A modern endokrin diagnosztika alapjai és perspektívái

KovKováács L. Gcs L. Gááborbor

PPéécsi Tudomcsi Tudomáányegyetemnyegyetem

ÁÁOK LaboratOK Laboratóóriumi Medicina Intriumi Medicina Intéézetezeteééss

ETK Diagnosztikai ETK Diagnosztikai éés Menedzsment s Menedzsment IntIntéézetezete

Az elmúlt 50 év endokrin Nobel díjasai

1958: F Sanger

1966: CB Huggins

1971: EW Sutherland

1977: RS Yalow, RL Guillemin, AV Schally

1984: GJF Köhler

1992: EH Fisher, EG Krebs

1994: AG Gilman, M Rodbell

1998: RF Furchgott

2003: P Agre R MacKinnon

• Az inzulin szerkezete

• Prosztata rák hormonkezelése

• Hormonhatás mechanizmusa

• RIA, releasing hormonok

• Monoclonalis antitestek

• Proteinkinázok

• G proteinek

• NO

• vízcsatornák

Hormontermelés:”klasszikus” mirigyek

Hypothalamus:•GHRH, CRH, TRH, GnRH•Szomatosztatin•ADH

Hypophysis:•GH•Prolactin•ACTH, MSH•TSH•FSH & LHOxytocin•ADH

Pancreas:•Insulin•Glucagon

Petefészek:•Ösztrogének•Progeszteron

Tobozmirigy:•Melatonin

Pajzsmirigy:•T3, T4•Calcitonin

Mellékpajzsmirigy•Parathyroid h.

Mellékvesekéreg:•Cortisol•Aldoszteron•Androgének

Mellékvese velı:•Catecholaminok

Kevésbé hagyományos hormonok

Placenta:•Mindenfajta hormon

Adipocyta:•Leptin

Cardiocyta:•ANP

Vese:•Erythropoietin•RAS

GIT:•Gastrin•Cholecystokinin•Secretin,...

Endothelium:•Endothelin•NO•Prosztanoidok,...

Immunrendszer:•Citokinek

Thrombocyta:•Növekedési faktorok

Gonadok:•Inhibin•Activin

AZ ELİADÁS VÁZLATA

1. HORMON-RECEPTOROK

2. SZABAD HORMON KONCEPCIÓ

3. NEUROPEPTIDEK

4. POSZT-TRANSZLÁCIÓS MÓDOSULÁSOK

5. FOETALIS mRNS AZ ANYAI VÉRBEN

6. A VIZSGÁLÓ-ELJÁRÁSOK FEJLİDÉSE

1. Szemléleti áttörés: a hormon-receptorok felfedezése

• Szerkezet és funkcióközötti kölcsönhatás megértése.

• Receptorokra hatógyógyszerek felfedezése.– Emlı cc. stratifikáció

– Graves’ betegség diagnosisa

– Prostata cc.

– Carcinoid (somatostatin)

GENOMIKUS – NEM GENOMIKUS RECEPTOROK

Újfajta hormon-receptorok

• Diabetes – incretin hormonok: a postpradialis insulinszekréciószabályozói– glucagon-like peptid (GLP1)

– glucose-dependent insulinotropicpolypeptide (GIP)

– GLP1 és DPP-4 receptorok.

• Kamrai hypertrophia– cardiotrophin-1 (CT-1; az IL-6

család tagja)

– IL-6 receptor (IL-6R)

• Kisspeptin (metastin, KISS1): melanoma metastasissuppressor gén– GPR54 receptor

– neuroendokrin kontroll, pubertás

2. Szemléleti áttörés:A szabad hormon koncepció

• Az intracelluláris(hatékony) hormon-koncentráció a szabad szinttel arányos, nem pedig a kötöttel.

• Az albuminhoz kötött tesztoszteron fél életideje 1 mp, az SHBG-hez kötve 20 mp.

• A szöveti mikrocirkulációképes elısegíteni a szabad hormon felszabadulást a kötésbıl („bioavailable hormone”).

Peptid hormonokat szállító fehérjék:

CRH-BP, IGFBP-1-6, albumin (calcitonin, PTH, ACTH)

Szteroid hormonokat szállító fehérjék:

CBG, SHBG, D-vitamin-BG

Pajzsmirigy hormonokat szállító fehérjék:

TBG, albumin, transthyretin (prealbumin)

Transzport proteinek

Rheuma faktor (Rf)Humán IgG Fc fragmense ellen képzıdnek (IgM)

Elıfordulásuk:

1. normál populációban (idısebb kor): 5-10 %,

2. autoimmun betegekben gyakrabban

3. rheumatoid arthritis: elsı év: 40-60 %; késıbb: 80 %

Úgy viselkednek, mint a heterophil antitestek: minden faj immunglobulinjához hozzákötıdnek.

Állati fehérje ellenes humán antitestek (HAAAs)

1. Izotípus: IgG, IgM, IgA, IgE.2. Állati fehérjével történı

expozíció igazolható, és az állatfaj azonos a tesztben alkalmazott állati immunglobulinnal (anti-mouse: HAMA, anti-rat: HARA, etc..)

3. Szérumkoncentráció: g/L is lehet!

4. Évekig a keringésben maradnak.

5. Elıfordulásuk: 80 % is lehet.

Szabad hormon koncentráció: teljesen független a kötıfehérjéktıl?

-20%-10%

0%10%20%30%40%50%60%70%80%

15 20 25 30 35 40 45 50 55

Albumin (g/L)

Bia

s of

fT

4 (M

EIA

)

A

-25%

25%

75%

125%

175%

15 20 25 30 35 40 45 50 55

Albumin (g/L)

Bia

s of

fT

3 (M

EIA

)C

Toldy, Lıcsei, Szabolcs, Bezzegh, Kovács: Clinica Chimica Acta, 2005

IGF-1 és a kötıfehérjék: BP1-6

Az Az öösszes keringsszes keringıı IGFIGF--1 mennyis1 mennyisééggéének: < 5%nek: < 5% szabad

- szövetspecifikus enzimek,- pH viszonyok - farmakonok

A szövetenként eltérı lehet a hatásmód és hatáserısség!

BP4-6 IGFIGF--11

+ +

BP1-2 IGFIGF--11

αααα-subunit

BP3

ββββ-subunit

IGFIGF--11 IGFIGF--11

IGFIGF--11

IGFIGF--11

αααα-subunit

BP3

ββββ-subunit

Az interakciót okozó antitestek kiszőrése

Blokkoló ágens használataborjú v. murin immunglobulin,nem specifikus egér antitest (MAK33): interferencia elimináló fehérjék

biotinizált egyszárú antitest használata

A minta elıkezelése:PEG, alkohol, ammónium szulfát, protein A kromatográfia, ultrafiltráció, gél diffúziós kromatográfiadetergens, hıkezelése, hígítása

Visszanyerés méréseAz antitest közvetlen mérése, pl. TgAb

Analitikai problAnalitikai probléémama: : a rutinban alkalmazott a rutinban alkalmazott immunoassay módszerek jelentıs eltérése

Bayer (Chiron Centaur)

DPC Immulite

ABBOTT AxSYM

Roche Enzymun

Wallac DELFIA

Beckman Access

Roche Cobas CoreJ & J Vitros ECI

Bayer Immuno-1J & J Amerlite

Abbott ImxRoche Elecsys

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000

Monomer PRL szint: 270 mU/L+ 93 % macroprolactin

PRL mU/L

Fahie-Wilson, 2000.

214 macroprolactinaemiáseset közül

37 beteg (~17%)

fölöslegesen részesült bromocriptin terápiában

SajSajáát tapasztalatunkt tapasztalatunk

A klinikus korlátlan bizalma és a laboratórium hallatlan

felelıssége

Total β-HCG mérés

58 technikailag hibás fölémérés heterophil antitest jelenléte miatt, amit a referencia laboratórium utólag tisztázott (Cole, 2004):

• Curettage (85 %)

• Curettage + MTX kezelés (70 %)

• Laparoscopia (45 %)

• Hysterectomia (11 %)

• Bilateralis salpingo-oophorectomia (6 %)

3. Szemléleti áttörés:A neuropeptidek felfedezése

• Neurovascularis kapcsolat a hypothalamus és a hypophysis között (Harris, Szentágothai, Halász, Flerkó)

• Az idegrendszer részt vesz a gonadotropin szekrécióban (Sawyer)

• Releasing hormok (Guillemin és Schally)

• Idegrendszerre gyakorolt neuropeptid hatások (De Wied, Lissák, Endrıczi, Telegdy)

††LissLissáákk KKáálmlmáánn TelegdyTelegdy GyulaGyula ††Bohus BBohus Béélala

AZ ENDOKRIN MUNKACSOPORT

NAGY GENERÁCIÓJA

David De Wied

A NEURO-ENDOKRIN-IMMUN SZABÁLYOZÁS ZAVARAI

• Biológiai ritmusok

• Alvás és immunrendszer

• Vasopressin az agyban

• Gyulladásos mediátorok és a hormonelválasztás

• T-helper sejtek és a glucocorticoid érzékenység

NEUROHYPOPHYSIS HORMONOK HATÁSAI AMAGASABB IDEGTEVÉKENYSÉGRE

0

2

4

6

8

10

12

1 2 3 4 5 6

CONTROL AVP OXT

0

1

2

3

4

5

6

7

CONTROL AVP OXT

Kovács, Vécsei és Telegdy, 1978Kovács és Telegdy, 1987

Schulz, Kovács és Telegdy, 1974Kovács, Telegdy és Lissák, 1976

NEUROHYPOPHYSIS HORMONOK: TANULÁS, NORADRENALIN

A HATÁS

•AGYI HELYEI•INTERAKCIÓI

Kovács, Bohus, Versteeg, De Kloet, De Wied, 1979

Kovács és Versteeg, 1993Kovács és De Wied, 1994

NEUROHYPOPHYSIS HORMONOK: TANULÁS, NORADRENALIN

A HATÁS

•AGYI HELYEI•INTERAKCIÓI

Kovács, Bohus, Versteeg, De Kloet, De Wied, 1979

Kovács és Versteeg, 1993Kovács és De Wied, 1994

NEUROHYPOPHYSIS HORMONOK: TANULÁS, NORADRENALIN

A HATÁS

•AGYI HELYEI•INTERAKCIÓI

Kovács, Bohus, Versteeg, De Kloet, De Wied, 1979

Kovács és Versteeg, 1993Kovács és De Wied, 1994

•T�G MUTÁCIÓ (20. KROMOSZÓMA; 2110. NUKLEOTID; 116. CODON),

•C�G CSERE NP85,•AUTOSOMALIS DOMINÁNS ÖRÖKLÉSMENET,•ENDOPLASMATIKUS RETICULUM, •LASSÚ, KÉSLELTETETT

NEURODEGENERÁCIÓ.•(Bruins, Kovács et al. 2006)

HUMAN FAMILIALIS DIABETES INSIPIDUS:MUTÁCIÓ A PROHORMON GÉNEN

Az agy-vér gát átjárhatóvá tehetı„KLASSZIKUS”RECEPTOROK:V1a, (V1b), OXT

[pGlu4,Cyt6]AVP-(4-8)[pGlu4,Cyt6]AVP-(4-9)

(Vaccari és mtsai, 1998)

Arg-His-Pro-[pGlu4,Cyt6]AVP-(4-9)(Tanabe és mtsai, 1999)

abszorpció-mediáltendocitosis

„SAJÁT” RECEPTOR KLÓNOZVA

(Xiong és mtsai, 1999; Nakayama és mtsai, 2000)

A neuropeptidek felfedezésének gyakorlati jelentısége

• Az endokrin integráció elveinek megismerése.

• Endokrin betegségek patomechanizmusának megértése (pl. perifériás mirigyek tercier zavarai).

• Új terápia, pl. LHRH analógok daganatokban.

• Új funkcionális tesztek.• Az idegrendszer mőködésének

módosítása.

4. SZEMLÉLETI ÁTTÖRÉS:

POSZT-TRANSZLÁCIÓS MODIFIKÁCIÓK

•FUNKCIONÁLIS CSOPORTOK HOZZÁADÁSA

•EGYÉB FEHÉRJÉK HOZZÁADÁSA•AMINÓSAVAK KÉMIAI

SZERKEZTÉNEK MÓDOSÍTÁSA•SZERKEZETI VÁLTOZÁSOK

SZIALIZÁCIÓ4. SZEMLÉLETI ÁTTÖRÉS

POSZT-TRANSZLÁCIÓS MÓDOSULÁSOK: A BIOLÓGIAI FÉL-ÉLETIDİ SZABÁLYOZÁSA

TERHESSÉG – FOKOZOTT SZIALIZÁCIÓLASSABB TBG CLEARENCE – EMELKEDETT TBG

5. Szemléleti áttörésFoetalis mRNS, DNS az anyai vérben

kivon RNS, DNS

Magzati nem meghatározásaCalbindin-D9k mRNANövekedési hormon; insulin-szerő növekedési faktor-1Veleszületett betegségek diagnosztikája

6. A VIZSGÁLÓELJÁRÁSOK FEJLİDÉSE

•• Specifikusabb A cél: klinikai

• Szenzitívebb

• Szélesebb méréstartomány

• Rövid analízis idı

• Automatizálható

• Környezetkímélı A cél: analitikai

PCR

LIA1980 BIOLUMINESCENCIA

FIA

EIA1960 RIA

ATOMABSZORBCIÓ

FLUORIMETRIA

KROMATOGRÁFIA1940

umol/l

nmol/l

pmol/l

NEPHELOMETRIA

FOTOMETRIA mmol/l

TITRIMETRIA1890

2000fmol/l

A modern immunoassay specificitása

• Néhány ng/L mennyiségőanyagot felismer olyan környezetben, ahol az anyagkoncentráció 1011 ng/L.

• Az arány pontosan olyan, mintha egyetlen embert kellene azonosítani a világ teljes népességében.

Biomarkerek…

10%

Albumin

Össz IgG

TranszferrinFibrinogén

Össz IgA

α-2-Makroglobulin

Össz IgM

α-1-Antitripszin

C3 komplement

Hapto-globin 10%

H-faktor

komplement faktor B

Cöruloplazmin

1%

Apolipoprotein A-1Apolipoprotein B

α-1 savas Glycoprotein

Lipoprotein

C4 komplement

Prealbumin

C9 komplement

C1q komplementC8 komplement

BIOMARKEREK

Az analitikai forradalom: tömegspektrometria

• Kis molekulák jövıbeli vizsgáló módszere.

• A kereszt-reakciók kiküszöbölve.

• Gyors, nem igényel minta elıkezelést, nincs reagens költség.

• A berendezés drága, különleges felkészültséget igényel.

A point-of-care (POCT) és a point-of-surgery (POST) hormonmérés

• Sürgıs:�Terhességi

próba

�LH: ovulatioellenırzés

�β-HCG

�Cortisol

• Intraoperativ:�PTH

�Cortisol

�Insulin

�ACTH

�Gastrin

Molekuláris endokrin diagnosztika

• Multiple endokrin neoplasia

• Congenitalis adrenalis

hyperplasia

• Tg mRNA: differenciált sejtes pajzsmirigyrák

• Kallikrein mRNA: számos daganat

• Oestrogen receptor polimorfizmus

• ENDOKRIN MICROARRAY (BIOCHIP)

– Kezdetleges

– Drága

„Személyre szabott” és „designer”hormonkezelés egészséges emberben?

• Korábban: a hormonkezelés a hormonhiány pótlására szolgált.

• „Személyre szabott”(genotípus-specifikus) kezelés:

– Glucagon-like peptid-1 (II. típusú diabetes)

– Ghrelin (anorexia)

– Szövetspecifikus hormonok

• Kozmetikai endokrinológia.

• Gének modifikációja?

• Öregedés:

• www letöltés 2008:

• 2.2 millió GH,

• 1.2 millió DEA az öregedés ellen

A HORMONDIAGNOSZTIKA JÖVİJE

Az endokrin kézikönyveket át kell írni:– Peptid és szteroid hormonok

hatásmechanizmusa közötti különbségek eltőnıben

– Kötıfehérjék új szerepben

Új endokrin szervek, hormonok:– Kisspeptin (pubertás), – Thyrostimulin (pm. aktivátor)

Egy gén – több hormon: POMC

Új molekuláris módszerek:• Szelektív knock-out egyes agyterületek

peptid receptoraiban• Az adaptáció funkcionális genomikája• Transcriptomika• Proteomika• Metabolomika• Glikomika• Lipidomika• Farmakogenomika• Fiziomika

PÉCSI TUDOMÁNYEGYETEMI KONZORCIUM„A HUMORÁLIS ADAPTÁCIÓ ZAVARAINAK JELENTİSÉGE KLINIKAI KÓRKÉPEKBEN”

• A reproduktív rendszerszabályozási zavarai.

• Immuno-neuroendocrin adaptációvizsgálata kritikus állapotbanlévıbetegekben.

• Összefüggés vizsgálata a metabolikus szindrómabiokémiai és a visceráliszsírsejtek élettani jellemzıi között.

• A könny összetételénekváltozása endokrin ophthalmopathiában.

• PTE ÁOK Anatómiai Intézet• PTE ÁOK

Gyermekgyógyászati Klinika• PTE ÁOK I.sz. Belgyógyászati

Klinika• PTE ÁOK Laboratóriumi

Medicina Intézet• PTE ÁOK Szemészeti Klinika• PTE ÁOK Szülészeti és

Nıgyógyászati Klinika• PTE ETK Ápolás és Betegellátás

Intézete• PTE ETK Diagnosztikai és

Menedzsment Intézet