hidrolizar (202).
Tras la administración oral, se obtienen concentraciones plasmáticas
apreciables a los 2-30 minutos y máximas a los 60-120 minutos. La tasa de
absorción depende de diversos factores, entre los cuales destacan: la velocidad
de desintegración y disolución, que varían según la fórmula galénica, el pH
gástrico e intestinal, la velocidad de vaciamiento gástrico y la presencia de
alimentos en el tracto digestivo.
La absorción de las formas no disociadas de ácido salicílico o de
acetilsalicílico se produce por difusión pasiva, a través de las membranas
celulares. El incremento del pH gástrico aumenta la solubilidad del AAS, pero
también facilita su ionización, acelerando además el vaciamiento del estómago,
con lo cual disminuye la absorción a este nivel. El pH alcalino del intestino
facilita la disolución e ionización del AAS, aunque la ionización no entorpece la
absorción, probablemente debido a la gran superficie disponible. La presencia
de alimentos retrasa la absorción y puede disminuir el pico máximo alcanzado
en sangre.
La tasa de absorción es más rápida para las soluciones acuosas,
efervescentes o no, seguida por las tabletas no recubiertas y por las tabletas
con recubrimiento de metilcelulosa, siendo más lenta para las formulaciones
encapsuladas (213).
Después de su absorción, los salicilatos se distribuyen rápidamente por
los tejidos, encontrándose en órganos y líquidos del organismo, como la saliva,
bilis, líquido cefalorraquídeo, líquido sinovial, en concentraciones variables,
pero inferiores a las de la sangre. El volumen aparente de distribución es de
0,15-0,20 l/kg de peso corporal a dosis terapeúticas, tanto para el salicilato,
como para el AAS. Dicho volumen aumenta al incrementarse la dosis de AAS
Introducción
86
y/o la concentración plasmática de salicilatos, debido en parte a la saturación
de los lugares de unión a las proteínas plasmáticas. Otro factor que contribuye
a este hecho es el efecto de saturación de las esterasas intestinales por el
substrato, lo cual incrementa la cantidad de AAS absorbido sin hidrolizar, al
incrementar la dosis, a pesar de no observarse un aumento apreciable de su
biodisponibilidad para dosis orales entre 20 y 1300 mg.
El AAS es hidrolizado por esterasas tisulares a ácido acético y ácido
salicílico en la mayoría de los tejidos, y fundamentalmente en hígado,
eritrocitos, plasma, y líquido sinovial; aunque el proceso comienza en la
mucosa gastrointestinal durante la fase de absorción. Sólo el 1 % de una dosis
oral es excretada por vía urinaria sin hidrolizar. Otra vía metabólica es actuar
como donador de grupos acetilo en la acetilación de diversos compuestos
orgánicos, reacción que permite explicar algunas de sus acciones
farmacológicas, como la inhibición de la agregación plaquetaria.
La vida media plasmática del AAS es de 15 minutos, la del salicilato a
dosis bajas es de 2-3 horas y a dosis altas, como en el uso antiinflamatorio
usual, aumenta hasta 12 horas, e incluso a 15-30 horas con dosis tóxicas. Esta
eliminación dosis-dependiente es resultado de la capacidad limitada del hígado
para conjugar los salicilatos, y contribuye al incremento de la excreción urinaria
de droga son metabolizar cuando se administran dosis altas.
La eliminación renal del salicilato se produce por filtración glomerular y
por secreción a nivel de los túbulos proximales.
A.5. TOXICIDAD Y REACCIONES COLATERALES.
Muchos efectos adversos del AAS han sido reseñados ya en la revisión
de sus propiedades farmacológicas. Su uso extendido como automedicación
antipirética y analgésica hace que sean relativamente frecuentes los casos de
Introducción
87
intoxicación crónica, más frecuente en ancianos ya que el aclaramiento
sistémico de los salicilatos, tanto hepático como renal, disminuye con la edad.
El AAS debe ser usado con cautela en pacientes con antecedentes de
dispepsia o enfermedad ulcerosa gastrointestinal, ya que puede dañar la
mucosa gástrica (94).
Deben realizarse controles hematológicos y de función renal y hepática
de forma periódica, en los enfermos que tomen AAS por tiempo prolongado,
para vigilar la aparición de anemia por sangrado oculto, o de efectos adversos
sobre la función hepatorrenal.
No existe constancia de un efecto teratógeno del AAS, pero su uso se ha
relacionado con complicaciones hemorrágicas maternofetales, y persistencia de
ductus arterioso en el recién nacido. Además inhibe la motilidad uterina,
prolongando el periodo de parto, lo cual puede facilitar situaciones de
sufrimiento fetal.
A.6. INTERACCIONES MEDICAMENTOSAS.
La unión de los salicilatos a las proteínas plasmáticas puede interferir
con la de otras drogas desplazándolas de sus sitios de unión e incrementando
la fracción libre de las mismas, con lo que puede facilitar efectos adversos. Este
hecho tiene importancia en el caso de los anticoagulantes orales y
antidiabéticos orales, hidantoínas o ácido valproico(120).
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosis moderadamente bajasde ácido acetilsalicílico.
1
El ácido acetil salicílico es una molécula centenaria, de hecho este año se
celebran cien años desde que se registró el nombre de Aspirina. Pues bien, a pesar
de su longevidad, aún se establecen encendidos debates sobre todos los aspectos
de su farmacología: nuevas orientaciones sobre posibles mecanismos de acción
adicionales a la inhibición irreversible de la enzima ciclooxigenasa, como es la
participación sobre la producción de óxido nítrico o sobre la liberación de factores
quimiotácticos; nuevas indicaciones que incrementan la ya clásica lista como
antiinflamatorio, analgésico, antitérmico o antitrombótico, y que abordan campos tan
interesantes como la neuroprotección, la microangiopatía diabética o la prevención
del cáncer; nuevas formas galénicas de administración del ácido acetilsalicílico, con
la finalidad de mejorar su farmacodinamia, como es el caso de las cápsulas de
liberación sostenida, que consiguen niveles bajos, pero mantenidos, del fármaco en
cuestión, hecho fundamental para un correcto equilibrio entre eicosanoides
protrombóticos y antitrombóticos.
Así podríamos relatar una larga lista de nuevas aportaciones a la
farmacología del ácido acetilsalicílico, lo cual es motivo de que este fármaco sea el
líder en cuanto a publicaciones científicas e incluso sea una de las palabras más
citadas en toda la literatura universal, científica o no.
Respecto al efecto antiplaquetario del ácido acetilsalicílico, nuestro grupo de
trabajo ha estudiado algunos aspectos del mismo:
• En primer lugar, se analizó el efecto antiagregante plaquetario del fármaco en
sangre total, observándose que era mayor que en plaquetas aisladas (61,259).
Este mayor efecto se comprobó que iba vehiculizado por un efecto del ácido
acetilsalicílico sobre la interacción leucocito-plaqueta.
• Profundizando sobre este mecanismo, recientemente se ha comprobado que
ácido acetilsalicílico estimula la síntesis de óxido nítrico por los neutrófilos, lo cual
origina que éstos vean incrementado su efecto antiagregante fisiológico (22).
• En tercer lugar, nuestro grupo viene trabajando desde hace años sobre el efecto
de algunos antiagregantes plaquetarios sobre la retinopatía diabética
experimental, entre ellos el ácido acetilsalicílico (71,183), observando un efecto
protector del mismo en esta patología.
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosis moderadamente bajasde ácido acetilsalicílico.
2
• Por último, un aspecto interesante del ácido acetilsalicílico es su diferente acción
en hombres y mujeres, presentando un mayor efecto en el sexo masculino (61),
en clara relación con el estado hormonal del ser humano (61).
Aunando algunos de estos aspectos, quisimos abordar un trabajo en el que se
relacionara el mecanismo de acción clásico del ácido acetilsalicílico como
antitrombótico (bloqueo de la ciclooxigenasa), con nuevos mecanismos
(producción de óxido nítrico), con uno de sus acciones demostradas (prevención
de la retinopatía diabética experimental) y valorando el aspecto diferencial entre
sexos.
Por ello, nos planteamos el presente trabajo con los siguientes objetivos:
1. Analizar la relación entre el efecto del ácido acetilsalicílico a nivel de la
retinopatía diabética experimental y su mecanismo de acción antitrombótico a
nivel de síntesis de eicosanoides y produccción de óxido nítrico.
2. Valorar si este efecto, tanto a nivel bioquímico como morfológico, es diferente
según el sexo del animal de experimentación.
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosis moderadamente bajasde ácido acetilsalicílico.
123
1. MATERIAL
INSTRUMENTAL Y APARATAJE:
- Agitador de tubos de ensayo, Mod. Reax 2000. Heidolph comecta. Alemania.
- Agregómetro de impedancia eléctrica de doble canal Chrono-log, Mod. 540, con
control de temperatura y de velocidad de agitación variable. Chrono-log Corporation.
Haverton. U.K.
- Agujas 21 G, 0.8 x 25 Luer. Becton Dickinson S.A., Huesca. España.
- Analizador de imágenes IBAS Kontron 2000 (Kontron Bildanalyse. Alemania.),
configurado por los siguientes elementos:
* Procesador 2-80, con sistema operativo CP/M
* Cuatro discos duros de 10 Megabytes
* Floppy de 360 K
* Monitor de programación
* Monitor gráfico
* Monitor Trinitron de Sony
* Impresora gráfica Microline-93
* Sofware en Forntran VII
* Programa IPS (Image Processing System)
- Balanza de precisión mod. Mettler H-31. CR MARES S.A., España.
- Baño termostatado Unitronic con temperatura variable de 0-100�C, con sistema
automático regulable de agitación. SELECTA. España.
- Baño termostatado con temperatura variable de 0-100�C. mod. MT/2. MGW
LAUDA. Alemania.
- Carretes fotográficos Ektachrome 100. KODAK. Holanda.
- Centrífuga refrigerada Kontron, mod. Hermle ZK-364 con cuatro cabezales
variables, control automático de temperatura desde 0-40�C, con temporizador
automático y tacómetro graduado de de 0 a 24000 X 9 G. Mod. Centricon H-401.
KONTRON HERMLE. Suiza.
- Centrífuga de tubos cónicos Ependorf, mod. 5415S con velocidad fija de 10000 G.
y temporizador graduable de 1 a 5 minutos, con mando normal y cierre automático.
Material y Métodos
124
EPENDORF. Alemania.
- Contador celular de series hematológicas Baker 8000. MENARINI S.A., España.
- Cubetas siliconadas de 8 x 50 mm.
- Cubetas siliconadas de 10 x 45 mm., para agregómetro de impedancia eléctrica.
Chrono-log Corporation. Haverton. U.K.
- Detector electroquímico de óxido nítrico, ISO- NOP 30. World Precision
Instruments. UK.
- Dextrometer computarizado con calibrador digital.MENARINI.
- Espátula fina, Ref. 9611B. MORIA. Francia.
- Espectrofotómetro para determinaciones en el espectro de luz visible y
ultravioleta NOVASPEC II. LKB Biochrom. England.
- Granatorio de precisión. Mod. C-300-S. COBOS. España.
- Granatorio-balanza. Mod. Mettler 2000. CR MARES S.A. España.
- Imanes de agitación para cubetas de agregometría por impedancia eléctrica.
- Jeringas siliconadas de 2 y 5 ml. de capacidad total. LUER S.A. España.
- Jeringas siliconadas de 1 ml. de capacidad total, 25 G con escala U-40, mod.
Micro-fine IV. BECTON DICKINSON. España.
- Jeringas siliconadas de 1 ml. de capacidad total, mod. Plastipack. BECTON
DICKINSON. España.
- Microscopio binocular Nikon mod. 130390. Japón.
- Microscopio fotográfico Labophot con sistema fotográfico AFX, mod. 34006. Nikon.
Japón.
- Microscopio quirúrgico provisto de luz fría por fibra óptica, con iluminación de
hendidura y/o coaxial de 6 aumentos, mod. K-280. KONAN. Japón.
- Palomilla de perfusión epicraneal G 25 Luer, mod. Venofix. B. BRAUN
MELSUNGEN AG. Alemania.
- Peachímetro digital mod. micro-pH 2000. CRISON. España.
- Pinzas forceps de 12.5 cm. de longitud. AESCULAP. Alemania.
- Pinzas de Graefe de 10 cm. de longitud. Ref. T-2521. TEUFEL. Alemania.
- Pipetas de volumen fijo de 50 y 100 �L. EPPENDORF. Alemania.
- Pipetas de volumen variable de 20-200 �L y de 100-1000 GILSON �L MEDICAL
ELECTRONIC. Francia.
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosis moderadamente bajasde ácido acetilsalicílico.
125
- Pipeta dosificadora multiuso de volumen variable de 10 �L a 5 ml., mod.
Multipipette. EPPENDORF GERATEBAU. Alemania.
- Pipetas pasteur desechables. LABOPLAST. España.
- Pipetas de volumen variable de 0 a 20 �L, GILSON. U.K.
- Pipeta dosificadora Macro-Eppendorf-Multipipette, mod. 4780. EPPENDORF.
Alemania.
- Placas de agitación con tacómetro graduable de 60 a 1600 r.p.m., mod. Agimatic-S.
SELECTA. España.
- Porta agujas ref. 13100. MORIA. Francia.
- Portaobjetos y cubreobjetos. BRAND. Alemania.
- Puntas de pipeta desechables de 1-200 y de 100-1000 �L, BASLAB. España.
- Registrador Omniscribe Recorder de doble canal. HOUSTON INSTRUMENT.
Bélgica.
- Rejillas metálicas para sujección de tubos.
- Suturas de seda trenzada de 3, 4 y 5 ceros, B.Braun-Dexon. INDUSTRIAS PALEX
S.A., España.
- Tijeras de disección Aesculap. Alemania.
- Tijeras de Wescot-Cochet de 13 cm., ref. 4263. MORIA. Francia.
- Tubos de cristal mod. 1636/30M de 16x160. PIREX. España.
- Tubos siliconados graduados de 5 y 10 ml. de capacidad. EUROTUBO. España.
- Tubos de plástico para ultracentrifugación mod. 253140-PA. KONTRON. Suiza.
Material y Métodos
126
FARMACOS:
Acido acetilsalicílico en forma cristalina. Peso molecular: 180. Sigma
Chemical Corp. (St. Louis, USA). Cod. A- 5376.
REACTIVOS:
COMPONENTES PARA LA DETEMINACION DE TROMBOXANO B2:
- Kit comercial para la determinación de Tromboxano B2 por
enzimoinmunoensayo. Amersham Internacional plc. Cod: 221. U.K.
Compuesto por:
- • Buffer fosfato.
• 3, 3′, 5, 5′ tetrametilbenzidina (TMB) y peróxido de hidrógeno.
• Anticuerpo anti-tromboxano B2
• Tromboxano B2 conjugado y no conjugado.
• Cloruro sódico.
• Albúmina bovina.
COMPONENTES PARA LA DETERMINACION DE 6-KETO-PGF1�:
- Kit comercial para la determinación de 6-keto-PG F1� mediante
enzimoinmunoensayo. Amersham Internacional plc. Cod. 221. U.K.;
conteniendo los siguientes elementos:
• Buffer fosfato.
• 3, 3′, 5, 5′ tetrametilbenzidina (TMB) y peróxido de hidrógeno.
• Anticuerpo anti-6-keto-PGF1∝.
• 6-keto-PGF1∝ conjugada y no conjugada.
• Cloruro sódico.
• Albúmina bovina.
OTROS:
- Acido acético 0.1 N, cod. 181011. PANREAC. España.
- Acido clorhídrico (ClH), Pm 36.47; Densidad 1.18. Lote nº 6266. PROBUS.
España.
- Acido fosfórico. Pm: 98.00. Riqueza min. 50%. Probus. Barcelona. España.
- Alcohol Etílico (CH3CH2OH) al 96% (densidad 0.816); y al 99/100%
(densidad 0.79). PROBUS. España.
- Citrato sódico. Pm: 294.10, cod. 131655. PANREAC. España.
- Cloruro sódico cristalino. Pm: 58.44, cod. 33643. PROBUS. España.
- Colágeno, 1 ml de suspensión de colágeno tendinoso bovino (100 �L/ml).
Aggrepack. Cod. U-5140. MENARINI S.A., Japón.
- Diazepan. Ampollas de 10 mg/2 ml. PRODES S.A.,España.
- Diluyente del colágeno: solución Tris-buffer 0.05 molar, más Cloruro Sódico
2.2 gr/l, pH 7.4; Menegent, codigo U-5140. MENARINI S.A., Japón.
- Diluyente de contaje de plaquetas Unopette con micropipetas capilares y
reservorios. Cod. 5855. BECTON-DICKINSON. USA.
- Eter etílico purísimo. Cod. 141313. PANREAC. España.
- Glucopat, tiras reactivas para determinación de glucosa en sangre total.
MENARINI S.A., Japón.
- Heparina sódica al 5% , viales de 5 ml. ROVI. España.
- Insulina isofánica (NPH) Insulatard HM. NOVO. Dinamarca.
- Medio de montaje DPX. Lote n1 127550. PROBUS. España.
- Napthyl Ethylenediamine (N-[ 1-Naphthyl] Ethyl-enediamine). Pm: 259.2.
Sigma Chemical Co. St. Louis. USA.
- Nitroblue tetrazolium. Pm 817.6, SIGMA. USA.
- Nitrito sódico. Pm: 69.00. Sigma Chemical Co. St. Louis. USA.
- Nitroferrocianida sódica. Ref. S-0501. SIGMA. USA.
- Pentobarbital sódico (Nembutal). ABBOT. Irlanda.
- Peroxidasa de rábano Tipo II. Ref. P-8250. SIGMA. USA.
- Reactivo de Griess. Compuesto de (para 100 mL):
- • Acido fosfórico al 4%.
- • Sulfanilamida 0.5 g.
- • Naphyl Ethylenediamine 0.05 g.
- Sacarosa (C12H22O11): Pm 342.30, lote n1 176820. PROBUS. España.
- Streptozotocina. Cod. S-0130. SIGMA. USA.
- Sulfanilamida. Pm: 172.2. Sigma Chemical Co. St. Louis. USA.
- Xileno. Ref. 3589. PROBUS. España.
2. METODOS:
2.1 ANIMAL DE EXPERIMENTACION:
Se ha empleado como animal de experimentación la rata Wistar adulta,
de 3-4 meses de edad y 200-350 gramos de peso, mantenidas en condiciones
estrictas de luz-oscuridad (16 horas de luz y 8 de oscuridad) y de temperatura
(entre 16 y 23�C).
2.2 DISEÑO DEL ESTUDIO:
Hemos empleado 140 ratas adultas, 70 hembras y 70 machos de la cepa
Wistar. Los animales fueron distribuídos en los siguientes grupos de estudio:
Grupo I.- 20 ratas que han sido utilizadas como Control No Diabético:
Subgrupo Ia. 10 ratas machos no diabéticas.
Subgrupo Ib. 10 ratas hembras no diabéticas.
Grupo II.- 30 ratas machos a las cuales se les indujo la diabetes experimental,
no administrándosele tratamiento alguno, salvo el control de su diabetes
mediante insulinoterapia, subdividiéndose este grupo en tres partes:
Subgrupo IIa. 10 ratas machos, en las condiciones anteriores, que
fueron sacrificadas a los 30 días del comienzo de su diabetes.
Subgrupo IIb. 10 ratas machos, en las condiciones anteriores, que
fueron sacrificadas a los 60 días del comienzo de su diabetes.
Subgrupo IIc. 10 ratas machos, en las mismas condiciones, que fueron
sacrificadas a los 90 días del comienzo de su diabetes.
Grupo III.- 30 ratas hembras a las cuales se les indujo la diabetes
experimental, no administrándole tratamiento alguno, salvo el control de su
diabetes mediante insulinoterapia, subdividiéndose este grupo en tres
partes:
Subgrupo IIIa. 10 ratas hembras, en las condiciones anteriores, que
fueron sacrificadas a los 30 días del comienzo de su diabetes.
Subgrupo IIIb. 10 ratas hembras, en las condiciones anteriores, que
Material y Métodos
124
fueron sacrificadas a los 60 días del comienzo de su diabetes.
Subgrupo IIIc. 10 ratas hembras, en las mismas condiciones, que
fueron sacrificadas a los 90 días del comienzo de su diabetes.
Grupo IV.- 30 ratas macho a las que se les indujo la diabetes experimental y
posteriormente fueron tratadas con ácido acetilsalicílico (2 mg/Kg de
peso/día p.o.) desde el primer día de diabetes, subdividiéndose este grupo
en tres partes:
Subgrupo IVa. 10 ratas machos, diabéticas y tratadas con AAS, que
fueron sacrificadas a los 30 días de su diabetes.
Subgrupo IVb. 10 ratas machos, diabéticas y tratadas con AAS, que
fueron sacrificadas a los 60 días de su diabetes.
Subgrupo IVc. 10 ratas machos, diabéticas y tratadas con AAS, que
fueron sacrificadas a los 90 días de su diabetes.
Grupo V.- 30 ratas hembra a las que se les indujo la diabetes experimental y
posteriormente fueron tratadas con ácido acetilsalicílico (2 mg/Kg de
peso/día p.o.) desde el primer día de la diabetes, subdividiéndose este grupo
en tres partes:
Subgrupo Va. 10 ratas hembras, diabéticas y tratadas con AAS, que
fueron sacrificadas a los 30 días de su diabetes.
Subgrupo Vb. 10 ratas hembras, diabéticas y tratadas con AAS, que
fueron sacrificadas a los 60 días de su diabetes experimental.
Subgrupo Vc. 10 ratas hembras, diabéticas y tratadas con AAS, que
fueron sacrificadas a los 90 días de su diabetes experimental.
El tratamiento con fármacos antiagregantes se realizó diariamente por
vía oral, mediante canulación endogástrica.
2.3 METODO DE PRODUCCION Y CONTROL DE LA DIABETES
EXPERIMENTAL:
2.3.1 PRODUCCION DE DIABETES EXPERIMENTAL:
Los animales de experimentación fueron anestesiados mediante la
inyección intraperitoneal de 6 mg/Kg de peso de diazepan (Prodes),
Material y Métodos
125
acompañada de una inhalación inconstante de éter etílico. Una vez
anestesiados, se procedió a realizar una incisión longitudinal, mediante tijeras
de disección, en la cara anterior del pliegue inguinal, disecando la piel, el tejido
celular subcutáneo y aponeurosis musculares. Tras la localización del paquete
vasculonervioso femoral, se procedió a la canulación de la vena femoral con
una palomilla epicraneal de 25 G, infundiéndose 50 mg/Kg de peso de
estreptozotocina disuelta en 1 ml de tampón citrato (compuesto por ácido
cítrico 0.1 M y fosfato disódico 0.1 M) a pH 4,5. Finalizada la infusión, se
procedió a suturar la piel con seda trenzada de 4 ceros.
2.3.2 MEDICION DE LA GLUCEMIA:
Para ello se han empleado el Glucometer® y las tiras reactivas
Glucopat® de la casa Menarini. La técnica consiste en la realización de una
incisión longitudinal mediante bisturí, a nivel de la porción distal del rabo del
animal, previo masaje compresivo para facilitar el éstasis sanguíneo. Obtenida
la gota de sangre, es depositada en la tira problema. Posteriormente se
esperan 60 segundos y secamos la tira, esperando otros 30 segundos para
introducir la tira en el GlucometerR; al cabo de 30 segundos aparecen las cifras
de glucemia en la pantalla de lectura del aparato.
2.3.3 CONTROL DE LAS CIFRAS DE GLUCEMIA POST-INTERVENCION
QUIRURGICA:
El control y valoración de las cifras de glucemia se realizó según la
siguiente pauta:
- Durante la primera semana: control diario.
- Durante la segunda semana: control a días alternos.
- Durante la tercera semana: dos días a la semana.
- Durante la cuarta semana: una vez a la semana.
- Durante el segundo y tercer mes: cada quince días.
Material y Métodos
126
Consideramos como primer día con cifras de glucemia patológicas,
aquél en el que son superiores a 200 mg/dl.
2.3.4 CONTROL DE LA DIABETES:
Todos los animales fueron sometidos a un riguroso control de glucemia.
El control se realizó mediante la inyección subcutánea diaria de 2-4 U.I. de
insulina NPH NOVOLET®, dependiendo de las cifras de glucemia previas.
2.4 METODICA SEGUIDA AL FINALIZAR EL PERIODO DE
TRATAMIENTO
2.4.1 ANESTESIA:
Se realizó una anestesia general profunda con Pentobarbital sódico
(Nembutal®) a dosis de 40 mg/Kg de peso mediante inyección intraperitoneal.
2.4.2 TECNICA QUIRURGICA:
La técnica quirúrgica empleada para la introducción de la sustancia
testigo (HRP), en el árbol vascular retiniano del animal consistió en cateterizar
la arteria carótida interna.
Para ello se colocó al animal en decúbito supino con el cuello en
hiperextensión. A continuación se procedió a realizar dos incisiones, una
longitudinal y otra perpendicular a la primera, disecándose la piel y tejido
celular subcutáneo. Localizada la gládula submandibular se realiza una incisión
longitudinal, en su zona media, rechazándola lateralmente; de esta forma se
evita la lesión de las venas glandulares y yugulares, minimizandose el riesgo
de hemorragia. De esta forma quedan expuestos los grupos musculares
medios del cuello, donde se reconocen en su zona media los músculos
esternohioideo y lateralmente el fascículo externo del esternocleidomastoideo.
Se realiza la disección entre el músculo esternocleidomastoideo, el músculo
esternohioideo, el omohioideo y la tráquea, apareciendo un espacio anatómico
en el fondo del cuál y lateralmente se encuentran la arteria carótida y los
nervios que la acompañan.
Material y Métodos
127
A continuación se diseca la arteria, y colocamos dos ligaduras con seda
trenzada a su alrededor, sin ocluir el paso sanguíneo, dejándola debidamente
fijada.
Posteriormente procedemos a realizar una laparotomía y toracotomía
media, procediendo a continuación a identificar la vena cava inferior y la aorta
descendente. Una vez localizada la aorta descendente, procedemos a
clamparla mediante una pinza de fijación con el objeto de que no pase
peroxidasa a través de ella y que pueda interferir los datos de la agregometría.
2.4.3 OBTENCION DE LAS MUESTRAS PARA EL ANALISIS PLAQUETARIO
Una vez localizada la vena cava inferior, extraemos 2 ml de sangre con
una jeringa previamente heparinizada. Un mililitro de muestra se deposita en un
tubo de ensayo con 200 �L de citrato sódico, agitándolo suavemente. El otro
ml es depositado en otro tubo de ensayo de vidrio, el cual se introduce en un
baño a 37ºC.
2.4.4 TECNICA DE ESTUDIO DEL ARBOL VASCULAR RETINIANO
Una vez obtenida la muestra de sangre para el análisis plaquetario, se
procede a la perfusión del HPR Sigma tipo II a nivel de la carótida interna a
dosis de 180 mg/Kg de peso disuelta en un ml de agua destilada. Finalizada la
perfusión de la sustancia testigo, procedemos a anudar las ligaduras de seda
previamente fijadas a nivel de la carótida.
A continuación seccionamos un segmento de aorta descendente por
debajo del punto de clampaje, introduciéndolo en un tubo cónico con 1 ml de
tampón para arterias a pH 7.5, el cual depositamos en un recipiente con hielo
triturado.
2.4.5 OBTENCION DE LA MUESTRA PARA EL ANALISIS RETINIANO
Transcurridos 10 minutos desde la perfusión de la sustancia testigo a
nivel de la carótida interna, se procede a la enucleación de ambos globos
oculares, los cuales son depositados en una solución con fijador durante 45
minutos. Transcurridos los cuales, se les realiza una incisión a nivel del limbo
Material y Métodos
128
esclerocorneal para extraer el cristalino. Extraído el cristalino y eliminado el
contenido de humor vítreo, se introduce la esclerótica junto con la retina en
fijador de Mesulam (compuesto por una mezcla de glutaraldehido al 1.2% y
paraformaldehido al 1% disueltos en tampón fosfato 0.2 molar a pH 7.2-7.4)
durante 48 horas; transcurridas las cuales se pasa a tampon fosfato 0.1 normal
durante 24 horas más y a continuación se separa la retina de la esclera
mediante una espátula fina, con ayuda del microscopio quirúrgico.
Material y Métodos
129
2.5 TECNICAS ANALITICAS PLAQUETARIAS
2.5.1 AGREGOMETRIA PLAQUETARIA:
Esta prueba tiene por finalidad establecer cuantitativamente la
proporción de plaquetas que forman agregados tras la adición de un inductor
de la agregación plaquetaria. Como consecuencia estudia la actividad global
plaquetaria ante determinados estímulos químicos.
Esta técnica aporta como ventaja fundamental la posibilidad de explorar
el funcionalismo plaquetario en presencia de todos los elementos sanguíneos.
Es por ello que sea considerada como una de las técnicas que más
fisiológicamente explora el funcionalismo plaquetario.
Esta técnica desarrollada por Cardinal y Flower en 1979 se basa en la
introducción de dos electrodos en la muestra de sangre, dejando circular una
corriente eléctrica entre ambos, que pasará a través de la sangre. Cuando se
añade un agente inductor de la agregación plaquetaria, las plaquetas se
adhieren a los electrodos en proporción directa al grado de agregabilidad,
incrementando de esta forma la resistencia al paso de la corriente eléctrica de
forma proporcional al número de plaquetas agregadas en dichos electrodos.
Estos cambios en la impedancia eléctrica se pueden registrar gráficamente,
constituyendo la denominada curva de agregación plaquetaria.
Para la realización de las curvas de agregación se utilizó 1 ml de sangre
anticoagulada con citrato sódico al 3.8% en proporción 1:5. Posteriormente se
distribuyó la sangre en dos cubetas siliconadas, 500 �L en cada cubeta, a las
cuales se les añadió 500 �L de suero salino isotónico. De esta forma el
volumen final de cada cubeta fue de 1 ml. Esta dilución se realizó en base a
trabajos previos según los cuales el registro gráfico es más apropiado y
cuantificable empleando esta dilución.
Las cubetas con las muestras y un imán agitador se introducen en unos
posillos de incubación que para tal efecto posee el agregómetro a una
temperatura constante de 37�C.
Cuando la sangre adquirió esta temperatura, se introdujo la muestra en el
posillo de agregación, fijándose la velocidad del imán a 1000 rpm. A
Material y Métodos
130
continuación se introdujeron los electrodos en la sangre, graduando el registro
gráfico en su línea basal (mínima impedancia o máximo paso de corriente
eléctrica). Seguidamente se calibró la sensibilidad del aparato, de forma que al
trasladarse la gráfica 1 cm en sentido vertical representase el cambio de 1
ohmio de resistencia eléctrica.
En este momento mediante una pipeta de 100 �L se administró el
agente inductor, en nuestro caso colágeno, cuya composición cuantitativa fue
la siguiente: Se partió de la suspensión comercial (100 �g/ml), la cual fue
almacenada en frigorífico a 4�C hasta el momento de su uso. Al realizar la
experiencia se extrajeron 100 �L de dicha solución, añadiéndoselos a la
muestra sanguínea, de esta forma la concentración final de colágeno en la
muestra fue de 10 �g/ml.
Una vez depositado el colágeno se observó la agregación durante un
tiempo de 10 minutos; siendo la velocidad de arrastre del papel de 1 cm por
minuto en todas las experiencias.
Una vez obtenida la curva de agregación, se consideró como intensidad
máxima de agregación la altura en centímetros (correspondiente al valor
numérico de la impedancia en ohmios) desde la línea basal hasta el punto
máximo de la curva. Dicho valor fue expresado en ohmios de resistencia
eléctrica.
2.5.2 DETERMINACIÓN DE LA PRODUCCIÓN PLAQUETARIA DE
TROMBOXANO B2.
FUNDAMENTO DE LA TECNICA.
Mediante la determinación del Tromboxano B2 se efectuó un test de
actividad metabólica del ácido araquidónico trombocitario. Lo ideal fue
determinar los niveles de TxA2, pero este es muy lábil y con vida media
fisiológica de 30 a 35 segundos. Habitualmente, el TxA2 se convierte en un
metabolito estable, el TxB2, de vida media entre 40 y 45 minutos, y cuya
medida es aceptada como válida para explorar esta vía metabólica. El TxB2 se
cuantifica mediante técnicas de enzimoinmunoensayo que empleamos en este
Material y Métodos
131
estudio.
METODICA GENERAL.
Se descongelaron las muestras y el kit comercial para la determinación
de TxB2, dejándolos a temperatura ambiente durante 15 a 20 minutos antes de
empezar la experiencia. Así obtenemos un estado líquido de todos ellos,
aunque lo seguimos conservando en frío (dentro de una bandeja con hielo
triturado).
Se prepararon placas de enzimoinmunoensayo (96 pocillos), cada uno
de ellos, prefectamente identificadas. Se estableció una curva estándar con los
preparados del sistema TxB2, realizándose por duplicado. La numeración fue la
siguiente:
- Pocillos 1 y 2: cuentas totales (TC ó Total Counts).
- Pocillos 3 y 4: unión no específica (NSB ó Non Specific Binding).
- Pocillos 5 y 6: máxima unión, estándar cero (BO ó Bound).
- Pocillos 7 y 8; 9 y 10; 11 y 12; 13 y 14; 15 y 16; 17 y 18; 19 y 20:
concentraciones estándar de los distintos preparados del Kit por duplicado.
- Pocillos 21 y 22; 23 y 24; 25 y 26;….: muestras de plasma en estudio,
por duplicado.
Las muestras se sometieron a una dilución 1:20 (10 µL de la muestra y 190
µL de agua destilada) y se tomaron 100 µL de este nuevo preparado
depositándose en los pocillos de la placa que habíamos preparado.
Preparación pocillos curva estándar:
- Tampón buffer fosfato salino: 100 µL a los pocillos 1 y 2 (TC).
50 µL a los pocillos 3 y 4 (NSB).
50 µL a los pocillos 5 y 6 (BO).
- Soluciones estándar A, B, C, D, E, F y G: 100 µL en cada unode sus
pocillos correspondientes:
A.- Pocillos 7 y 8: concentración 0.5 pg/mL de TxB2 en buffer fosfato
salino.
Material y Métodos
132
B.- Pocillos 11 y 12: 1 pg/mL.
C.- Pocillos 13 y 14: 4 pg/mL.
D.- Pocillos 13 y 14: 4 pg/mL.
E.- Pocillos 15 y 16: 8 pg/mL.
F.- Pocillos 17 y18: 16 pg/mL.
G.- Pocillos 19 y 20: 32 pg/mL.
Se agitaron todos los tubos durante 10 segundos y, seguidamente se
añadió Antiserum TxB2 (100 µL) a todos los pocillos excepto los identificados
como TC (tubos 1 y 2) y NSB (pocillos 3 y 4 ). Se volvieron a agitar todos los
pocillos 5 segundos cada uno.
Posteriormente, se añadieron 50 µL de peroxidasa conjugada de TxB2 a
todos los pocillos excepto a los BO y se incubaron durante 1 hora a una
temperatura entre 15° y 30° C. Transcurrido este tiempo se procedió al lavado
con 400 µL de buffer de lavado.
Inmediatamente después se dispensó 150 µL de sustrato enzimático y
se volvieron a incubar durante 15 minutos a una temperatura entre 15° y 30° C.
La reacción se paró con 100 µL de ácido sulfúrico 1 M.
La densidad óptica (DO) del contenido fue determinada durante 30
minutos a 450 nm.
INTERPRETACION DE RESULTADOS.
Básicamente, la concentración de TxB2 existente en cada muestra de
los resultados. estándar e interpolando los mismos los datos de los tubos
problemas, para ello se realizó una correlación suero se halla calculando los
datos correspondientes a los tubos gráfica de los datos de las muestras con la
curva estándar obtenida, constituyendo la base de la obtención de los
resultados.
Los datos aportados por la densidad óptica de cada pocillo, sirvieron
para calcular la proporción de TxB( en cada tubo respecto a la unión máxima
establecida en la muestra BO a partir de la siguiente expresión:
Material y Métodos
133
DO TS ó TP – DO NSB
% B / BO = ----------------------------------------- * 100
DO BO – DO NSB
donde:
% B / BO = Porcentaje de unión de TxB( respecto a la unión máxima.
DO TS = Densidad óptica de cada pocillo estándar.
DO TP = DO de cada pocillo problema.
DO NSB = DO en pocillos (unión no específica).
DO BO = DO en pocillos de máxima unión (estandar 0 ).
La curva estándar puede ser generada interpolando el porcentaje B / BO
como una función del logaritmo de la concentración de TxB2.
2.5.3. DETERMINACION DE LA PRODUCCIÓN VASCULAR DE 6-KETO-
PGF1α.
Se descongelaron las muestras y el Kit comercial para la determinación
de 6-keto-PGF1α dejándolos a temperatura ambiente durante 15 a 20 minutos
antes de empezar la experiencia. Así obtenemos un estado líquido de todos
ellos, aunque lo seguimos conservando en frío (dentro de una bandeja con
hielo troturado).
Se prepararon placas de enzimoinmunoensayo ( 96 pocillos), cada uno
de ellos, perfectamente identificadas. Se estableció una curva estándar con los
preparados del sistema 6-keto-PGF1α, realizándose por duplicado. La
numeración fue la siguiente:
- Pocillos 1 y 2: cuentas totales (TC ó Total Counts).
- Pocillos 3 y 4: unión no específica (NSB ó Non Specific Binding).
- Pocillos 5 y 6: máxima unión, estándar cero (BO ó Bound).
- Pocillos 7 y 8:; 9 y 10; 11 y 12; 13 y 14; 15 y 16; 17 y 18; 19 y 20:
concentraciones estándar de los distintos preparados del Kit por
duplicado.
Las muestras se sometieron a una dilución 1:20 (10 µL de la muestra y
Material y Métodos
134
190 µL de agua destilada) y se tomaron 100 µL de este nuevo preparado
depositándose en los pocillos de la placa que habíamos preparado.
Preparación pocillos curva estándar:
- Tampón buffer fosfato salino: 100 µL a los pocillos 1 y 2 (TC).
50 µL a los pocillos 3 y 4 (NSB).
50 µL a los pocillos 5 y 6 (BO).
- Soluciones estándar A, B, C, D, E, F y G: 100 µL en cada uno de sus
pocillos correspondientes:
A.- Pocillos 7 y 8: concentración 0.5 pg/ mL de 6-keto-PGF1α en buffer
fosfato salino.
B.- Pocillos 9 y 10: 1 pg/ mL.
C.- Pocillos 11 y 12: 2 pg/ mL.
D.- Pocillos 13 y 14: 4 pg/ mL.
E.- Pocillos 15 y 16: 8 pg/mL.
F.- Pocillos 17 y 18: 16 pg/ mL.
G.- Pocillos 19 y 20: 32 pg/ mL.
Se agi8taron todos los tubos durante 10 segundos y, seguidamente se
añadió Antiserum 6-keto-PGF1α (100 µL) a todos los pocillos excepto los
identificados como TC (tubos 1 y 2) y NSB (pocillos 3 y 4 ). Se volvieron a
agitar todos los pocillos 5 segundos cada uno.
Posteriormente. Se añadieron 50 µL de peroxidasa conjugada de 6-keto-
PGF1α a todos los pocillos excepto a los BO y se incubaron durante 1 hora a
una temperatura entre 15° y 30° C. Transcurrido este tiempo se procedió al
lavado con 400 µL de buffer de lavado.
Inmediatamente después se dispensó 150µL de sustrato enzimático y se
volvieron a incubar durante 15 minutos a una temperatura entre 15° y 30° C.
La reacción se paró con 100 µL de ácido sulfúrico 1 M.
La densidad óptica (DO) del contenido fue determinada durante 30
minutos a 450 nm.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS.
Material y Métodos
135
Básicamente, la concentración de 6-keto-PGF1α existente en cada
muestra de suero se halla calculando los datos correspondientes a los tubos
estándar e interpolando los mismos los datos de los tubos problemas, para ello
se realizó una correlación gráfica de los datos de las muestras con la curva
estándar obtenida, constituyendo la base de la obtención de los resultados.
Los datos aportados por la densidad óptica de cada pocillo, sirvieron
para calcular la proporción de 6-keto-PGF1α en cada tubo respecto a la unión
máxima establecida en la muestra BO a partir de la siguiente expresión:
DO TS ó TP – DO NSB
% B / BO = -------------------------------- * 100
DO BO – DO NSB
Donde:
% B / BO = Porcentaje de unión de 6-keto-PGF1α respecto a la unión
máxima.
DO TS = Densidad óptica de cada pocillo estándar.
DO TP = DO en pocillos (unión no específica).
DO BO = DO en pocillos de máxima unión (estándar 0).
La curva estándar puede ser generada interpolando el porcentaje B / BO
como una función del logaritmo de la concentración de 6-keto-PGF1α.
2.5.4. DETERMINACION DE NITRITOS PLASMATICOS.
FUNDAMENTO.
Se cuantificaron, por técnica espectrofotométrica, los nitritos del plasma
pobre en plaquetas (PPP), como índice de producción basal celular de óxido
nítrico.
METODO.
Tras repartir en dos alicuotas de 500 µL el PPP, añadimos a una de ellas
500 µL de ácido fosfórico al 4 % (blanco) y a la otra 500 µL de reactivo de
Griess; quedando las muestras preparadas para medir su absorbancia en el
Material y Métodos
136
espectrofotómetro, calibrado para una longitud de onda de λ = 546 nm.
RESULTADOS.
Al valor obtenido de la muestra con reactivo de Griess le restamos el
valor del blanco y el resultado lo podremos expresar en µmol/L de NO2, tras
interpolación en una recta de regresión realizada con concentraciones
crecientes de nitrito sódico.
2.5.5. DETECCION DE LA PRODUCCION AORTICA DE OXIDO NITRICO .
FUNDAMENTO.
El método ideal para la detección de la producción in situ de óxido nítrico
debe tener las siguientes características:
1. Buena selectividad para el óxido nítrico, discriminando otras especies.
2. Buena sensibilidad, ya que es muy importante la habilidad para detectar
concentraciones nM.
3. Rápida respuesta, es decir, escaso tiempo transcurrido desde la exposición
al óxido nítrico.
4. Larga estabilidad durante la medición.
5. Un sensor pequeño que facilite una ajustada proximidad al sitio de
liberación.
6. Que origine el mínimo disturbio en la muestra o preparación problema.
7. Facilidad de calibración usando reactivos estándar de laboratorio.
El principio de deteción de óxido nítrico que hemos usado está basado en
una técnica electroquímica , pudiendo considerarse los sensores como
electrodos amperométricos. De forma resumida, se puede decir que está
basado en la detección por el sensor del número de electrones producidos en
la oxidación de cada una de las moléculas de óxido nítrico originadas:
NO + 4OH -----------------> NO3 + 2 H2O = 3 e-
Existen distintos sensores según su diámetro, y la mayoría de ellos se
cubren de una manera altamente selectiva para permeabilizar gases, la cual
Material y Métodos
137
separa el sistema interno de electrodos de la muestra solución. Este diseño
previene que grandes moléculas o ciertas especies iónicas pasen a través de la
membrana y , por tanto, interfieran con la medición de óxido nítrico. En
nuestros experimentos hemos usado un sensor de 30 µm que incorpora un
revestimiento capaz de excluir a la mayoría de especies que pueden ser
relevantes en la investigación del óxido nítrico por originar interferencias con
éste, como son: nitritos, L-arginina, dopamina, ácido ascórbico, cisteína,
peróxido de hidrógeno, nitratos, N-acetil-cisteina, etanol, metanol, glucosa y
otros carbohidratos, proteínas, nitrógeno, oxígeno, monóxido y dióxido de
carbono.
Los métodos no electroquñimicos para la detección de óxido nítrico no son
los ideales para las mediciones in situ en tiempo real. Por ejemplo, la
quimioluminiscencia en fase gaseosa, aunque altamente sensible, requiere de
la extracción de óxido nítrico a partir de la muestra en fase gaseosa. Esto
obviamente impide la medición em tiempo real; además, es un procedimiento
que emplea mucho tiempo y requiere no sólo el uso de reactivos gaseosos,
sino también un espacio e instrumentación en laboratorio adecuados.
Por otro lado, la detección espectrofotométrica de óxido nítrico, basada en
la reacción de éste con oxohemoglobina no es del todo fiable, ya que los
peroxinitritos inducen cambios espectrales idénticos a los producidos por el
óxido nítrico.
Por tanto, parece que estos nuevos sensores electroquímicos de óxido
nítrico superan con confianza el principal problema asociado a la medición de
éste in situ en tiempo real. Se dispone de variedad de aplicaciones de este
método en la bibliografía, tanto en los primeros experimentos con esta
sustancoa, como en otros más recientes.
METODO.
Previamente, hubo de calibrarse el aparato mediante generación química de
óxido nítrico con una serie de reactivos que cumplían la siguiente reacción:
2 KNO2 + 2KI + 2H2SO4 -------> 2NO + I2 + 2H2O + 2K2SO4
Material y Métodos
138
Una vez calibrado, pudimos comenzar a medir la producción de oxido
nítrico en las distintas muestras arteriales. Para ello, los tubos que las
contenían se colocaron en un baño a 37° C, luego se introdujo el electrodo y,
colocando el regostrador en cero, se esperó a la estabilización del mismo.
Alcanzada ésta, la adición de sustancias tuvo el siguiente orden:
1) Se añadió el fármaco en estudio, durante 5 minutos.
2) A continuación se adicionó L-arginina, como sustrato necesario,
durante otros 5 minutos.
3) Por último, el ionóforo de calcio (A 23187), a fin de
incrementarbruscamente la concentración intracelular de calcio, y ser
éste el principal estímulo para la NO-sintetasa de tipo constitutivo
El detector automáticamente ofrecía la medida en pAS y su transformación
en µmoles de óxido nítrico.
Se registraron los cambios de producción de óxido nítrico valorándose
cuatro períodos:
Los incrementos medidos fueron los siguientes: C-B, D-C y E-D.
2.6 TECNICAS ANALITICAS RETINIANAS
2.6.1 PROCESAMIENTO DE LA RETINA A PLANO
Obtenida la retina a plano, se coloca en un portaobjetos previamente
gelatinizado para que no se desprenda y se deja secar 30-60 minutos.
Transcurrido este tiempo se procede al procesado de la pieza histológica en
una solución de embebimiento compuesta por 10 mgr de 3-3' 5-5'Tetrametil-
Material y Métodos
139
bencidina disuelta en 5 ml de alcohol absoluto, más 100 mgr de
Nitroferrocianida sódica disuelta en tampón acetato y agua destilada a pH de
3.3, durante 20 minutos; y posteriormente otros 20 minutos añadiéndole de 5 a
10 ml de una solución al 1% de peróxido de hidrógeno.
Finalizado este proceso de revelado, se dejan los cortes durante 24
horas en el refrigerador en una solución lavadora compuesta por una solución
de tampón acetato pH 3.3 al 10% en agua destilada.
Transcurrido este tiempo procedemos a la deshidratación de los cortes
según la siguiente pauta:
- 10 segundos en agua destilada
- 10 segundos en alcohol de 701
- 10 segundos en alcohol de 961
- 10 segundos en alcohol de 1001
- 3-5 minutos en Xilol
- 10 minutos en Xilol
Finalizado el proceso de deshidratación son montadas las retinas en los
portas con DPX y cubreobjetos, quedando listas para su observación a
microscopía óptica.
2.6.2 VALORACION CUANTITATIVA DEL LLENADO VASCULAR RETINIANO
Una vez montadas las retinas, pueden ser observadas a diferentes
aumentos en microscopio óptico, tanto en campo claro como en campo oscuro;
y posteriormente fotografiadas.
Realizadas las fotografías, estas son procesadas mediante un programa
informático de análisis de imagen, con el cual valoraremos el porcentaje de
área ocupada por los vasos rellenos por la sustancia inyectada (HRP) con
respecto al área fotografiada.
Los pasos realizados por el programa procesador de imagen son los
siguientes (91):
1 Digitalización: Esta fase constituye el elemento de enlace entre el mundo real
y el ordenador. Mediante el proceso de digitalización, determinados sensores
Material y Métodos
140
(cámara de video) transforman la imagen analógica (fotografía) en digital,
transformándose esta en blanco y negro. Durante el proceso de digitalización,
el intervalo total de valores de gris posible se divide en intervalos consecutivos,
conocidos como niveles de cuantización, a cada uno de los cuales se le asigna
un valor. La calidad de la representación viene determinada por la escala de
grises de que disponga el sistema, es decir, del número de niveles de
cuantización considerado. Figura 10-A.
2 Mejora: El tratamiento de la imagen una vez digitalizada consiste en procesar
un conjunto de datos para obtener valores nuevos, que dan lugar a una versión
retocada de la imagen original. Figura 10-B.
3 Discriminación (segmentación): Esta operación extrae de la imagen una
determinada característica, originando imágenes que tienen dos valores:
blanco o negro. Se elige un intervalo de valores de gris y se compara con la
imagen de entrada. Para crear la imagen de salida, a cada pixel de la imagen
de entrada se le asigna el valor: blanco, si su valor de gris está dentro del
intervalo, y negro si queda fuera.
Esta operación permite delimitar aquellas estructuras dentro de la
imagen que posteriormente van a ser evaluadas. Figura 10-C.
4 Depuración: No es más que la repetición del paso anterior a un nivel más
depurado. Figura 10-D.
5 Evaluación: Es una ayuda interna al computador que le permite distinguir
como distintas las estructuras que surgen de la segmentación, de modo que
dará los valores de cada una de ellas por separado.
Material y Métodos
141
2.7 VALORACION DEL GRADO DE CATARATAS
Para la valoración del grado de la catarata hemos realizado un
seguimiento mensual con iluminacion frontal y lateral mediante el microscopio
quirúrgico, procediendo a la toma de fotografia mensualmente.
Para el estadiaje de la catarata nos hemos basado en los estudios
realizados por Moreno et al. (169), así hemos clasificado la evolución de la
catarata en los siguientes grados (Figura 11):
� Estadío 0: No existen cambios biomicroscópicos a nivel del
cristalino.
� Estadío I : Los signos iniciales de opacificación del cristalino
aparecen como pequeñas vacuolas y/o discretas opacidades radiales
localizadas en la región ecuatorial del cristalino, sin tendencia a coalescer.
� Estadío II: Las opacidades aumentan tanto en número como en
tamaño, diseminandose hacia la región central del cristalino.
� Estadío III: Desaparecen parcialmente las vacuolas, apareciendo
una opacificación difusa a nivel del núcleo y de la corteza profunda.
� Estadío IV: El cristalino se transforma en una masa opalescente e
intumescente siendo imposible visualizar el fondo de ojo.
A B
--------------------------------------------
-----------------------------------------
C D
Material y Métodos
142
Figura 10. A) Imagen original (digitalizada)
B) Imagen mejorada (aumentada de contraste)
C) Imagen segmentada
D) Imagen segmentada depurada (definitiva)
Material y Métodos
143
Material y Métodos
144
2.8 METODO ESTADISTICO
Los datos expresados en el texto, tablas y figuras son la media ± error
estándar de la media, de los diversos grupos de resultados en cada caso.
La valoración estadística de dichos resultados se realizó mediante la
utilización del programa para ordenador personal SPSS (Social Program for
Statistical Sciencies) para Windows 95, versión 6.0 ( SPSS Inc., 1993).
En primer lugar, se tabularon los grupos de resultados por técnicas de
estudio y grupos experimentales, comprobando la normalidad de la distribución
mediante el test de D'Agostino.
Una vez confirmada esta normalidad, se realizó una comparación de
medias mediante el test ANOVA, aplicando posteriormente la transformación
de Bonferroni. Así mismo, se aplicó el Test de regresión lineal para confirmar la
dependencia entre dos variables. Se consideró como de mínima significancia
estadística aquella con p< 0.05.
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosismoderadamente bajas de ácido acetilsalicílico.
1
1. RESULTADOS CORRESPONDIENTES A LOS ANIMALES DEL GRUPO
CONTROL NO DIABETICO
1.1. RESULTADOS CORRESPONDIENTES A PARAMETROS GENERALES
En la Tabla 1 se muestran los valores medios ( media ±
error estándar de la media ) correspondientes a los pesos corporales (en
gramos), niveles de glucosa en sangre (mg / dL) y recuentos celulares
sanguíneos: hematies (x 10 12 / L), leucocitos (x 10 9 / L), hemoglobina (g / L),
hematocrito (%), plaquetas (x 10 9 / L) y volumen plaquetario (fl), en el
momento del sacrificio, correspondientes a los animales del grupo control no
diabético, diferenciando los resultados obtenidos en las ratas macho de
aquellos cuantificados en las hembras.
En la Figura 1 se representan gráficamente los resultados anteriores.
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosismoderadamente bajas de ácido acetilsalicílico.
2
TABLA 1. Valores de parámetros de peso, glucemia y hematimetría en el grupo
de animales control no diabético.
Ratas Macho Ratas Hembra P
N 10 10
Peso corporal (g) 425 ± 28.86 395 ± 27.52 N.S.
Glucemia (mg/dL) 81.36 ± 3.25 84.12 ± 6.26 N.S.
Hematies (×1012/L) 4.12 ± 0.095 4.13 ± 0.11 N.S.
Leucocitos (×109/L) 5.96 ± 0.32 5.04 ± 0.46 N.S.
Hemoglobina (g/L) 14.36 ± 0.42 14.22 ± 0.51 N.S.
Hematocrito (%) 45.30 ±0 0.65 44.52 ± 1.27 N.S.
Plaquetas ( ×109/L) 932 ± 20.50 924 ± 52.74 N.S.
Volumen plaquetario ( fL) 5.16 ± 0.20 5.38 ± 0.26 N.S.
N.S.: diferencias no significativas.
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosismoderadamente bajas de ácido acetilsalicílico.
3
1.2. RESULTADOS CORRESPONDIENTES A PARAMETROS DE FUNCIÓN
PLAQUETARIA
En la Tabla 2 se muestran los valores medios ( media ± error estándar
de la media ) correspondientes a la intensidad máxima de agregación (ohms),
velocidad de agregación (ohms), tromboxano B2 (ng / mL), tromboxano B2
plaquetario (nmol / 109 plaq.) y prostaglandina I2 (pg / mg aorta), en el momento
del sacrificio, correspondientes a los animales del grupo control no diabético,
diferenciando los resultados obtenidos en las ratas macho de aquellos
cuantificados en las hembras.
En la Figura 2 se representan gráficamente los resultados anteriores.
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosismoderadamente bajas de ácido acetilsalicílico.
4
TABLA 2. Valores de parámetros de función plaquetaria en el grupo de
animales control no diabético
Ratas Macho Ratas Hembra P
N 10 10
Imax. Agregación * ( ohms) 5.81 ± 0.62 5.49 ± 0.56 N.S.
Vel. Agregación * (ohms) 2.09 ± 0.21 2.10 ± 0.19 N.S.
TxB2 ( ng/mL) 31.32 ± 2.16 23.12 ± 1.98 0.05
TxB2 plaquetario (nmol/10 plaq.) 0.98 ± 0.09 0.069 ± 0.08 0.05
PGI2** (pg/ mg aorta) 92.10 ± 7.20 128 ± 9.73 0.05
N.S.: diferencias no significativas.
Imax. agregación: intensidad máxima de agregación.
Vel. agregación: velocidad de agregación.
*: inducción con 10 µg/ mL de colágeno.
**: inducción con 100 µmol/L de ácido araquidónico.
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosismoderadamente bajas de ácido acetilsalicílico.
5
1.3. RESULTADOS CORRESPONDIENTES A LA PRODUCCION DE ÓXIDO
NITRICO
En la Tabla 3 se muestran los valores medios ( media ± error estándar
de la media ) correspondientes a óxido nítrico basal (µmol / mg aorta), óxido
nítrico inducido (µmol / mg aorta), nitratos plasmáticos (µmol / L) y nitratos en
tejido aórtico (µmol / mg aorta), en el momento del sacrificio, correspondientes
a los animales del grupo control no diabético, diferenciando los resultados
obtenidos en las ratas macho de aquellos cuantificados en las hembras.
En la Figura 3 se representan gráficamente los resultados anteriores.
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosismoderadamente bajas de ácido acetilsalicílico.
6
TABLA 3. Valores relacionados con la producción de óxido nítrico en el grupo
de animales control no diabético.
Ratas Macho Ratas Hembra P
N 10 10
NO basal (µmol/ mg aorta) 2.64 ± 0.27 2.09 ± 0.08 N.S.
NOinducido*(µmol/mg aorta) 1.08 ± 0.06 0.446 ± 0.02 0.05
NO2- plasmático (µmol/L) 2.40 ± 0.14 2.70 ± 0.69 N.S.
NO2- aórtico*(µmol/mg aorta) 0.024 ± 0.001 0.0043 ± 0.0002 0.05
N.S.: diferencias no significativas.
*: inducción con 10 µmol/L de ionóforo de calcio.
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosismoderadamente bajas de ácido acetilsalicílico.
7
1.4. RESULTADOS CORRESPONDIENTES A PARAMETROS OCULARES
En la Tabla 4 se muestran los valores medios ( media ± error estándar
de la media ) correspondientes al grado de opacificación de los cristalinos y
porcentaje de área retiniana ocupada por vasos sanguíneos marcados en su
interior con peroxidasa, en el momento del sacrificio, correspondientes a los
animales del grupo control no diabético, diferenciando los resultados obtenidos
en las ratas macho de aquellos cuantificados en las hembras.
En la Figura 4 se representan gráficamente los resultados anteriores.
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosismoderadamente bajas de ácido acetilsalicílico.
8
TABLA 4. Valores de parámetros de opacificación cristaliniana y
vascularización retiniana en el grupo de animales control no diabético.
Ratas Macho Ratas Hembra P
N 10 10
Cristalino dcho.( unidades orbitarias) 0 ± 0 0 ± 0 N.S.
Cristalino izdo. ( unidades orbitarias) 0 ± 0 0 ± 0 N.S.
Área retiniana ocupada por vasos
permeables a peroxidasa (%)
15.50 ± 1.23 15.42 ± 1.21 N.S.
N.S.: diferencias no significativas.
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosismoderadamente bajas de ácido acetilsalicílico.
9
2. RESULTADOS CORRESPONDIENTES A LOS ANIMALES DEL GRUPO
DIABETICO NO TRATADO DE UN MES DE EVOLUCION
2.1. RESULTADOS CORRESPONDIENTES A PARAMETROS GENERALES
En la Tabla 5 se muestran los valores medios ( media ± error estándar
de la media ) correspondientes a los pesos corporales (en gramos), niveles de
glucosa en sangre (mg / dL) y recuentos celulares sanguíneos: hematies (x 1012 / L), leucocitos (x 10 9 / L), hemoglobina (g / L), hematocrito (%), plaquetas (x
10 9 / L) y volumen plaquetario (fl), en el momento del sacrificio,
correspondientes a los animales del grupo diabético no tratado tras un mes de
evolución, diferenciando los resultados obtenidos en las ratas macho de
aquellos cuantificados en las hembras.
En la Figura 5 se representan gráficamente los resultados anteriores.
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosismoderadamente bajas de ácido acetilsalicílico.
10
TABLA 5. Valores de parámetros de peso, glucemia y hematimetría en el grupo
de animales diabéticos no tratados de un mes de evolución.
Ratas Macho Ratas Hembra P
N 10 10
Peso corporal (g) 278 ± 16.12 265 ± 12.01 N.S.
Glucemia (mg/dL) 479 ± 15.62 487 ± 19.27 N.S.
Hematies (×1012/L) 4.09 ± 0.19 3.98 ± 0.21 N.S.
Leucocitos (×109/L) 6.62 ± 0.71 6.51 ± 0.48 N.S.
Hemoglobina (g/L) 14.67 ± 0.39 14.04 ± 0.64 N.S.
Hematocrito (%) 50.01 ± 1.63 48.51 ± 2.05 N.S.
Plaquetas ( ×109/L) 688 ± 39.52 650 ± 56.61 N.S.
Volumen plaquetario ( fL) 5.91 ± 0.10 5.88 ± 0.26 N.S.
N.S.: diferencias no significativas.
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosismoderadamente bajas de ácido acetilsalicílico.
11
2.2. RESULTADOS CORRESPONDIENTES A PARAMETROS DE FUNCIÓN
PLAQUETARIA
En la Tabla 6 se muestran los valores medios ( media ± error estándar de la
media ) correspondientes a la intensidad máxima de agregación (ohms), velocidad
de agregación (ohms), tromboxano B2 (ng / mL), tromboxano B2 plaquetario (nmol
/ 109 plaq.) y prostaglandina I2 (pg / mg aorta), en el momento del sacrificio,
correspondientes a los animales del grupo diabético no tratado de un mes de
evolución, diferenciando los resultados obtenidos en las ratas macho de aquellos
cuantificados en las hembras.
En la Figura 6 se representan gráficamente los resultados anteriores.
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosismoderadamente bajas de ácido acetilsalicílico.
12
TABLA 6. Valores de parámetros de función plaquetaria en el grupo de animales
diabéticos no tratados de un mes de evolución.
Ratas Macho Ratas Hembra P
N 10 10
Imax. Agregación * ( ohms) 6.85 ± 0.49 6.59 ± 0.71 N.S.
Vel. Agregación * (ohms) 3.20 ± 0.29 3.27 ± 0.32 N.S.
TxB2 ( ng/mL) 44.01 ± 5.78 45.48 ± 3.93 N.S.
TxB2 plaquetario (nmol/10 plaq.) 2.54 ± 0.16 1.43 ± 0.16 0.05
PGI2** (pg/ mg aorta) 60.1 ± 5.23 81.2 ± 9.08 0.05
N.S.: diferencias no significativas.
Imax. agregación: intensidad máxima de agregación.
Vel. agregación: velocidad de agregación.
*: inducción con 10 µg/ mL de colágeno.
**: inducción con 100 µmol/L de ácido araquidónico.
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosismoderadamente bajas de ácido acetilsalicílico.
13
2.3. RESULTADOS CORRESPONDIENTES A LA PRODUCCION DE ÓXIDO
NITRICO
En la Tabla 7 se muestran los valores medios ( media ± error estándar de la
media ) correspondientes a óxido nítrico basal (µmol / mg aorta), óxido nítrico
inducido (µmol / mg aorta), nitrato plasmático (µmol / L) y nitrato aórtico (µmol / mg
aorta), en el momento del sacrificio, correspondientes a los animales del grupo
diabético no tratado de un mes de evolución, diferenciando los resultados
obtenidos en las ratas macho de aquellos cuantificados en las hembras.
En la Figura 7 se representan gráficamente los resultados anteriores.
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosismoderadamente bajas de ácido acetilsalicílico.
14
TABLA 7. Valores relacionados con la producción de óxido nítrico en el grupo de
animales diabético no tratado de un mes de evolución.
Ratas Macho Ratas Hembra P
N 10 10
NO basal (µmol/ mg aorta) 0.16 ± 0.02 0.24 ± 0.020.08 N.S.
NOinducido*(µmol/mg aorta) 0.053 ± 0.003 0.038 ± 0.005 0.05
NO2- plasmático (µmol/L) 1.59 ± 0.14 1.08 ± 0.08 0.05
NO2- aórtico*(µmol/mg aorta) 0.009 ± 0.001 0.009 ± 0.001 N.S.
N.S.: diferencias no significativas.
*: inducción con 10 µmol/L de ionóforo de calcio.
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosismoderadamente bajas de ácido acetilsalicílico.
15
2.4. RESULTADOS CORRESPONDIENTES A PARAMETROS OCULARES
En la Tabla 8 se muestran los valores medios ( media ± error estándar de la
media ) correspondientes al grado de opacificación de los cristalinos y porcentaje
de área retiniana ocupada por vasos sanguíneos marcados en su interior con
peroxidasa, en el momento del sacrificio, correspondientes a los animales del
grupo diabético no tratado de un mes de evolución, diferenciando los resultados
obtenidos en las ratas macho de aquellos cuantificados en las hembras.
En la Figura 8 se representan gráficamente los resultados anteriores.
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosismoderadamente bajas de ácido acetilsalicílico.
16
TABLA 8. Valores de parámetros de opacificación cristaliniana y vascularización
retiniana en el grupo de animales diabéticos tratados de un mes de evolución.
Ratas
Macho
Ratas
Hembra
P
N 10 10
Cristalino dcho.( unidades orbitarias) 1.08 ± 0.09 1.10 ± 0.11 N.S.
Cristalino izdo. ( unidades orbitarias) 1.00 ± 0.08 1.10 ± 0.12 N.S.
Área retiniana ocupada por vasos
permeables a peroxidasa (%)
10.46 ± 1.28 12.47 ± 0.99 N.S.
N.S.: diferencias no significativas.
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosismoderadamente bajas de ácido acetilsalicílico.
17
3. RESULTADOS CORRESPONDIENTES A LOS ANIMALES DEL GRUPO
DIABETICO NO TRATADO DE DOS MESES DE EVOLUCION
3.1. RESULTADOS CORRESPONDIENTES A PARAMETROS GENERALES
En la Tabla 9 se muestran los valores medios ( media ± error estándar de la
media ) correspondientes a los pesos corporales (en gramos), niveles de glucosa
en sangre (mg / dL) y recuentos celulares sanguíneos: hematies (x 10 12 / L),
leucocitos (x 10 9 / L), hemoglobina (g / L), hematocrito (%), plaquetas (x 10 9 / L) y
volumen plaquetario (fl), en el momento del sacrificio, correspondientes a los
animales del grupo diabético no tratado de dos meses de evolución, diferenciando
los resultados obtenidos en las ratas macho de aquellos cuantificados en las
hembras.
En la Figura 9 se representan gráficamente los resultados anteriores.
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosismoderadamente bajas de ácido acetilsalicílico.
18
TABLA 9. Valores de parámetros de peso, glucemia y hematimetría en el grupo de
animales diabéticos no tratados de dos meses de evolución.
Ratas Macho Ratas Hembra P
N 10 10
Peso corporal (g) 292 ± 18.13 283 ± 25.76 N.S.
Glucemia (mg/dL) 432 ± 26.10 429 ± 17.25 N.S.
Hematies (×1012/L) 4.94 ± 0.23 4.41 ± 0.31 N.S.
Leucocitos (×109/L) 6.30 ± 0.46 6.35 ± 0.44 N.S.
Hemoglobina (g/L) 16.00 ± 0.51 15.71 ± 1.07 N.S.
Hematocrito (%) 53.80 ± 3.21 49.30 ± 3.12 N.S.
Plaquetas ( ×109/L) 547 ± 61.39 473 ± 58.10 N.S.
Volumen plaquetario ( fL) 5.90 ± 0.21 6.47 ± 0.71 N.S.
N.S.: diferencias no significativas.
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosismoderadamente bajas de ácido acetilsalicílico.
19
3.2. RESULTADOS CORRESPONDIENTES A PARAMETROS DE FUNCIÓN
PLAQUETARIA
En la Tabla 10 se muestran los valores medios ( media ± error estándar de
la media ) correspondientes a la intensidad máxima de agregación (ohms),
velocidad de agregación (ohms), tromboxano B2 (ng / mL), tromboxano B2
plaquetario (nmol / 109 plaq.) y prostaglandina I2 (pg / mg aorta), en el momento
del sacrificio, correspondientes a los animales del grupo diabético no tratado de
dos meses de evolución, diferenciando los resultados obtenidos en las ratas
macho de aquellos cuantificados en las hembras.
En la Figura 10 se representan gráficamente los resultados anteriores.
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosismoderadamente bajas de ácido acetilsalicílico.
20
TABLA 10. Valores de parámetros de función plaquetaria en el grupo de animales
diabéticos no tratados de dos meses de evolución.
Ratas Macho Ratas Hembra P
N 10 10
Imax. Agregación * ( ohms) 9.26 ± 0.98 9.08 ± 0.70 N.S.
Vel. Agregación * (ohms) 5.51 ± 0.49 5.60 ± 0.48 N.S.
TxB2 ( ng/mL) 73.21 ± 8.19 73.42 ± 7.31 N.S.
TxB2 plaquetario (nmol/10 plaq.) 7.43 ± 0.95 5.57 ± 0.48 0.05
PGI2** (pg/ mg aorta) 42.3 ± 2.78 45.3 ± 3.76 N.S.
N.S.: diferencias no significativas.
Imax. agregación: intensidad máxima de agregación.
Vel. agregación: velocidad de agregación.
*: inducción con 10 µg/ mL de colágeno.
**: inducción con 100 µmol/ L de ácido araquidónico.
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosismoderadamente bajas de ácido acetilsalicílico.
21
3.3. RESULTADOS CORRESPONDIENTES A LA PRODUCCION DE ÓXIDO
NITRICO
En la Tabla 11 se muestran los valores medios ( media ± error estándar de
la media ) correspondientes a óxido nítrico basal (µmol / mg aorta), óxido nítrico
inducido (µmol / mg aorta), nitrato plasmático (µmol / L) y nitrato aórtico (µmol / mg
aorta), en el momento del sacrificio, correspondientes a los animales del grupo
diabético no tratado de dos meses de evolución, diferenciando los resultados
obtenidos en las ratas macho de aquellos cuantificados en las hembras.
En la Figura 11 se representan gráficamente los resultados anteriores.
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosismoderadamente bajas de ácido acetilsalicílico.
22
TABLA 11. Valores relacionados con la producción de óxido nítrico en el grupo de
animales diabético no tratado de dos meses de evolución.
Ratas Macho Ratas Hembra P
N 10 10
NO basal (µmol/ mg aorta) 0.11 ± 0.02 0.13 ± 0.02 N.S.
NOinducido*(µmol/mg aorta) 10.026 ± 0.003 0.023 ± 0.004 0.05
NO2- plasmático (µmol/L) 0.89 ± 0.09 0.81 ± 0.09 N.S.
NO2- aórtico*(µmol/mg aorta) 0.0069 ± 0.001 0.026 ± 0.004 0.05
N.S.: diferencias no significaticas.
*: inducción con 10 µmol/L de ionóforo de calcio.
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosismoderadamente bajas de ácido acetilsalicílico.
23
3.4. RESULTADOS CORRESPONDIENTES A PARAMETROS OCULARES
En la Tabla 12 se muestran los valores medios ( media ± error estándar de
la media ) correspondientes al grado de opacificación de los cristalinos y
porcentaje de área retiniana ocupada por vasos sanguíneos marcados en su
interior con peroxidasa, en el momento del sacrificio, correspondientes a los
animales del grupo diabético no tratado de dos meses de evolución, diferenciando
los resultados obtenidos en las ratas macho de aquellos cuantificados en las
hembras.
En la Figura 12 se representan gráficamente los resultados anteriores.
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosismoderadamente bajas de ácido acetilsalicílico.
24
TABLA 12. Valores de parámetros de opacificación cristaliniana y vascularización
retiniana en el grupo de animales diabéticos no tratados de dos meses de
evolución.
Ratas Macho Ratas
Hembra
P
N 10 10
Cristalino dcho.( unidades orbitarias) 2.16 ± 0.13 1.75 ± 0.10 0.05
Cristalino izdo. ( unidades orbitarias) 2.07 ± 0.16 1.71 ± 0.15 0.05
Área retiniana ocupada por vasos
permeables a peroxidasa (%)
5.58 ± 0.31 9.04 ± 0.76 0.05
N.S.: diferencias no significativas.
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosismoderadamente bajas de ácido acetilsalicílico.
25
4. RESULTADOS CORRESPONDIENTES A LOS ANIMALES DEL GRUPO
DIABETICO NO TRATADO DE TRES MESES DE EVOLUCION.
4.1. RESULTADOS CORRESPONDIENTES A PARAMETROS GENERALES
En la Tabla 13 se muestran los valores medios ( media ± error estándar de
la media ) correspondientes a los pesos corporales (en gramos), niveles de
glucosa en sangre (mg / dL) y recuentos celulares sanguíneos: hematies (x 10 12 /
L), leucocitos (x 10 9 / L), hemoglobina (g / L), hematocrito (%), plaquetas (x 10 9 /
L) y volumen plaquetario (fl), en el momento del sacrificio, correspondientes a los
animales del grupo diabético no tratado de tres meses de evolución, diferenciando
los resultados obtenidos en las ratas macho de aquellos cuantificados en las
hembras.
En la Figura 13 se representan gráficamente los resultados anteriores.
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosismoderadamente bajas de ácido acetilsalicílico.
26
TABLA 13. Valores de parámetros de peso, glucemia y hematimetría en el grupo
de animales diabéticos no tratados de tres meses de evolución.
Ratas Macho Ratas Hembra P
N 10 10
Peso corporal (g) 298 ± 19.12 287 ± 21.14 N.S.
Glucemia (mg/dL) 455 ± 19.16 445 ± 16.38 N.S.
Hematies (×1012/L) 4.52 ± 0.37 4.20 ± 0.38 N.S.
Leucocitos (×109/L) 6.38 ± 0.41 6.50 ± 0.55 N.S.
Hemoglobina (g/L) 15.00 ± 0.87 14.71 ± 0.63 N.S.
Hematocrito (%) 48.32 ± 2.19 46.50 ± 4.86 N.S.
Plaquetas ( ×109/L) 594 ± 71.38 575 ± 68.14 N.S.
Volumen plaquetario ( fL) 5.16 ± 0.21 5.38 ± 0.26 N.S.
N.S.: diferencias no significativas.
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosismoderadamente bajas de ácido acetilsalicílico.
27
4.2. RESULTADOS CORRESPONDIENTES A PARAMETROS DE FUNCIÓN
PLAQUETARIA
En la Tabla 14 se muestran los valores medios ( media ± error estándar de
la media ) correspondientes a la intensidad máxima de agregación (ohms),
velocidad de agregación (ohms), tromboxano B2 (ng / mL), tromboxano B2
plaquetario (nmol / 109 plaq.) y prostaglandina I2 (pg / mg aorta), en el momento
del sacrificio, correspondientes a los animales del grupo diabético no tratado de
tres meses de evolución, diferenciando los resultados obtenidos en las ratas
macho de aquellos cuantificados en las hembras.
En la Figura 14 se representan gráficamente los resultados anteriores.
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosismoderadamente bajas de ácido acetilsalicílico.
28
TABLA 14. Valores de parámetros de función plaquetaria en el grupo de animales
diabéticos no tratados de tres meses de evolución.
Ratas Macho Ratas Hembra P
N 10 10
Imax. Agregación * ( ohms) 15.93 ± 1.85 16.03 ± 1.77 N.S.
Vel. Agregación * (ohms) 6.30 ± 0.41 6.05 ± 0.62 N.S.
TxB2 ( ng/mL) 110 ± 9.93 89.81 ± 9.94 0.05
TxB2 plaquetario (nmol/10 plaq.) 9.08 ± 0.79 9.80 ± 0.81 N.S.
PGI2** (pg/ mg aorta) 92.10 ± 7.20 128 ± 9.73 N.S.
N.S.: diferencias no significativas.
Imax. agregación: Intensidad máxima de agregación.
Vel. agregación: Velocidad de agregación.
*: Inducción con 10 µg/ mL de colágeno.
**: Inducción con 100 µmol/ L de ácido araquidónico.
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosismoderadamente bajas de ácido acetilsalicílico.
29
4.3. RESULTADOS CORRESPONDIENTES A LA PRODUCCION DE ÓXIDO
NITRICO
En la Tabla 15 se muestran los valores medios ( media ± error estándar de
la media ) correspondientes a óxido nítrico basal (µmol / mg aorta), óxido nítrico
inducido (µmol / mg aorta), nitrato plasmático (µmol / L) y nitrato aórtico (µmol / mg
aorta), en el momento del sacrificio, correspondientes a los animales del grupo
diabético no tratado de tres meses de evolución, diferenciando los resultados
obtenidos en las ratas macho de aquellos cuantificados en las hembras.
En la Figura 15 se representan gráficamente los resultados anteriores.
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosismoderadamente bajas de ácido acetilsalicílico.
30
TABLA 15. Valores relacionados con la producción de óxido nítrico en el grupo de
animales diabéticos no tratados de tres meses de evolución.
Ratas Macho Ratas Hembra P
N 10 10
NO basal (µmol/ mg aorta) 0.09 ± 0.01 0.17 ± 0.02 0.05
NOinducido*(µmol/mg aorta) 0.012 ± 0.001 0.10 ± 0.02 0.05
NO2- plasmático (µmol/L) 0.46 ± 0.03 0.38 ± 0.06 N.S.
NO2- aórtico*(µmol/mg aorta) 0.0038 ± 0.0008 0.0013 ± 0.0003 0.05
N.S.: diferencias no significativas.
*: inducción con 10 µmol/L de ionóforo de calcio.
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosismoderadamente bajas de ácido acetilsalicílico.
31
4.4. RESULTADOS CORRESPONDIENTES A PARAMETROS OCULARES
En la Tabla 16 se muestran los valores medios ( media ± error estándar de
la media ) correspondientes al grado de opacificación de los cristalinos y
porcentaje de área retiniana ocupada por vasos sanguíneos marcados en su
interior con peroxidasa, en el momento del sacrificio, correspondientes a los
animales del grupo diabético no tratado de tres meses de evolución, diferenciando
los resultados obtenidos en las ratas macho de aquellos cuantificados en las
hembras.
En la Figura 16 se representan gráficamente los resultados anteriores.
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosismoderadamente bajas de ácido acetilsalicílico.
32
TABLA 16. Valores de parámetros de opacificación cristaliniana y vascularización
retiniana en el grupo de animales diabéticos no tratados de tres meses de
evolución.
Ratas Macho Ratas
Hembra
P
N 10 10
Cristalino dcho.( unidades orbitarias) 3.98 ± 0.21 3.50 ± 0.20 N.S.
Cristalino izdo. ( unidades orbitarias) 3.96 ± 0.23 3.45 ± 0.19 N.S.
Área retiniana ocupada por vasos
permeables a peroxidasa (%)
2.03 ± 0.13 4.36 ± 0.19 0.05
N.S.: diferencias no significativas.
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosismoderadamente bajas de ácido acetilsalicílico.
33
5. RESULTADOS CORRESPONDIENTES A LOS ANIMALES DEL GRUPO
DIABETICO TRATADO CON ASA DE UN MES DE EVOLUCION.
5.1. RESULTADOS CORRESPONDIENTES A PARAMETROS GENERALES
En la Tabla 17 se muestran los valores medios ( media ± error estándar de
la media ) correspondientes a los pesos corporales (en gramos), niveles de
glucosa en sangre (mg / dL) y recuentos celulares sanguíneos: hematies (x 10 12 /
L), leucocitos (x 10 9 / L), hemoglobina (g / L), hematocrito (%), plaquetas (x 10 9 /
L) y volumen plaquetario (fl), en el momento del sacrificio, correspondientes a los
animales del grupo diabético tratado con ASA de un mes de evolución,
diferenciando los resultados obtenidos en las ratas macho de aquellos
cuantificados en las hembras.
En la Figura 17 se representan gráficamente los resultados anteriores.
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosismoderadamente bajas de ácido acetilsalicílico.
34
TABLA 17. Valores de parámetros de peso, glucemia y hematimetría en el grupo
de animales diabéticos tratados con ASA de un mes de evolución.
Ratas Macho Ratas Hembra P
N 10 10
Peso corporal (g) 331 ± 28.49 320 ± 7.22 N.S.
Glucemia (mg/dL) 469 ± 18.47 494 ± 14.51 N.S.
Hematies (×1012/L) 4.51 ± 0.12 4.27 ± 0.16 N.S.
Leucocitos (×109/L) 5.78 ± 0.80 5.33 ± 0.73 N.S.
Hemoglobina (g/L) 14.64 ± 0.39 14.85 ± 0.48 N.S.
Hematocrito (%) 49.46 ± 1.68 48.50 ± 1.16 N.S.
Plaquetas ( ×109/L) 743 ± 72.61 708 ± 49.52 N.S.
Volumen plaquetario ( fL) 5.23 ± 0.10 5.46 ± 0.09 N.S.
N.S.: diferencias no significativas.
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosismoderadamente bajas de ácido acetilsalicílico.
35
5.2. RESULTADOS CORRESPONDIENTES A PARAMETROS DE FUNCIÓN
PLAQUETARIA
En la Tabla 18 se muestran los valores medios ( media ± error estándar de
la media ) correspondientes a la intensidad máxima de agregación (ohms),
velocidad de agregación (ohms), tromboxano B2 (ng / mL), tromboxano B2
plaquetario (nmol / 109 plaq.) y prostaglandina I2 (pg / mg aorta), en el momento
del sacrificio, correspondientes a los animales del grupo diabético tratado con ASA
de un mes de evolución, diferenciando los resultados obtenidos en las ratas
macho de aquellos cuantificados en las hembras.
En la Figura 18 se representan gráficamente los resultados anteriores.
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosismoderadamente bajas de ácido acetilsalicílico.
36
TABLA 18. Valores de parámetros de función plaquetaria en el grupo de animales
diabéticos tratados con ASA de un mes de evolución.
Ratas Macho Ratas Hembra P
N 10 10
Imax. Agregación * ( ohms) 0 ± 0 0 ± 0 N.S.
Vel. Agregación * (ohms) 0 ± 0 0 ± 0 N.S.
TxB2 ( ng/mL) 7.61 ± 0.82 20.86 ± 1.75 0.05
TxB2 plaquetario (nmol/10 plaq.) 0.25 ± 0.04 0.54 ± 0.07 0.05
PGI2** (pg/ mg aorta) 38.10 ± 2.93 36.99 ± 2.14 N.S.
N.S.: diferencias no significativas.
Imax. agregación: intensidad máxima de agregación.
Vel. agregación: velocidad de agregación.
*: inducción con 10 µg/ mL de colágeno.
**: inducción con 100 µmol/L de ácido araquidónico.
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosismoderadamente bajas de ácido acetilsalicílico.
37
5.3. RESULTADOS CORRESPONDIENTES A LA PRODUCCION DE ÓXIDO
NITRICO
En la Tabla 19 se muestran los valores medios ( media ± error estándar de
la media ) correspondientes a óxido nítrico basal (µmol / mg aorta), óxido nítrico
inducido (µmol / mg aorta), nitrato plasmático (µmol / L) y nitrato aórtico (µmol / mg
aorta), en el momento del sacrificio, correspondientes a los animales del grupo
diabético tratado con ASA de un mes de evolución, diferenciando los resultados
obtenidos en las ratas macho de aquellos cuantificados en las hembras.
En la Figura 19 se representan gráficamente los resultados anteriores.
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosismoderadamente bajas de ácido acetilsalicílico.
38
TABLA 19. Valores relacionados con la producción de óxido nítrico en el grupo de
animales diabéticos tratados con ASA de un mes de evolución.
Ratas Macho Ratas Hembra P
N 10 10
NO basal (µmol/ mg aorta) 0.41 ± 0.019 0.32 ± 0.04 N.S.
NOinducido*(µmol/mg aorta) 1.16 ± 0.10 0.23 ± 0.04 0.05
NO2- plasmático (µmol/L) 2.12 ± 0.19 2.32 ± 0.21 N.S.
NO2- aórtico*(µmol/mg aorta) 0.015 ± 0.002 0.011 ± 0.003 N.S.
N.S.: diferencias no significativas.
*: inducción con 10 µmol/L de ionóforo de calcio.
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosismoderadamente bajas de ácido acetilsalicílico.
39
5.4. RESULTADOS CORRESPONDIENTES A PARAMETROS OCULARES
En la Tabla 20 se muestran los valores medios ( media ± error estándar de
la media ) correspondientes al grado de opacificación de los cristalinos y
porcentaje de área retiniana ocupada por vasos sanguíneos marcados en su
interior con peroxidasa, en el momento del sacrificio, correspondientes a los
animales del grupo diabético tratado con ASA de un mes de evolución,
diferenciando los resultados obtenidos en las ratas macho de aquellos
cuantificados en las hembras.
En la Figura 20 se representan gráficamente los resultados anteriores.
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosismoderadamente bajas de ácido acetilsalicílico.
40
TABLA 20. Valores de parámetros de opacificación cristaliniana y vascularización
retiniana en el grupo de animales diabétcios tratados con ASA de un mes de
evolución.
Ratas Macho Ratas Hembra P
N 10 10
Cristalino dcho.( unidades orbitarias) 0.77 ± 0.09 0.78 ± 0.09 N.S.
Cristalino izdo. ( unidades orbitarias) 0.76 ± 0.08 0.78 ± 0.09 N.S.
Área retiniana ocupada por vasos
permeables a peroxidasa (%)
13.70 ± 0.99 12.28 ± 1.09 N.S.
N.S.: diferencias no significativas.
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosismoderadamente bajas de ácido acetilsalicílico.
41
6. RESULTADOS CORRESPONDIENTES A LOS ANIMALES DEL GRUPO
DIABETICO TRATADO CON ASA DE DOS MESES DE EVOLUCION.
6.1. RESULTADOS CORRESPONDIENTES A PARAMETROS GENERALES
En la Tabla 21 se muestran los valores medios ( media ± error estándar de
la media ) correspondientes a los pesos corporales (en gramos), niveles de
glucosa en sangre (mg / dL) y recuentos celulares sanguíneos: hematies (x 10 12 /
L), leucocitos (x 10 9 / L), hemoglobina (g / L), hematocrito (%), plaquetas (x 10 9 /
L) y volumen plaquetario (fl), en el momento del sacrificio, correspondientes a los
animales del grupo diabético tratado con ASA de dos meses de evolución,
diferenciando los resultados obtenidos en las ratas macho de aquellos
cuantificados en las hembras.
En la Figura 21 se representan gráficamente los resultados anteriores.
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosismoderadamente bajas de ácido acetilsalicílico.
42
TABLA 21. Valores de parámetros de peso, glucemia y hematimetría en el grupo
de animales diabéticos tratados con ASA de dos meses de evolución.
Ratas Macho Ratas Hembra P
N 10 10
Peso corporal (g) 344 ± 22.80 348 ± 9.15 N.S.
Glucemia (mg/dL) 468 ± 16.09 430 ± 23.11 N.S.
Hematies (×1012/L) 4.80 ± 0.20 4.68 ± 0.38 N.S.
Leucocitos (×109/L) 6.69 ± 0.60 6.29 ± 0.71 N.S.
Hemoglobina (g/L) 15.60 ± 0.60 15.91 ± 0.39 N.S.
Hematocrito (%) 53.08 ± 2.03 49.67 ± 2.00 N.S.
Plaquetas ( ×109/L) 722 ± 79.68 748 ± 89.66 N.S.
Volumen plaquetario ( fL) 5.83 ± 0.33 5.95 ± 0.32 N.S.
N.S.: diferencias no significativas.
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosismoderadamente bajas de ácido acetilsalicílico.
43
6.2. RESULTADOS CORRESPONDIENTES A PARAMETROS DE FUNCIÓN
PLAQUETARIA
En la Tabla 22 se muestran los valores medios ( media ± error estándar de
la media ) correspondientes a la intensidad máxima de agregación (ohms),
velocidad de agregación (ohms), tromboxano B2 (ng / mL), tromboxano B2
plaquetario (nmol / 109 plaq.) y prostaglandina I2 (pg / mg aorta), en el momento
del sacrificio, correspondientes a los animales del grupo diabético tratado con ASA
de dos meses de evolución, diferenciando los resultados obtenidos en las ratas
macho de aquellos cuantificados en las hembras.
En la Figura 22 se representan gráficamente los resultados anteriores.
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosismoderadamente bajas de ácido acetilsalicílico.
44
TABLA 22. Valores de parámetros de función plaquetaria en el grupo de animales
diabéticos tratados con ASA de dos meses de evolución.
Ratas Macho Ratas Hembra P
N 10 10
Imax. Agregación * ( ohms) 0 ± 0 0 ± 0 N.S.
Vel. Agregación * (ohms) 0 ± 0 0 ± 0 N.S.
TxB2 ( ng/mL) 7.07 ± 0.83 21.12 ± 1.76 0.05
TxB2 plaquetario (nmol/10 plaq.) 0.31 ± 0.02 0.52 ± 0.06 0.05
PGI2** (pg/ mg aorta) 39.72 ± 3.90 35.14 ± 6.12 N.S.
N.S.: diferencias no significativas.
Imax. agregación: intensidad máxima de agregación.
Vel. agregación: velocidad de agregación.
*: inducción con 10 µg/ mL de colágeno.
**: inducción con 100 µmol/L de ácido araquidónico.
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosismoderadamente bajas de ácido acetilsalicílico.
45
6.3. RESULTADOS CORRESPONDIENTES A LA PRODUCCION DE ÓXIDO
NITRICO
En la Tabla 23 se muestran los valores medios ( media ± error estándar de
la media ) correspondientes a óxido nítrico basal (µmol / mg aorta), óxido nítrico
inducido (µmol / mg aorta), nitrato plasmático (µmol / L) y nitrato aórtico (µmol / mg
aorta), en el momento del sacrificio, correspondientes a los animales del grupo
diabético tratado con ASA de dos meses de evolución, diferenciando los
resultados obtenidos en las ratas macho de aquellos cuantificados en las
hembras.
En la Figura 23 se representan gráficamente los resultados anteriores.
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosismoderadamente bajas de ácido acetilsalicílico.
46
TABLA 23. Valores relacionados con la producción de óxido nítrico en el grupo de
animales diabéticos tratados con ASA de dos meses de evolución.
Ratas Macho Ratas Hembra P
N 10 10
NO basal (µmol/ mg aorta) 0.45 ± 0.014 0.31 ± 0.04 0.05
NOinducido*(µmol/mg aorta) 1.01 ± 0.15 1.10 ± 0.12 0.05
NO2- plasmático (µmol/L) 3.33 ± 0.25 2.32 ± 0.17 0.05
NO2- aórtico*(µmol/mg aorta) 0.01 ± 0.003 0.011 ± 0.003 N.S.
N.S.: diferencias no significativas.
*: inducción con 10 µmol/L de ionóforo de calcio.
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosismoderadamente bajas de ácido acetilsalicílico.
47
6.4. RESULTADOS CORRESPONDIENTES A PARAMETROS OCULARES
En la Tabla 24 se muestran los valores medios ( media ± error estándar de
la media ) correspondientes al grado de opacificación de los cristalinos y
porcentaje de área retiniana ocupada por vasos sanguíneos marcados en su
interior con peroxidasa, en el momento del sacrificio, correspondientes a los
animales del grupo diabético tratado con ASA de dos meses de evolución,
diferenciando los resultados obtenidos en las ratas macho de aquellos
cuantificados en las hembras.
En la Figura 24 se representan gráficamente los resultados anteriores.
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosismoderadamente bajas de ácido acetilsalicílico.
48
TABLA 24. Valores de parámetros de opacificación cristaliniana y vascularización
retiniana en el grupo de animales diabéticos tratados con ASA de dos meses de
evolución.
Ratas Macho Ratas
Hembra
P
N 10 10
Cristalino dcho.( unidades orbitarias) 1.28 ± 0.13 1.17 ± 0.14 N.S.
Cristalino izdo. ( unidades orbitarias) 1.35 ± 0.15 1.10 ± 0.12 N.S.
Área retiniana ocupada por vasos
permeables a peroxidasa (%)
10.85 ± 0.93 11.11 ± 0.87 N.S.
N.S.: diferencias no significativas.
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosismoderadamente bajas de ácido acetilsalicílico.
49
7. RESULTADOS CORRESPONDIENTES A LOS ANIMALES DEL GRUPO
DIABETICO TRATADO CON ASA DE TRES MESES DE EVOLUCION.
7.1. RESULTADOS CORRESPONDIENTES A PARAMETROS GENERALES
En la Tabla 25 se muestran los valores medios ( media ± error estándar de
la media ) correspondientes a los pesos corporales (en gramos), niveles de
glucosa en sangre (mg / dL) y recuentos celulares sanguíneos: hematies (x 10 12 /
L), leucocitos (x 10 9 / L), hemoglobina (g / L), hematocrito (%), plaquetas (x 10 9 /
L) y volumen plaquetario (fl), en el momento del sacrificio, correspondientes a los
animales del grupo diabético tratado con ASA de tres meses de evolución,
diferenciando los resultados obtenidos en las ratas macho de aquellos
cuantificados en las hembras.
En la Figura 25 se representan gráficamente los resultados anteriores.
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosismoderadamente bajas de ácido acetilsalicílico.
50
TABLA 25. Valores de parámetros de peso, glucemia y hematimetría en el grupo
de animales diabéticos tratados con ASA de tres meses de evolución.
Ratas Macho Ratas Hembra P
Peso corporal 332 ± 14.28 345 ± 9.80 N.S.
Glucemia 485 ± 1025 471 ± 22.17 N.S.
Hematies 4.68 ± 0.13 4.21 ± 0.11 N.S.
Leucocitos 6.75 ± 0.45 7.22 ± 0.61 N.S.
Hemoglobina 15.63 ± 0.49 14.77 ± 0.42 N.S.
Hematocrito 50.11 ± 1.40 47.23 ± 1.17 N.S.
Plaquetas 733 ± 92.82 770 ± 87.75 N.S.
Volumen plaquetario 5.95 ± 0.49 6.10 ± 0.50 N.S.
N.S.: diferencias no significativas.
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosismoderadamente bajas de ácido acetilsalicílico.
51
7.2. RESULTADOS CORRESPONDIENTES A PARAMETROS DE FUNCIÓN
PLAQUETARIA
En la Tabla 26 se muestran los valores medios ( media ± error estándar de
la media ) correspondientes a la intensidad máxima de agregación (ohms),
velocidad de agregación (ohms), tromboxano B2 (ng / mL), tromboxano B2
plaquetario (nmol / 109 plaq.) y prostaglandina I2 (pg / mg aorta), en el momento
del sacrificio, correspondientes a los animales del grupo diabético tratado con ASA
de tres meses de evolución, diferenciando los resultados obtenidos en las ratas
macho de aquellos cuantificados en las hembras.
En la Figura 26 se representan gráficamente los resultados anteriores.
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosismoderadamente bajas de ácido acetilsalicílico.
52
TABLA 26. Valores de parámetros de función plaquetaria en el grupo de animales
diabéticos tratados con ASA de tres meses de evolución.
Ratas Macho Ratas Hembra P
N 10 10
Imax. Agregación * ( ohms) 0 ± 0 0 ± 0 N.S.
Vel. Agregación * (ohms) 0 ± 0 0 ± 0 N.S.
TxB2 ( ng/mL) 4.60 ± 0.52 18.13 ± 1.68 0.05
TxB2 plaquetario (nmol/10 plaq.) 0.30 ± 0.04 0.40 ± 0.06 0.05
PGI2** (pg/ mg aorta) 25.86 ± 1.77 30.12 ± 3.21 N.S.
N.S.: diferencias no significativas.
Imax. agregación: intensidad máxima de agregación.
Vel. agregación: velocidad de agregación.
*: inducción con 10 µg/ mL de colágeno.
**: inducción con 100 µmol/L de ácido araquidónico.
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosismoderadamente bajas de ácido acetilsalicílico.
53
7.3. RESULTADOS CORRESPONDIENTES A LA PRODUCCION DE ÓXIDO
NITRICO
En la Tabla 27 se muestran los valores medios ( media ± error estándar de
la media ) correspondientes a óxido nítrico basal (µmol / mg aorta), óxido nítrico
inducido (µmol / mg aorta), nitrato plasmático (µmol / L) y nitrato aórtico (µmol / mg
aorta), en el momento del sacrificio, correspondientes a los animales del grupo
diabético tratado con ASA de tres meses de evolución, diferenciando los
resultados obtenidos en las ratas macho de aquellos cuantificados en las
hembras.
En la Figura 27 se representan gráficamente los resultados anteriores.
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosismoderadamente bajas de ácido acetilsalicílico.
54
TABLA 27. Valores relacionados con la producción de óxido nítrico en el grupo de
animales diabéticos tratados con ASA de tres meses de evolución.
Ratas Macho Ratas Hembra P
N 10 10
NO basal (µmol/ mg aorta) 0.75 ± 0.048 0.55 ± 0.03 0.05
NOinducido*(µmol/mg aorta) 1.16 ± 0.12 0.21 ± 0.04 0.05
NO2- plasmático (µmol/L) 4.85 ± 0.34 5.00 ± 0.47 N.S.
NO2- aórtico*(µmol/mg aorta) 0.031 ± 0.004 0.021 ± 0.003 N.S.
N.S.: diferencias no significativas.
*: inducción con 10 µmol/L de ionóforo de calcio.
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosismoderadamente bajas de ácido acetilsalicílico.
55
7.4. RESULTADOS CORRESPONDIENTES A PARAMETROS OCULARES
En la Tabla 28 se muestran los valores medios ( media ± error estándar de
la media ) correspondientes al grado de opacificación de los cristalinos y
porcentaje de área retiniana ocupada por vasos sanguíneos marcados en su
interior con peroxidasa, en el momento del sacrificio, correspondientes a los
animales del grupo diabético tratado con ASA de tres meses de evolución,
diferenciando los resultados obtenidos en las ratas macho de aquellos
cuantificados en las hembras.
En la Figura 28 se representan gráficamente los resultados anteriores.
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosismoderadamente bajas de ácido acetilsalicílico.
56
TABLA 28. Valores de parámetros de opacificación cristaliniana y vascularización
retiniana en el grupo de animales diabéticos tratados con ASA de tres meses de
evolución.
Ratas Macho Ratas Hembra P
N 10 10
Cristalino dcho.( unidades orbitarias) 2.76 ± 0.25 1.95 ± 0.15 0.05
Cristalino izdo. ( unidades orbitarias) 2.76 ± 0.17 1.94 ± 0.19 0.05
Área retiniana ocupada por vasos
permeables a peroxidasa (%)
7.38 ± 0.55 7.56 ± 0.60 N.S.
N.S.: diferencias no significativas.
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosismoderadamente bajas de ácido acetilsalicílico.
57
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosis moderadamente bajasde ácido acetilsalicílico.
1
DISCUSIÓN
En las figuras 16-17 observamos la intensidad máxima y velocidad de
agregación en lo animales diabéticos sin tratamiento antiagregante respecto a los
controles no diabéticos. Hay un claro comportamiento hiperactivo de las plaquetas
ante estímulos agregatorios en los animales diabéticos, respecto a los no diabéticos,
es decir, las plaquetas de las ratas diabéticas están más dispuestas a agregarse
ante estímulos que en los animales no diabéticos .
En la figura 18 observamos las tasas de tromboxano B2 a lo largo de los
periodos de diabetes experimental. Apreciamos que la producción plaquetaria de
tromboxano va incrementándose progresivamente a medida que el tiempo de
evolución de la diabetes es mayor, hasta el punto de establecerse una correlación
lineal significativa entre ambos parámentos.
En la figura 19 podemos observar las tasas de 6-keto-PGF1 como índice de
producción de prostaciclina vascular, apreciándose que la actividad prostaciclin-
sintetasa endotelial está francamente disminuida en los animales diabéticos respecto
a los controles no diabéticos. En trabajos previos a nuestro grupo se demostró que
incluso disminuyéndose desde los 15 días de evolución, prácticamente a la mitad de
los valores no diabéticos.
Respecto a la producción de NO, en las figuras 20 y 21 podemos observar
que los animales diabéticos presentan una clara menor produccion vascular de NO,
así como una ostensible menor producción vascular del mismo ante un estímulo de
la NO-sintasa constitutiva. Igualmente, si valoramos la producción de NO en
conjunto (vascular y leucocitaria), observamos un descenso en la misma respecto a
los animales no diabéticos, en cualquier tiempo de evolución.
Nos encontramos un modelo con una clara hiperactivación plaquetaria y clara
disfunción endotelial, lo cual coincide con diversos trabajos de la literatura.
¿Realmente podría originar una alteración vascular? Efectivamente:
En la figura 24 se observa el prcentaje de retina ocupada por vasos marcados
con peroxidasa, apreciándose que éste disminuye progresivamente a medidia que
avanza el tiempo de evolución de la diabetes.La disminuciòn de este parámentro nos
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosis moderadamente bajasde ácido acetilsalicílico.
2
indica que la sustancia marcadora ve dificultado su paso a través de los vaos
retinianos. Este parámetro se apoya en la valoración cualitativa de las imágenes
retinianas, las cuales se caracterizan por estrecheces, interrupción de paso de la
sustancia marcadora y tortuosidades:
• En los animales diabéticos sin tratamiento antiagregante
plaquetario, vemos un “estado protrombótico”, este estado general
indica que la hemostasia primaria de estos animales está más
dispuesta a ser activada que en los animales no diabéticos.
Nuestro trabajo aporta que además del desequilibrio
tromboxano/prostaciclina, el déficit de NO podría desequilibrar aún más la
balanza, ya que completaria la disfunción endotelial antes comentada con la
diabetes.
• Respecto a los efectos observados tras la administración de AAS,
éstos son los esperados según su mecanismo de acción: (-) de la
agregabilidad plaquetaria, reducción en la producción de
tromboxano plaquetario y una menor reduccíón en la producción de
prostaciclina. En términos generales podemos apreciar que la
síntesis de prostaciclina se inhibe en menor proporción que la de
tromboxano, lo cual coincide con un perfil de “dosis moderadamente
baja” de AAS (que en el ser humano equivaldría aproximadamente
a la toma de 150 mg/día). El efecto del AAS sobre el equilibrio
tromboxano/prostaciclina podemos resumirlo a través del
denominado índice trombogénico (TxB2/ 6-Keto_PGF1),
denominado así por Moncada (diapos). Podemos observar que los
animales diabéticos presentan valores claramente más elevados
que los no diabéticos y que la administración de AAS acerca
bastante este equilibrio a los valores de los aimales sanos.
Un aspecto que creemos importante en nuestro trabajo es la relación entre
diabetes experimental y producción de NO, así como la influencia de AAS.En
nuestro modelo experimental, la producción vascular de NO, que estaba
disminuida por la diabetes, se incrementa en los animales tratados con AAS.
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosis moderadamente bajasde ácido acetilsalicílico.
3
Tras un mes aumenta un 82.5 %, a los dos meses un 210% y a los tres
meses un 400%, considerando a los animales en su conjunto. Este
incremento en la cantidad de NO arterial se acompaña de un incremento en la
capacidad de síntesis del mismo ante un estímulo de la NO-sintasa
constitutiva (esta actividad se incrementa 10-12 veces).
La relación emtre AAS y NO fue aventurada de forma indirecta por
nuestro grupo, al comprobar que su efecto antiagregante plaquetario se
incrementaba en presencia de neutrófilos. Recientemente hemos demostrado
que AAS estimula la liberación de NO por neutrófilos, medido de forma
directa, así como facilita que éste incremente significativamente las tasas de
GMPc intraplaquetario. (esquema Encarni). Efectivamente, el prcentaje de
retina ocupada por vasos permeables a la peroxidasa se incrementa en los
animales diabéticos tratados con AAS, de tal forma que tras un mes de
seguimiento el procentaje de retina ocupada por vasos permables a la
peroxidasa se incrementa en un 14%, tras dos meses un 50% y tras tres
meses en un 132%.
Para valorar la importancia de la dosis de AAS utilizada,comparamos
nuestros resultados con estudios anteriores y vemos que los resultados
obtenidos con dosis bajas son proporcionalmente mejores que con dosis altas
de AAS, hecho que confirma toda la teoría planteada alrededor de la dosis de
este fármaco, al menos a nivel de vascularización retiniana y en nuestro
modelo experimental.
En resumen podemos decir que el AAS ejerce un efecto
beneficioso sobre los dos mecanismos bioquímicos estudiados (síntesis de
eicosanoides y producción de NO)(esquema), los cuales se presentan
claramente alterados en nuestro modelo experimental de diabetes.Estaqs
mismas alteracones han sido demostradas en el ser humano, ralacionándose
con la aparición de retinopatía diabetica. Asimismo, la administración de AAS
a enfermos diabéticos modifica la evolución de esta enfermedad, si bien los
datos disponibles hastaa esta momento son variables debido a que se
diseñaron con dosis francamente altas de AAS (900 mg/Kg/día).
C) El segundo de nuesros objetivos era la valoración de un posible
efecto diferencial de AAS según el sexo del animal de
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosis moderadamente bajasde ácido acetilsalicílico.
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experimentación. Es un hecho conocido en clínica humana que las
mujeres presnetan una menor incidencia de enfermedades
cardiovasculares, pero cuando acontence en ellas, la mortalidad
inmediata es mayor entre otros factores por los farmacológicos..En
este caso, lo más representativo es la menor respuesta
antitrombótica del AAS en la mujer, sobre todo en cuanto a
prevención de accidentes vasculares cerebrales. Se ha demostrado
que la inhibición de la agregación palquetaria es menor en mujeres
que en hombres, es decir ,las plaquertas de las mujeres responden
menos al efecto del AAS que la de los hombres. Los niveles de
testosterona y estrógenos pueden influir Esta presencia hormonal
parece condicionar la síntesis de eicosanoides, ya que en la fase
estrogénica del ciclo es cuando menos tromboxano y más
prostaciclina presentan las mujeres.
En nuestro estudio en los animales no diabéticos no apreciamos
diferencias sexuales en cuanto a la agregabilidad plaquetaria.La
administracion de AAS bloquea totalmente la agregación plaquetaria por lo
que no podemos determinar posibles diferencias sexuales a este nivel. Sin
embargo, al analizar el metabolismo eicosanoide, apreciamos diferencias
entre sexos. En los animales no diabéticos existe una menor tasa de
tromboxano plaquetario y una mayor producción de prostaciclian aórtica, lo
cual origina que el denominado índice trombogénico es mayor en los animales
machos(tabla). Por otra parte, al cuantificar el desequilibrio eicosaniode que
acontece en la diabetes experimental, observamos las siguientes
diferencias(diapos pag 209).Respecto al tratamiento con AAS observamos los
siguientes cambios tras su administración a los animales diabéticos (diapos
pag. 210).Es decir, los factores perotrombóticos (tromboxano) se inhibe más
por AAS en las ratas machos y los antitrombóticos (prostaciclina) se reducen
más por AAS en las ratas hembras, por lo que el índice trombogénico se
reduce en mayor medida en el sexo macho.. Respecto a la producción de
óxido nítrico, en condiciones basales y en los animales no diabéticos, las
ratas hembras producen menos que las del sexo macho, aunque no sean
diferencias muy marcadas enb términos proporcionales. En cuanto a la
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reactividad de la NO-sintasa constitutiva, las ratas hembras producen un
significativo menor incremento de la síntesis de NO que los machos, lo cual
coincide con la hipótesis planteada por McCulloch y Randall, según los cuales
la producción de NO es menos importante para mantener la reactividad
vascular en los animales de sexo hembra que en los machos. El déficit
observado en los animales diableticos, a nivel de NO es el siguiente(diapos
pag 212)En este caso no parecen existir grandes diferencias entre sexos, en
cuanto al déficit de NO producido por la diabetes. El cpmportamiento del AAS,
que recordemos consistía en incrementar la producción de NO en nuestro
modelo experimental, es el sigruiente por sexos(diapos pag. 213). En este
sentido, la administración de AAS a ratas diabéticas, incrementa en mayor
proporción la producción de NO aórtico en los animales de sexo macho, si
bien la tasa total de nitritos plasmátciso, en proporción, se incrementa más en
las ratas hembras.Posiblemente, al reducirse más la tasa de nitritos en las
hembras diabétcias que en los machos, la preoporción de incremento sea
mayor, a pesar de que, en términos absolutos, los niveles de producción de
NO sean menores en los animales de sexo hembra. Por lo tanto, las ratas
hembra presentan un mayor daño en la balanza T/P y una menor respuesta
benefficiosa tras el tratamiento con AAS, así como una menor respuesta
vascular a la prodcuccion de NO por parte del AAS. Estos efectos deberían
originar unas diferencias en la vascularización retiniana. Los cambios
observados en las tasas de vascularización según el sexo (diapos pag. 214):
Es decir, el sexo no parece ser un factor condicionannete de una menor tasa
de vascularización retiniana en nuestro modelo esperimental, pero sí para la
respuesta ante la administración de AAS, que las ratas hembras mejoraron
su vascularización retiniana en menor proporción que los machos, siempre en
términos relativos. Pero no hay que olvidar que estas diferencias a pesar de
ser estadísticamente significativas, siguen estando en un margen de
vascularización muy escaso que no supera el 5% por lo que pensamos que
aunque las diferencias pueden ser estadísticamente significativas en la
diferencia de comportamiento, no es funcionalmente relevante.
Por último comentar los resultados observados a nivel de las
cristalinos de los animales diabéticos En los animales diabéticos existe un
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosis moderadamente bajasde ácido acetilsalicílico.
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grado de opacificación que aumenta con el tiempo de evolución En términos
generales la administración de AAS reduce la opacificación en todos los
grupos de estudio, con los siguientes porcentajes (diapos pag. 216). En este
parámetro no encontramos diferencias significativas entre sexos, lo cual
valida aún más los datos encontrados a nivel de los parámetros bioquímicos
antes comentados ya que la formación de cataratas se produce por un
mecanismo totalmente distinto a los anteriores. Buscando correlaciones,
habvlaremos de la que se produce entre esta y la vascularización retiniana
por la fórmula pag. 217) --------, es decir, cuanto mayor sea el grado de
vascularización, menor es el de opacificación. Esta relación marca una
interacción plaqueta-cristalino que es difícil de explicar. A pesar de demostrar
diferencias estadísticas en el comportamiento vascular retiniano no creemos
que sean suficientes, desde un punto de vista cuantitativo, como para
planterar un tratamiento medicamentoso diferente en mujeres diabétcias, a fin
de establecer una profilaxis de la retinopatia diabetica. No obstante, el
diferente comportamiento bioquímico ante el tratamiento con AAS en las ratas
hembras, abre vías de estudio en relación a la influencia que estas diferencizs
pudieran tener a nivel de la macroangiopatía dfiabética, en todas sus
acepciones.
Nosotros aportamos la relación AAS/NO/ Retinopatía y confirmamos un
hecho práctico clínico diario; aunque estadísticamente se pueda diferenciar el
comportamiento plaqueto-retiniano entre hombre y mujer, a la hora de abordar
una profilaxis farmacológica no parece necesario hacer una diferencia entre
ambos sexos.
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1
Del análisis pormenorizado de los resultados obtenidos en el presente
estudio, hemos extraído las siguientes conclusiones:
1. En el modelo de diabetes experimental utilizado en nuestro estucio, se produce
un incremento tiempo-dependiente de la agregabilidad plaquetaria en sangre
total inducida con colágeno, así como un desequilibrio del metabolismo
eicosanoide, en el sentido de un incremento tiempo-dependiente en la síntesis
plaquetaria de tromboxano y una disminución en la síntesis vascular de
prostaciclina, por lo que se produce un claro incremento del índice trombogénico.
2. La producción vascular de óxido nítrico se reduce drásticamente desde el primer
mes de evolución de la diabetes, tanto en la cantidad formada in vivo como en la
capacidad de síntesis de óxido nítrico a través de la NO-sintasa constitutiva.
3. La vascularización retiniana disminuye progresivamente con el tiempo de
evolución de la diabetes experimental, siendo máximas las diferencias a los tres
meses.
4. En el modelo experimental utilizado se produce una opacificación cristaliniana
que se incrementa con el tiempo de evolución, siendo prácticamente máxima a
los tres meses de diabetes.
5. La administración oral de 2 mg/Kg/día de ácido acetilsalicílico anula la
agregación plaquetaria en sangre total inducida con colágeno. La síntesis
plaquetaria de tromboxano se inhibe en un 70-80 % y la vascular de prostaciclina
en un 15-40%, por lo que el índice trombogénico se reduce un máximo de un
87%.
6. La administración oral de ácido acetilsalicílico incrementa la producción vascular
de óxido nítrico, así como la capacidad arterial de síntesis tras estimulación de la
forma constitutiva de la NO-sintasa, en los animales diabéticos.
7. Los defectos de vascularización retinianas acaecidos en el modelo experimental
de diabetes, disminuyen significativamente tras la administración de ácido
acetilsalicílico, frenándose la reducción progresiva de vasos retinianos
permeables.
8. La opacificación cristaliniana debida a la diabetes experimental, se reduce
significativamente, sobre todo a los tres meses de evolución de la enfermedad.
9. Los animales no diabéticos de sexo hembra, presentan una menor producción
plaquetaria de trombozano y una mayor síntesis vascular de prostaciclina, por lo
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosis moderadamente bajasde ácido acetilsalicílico.
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que el índice trombogénico es favorable para este sexo. La diabetes
experimental, en el sexo hembra, produce un incremento significativamente
mayor del indice trombogénico, respecto a los animales machos.
10. La administración de ácido acetilsalicílico ejerce un efecto inhibidor de la síntesis
de tromboxano plaquetario que es mayor en ratas machos que en hembras, por
lo que la reducción del índice trombogénico es favorable para los animales
machos.
11. La producción de óxido nítrico y la capacidad de síntesis ante un estímulo de la
NO-sintasa costitutiva, en ratas hembras no diabéticas es menor que en los
animales machos.
12. La inhibición de la producción vascular de óxido nítrico acaecida en la diabetes
experimental es similar en ambos sexos.
13. El efecto incrementador de la producción de óxido nítrico es significativamente
mayor en los animales diabéticos machos que en las hembras.
14. Los defectos en la vascularización retiniana en la diabetes experimental no
muestran una clara tendencia diferencial entre sexos, si bien el efecto preventivo
del ácido acetilsalicílico a este nivel es significativamente mayor en los animales
machos.
Isabel María Arranz Salas./ Prevención de la Retinopatía diabética experimental con dosis moderadamente bajasde ácido acetilsalicílico.
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