a possible role for the alzheimer amyloid precursor protein in the regulation of epidermal basal...

10
A possible role for the Alzheimer amyloid precursor protein in the regulation of epidermal basal cell proliferation Jens Hoffmann a , Christiane Twiesselmann a , Markus P. Kummer a , Paolo Romagnoli b , Volker Herzog 1)a a Institut für Zellbiologie und Bonner Forum Biomedizin, Universität Bonn, Bonn/Germany b Dipartimento Anatomia umana e Istologia Sezione Istologia, ªE. Allaraº, Firenze/Italia Received April 18, 2000 Received in revised version August 9, 2000 Accepted August 15, 2000 Keratinocytes ± proliferation ± Alzheimer amyloid precursor protein ± epidermal growth The regulation of epidermal growth involves a number of ions, growth factors and cytokines and possibly additional but as yet unknown factors. Here we report on the potential role of the secretory N-terminal domain sAPP) of the Alzheimer amyloid precursor protein APP) in the regulation of kerati- nocyte proliferation. In human skin APP was detectable predominantly in the basal cell layer of the epidermis whereas the immunocytochemical signal in the underlying mesenchy- mal tissue was very low. Cultured normal human keratinocytes expressed the three APP isoforms 695, 751 and 770 with highest values for the isoforms 751 and 770. HaCaT cells, a spontaneously immortalized human keratinocyte cell line, exhibited almost identical patterns in the expression of the APP isoforms and in the release of endogenous sAPP. In HaCaT cells, recombinant sAPP sAPPrec) was found to compete with endogenous sAPP for the same binding sites. Binding of sAPPrec was specific and occurred in microdo- mains of 0.1 to 0.3 mm in diameter. At 10 nM, sAPPrec binding induced a 2- to 4-fold increase in the rate of cell growth. sAPP concentrations in the conditioned media were found to reach 5 ± 20 nM which is in the mitogenic range of sAPPrec. The proliferative effect of sAPP was inhibited by 50% when antisense oligonucleotides directed against the APP mRNA were applied. The predominant expression of APP in basal cells, the growth-promoting effect of sAPP on keratinocytes, the physiologically relevant concentrations of sAPP secreted by keratinocytes, and the antisense-induced inhibition of proliferation point to a function in the autocrine regulation of epidermal growth by sAPP. Abbreviations. APP Alzheimer amyloid precursor protein. ± sAPP Soluble N-terminal domain of APP. ± NHK Normal human keratinocytes. ± TGFa Transforming growth factor alpha. ± KFG Keratinocyte growth factor. Introduction Keratinocyte proliferation is an essential part of a wide range of biological phenomena such as morphogenesis of the epidermis, maintenance of epidermal organisation and wound healing. The rate of proliferation of mitotically active kerati- nocytes depends critically on ions and on a number of cytokines and polypeptide growth factors, i.e. a group of molecules that have stimulatory or inhibitory effects on DNA synthesis and on cell proliferation in vitro for reviews see Stoof et al., 1994; Martin, 1997)). Thus, several studies have documented the potential role of epidermal growth factor EGF) and EGF-related ligands by targeted disruption of the EGF receptor resulting in impaired epidermal development Mietinnen et al., 1995) or abnormalities such as inverted hair follicles Threadgill et al., 1995). Apparently, growth factor receptors are required for normal epidermal development, whereas an essential role of a given growth factor has, thus far, not been observed. However, the importance of some growth factors has been shown in the regulation of wound healing for reviews see Nozaki et al., 1992; Pittelkow, 1992)), where they operate in the complex autocrine or paracrine control of epidermal growth. Their biological significance is exemplified by two main growth factors regulating development and growth of the epidermis: Transforming growth factor a TGF- a) and keratinocyte growth factor KGF). TGF-a which belongs to the EGF family of growth factors is synthesized and released by basal cells, which thereby stimulate their own division Barrandon and Green, 1987a; Pelton et al., 1989). This autocrine growth factor is overexpressed in psoriasis, a disease characterized by the production and exfoliation of an EJCB 905 European Journal of Cell Biology 79, 905 ± 914 2000, December) ´ Urban & Fischer Verlag ´ Jena http://www.urbanfischer.de/journals/ejcb 0171-9335/00/79/12-905 $15.00/0 1) Prof. Dr. Volker Herzog, Institut für Zellbiologie, Universität Bonn, Ulrich-Haberland-Straûe 61a, D-53121 Bonn/Germany, e-mail: [email protected], Fax: 49 228 735302.

Upload: jens-hoffmann

Post on 20-Sep-2016

222 views

Category:

Documents


1 download

TRANSCRIPT

� �������� ��� � ��� �� ����� ������� ������������ �� ��� ��������� � �������� ����� ��������������

���� ������� �� ������ ����������� � ��� �� ����� ���� ��������� ����� �� �����

������� �! "����������� ��# $���� %� �� $����#���� &��'� ���(� $��� $���)*� ��+� ,�- ������� .����� ��� � ������� /������ ������� 01� .�� 2 %� ����) ���

��3��'�# .- �� �4 5666��3��'�# �� �'���# '� ���� .����� 7 5666.33�-��# .����� �8 5666

����������� � ������������ � ��������� ������ ������� ������ � � ������� ������

��� �������� � �������� ����� ������� � ������ � ��������� ����� ��� ������� ��� ������� ������� �� �� ��������� ������ ���� �� ����� �� �� ������ ���� � ���������� �������� ����� ����� � �� ��!����������� ��������� ����� ���� � �� �������� � ���������� ���� ������ "� ����� ��� ��� ��� ������������������� � �� ����� ���� ����� � �� ������� ��������� ��������������� ����� � �� ��������� ������������ ���� ��� ���� ���� #������ ������ ����� �����������$������� �� ���� ��� �� ���� %&'� (') ��� ((* ������� ������ �� �� �� ���� (') ��� ((*� ��#�� ������ ������������� ������!�� ����� ��������� ���� �����$���� ����� ������ ������ � �� �$������� � ����� �� ���� ��� � �� ������� � ���������� ����� "���#�� ������ ��������� ���� �������� ��� ���� ������� �� ���������� ���� �� �� ���� ����� ����+���� � ������� ��� ���� � ��� �������� � ����������� � �*�) � �*�, �� � ������� � )* �-� ������������ ������ � .� � /� ��� ������� � �� ��� � ���������� ���� ����������� � �� �������� ���� ���� ���� � ����� ' 0 .* �- ���� � � �� ������ ����� � �������� ��� ���� ����� � �� � ���� ��� ����� ���'*1 ���� ������� ������������� ������ ����� ����� �2�� ���� ������� ��� ��������� �$������� � ��� � ����� ������ �� ������������� � �� � ���� ������������� �� ������������� ������� ����������� � ���� ������� �� ����������� ��� �� ������������������� � ���� ����� ��� � � ����� � �� ��������������� � �������� ����� �� �����

������������ ��� ������� ��� �� ����� � ����� � ���� � ������������� � ��� � ���� � ��� � �� ���� ������ ������ � �� ������ ��! ! "�� ���� ������ � � � ������ ���� ! "�� ���� �

�����������

�� ����3+�� - ����� ���� �� � �������� - � �� ��#� ����� �������3� -������� ��3� � �� -��������� �� ����-�#� ��� �������3� �� �-�#� �� � �������� �# ����#������� ��� �� �� - ����� ���� �� ������3��+ 3��'� �� ��9��3+��� #�-��#� 3 ���3��+ �� ���� �# �� ����� ��3+������� �# -��+-�-��#� � ���� �3�� � �� �� � ��- ������3���� ��� �'� �������� + � �������� + ����3�� �� ,:.�+������� �# �� 3��� - ����� ���� �� '�� � ;�� �'���� ���;/���� �� �� �77<= � ��� �77>��� ���� ��'� � ���#��� �'�#�3������# ��� -������� ��� �� �-�#� �� � ���� �3�� ;1*%� �# 1*%9 ����# ����#� �+ � ����# #�� �-���� �� ���1*% �3�-�� �������� �� ��-� �# �-�#� �� #�'���-����;��������� �� �� �778� � ��� ������� ��3� � ��'� ��# �� �����3��� ;�� �#���� �� �� �778�� .-- ����+ � ���� �3�� �3�-�� � � �?�� �# �� �� �� �-�#� �� #�'���-������� �� � �������� ��� �� ��'�� � ���� �3�� �� ���� � ��� ���� ���� '�#� ����'� ��� ��-� ��3� �� ���� � �����3�� � �� ���� ����� �� ��� �������� �� ����# ������ ;�� �'���� ��� ;:���� �� �� �775= ��������� �775�� ��� � ���+�-� �� �� ��� 3��-��@ ���3 ��� � - 3 ��� 3��� �� ���-�#� �� � ����� ���� �������3� �������3�3� �� �@��-�����#�+ ��� ��� � ���� �3�� � �������� #�'���-���� �#� ���� �� ��� �-�#� ���A � ���� ���� � ���� �3�� � ;�*%9�� �# �� ����3+�� � ���� �3�� ;�*%�� �*%9� ���3�������� �� ��� 1*% ����+ �� � ���� �3�� � �� �+��������# �# �����# �+ ��� 3���� ���3� ��� ��+ �������� ���� ���#�'����� ;$ �#�� �# * ��� �74>= ������ �� �� �747������ ���3 ��� � ���� �3�� �� �'� �@- ����# �� -�� ���� #����� 3� 3�� ���# �+ ��� - �#�3���� �# �@�������� �� �

���� ���#� ���� $ ���� � %��� &� � !� ��' ()* � (+, -.)))' /�����0 1 2 3���4 ����� 5���! 1 $�������677"""��������������78 �����7�8��

6�>�97BB8)66)>7)�59768 C�8�66)6

�� � ��� , � ����� �� ��� ������� �! "����������� &��'� ���(�$��� &� �3�9��� ��#9/� D� E� ,98B�5� $���)*� ��+ �9���A�� ���F���9�����#� %@A � <7 554 >B8B65�

�@3����'� ����� �� �-�#� �� 3���� ;1�#� �� �� �747�� �*%���3� --� � �� �� ��#� ��� 3��� �� �� ��� �� ����3+��9#� �'�# ���� ������9� ;��9/������� �� �� �777� �� �+����9����# �# �����# �+ ��� ������ ��#� �+��� ��� �-�#� �����*% �-� ��� ��� ��� � � - 3 ��� � ���� �3�� �����9����� ����+ �� ����3+��� �� - ����� �� ��� �� ��� ������ ���� �� ��-����'� ;��������� �775= G� �� �� �� �775� ;�� �'��� ��� ;G� �� �774��� H��� '����� ���� ���3�9��� ��3�������� ��� �*% �+ ��� �� ���������+ �?�� �# ���� �� ����# ������ �'�� ���� ��� �@- ������ �� �*%9� �� �������# ;*�� �� �� �774�� ���3� ������� ���� �3�� �3��� ����� �� �-�#� �� � ���� �������� ���� �� ����--� � �� �� ��������� ���� ��#�3��� ��� ��� �������� ���-�#� �� - ����� ���� �� 3��-��@ - �3��� ���3� �+��'��'� ##������ � +�� ���#�������# � ���� �3�� � �#-� �-� ���� 3��3� ��# 3�����

��3����+ ��� ��3 ��� + :9�� ���� -� ���� ;�.��� �� ���.������� �+���# - �3� �� - ����� ;.��� �� ���� �#����9���# � � �-������� � ���� �3�� ��� ��#���� ��� �/�9��#�3�# - ����� ���� �� ��+ �3+��� ;��-- �� �� �77E= ���� ����� �� �774�� .�� �� ���?�������+ �@- ����# ��� �� ����+���� ��'�������# �� 3���� �� ��� 3��� � �� '��� �+�����$�3��� �� ��� �@- ������ �� ��� ����# �� ��� �-�#� ��� ���?������� ��� ������ �# � ���3� ���- �.�� �+ - ��3�9-�� �� ��� �������� �� �-�#� �� � ����� � ���� ���#+ ����+��# ��� ��� � ��� �@- ������ �� ����� � �� ��� .��- ����� ����+ �� ��� ���� �-�#� ���� H� ������ ���� ���.�� �� ����+ ��3����# �� 3���� �� ��� ��� �+� ��� ����3��'� ����� �� ��� �-�#� ��� �� �� �� �� - ����� �����1@��������+ ##�# �.�� �3 ���#� �� �� ����3+�� �� �3����� ��+ ��#�3��� ��� �� - ����� ���� 3��- ��� �� �������#�3�# �+ �*%9� � �*%� H� ���� '����� �+ �� ���'���� ��� ��#� ���#��� �� �-�#� �� � ���� �������� ����#� ��� ����# �-� � -�� ���� �# �� ��� #�'���-���� ����� 3���� � ��#��

�������� ��� �������

�������� ������� ��� �������� ����� ;$����- �� �� �744� �� � - �'�#�# �+ , � :� 1�%������ ;*� �� ��3� ���� 3� ����� ���#���� ��� ���� ����� �� �� ��3��+ ���'�# ��� + ���#� �� ���#�+ - �'�#�# �+ , ��� �(�� ;� ������-��� $ !�� *� ��+�� ���+3���� ����� �����8 ;/���#� �� �� �77B� ����� ���.�� �9�� ����� �� - �'�#�# �+, � 1� ��� ;/� ,���� &/.�� ��� ����3���� �����#+ 55���;G��#���� �� �� �747� �� ���� � �� , �� �� $�+ ����� �# *�������- ;"�$� ���#���� � *� ��+�� ��� ���� ����� �� BB57����� �.�� �� ���# �� �� ��� �� + ����� �3�� ���+ - �#�3�# �3������� �.�� ;�.�� �3� � ������� ��� ����3���� �����#+�8,5 ����� �� ����� �� �� � �� �����3�� ��� ������ ;�������*� ��+�� ��� ��3��# + 89;<E9#�3��� �� ����959+��9�������� ��93��� �+# �3��� �#� ;,�.%�9 -� �@�#��9 � �+B9�����# ���9����� � ���9 ���� �����#��� �� � � �� ,���' ;���� � *� ��+��

!�������� � ���������� ��!! "��!!��#�� �@3��#� ��� ���#��� �� �.�� �3 �� ��� 3��� �� �3� ����� ����#���# �+ ��� ������9�+-� - ����� �������� ;�� � ��?���3� �����# �.�� �3 #� �'�# � �� .��E78 �3���� ���� #����� �.�� �3 ��- �- �# � �� �� ��� �3�� � �@- ������ ���9����# ���� �.��;%��� �� � #��3 ���# - �'�����+ ;���� ��� �� �� �774��

���� ��������� 3���� �� � 3����'��# � B> �� � 8I �H5 �# 78I � ��,����33�J� ������ �������� ��#��� ;,�1�= *��3� 1���������*� ��+� 3�������� �6I ���� 3�� �� �� ;%�/� -���3����� ;86 &)����# �� �-���+3�� ;86 &)���� :� �� ���� �� ����3+��� ;:����� � ������# ��������� ���# # - �3�#� �� ;��� �# :�3�������77<� �# 3���� �# �� �� ��9� �� ��#��� 3�������� 6��8 �� �5��6 ��)�� �-�#� �� � ���� �3�� ;1*%� 8 ��)�� ������� 6�8 ��)���+# �3� ������ �# 6�<I ;')'� -����� + �@� 3� ;�������3� �� -� /�,��� � &/.��

$���� ���������� ��������������������������� � �!! ��� �%&������� �� ������������� ��� �� '���( ��������� �-�#� ��� � �� �� ��3��+ ���'�# ����� � ��� ���� ���@3���# � ��# �� �@3��� #� �� ������ ����# ���� �$/ �# ��� �# ��46 ��� /�'�� �� ���3� 3 +����� ��3����� �� � ��@�# ���� <I- �� ��#��+#� �� B6 ���� ��� 3���� �� � ���#�# �� 3�'� ���-���@�# �� <I - �� ��#��+#� �# -� ��������# ���� 6�5I � ���� K9�66� .�� �� '�������# �+ ��3������ �� ������ ��3����� � 3���� ������� ����� �� ���8� ��9��3������� ���� ��9����� �� �� ��+��#��� �����?���� ��3������ �� ��3����� ���� ��� ���9�� ����� �������#+ �8,5� %� ���������� ��3��3� '���������� ������ ��3������ 3���� �� � ��3����# ���� ,�.%9�����# ��� ���9 ���� �*�������# �+ ��3������ ���� �+B9�����# ���9����� �* �����#+������� ��3����� � 3���� �� � '����# ���� ��/ <, L��3 3����3� ��� �3����� ��3 ��3�-� ;L/� L��3= $������� *� ��+�� M����������� 3+��3����3� ������ � �� ��3����� -� -��#�3�� �� ��� �-�#� ���+� � �� -� �� ��# ����� ��� ���# # ����� � �� ��� L/�� %�'���3����� ���� ��� #��� �������� �3� �� � ��+��#�

������� � �)��������� ����� ��!!�� �� �������� � '���( ����� ��� �� ����������� ������ �*���� ��+�� ��� ���#��� - �-� ���� �� �.�� �� 3��� �� �3�� ��� 3�������#�# �� 3�'� ���-� �� � ���3��# �� B6 ��� ���� BI $/. � < ����3����# ���� � �6 � �66 �� �.�� �3 ;B6 ��� � < ��� ����# ���$/ 8 ����� �� 8 ��� � < �� �# ��@�# �� <I - �� ��#��+#�� ������# �� ����# ��� ��3������ ���� �.�� �3 �� ��� -� �� ��# ����� - ����3� �� 6�BI$/.� %� �-�3���3 #���3���� �� ����# �.�� �3 ��� ���� ���9�.�� �����#+ ;����� �� BB57� �@3����'��+ �3���������.�� �3 ��� ��� ��#������� .�� �� ���#� :�3��� �� � �����# ����5 ��)�� - �-�#��� ��#�#�� �����3+��3����3� #���3���� �� -� 9�� ��# � #��3 ���# ��'�� �� ��+�� ��� �-�3���3��+ �� �.�� �3���#��� �# �� ��� ������ ��#������� �.�� �# �.�� �3 ��� ������ 3��� �� �3� ���#��� ���� �.��9�� �3��# �# �.��9� �� � 3������� � - �- �# � �� 3��#������# ��#� �� ��� 3���� � #��3 ���#- �'�����+ �� ��+ �3+��� ;��-- �� �� �77E�� � � ��� ��� 3���� �� ����#�# � ���� 3��� #�����+ ;8� �6E 3����)����� �# � ��� �� ,�1� ��>893�5 %�3�� ����� ����� 3�������3� �� �3��# ;B #+��� ����� �� ��@�����'��+ ����# �� ���'� %�/ �# 3���� �# �� ��� ����3� �� %�/�� B #+�� ��� ��#� �� � � ��# �� 3����� 3����������� �+3��� �������� �# ��� 3��3��� ���� �� �.�� �����# ���� ��� ��#�

��+ $� � �����' %� �"��������� �� ��� ����

3�� )� /3�����3 �- ��������� �� �.�� �3 �� �3�� �� %� -� ���39���� -� -���� E����9�� �� ��3��#�# � ��� :9�� ����� �� �.�� �3�:��� ��� �.�� �3 ��#� ���� ��� �9�� �����+ ��3��# �93��'�� �����# 3������ ��� ��� � ��� �93��'�� �����

�� �������# �+ /,/9�.*1 �# ���������� ����� ��� �����#+ E1�6;/������ :�� N� � &/.� ���� �.�� �3 � ���# #� �.�� 3��3��9� ����� �� � ����# �� �� � ���� 8 ��� %� ��� ��- ���� �� ����9� �� ���9����3�� 9������ - ������ �+ ��� ���� ���� ��� 3��#������#��#� �� � 3��� �����# �� 56 ��� ;�666�� �� ���� �3�� 3��3��� �� ����� ;.��3�� G����� *� ��+� ���� �66 �, �@3������ -� � �������� ����9����3�� 9������ � 3���� 3�������� �.�� �� 3��3��� ��#���� 89���# �������� �� � �.��93��3��� ���� �� ���� 58 ��� ������9����3�� 9������ � 3���� #�# ��� 3����� �+ #���3���� �.������ 3���� �� � ��3����# � < �� �� ����� �� ���� � 3����� ;B6 ������� ��� ������ ���#��� ����� �� � �33�-��# ���� - ���3������ ���������# �+ � ��3������ �� 3���� ���� �66 �� �.�� �3 ;B6 ��� �< ���� ��������� ��3��3� ?��������� �� �.�� �3 ����# �� ��� 3����� �3� �� -� �� ��# ����� ��� ���# # ����� � �� ��� 3����3���3 ��3�-� � #��3 ���# ���� � ;������� �� �� �777�� �� '��������.�� �3 ���#��� �� �� ����3+��� �� ���� �-�#� ��� �� ���� > �����3� 3 +���� ��3����� � �� ����� � ��� ���� �� � ��3����# �����66 �� �.�� �3 �� �$/ 3�������� 6�BI ��'��� �� �� ������;$/.� �� B6 ��� � B> ��� .��� ��3������ ��3����� �� � ����# ��� ����� �� �$/ 3�������� 6�BI $/. 8 ��� �3� �# ��@�# ���� <I- �� ��#��+#�� �.�� ����# �� 3��� �� �3�� �� '�������# �+��3������ ���� ��� ���� ���9�.�� �3 �����#+ ;����� �� BB57��

������������������ ������ �)���������� ����� ��� ������3+��3����3� �-�3���3��+ ����� �� 3��� ���@-� ������ �� �3� ������� - �3�#� � �� � -� �� ��#� �����3��� �� �@-� ������ ��3��#�# ��� ������������ �� ��� ����� �� �+ ���� - �9������ �� �� �� �'���� ��� - �� + �����#+� :��9�-�3���3 ���#��� �� ���� ��3����+ �����# ��3��# + �����#��� ���'����# �+ ��� �������� �� ��� - �� + �����#+�

,-,&!�.� ��� ���������������� ��+�� ��� �@- ������ �� .�� �� �+���� ��� 3���� �� � ����#���3� ���� �$/ �# �+��# �� B6 ��� � < �� �� 866 �� �+��� ����� ;86 ��� ��9��� ;-� >�8� �86 �� :�� 6�8I � ���� K9�66 5 �� -���+�9����+�������+����� �#� 8 �� ��#�3����#� � �� 1,�. �# 5<�����)�� �� ��� � +-��� ��3��'�� - ������� ���� � ���+ �� � 3�� �#�+ 3��� ���������

.�� �� 3��� �+���� �# �.�� �����# ���� ��� 3���� � ��#��� ����� 3���� � :�� �� � ��- ��# �� �5�8I �#�3��� /,/ ���;/3�(��� �# '�� ���� �74>� � ���� �# �� ��� �3�������� �##���3��# �+ ������ ���� ����� ���# # - �3�#� ��� ��� .��9 � �.��9�-�3���3 ��#� �� � '�������# �+ 3�����������3��3� ;1�L=.�� ��� $ ���3����� *� ��+� �# #�3������# �� K.�98����� ;��#� /����� � *� ��+��

��!! ������������ �� ����������� ��������#������# ��#� �� � - �- �# �+ 3���� ��� ��� 3���� �� >5��� � �� �� ��9� �� ,�1� � #��3 ���# ��'�� ��� ��#� �� �3����3��# �# 3��3��� ��# �+ ��� ��� �� /-��#�3 �'-� ����#�'�3� ;/� �66 /'�� % ����#�� :N�� .��� ��- ���� �+ /,/9�.*1 �# '���������� �+ �������������� ��� �.�� ��#� �� �?�������# ����� �.�� �3 � ���# #� ���3��� ����� �� � 3�3�9���# �# �@- ����# �� �� -� �� �� 3��#������# ��#����

���� ���������� ������%� ��� 89$ ���95�9#��@+� �#��� ;$ #&� ��+ ;* ���� �745���� 3���� �� � ���#�# �� ���� 3�'� ���-� �# 3���� �# � #��3 ���#��'�� .��� < #+� �� 3���� � ��� 3���� �� � ����# ���3� ���� ,�1�������� %�/ �# ���� 3���� �# �� >5 ��� � ���� �� ��9� �� ,�1�3�������� 6 6�� � �6 � �66 �� �.�� �3 �*% ;8 ��)��� � �*%9�;56 ��)��� ������� ���� � ��)�� $/.� � ������ �� ��� 3���� ����$ #& ������� �# ?�������'� ��+��� �� � -� �� ��# � #��3 ���#;��-- �� �� �77E�� %� #��� ������� �� ���� 3��� ����� ��� 3����;B6666 3���� -� 5893�5 ����� �� � 3���� �# �� <4 � ����# ���3� ����,�1� ������� %�/ �# 3���� �# ���� �� ��9� �� ,�1� 3��������6 � �6 �� �.�� �3� .��� >5 ��� � ��� 3���� �� � � +-������# �# ������� 3��� ����� �� #��� ����# ����� ����3+������ � ��� 3�������� �� 3��- �# �� ��� � ��� ��������� �� ��� ����������� %�

��� �'������ �� �������� �@-� ������ ;��� ������ ��� �� �� 3���- ����� ���� �� #��� ����# ����� ��� ;B9O<89#�����+�������959+�P9589#�-���+� ��� ������ � ���#�� ;���� ������� ������ ;��3���� � ������� *� ��+�� ��� �����+ �� --���# 33� #����� ��� ����3�� � J� ���� �3������ ��� �������� �� ��� #+�3� ��-��#��� �� ��� 3��� ����� �� ?�������# ����� �3�������������� �-�3� �-�������� ;���� ��� ���� �� L��+���� L��9�� /����� ��#��

����� � �������&����/���� ������ "��!#*����� ����/������ 3���� �� � 3���� �# �� �� ��9� �� ,�1� �� 4 ��� �� ��#����� ���'�# �# 3���� �� � ��������# �� �6 ��� ���� �6 �� �.�� �3��.� ����� 3��'��+ �� #��� ����# ����� ��� �.� ����� ��+ ���;:�� 1����# $����� $�'� �+ �. &/.� � #��3 ���# ���� �;���� ��� �� �� �774��

��������� �)��������1@- ������ �� .�� �� ��� 3���� �� ��������# �+ ���������������3�����#�� #� �3��# ����� ��� ������� 3�#�� .&*� ����������� �������3�����#� ��?���3� -�������� ��6 �� ��6 �� 8�9�***�.*�.��*�*.����*9B� �# ��� �#�� ��?���3� �� 8�9*��.�*��*���*.�*.*�*9B� �3���� �+ �������3�� �����9��+ �� ���� ��?���3�� �� ��� 1�$L #����� ��� -���-�� ���������#���3����� �� � ����������# � ��� 8� �# B� ��#� �� ��� �������3���9��#��� ��� #������ ���� �� ��� �������3�����#�� �� -� �� ��# ��������A ��� 3���� �� � 3���� �# �� 7E9���� ��3 ����� -��� � #�����+ �� 8666 3���� -� ���� �� <4 ��� � �# � ��� �# ��� ���� ���� ��9� �� ,�1�� .��� ##������ 5< ��� � ��� ��#��� ��3����# �� �� ��9� �� ��#��� 3�������� 56 �� �������3�����#������ ��#��� �� ��--�������# ���� � ##������ 56 �� �� �������93�����#�� �'� + �5 ��� �� ���� ��� �� � � ���# ���� ��� ���3��3��� ����� �� ��� �#�� �������3�����#�� .��� >5 ��� � ���- ����� ���� �� ��� 3���� �� #��� ����# ����� ��� ��� ����� ����� ���� ��� � #��3 ���# ��'��

�������� � 0���������/� ������� -� 3����� �� - ����� ����93��-����� ��� 3���� �� �3��@-� ����� � ��+��# �+ $ #& ��3� -� ���� �� #�����# � ��� /-��� ��#�@ ;�� -� 3��� �� ������ .�� ���� ������ �� � �-���# ����� �� �� ����� �+ 3������� ������� �� �566 3���� �� �3��@-� ����� �# �@- ����# � ��� ��� � /,� ,� �� � ��+��# �� �������3� #���� ��3�� �+ /��#���J� ��-� �# � ����� �� 6�68 ��3����#� �# �� �� �������3���

!�������� ����� �������������������� �� ��� ���� ������� �� ������� � ������!��"� �#����� �:. �� �@� 3��# ����� ���# # - ���3���� ��9��� ;.33�����9��� �+����= � ����� �� -� �� ��# �� �66 �� �3���� '�����3�������� 56 -� ���� �:. � ���-��� �# � �� �� .��� �# .�� - ��� � ������� 1@�� > �# 4 �� .�� ;���� � � <4 �� �� <8 ��� ���������?���� B8 3+3��� � 7< �� �� B6 � 8> �� �� B6 � �# >5 �� �� � ������� - �#�3�� �� � ����'�# �+ ���3� �-�� ���� �� BI :�/��'�� ��� ���� �# '�������# �+ ����#��� � ���#� ��������

$���������"� ������������� �� ��� ���� ������� �� �������%� ?��������� �� .�� ����� �� � ��3��# .��>>6 �# *.�,�;��+3� �#��+#�9B9-���-���9#��+# ������� 3�:. ���# #� �� ����#� *.�,� 3�:.�� ���� ��# �+ �'� �- �@������� ���������� �������� �� ��� ���� �� �6 ��� -� � ;G��� �� ���77>� �# �+ �� '�� �� ��3 �-����� ���������� �� .��>>6 �� -� �� ��# ����� ����������3�����#�� .�� � .�� .�� �� �# .�� � ;���� �� �:.�� �'� ���+ � ��3 ���# � >6 �� �� �6 ��� �������# �+ E6 ��� �<5 �� �# �8 ��� � >6 �� ����� 566 & /�-� �3 �-��� -��+�� �� �#B �� �#�� - ��� � ;*��3� $�L 1��������� *� ��+�� ���� �� �-� �� ��# ���� 6�5 �� �� �3� #:�� 56 -��� �� �3� �������3�����#��# 5�8 & �� �GH�? ,:. -��+�� �� ;.*/ ���#���� � *� ��+�

��� ����� � � ��� �� ������� ! "������

�� ���� '����� �� 86 ��� ����� #���� ���� � 7< �� �� 5 ��� ���������# �+ <6 ��� 3+3���� �+3���� 3��#������ �� � 7< �� �� B6 ��38E �� �� � ��� �# >5 �� �� � ���� ��� ����� 3,:. �� ��- ��#�@3���# 3����# ���� -��9�3 �-� ;-��9�3 �-� 3������ ��� /� ����� L���� &/.� �# '� ����# �+ ��?���3��� ;/�?���� '� ��� �������*� ��+�� ��� ���� ���# -����# �� ���# �� ���� �� ��� 3�:.���# # ;�� '�� � � ��3 �-���� ��� /� ����� L ���� &/.� ����� �B�:. -��+�� ��� �� ������� ��� ����� �� 3�:. ���# #�;.��>>6 �# *.�,�� �?�� �# �� ?��������� �� ��#�'�#�� �:.��-��� ��@�� �� �� 866 �� ���� �:. ;� �� :�� � ��� 3��������� �� �� #�������� �� 3�:. ���# #� ����� � �� ���4 -� �� ��4 -�;�� .��>>6 3�:. ���# #� �# 6�6� �� �� � �� ;�� *.�,� 3�:.���# #� �� � �'� ���+ � ��3 ���# �������# �+ 5< 3+3��� �� ��� �#��3 ���# ��'�� ��� �-����� ��� ���� -���� �� ��� .��>>6 �# ���*.�,� 3�:. ���# # �� ��4 -� �# �66 -� ��-�3��'��+� ��� ����� �-����3���� �� ��� �� �� �@-�3��# .�� ����� �� #�# ��� ���� �+�������3�� #���� ��3��� %� ?��������� �� .�� ����� �� �# *.�,����� �� � -� �� ��# � #��3 ���# ��'� ����� 3,:. �#� �� 866 ��:�� � ��� ���� �:. �# 3�:. ���# #� ;.��>>6 *.�,��� ���� �-����� ��� ���� -������ ��� �3���� ��@�� �� 3������# � ��3,:. �������� �# 56 -��� �� �3� - ��� �� ���� '����� �� 86 �� �

56 �� ��-�3��'��+� � ��� � �� � .�� � .�� 9��@ �*.�,�9.����# �*.�,�9��� �+3�� ����� � �� � 5< �# 57 �� ��� �-����39���� �� .�� �# *.�,� ��-�3��'��+� ��� 3+3��� �� � #Q����# �� ����@-������� ���� ��� - �#�3�� �� � ��- ��# �� � .$ � ��� B�6*�����3 ��+�� ;.--���# $���+����� G���� ��#� *� ��+� �����-� �� ��3�9�-������# ���+�� < ;�H�<= .--���# $���+����� G��9�� ��#� *� ��+��

1������ � ���� ���� ������# � �� ����� � ��� ���-���� .�� ����3����# ����+ �� ��� �-�#� ��� ��� �� ��� 3����� 3��9��������� �� ��� #� �� �+� ��3��#��� ��� #� �� ��� �����������# ���+ '� + ��� ������3+��3����3� ����� ;%��� 5����� ���� ����� �� ���8 ���# �� ��� ��3������� ����#������� .�� �� ���� ����� �� ���?��'�3��+ �3������.�� ������� ���� 3���� ���� ��� .��9 ����# .�L�9� � 95;/���#� �� �� �77B�� &���� ���� �����#+ .�� �� ����+����# �� �� ����3+��� �� ��� ��� �+� ���� ����� 3��@9

��2 $� � �����' %� �"��������� �� ��� ����

3�� .� �����3+��3����3� #���3���� �� .�� �� ���� ����� .���� - �#�������+ ��3��# �� ��� �-�#� ��� ��� �� ��� #� �� �+� �����# ���+ ���� ������� ;��� ���� �-�3���3 ��3������� ��3���� ��# �+ ��� ��3������� �� ��9����� �� ����� �� �� ��� �3��# ����� 3����� ��9����� �� �� ��3��# - �#�������+ �� ��� ������ �

-��� ���� ��� ;� ���� ��� �� .�� �� ����+ ����# ��� 3����9� �+ ;� ������� ���3� ���+ - ��� 3���3������� ������ ��'�� 3����� ���� '�# ;������� �����3� ��� �3����� ����� ��3 �� -��� �L3� �����# �+� = /*L �-����� �# � ��� �+� = $L ��� �+� = ,#� ���= $ � �6 ���

���� "� � ��� � ���# �� �-����3������

������ ������� � ����� � � ������� �������

��� � �� � ��� ��������������������������������� � �!� � �"" ������������������������������� �� #$" � #% ���������������������������������������������� �� #!" � #�� ������������������������������������������������� ��&'( #%� � #�# ���������������������������� ��&'(����)&���� "%% � � ! ������������������������������)&�*� !� � !� �������������������������� ����+*�

�, -����� ���. ��� �/����- �0����� ����������1 �, ���2��. -����� 1 �, ��/���� -�����3 �����/������ ��� ���������� .4��5 &'(, $,�,#�,$�,��,���6�0��6�����"������04�����������1 ��+*�, 7,7,7�,7����������64��"������04�6�.���3 �6� �������� ��-����. 6��� 6�/� ��� .�-�����. � �6� ��8�9 )��������������� ������ )!�"�� ���� �. +�� %� ���)&��3

- ����# ���� ��9����� �� ;%��� 5��� :� � ��# #���� ��3�� �� ����� '�# �� ��� �@- ������ �� .�� ������ ��� -�-������ ����� �� ����3+����

� � #� �� ��+�� �� ��� #����� �� - ����� ���� 3���� ��3���� � �� 3��- �# � ��� ��:. ��'�� ��� �@- ������ ��.�� ����� �� �������� � �� ��� ���'� �-��3��� �� �@��� > �#4 �� - �� + ���� �� ����3+��� �# �� ��� 3����� $�#��� - �#�3��# ���� 3� ��-��#��� �� ��� ����� �� E78 >8� �#>>6 �� � ������# �+ ��� �� ���� 3��� �+-�� ;%��� B�� :���# ��� 3���� �@������# ����� �#����3� -��� �� �� .������� � ��:.�� ��� ���� '����� ������# �+ ?�������'���� ;%��� B�� �����# ��� ��� ����'� ����� �� ��:. � ����� ����� �� .�� >>6 �# >8� �� ���� 49 �� �69����� ��� ����� .��E78 ��:.� /���� �+ .�� - ����� �@- ������ �#��� ����# �� 3��� �+���� �# �.�� ��3 ����� ���� ��� 3���� ���#��� �� � 3��- ��� �� :�� �# ��� 3���� ;%��� <��

G� ��� ��� � 3��3��#�# ��� ��� 3���� - �'�#� ��������#�� �+���� �� ���#��� �� ��� �������3� ��� �� �.�� ���� ����3+���� ���� �� - ��3�� �+ ��-� ��� � ��� 3���� ���#��� �� - �� + �� ����3+��� 3������ ����� ��� ���� �3�� � ���3� � �������� �� ��������� ����� 3���� ��3���� � ;��� �# :�3������ �77<� ��� �� ���� �� ��� �?�� �# �� ��� 3���� ���3� 3� �� 3���� �# �� �� ��9� �� 3��#������ �� ������# -� ��#� �� �����

1�#������� .�� �� ��� 3���� �� ����+ ����# �� ���-� ���3�� ����� ;%��� 8� #������ ���� �+-�3� �������-��� � �� ��� *���� 3��-��@� ��� -��+3���� �����#+ BB57 ���# ����� �.�� �3 �# 3� 3�� ���# �@�����'��+ ���� � �3������� ���+ �.�� �3 ��� �� ��#������� .�� ����� ��� ���+ ���������� ������3+��3����3� ������ ;���� ��� �� ���774= ������� �� �� �777�� G��� ��� 3���� �� ���3����# ���� �.�� �3 � < �� ���� �����#+ '�������# ������#��� �� �.�� �3 �� 3���9�� �3� ��3 �#����� �� ���� 6���� 6�B �� �� #����� ;%��� 8��� ��� �� ������ ����� ������ '�# � �66 �� �.�� �3� H� ���� � ���� ��3����� ������ �-�#� ��� �.�� �3 ����# �� �� �3�� �� �� ����3+����� �� �+� � ;%��� 83�� � ��� 3� �����# �+� ������ �� � ������� '�# �� ��� �@�� �� �� �3�� ����� ������ --� �# �� �����9�-�3���3 � ���+ �� � ��� ���� '�# �� ��� ����3� �� ���- �� + �����#+� $��#��� �� �.�� �3 �� �� ����3+��� ����� ��� � ��� �3��# �� ��'��� 3���� �# �� �� �-�3���3 ��3��� ��3���# �� ����3��'��+ 3��-���# �+ ��� --��3���� �� ���'��.�� ;%��� E� - �- �# � �� ��� 3���� � ��#��� �� ���3���� ��#�3���� ��� ��� ��#������� �.�� �# �.�� �3����# �� ��� ��� ���#��� �����

.##����� �� �.�� �3 �� ��� 3���� � ��#��� �� ��� 3���� ������# �� 3��3��� ����9#�-��#��� ��3 ��� �� ��� �� ��- ����� ���� � ��+��# ���� ��� $ #& ��+ ;%��� >� � �+#��� ������ ���� 3��� ����� � ;%��� >3�� ������� - ����� ���� ��� �� � ������# ���� �6 �� �.�� �3 +���#��� � ���� 59�� <9���# ��3 ��� � 3��- �# �� ��� 3���� 3���� �# �� ���

��� ����� � � ��� �� ������� ! "������

3�� ,� 1@- ������ �� .�� ����� �� �� �� �� ���� �� ����3+���;:��� �# �� ��� 3���� �+ ��9��� ��+���� ��� --��3���� ��- ��� � 3� ��-��#��� �� ��� 3����� ��?���3�� �� �@��� > �# 4 �# �- �������� ����� �� .�� E78 >8� �# >>6 ������# �� ��#� �� ���- �#�3��# ���� ;��� $+ ?�������'� ��� ��3���?��� ��� ��'��� �� �:.

�@- ������ �� � ����# �� �� 49 �� �69���# ����� �� .�� >8� � >>6 �3��- �# �� .�� E78� ��� 3���� �����# � �@- ������ -��� ����3� �� ����� �#����3� �� ��� �� �� �� ���� �� ����3+���;:��� ;���

3�� /� ,���3���� �� .�� �� �+���� �# �� �.�� �� ��� ��-� ����� ��:�� � ��� 3���� �+ ���������� ��+��� ����� ��� �����#������8 �� ��� #���3���� �� .�� � 55��� �� ��� #���3���� �� �.��� ���� � ;���6 �,� �# ��� � ;��B6 �,� .�� �� ��# � �#� ��#� ;����� % �# &� 3��������� �� ��� B ����� �� .�� E78 >8� �# >>6��.�� ;����� ' �# (� �� #���3��# � ��56 �,�

����3� �� �.�� �3� ���� ��3 ��� ��#�3�# �+ �.�� �3 ������ �� 33� #�3� ���� ��� ��3 ��� �� - ����� ���� ��#�3�#�+ ���� � ���� �3�� � ��3� � �*%9� �# �*% ;%��� >�������� 3��3��� ����� ;�66 ��� �� �.�� 3���# ��� �� ��- ����� ���� �� #�3 ��� ��� ;%��� >��

��� ���#��� �� �.�� ������# �� ��� 3��'���� ���.� ������ #���3��# �+ ��� -���-�� +����� �� 1L�9� ;%��� >#��M�������'� ��+��� �'���# ��� �.�� �� 3��#������# ��#��� ��� 3���� �3��# 8 �� 56 �� �# ���� 3��3��� ����������� ��� ��������3 ���� .�������� �������3�����#�� #� �3��#����� ��� ��:. �� .�� �������3���+ ��������# ��� � ���� ����� 3���� � 3��- �# �� 3��� �� 3���� ;%��� >���H��+ ���� ����3� �� ���� '�# ���� �#�� �������3�����#�� ;%��� >���

-���������

��� .������� �+���# - �3� �� - ����� ;.��� �� ���?��9�����+ #��� �����# ������ ���� ��9�-����� ��+3�- ���������� �� �� '� � �3 �����3�� - �3� �� �� � ���� ���#�����3� -�-��#�� �� �������3� ���'�3�A %� ��� �+���# ;.��-�-��#� ���� ��# �+ �-�3���3 - �����+��3 - �3������ �� .���# ����# �� ������ -�?��� �# ��� ���� ��� ������ �� ���3� �� � 3� ��@ �� -������ ����3��# ���� .������� J� #�����;���� � �� �� �748� ;�� �'���� ��� ;/����� �77<= /���#��# � �3� �778��� '� ��� ��3 ��� + :9�� ���� #���� �� .��;�.��� 3�������� ����� �� ���3������+ ���'�� - �����

�%� $� � �����' %� �"��������� �� ��� ����

3�� '� �����3+��3����3� ��3������� �� ��#������� .�� ;�� �#�� 3��� �� �3�9����# �.�� �3 �� ��� 3���� ;�� �# �� �� ����3+����� �-�#� �� � ���� ��3����� ;��� 1�#������� .�� �� ����+���� '�# �� ��� -� ���3�� ����� �- �������� ��� *���� 3��-��@ ����� 3���� ;��� �.�� ����# '�#�+ �� ��� �� �3�� �� ��� 3���� ;����� � �� �� ���� '�# �� -�3��� �� 6�� �� 6�B �� �� ���� ;����� �� ��� ���-� ���3�� ��3������� �� ��#������� .�� ;�� #���� �# � ��#�+� �� ��� ���#��� �� �.�� �� ��� 3��� �� �3�� ;�� �� ��� 3����� �� ���� �-�#� �� ��3����� ��� ������� �� ���� �� ��� �� �3�� ���� ����3+��� �� �� �+� � ;��� :�3��� �� � �����# ���� - �-�#�����#�#� ;���) ������ � �# ��� $ � �6 ��= ������ � ���

#����� ���3� �+ �� '� #�����3� -�+�������3� ���� ;/������ �� �747= ��� �� �� �77<= ��3�� �� �� �77E= ����� �� ���77>� ;�� �'��� ��� ;,� /� ��-� �# .��� � 5666����3��#��� �-������� - ����� ���� ;��-- �� �� �77E= ���� ����� �� �774�� ��� #��� ������� �# ��� �������3� ��� �� .�� ����� �-�#� ��� �� � � +�� ��������

�)������� � �!! �� ����� *����������� ��������� � ��!! � ���� �-� � �� ���� ��� �� ��� ���� �-�#� ��� .�� ������+ �@- ����# �� ����+ ��3��# �� ����3+���� ���� ��3�9������ ##� .�� �� 3����3���� �� - ������ - ����� �� ����� ����3+��� ��3��#��� ��9����� �� ;������ �� �� �777� ���3+���� ���� �8 �# ��< ;%��3�� �# ���� ��� �74>� �# ����� �� ���� 3����������� ��3� � L,L �3�-�� ;���9��9�������� �� �� �74>� *���� ���"�� ���������9���#�����+3�- ����� ;G�� �� �� �747� �*%9� ;$ �#�� �#* ��� �74>�� � �����3��� ; �3�� �# * ��� �777�� � ������ ����� ��� ��� 3���� � ���� �������� ;L'�� �#/�� �745� �� ��� ���+ #���� �� ���� �@- ������ �� ��� 3���� �� � - ��3�� + ��9����� �� ;��� �# G�� �747= �������� �� �777�� $+ ��+���� 3 ���9��3����� �� ��� �����-�#� ��� �� ����# �� �Q� #���� ��3�� �� ��� ��'�� �� .��- ����� �@- ������ ���� ��� �� ����3+����

� ����� ���� ���� �� ����3+��� �� 3���� � �# ���3���� �-���������+ ���� �����# ���� �� ����3+�� ����;$����- �� �� �744� �+�������� B .�� ����� ��A .�� >>6.�� >8� �# .�� E78� H� ?�������'� ��� ���#��� ������� .�� >>6 � >8� � �@- ����# ���� 49 �� �69���# ����� ��� .�� E78� � ��� ��� 3���� .��E78 �@������ ��� ���������'�� �� �@- ������ ;/�#� ��� �� �� �77<�� ���3� �� ����93+��� ���� ���� ���9��� ��� 3��� �+-�� #���� �������3���+� �� ��� ��� 3���� �� ��� �@- ������ �� .�� ����� ��� .��

�� �� ����� �� �+ 3��� ����� �� ��� ���� -��� �� �@� 3����� �.�� �����# �+ �� ����3+���� 1 �+ 3��'�� � �� � �����3�� ����� �+ �� ����3+��� --� �� �� ���� ������ ; L�9�� �# 9�� ;����� �� �� �77E�� � �� � +�� ������� ����'� �+ ���3� �3�� � ��� ����� �� �.�� �� �� ����3+��� �� ������#� H�� ��3����� �� ���� #���3��# �� ��+ �3+������ � �/� ��������� ��� ����� �� �.�� <9 �� �69���# ��'� ������ 3���� ;* ��� � �� �� �778 ���

������� � ��!! �� ��� ����� � *������������.�� �3 �# ���'� �.�� --� �� 3��-��� �� ��� ��� 3���9�� �3� ���#��� ����� � ���#��� �� �.�� �3 �� ����3�����+���3��# �+ ���'� �.�� #� �'�# � �� 3��#������# ��#� ����� 3����� ���3� �.�� �3 ���#��� �� �� ����3+��� -9-� � �� �� �-�3���3� ��� ���#��� �� �.�� �3 �� ���� ����� ���� ��#���# �+ ��@����9�������'� - ����� ;������� �� ���777� �# �� �� ��� ���� /�� ���� �� �3��# � �����66 �� �.�� �3 ���� �,9'���� �� ���� �8 �� ;��-��9�����#�� ����� #� � ������ ��� ��� �� '���� �� �.�����#��� �� $ �6< �# �� %��L98 3���� ���3� �@����� ���� <666���#��� ����� -� 3��� ;������� �� �� �777�� ��� 3��'���� ���.� ����� �# ��� - ����� ��'� ��-���� �� �.�� �3�� ����+ ������� ��� �@�����3� �� ��������� ���� �� �3�-�� �� �.��� ��3��� ���� '����� � �� �� ��� �� +��--� � ��� '��� ��� ���� -����'� �3�-�� - ����� �� - � ��- ��@������ -��� ���� �� ��3 �#����� �# ������� ���� ��� ����# ���� �����# �# � ���� �# �� ��#������ �#�+������� ;������� �� �� �777�� �.�� ���#��� ��3 �#�9���� �+ 3� ��-��# �� ���� �� ��� - �'�����+ #���3��#�� ��+ 3��� �+-�� �# ��-��3��# �� �-� �� �� ������ ��#�3���� �# �� 3��� #������ ;�� �'���� ��� ;/������# ����� �77>= � #� �� �� �774= ���-� �774= $ ����# L��#�� �774��� �.�� ���#��� �� #�����3� � �� ��#��9����� .�� ���3� �� ��� ���� ����# �� �� �������# �� 3����� �3� ��3 �#����� ;/����� �� �� �774��

G�� �� ��� �+������� �� .�� ���� -�3� ����+ �� ����� ����3+��� ��� ���#��� �� �.�� �3 ��3��#�� �� ����3+����� �� 3��� �+� �� ��� �������3�3� �� �.�� ���#��� �� 3���� �� ���+� � �� ��3�� � ��� ��- ����+ ��3��# 3���� � -���9������3 �� �� �� 3��#������� �� ��� ���#��� �� �� ��� �� + � ���# �� 3� ��+ ������ �� ��- ��� 3���� �.��- ��3�-��� �� ��� �������� �� �� ����3+�� #���� ���������# 3��� #����

��!! ������� *���������� ����������&-�� ���#��� �� 3��� �� �3�� �.�� �3 �� ��� �� ��3 ��� ��� �� �� - ����� ���� �� �� ����3+��� ���� 59 �� <9���# ����������� ��� � �6 �� �.�� �3� .� ��� ����� �� ���� ���#+��� � ����9- ������� ����3� �� �.�� �� ����� �� ��� ����3�� ���*%9� �# �*% ��� �Q� ������ � �� �� ����3+��- ����� ���� ;$ �#�� �# * ��� �74>�= G� �� �774����� � ����9- ������� 3���� �� �.�� �� �� ����3+���--� � ����� �� �*%9� ��� �� 3��� �� �� �*% �� �� ���#�� � ���3 ��� ����3�� ���� '��� �� ��--� ��# �+ ��� ���� '9���� ��� �.�� �� ��� 3��#������# ��#� � �� ��� 3���� �3��� 3��3��� ����� �� 8 �� 56 �� ���3� � ������ ����-����� ��������3 ��� �� �.��� $��� ����3�� �� �@��������+##�# �.�� � ��� ��� � �3��# ���� �- ���+ ���#�#��� 3���� ��� ��� �� � ��� ���� ����� ��#������� �.��3��3��� ������ H� ���� '����� ���� �������� �������3���9��#�� #� �3��# ����� ��� ��:. �� .�� �# ��� �� ���3�.�� �@- ������ �# �� ����3+�� - ����� ���� ��� -���� �� ����3 ��� ���3���� �� �.��� ,�� �� ��� � ����9- �������

�%% ����� � � ��� �� ������� ! "������

3�� %� ��������� �� �.�� �3 ���#��� �� ��� 3��� �� �3�� �+�-������� 3���9#� �'�# ���'� �.��� $��#��� �� �.�� �3 ;�� �$/ �������� �� �#�3�# ���� 3���� �� � - ���3����# ���� ���'� �.��;�.��9�� �3��# � 3���� ������ ���� ��� �����# ��3����# ����3���� �� � - ���3����# ���� �.��9� �� ��#��� ;����� �����

����3� �� - �-��� ��� 3���� � ��#� ��--�������# �����6 �� �.�� �3 ���3� �� �� ��#� � �'� ��� �� ���� ���� �� �� ����3+��� �� '�� ��

G�� �� ��� � ����9- ������� ����3� �� �.�� �� �� ����93+��� �� ���� ����� ��� -�-��#� ����� 3 +��� ���� 3��'��+�� ����� ���#�������#� � �� ����'� ����� ��� ��� :9�� ����#���� �� �.�� 3������ �����+ 3���� '�# 3+������9 �3� ����� ;/��� �� �� �77<� �# 3 +��� �� �3�� � #� ���������� �� ���� #���� �.�� 3� �� �� #�# � ��� ����� ��

��� 3+������9 �3� � ���� �3�� ����+ 3�������� #������#�9���#�# �9�� -�� ���-� ;����Q��� �� �� �777�� ���� ����+��� ��3��#�� ��-��3+�� � ���� �3�� ;"��� �� �� �774����3� �� �+��������# �# �����# �+ #� �� ��� ������ �#����� �� �������� � ���� �� �� ����3+��� �� - 3 ��������� ;�������� �� �� �77�= ��������� �775= G� �� �� ���775�� ��� :9�� ���� ����� �� �.�� �� ��� ��� � ��3����#� ��� ���� ��� �� ���� � ���#��� �� ��� ���#��� ���.�� �# ��� �����?���� 3����� ��-������

�%3 $� � �����' %� �"��������� �� ��� ����

3�� (� 1���3� �� �.�� �3 �� - ����� ���� �� ��� 3���� � #���3��#�+ ��� $ #& ��+ ;� �# �� � �+ ��� #��� ������� �� ���� 3�������� � ;��� �.�� �39�'���# 3��� - ����� ���� �� 3��3��� ����#�-��#��� ���� ������� ��� � �6 �� �.�� �3� ����� 3��3��� ������� �.�� �3 ;�66 ��� ������# �� �#�3�# - ����� ���� ;��� ��� ����3��� �.�� �3 �� ���� ��� ��� � ��� ����3� �� ��� ���� ����3����� ���� �3�� � �� �� �*%9� �# �*% ;��� �.�� �3 3�� �� ���� ���3��'���� �� �.� ����� � ��#�3��# �+ ��� -���-�� +����� �� 1L�9� �6 ��� ��� ���������� ;��� .��� � ������ �� 3���� ���� ���������������3�����#�� #� �3��# ����� ��� .�� ��:. ��� ��� ��- ����� ���� �� � � ��#�+ �#�3�# �+ ���� 86I ;�� � 3��- �#�� ��� ��� �� 3��� �� 3����� ��#�� �������3�����#�� �# ���+ ���� �# �������3��+ ��� �������3�� ����3��� ;RA -� 6�68��

���������������� G� ���� , �� �� $�+ ����� �# *� ������-����� �� ����3�� $�����+ ;���#���� �� �� ��� ����3���������#�+ 55��� , � 1� ��� ;/� ,���� &/.� �� ��� �����#+���8 �# , � :� 1� %������ *� �� ��3� ���� 3� ����� ;���#���� �� �� - �'�#��� ��� ��� 3����� G� � � ����� �� , ��� G��� ,�- ����� �� �����3� $��3������ + ;$���� �� - �'�#����� ���� ��� *.�,� 3,:. 3���� �� , � .� �3� �������� ��1@-� ������ ��������+ ;$���� �� '����� ���- �� ��� ?�����9��'� ��� #��� ������� �# �� , � �� �(�� ;� ������-��� $ !����� - �'�#��� �� ���� ������ ��-��� � �� ���� ���-����� G� ����# ������ ����, �� �� ������� �#G�:���!��� �� #��3������� �# 3 ���3� �#��� ��� ����3 �-�� G� � � ����� �� ��� $��� G��� �# ���$����� $���� �� ��3���3� ������3� �# �� �� ���� $ !�������# ���� :����+ �� ������3� �� ������� ��� - ����� ���� ��+������ �� � �� ��--� ��# �+ ,����3�� %� �3������������3��� ;%� 9�3�� ��--� 0�� ����3+���9� ����� ���� ��# #���� ����� �� L��������� #� 1-�#� ���2� �+ :� # ���� G������� ��� 3� � �� �# �+%��#� #� ������3��� �#��� ���

1�������

$ �#�� N� * ��� �� ;�74>�A �� �� 3���� �+-�� �� �� ����3+������� #���� ��� 3-3����� �� �����-��3����� � �3� :��� .3#� /3��&/. 4/ 5B65 S 5B6E�

$ �#�� N� * ��� �� ;�74>��A ���� ��� ���� �� �������� �� �������# � ���� �� �� ����3+�� 3�������A ��� ���� �� � ���� ����� ���� �3�� �-� �# �-�#� �� � ���� �3�� � ���� '* ��B� S��B>�

$����- �� ,� ��� 9��� ���'�� �� �� $ ���� ���� ,� �� ������ � ��� .� %������ :� 1� ;�744�A :� �� �� ��������� �� �-���������+ ���� ������# ���-���# ���� �� ����3+�� 3��� ������� ���� $���� )*% >E� S >>��

$ ��� ,� .� L��#�� 1� ;�774�A %��3����� �� ��-�# ��� �� �������3����� ���� .���� ��'� ���� ,�'� $���� )/ ��� S �BE�

,� /� ��-� $� .��� � G� ;5666�A � �����+��3 - �3������ �# 3����������3� ���3����� �� ��� �+���# - �3� �� - ������ �� ���� /3�� )),�48> S �4>6�

1�#� �� �� %���� *� �� L��#?���� �� $� $������ *� L� ����������� �� �����+ �� �� � � 1�������� �� L� ,� +�3� ����� ���� �� ��;�747�A H'� �@- ������ �� � ���� ���� � ���� �3�� �� -�� ���3�-�#� ���� /3���3� ./, 4�� S 4�<�

%���� �� ���� ��� �� .� ;�74>�A ���� �� �3� �# 3+���������3����� ���3���# ���� �-�#� �� �� ����3���� �# #���� ���������� � �� 3���� �� �� ��� +���3 ���� ����� ,�'� $���� ))& 5B� S 5<��

* ��� � �� /� ��-- *� �� ����� �� �� ��� �� ;�778�A �������#H9��+3��+����� �� ��� .������� �9.< �+���# - �3� �� - ����� ����+ �3+���� 1� � �� ���� $���� %% B7 S <E�

* ��� � �� /� L�����+ �� ����� �� �� ��� �� ;�778��A L�3���9���� �# ������# ����� �� .������� �+���# - �3� �� 9����- ����� �� ��+ �3+���� L�� �'���� (. 8�B S 85B�

* ���� �� *� ;�745�A ����3���� �����#+ �� 89� ���9 �# 89��#�#��@+� �#���A . ��� ����� �� #���3���� �� ,:. �-��3�����/3���3� .)4 <>< S <>8�

*�� L� ,��������� L� %�3�� 1� ;�774�A �� ����3+�� � ���� �3�� �� �?�� �# �� �� #�'���-���� ��� ��� �� ����# ������� *����,�'� )* �E8 S �>8�

��� �� .� G�� %� �� ;�747�A /��� 3����A ��� ���� ���� �#�������3� �� 3����� #�'� ���+� ,�'���-���� )*% E�7 S EBB�

� #� �� /3�������� �� �� �#� �� /����� �� ;�774�A L�-�# #������ �3�� � �� ��� -��� ���� �� �'���# �+ -�3���� ������ �� 3��-������� �� ����� $���� )/) 757 S 7<5�

������� �� ���� ��� �� &� ����� �� �� ����������� �� $�� �� �� ��� �� ;�777�A $��#��� �# ����3��'� #���3���� �� �����3 ��� + :9�� ���� #���� �� ��� .������� �+���# - �3� �� - ����� �� 3��� �� �3��� �� �����3���� �+��3���� /( B>B S B45�

���-� :� �� ;�774�A ,� ��+3���-�# ��3 �#����� ���+ �@���T �� �$���� 4 ��< S ��E�

����� *� $ �3��� �� /��� �� �#���� �� %���� ��G� �� /� ;�77E�A ,���� ����� �������� �� - �9�������� +3+������� #� ��� ����# ������ �� �� �� �# ���3�3� ��3��#9� ���# ��3�� �+������ 4 8<4 S 88E�

�3�� /� * ��� �� ;�777�A $����3��� ���3 ����� - ����� ���� ����3+��� �# �- �#�3��'� �� � 3���� ���#� �� ��� �:. ����- ����� � � �3� :��� .3#� /3�� &/. &% 7E54 S 7EB5�

������ &� $� L����� /� G�� %� �� ;�777�A ��� �-��� ���������-������� ���� 3���� �# ���� - ����+ �� ��� ��� �+� �� �����-�#� ���A ��� '��� ���# �� �����9����� �������� �# ��������+���� ,�'���-���� .% 5<67 S 5<�4�

��� L� G� :�����+ �� ��3� �� �� /3���� � ,� ����� 1� H�� �,� .� /���� �� ;�77<�A ��-��#�� 3�������� ��� �1��/ ��?���3��� �+���# ���).< - ����� - �3� �� ���# 3��� �� �3� �# - �������� ��� �@�������� �� :�� ��3�� )/ 8<E� S 8<>6�

L'�� �� �� /�� ��9�� ;�745�A ���� �������+ �� ��� �� ����3+���A�� -������3� �# ���3����� 3� �������� /3���3� .)' �5B7 S�5<��

��9/������� :� /������+�#��� .� %������ :� 1� ;�777�A�� ����3+�� � ���� �������� �� ��� ����� 3�3���� �� '� #�����- 3 ��� ��3������ �� ���� /3�� )). �4<B S �48B�

� ��� �� ;�77>�A G���# ������ S ����� �� -� ��3� ���� ����� 9����� /3���3� .(% >8 S 4��

����� 1� G�����# �� 1� ��3�������� 1� �� .� �� �� ������ + �� ������ � � /���#�� 1� ��3�� L� ;�77>�A .�+���#- �3� �� - ������ - ���3� ��� ��� �� � ������3 ��3� ����� 3����# 3� ���3 �@3�����@�3 ��Q� ��� �� '�'�� :�� ��3�� (4 �B8 S �<E�

���� � �� L� ������- *� /���� *� ���������� �� � ���� �� :�$�+ ����� �� ;�748�A :�� ��� � ���� �� 3� �� � �+���#A��� ���� ��� + ������ �� .������� J� #����� 3����� ��� ���- ����� � ��� �+���# �� -�?�� 3� �� �# ����# '������� 1�$H �� /5>8> S 5>EB�

�������� �� �������� �� N������ �� :��� �� ;�77��A� ��# ���������� �� � ���� �# �������+ �� ���� �� ����3+����+ ��-��3+�� � ���� �3�� � 1@-� ���� ���� )&% ��< S �56�

��������� �� �� $� �� �� 1� ������� �� ����� N� ��#� ��� �� .�G� � "� ,� +�3� �� ;�778�A 1-������� ����� ��+ �# ������ ������ � ����3� �3���� �-�#� �� � ���� �3�� �3�-�� � :�� � ,(%BB> S B<��

��� �� :�3������ $� ;�77<�A �����'���� �� ���� �-�#� ���� ����3+��� �� �� ��9� �� � ���� ��#���� �A � �� L���� 1� $�L�� %� �� G�� ;�#���A ��� �� ����3+�� ��#����� ��� �#��&��'� ���+ � ��� ��� �#�� --� �> S �7�

�����9�������� .� �� * +��� /� G�Q��� �� �� �� ��� $� �� 1��� �� �� ;�74>�A L�� #�����+ ��-�- ����� �3�-�� �@- �������� �� ����3+��� �� �� �� �# -�� ���3 �-�#� ���� �� �'����,� ����� 4& 8�B S 8�>�

��3�� L� .� �� �� �� ����� 1� ;�77E�A :�� �� �-��3 �#��� �- ���3��'� ����3�� �� �.�� �� � ������3 ��3�� .��� :� N�.3#� /3�� ((( 45 S 44�

:���� /� %���3��� �� /�#� ,� :� ;�775�A �� ����3+�� �+�������� �A �� �� ����� �� �� ;�#���A .#'�3�� �� ,� ������+� ����+ N� $���� �3� /�� L���� ���� > --� 4B S �6��

������ �� G� :��� /� ����� �� L� ���� *� L� �� ;�747�A1@- ������ �� � ���� ���� � ���� �3�� �5 �:. #� ��� �� ����� -���������� ,�'���-���� )*% >87 S >E>�

���� ��� �� &� ������� �� /�U�� �� ���� �� N� $�� �� H�� �,� .� �� ��3� �� �� �� ��� �� ;�774�A % �� #���� �������� ��- ����� ����A ��� ��3 ��� + �+���# - �3� �� - ����� � ��3���#��� �� � ���� �� ��+ ��# �-������� 3����� � �3� :��� .3#� /3��&/. &' �>>6 S �>>8�

��������� �� �� ;�775�A * ���� �3�� � �� 3������� ������+ �##������ �A �� �� ����� �� �� ;�#���A .#'�3�� �� ,� ������+�����+ N� $���� �3� /�� L���� ���� > --� 88 S 45�

��-- *� �� * ��� � �� /� ���� ��� �� &� ������ ��� /� ��L�����+ �� �� ��� �� ;�77E�A * ���� �������� �� ��+ �3+���;%��L9893����� �+ ��� ��3 ���# �3��#���� �� �9�+���# - �3� �� 9���� - ������� 1�#�3 ������+ ),( �7>8 S �74B�

����Q��� �� �--� �� %��� /� �� ��� + .��3����� + G� �� *����,� ����� L� ������- *� $�+ ����� �� ���� � �� L� � ��

�%4 ����� � � ��� �� ������� ! "������

�� G� ;�777�A � +��� �� �3�� � �� ��� :9�� ���� � ���� �3�� 9����#���� �� .������� �+���# - �3� �� - ������ :�� � /� �3��$���� % B5> S BB��

/���� �� /��#����� ��3� �� �� ���� :� ���� *� /3���� � ,�H��� �#� � �� /3���� ,� $� ;�747�A /�3 ���# �� � �� �+���# �- ����� - �3� �� �� ��'��'�# �� ��� � ���� �������� �� ��� ����������� '4 E�8 S E55�

/�#� ��� �� ���� � �� L� $�+ ����� �� ;�77<�A �.<9�+���#- ����� - �3� �� ��:. ����� �� ������� �@�� �8 � ���?������+�@- ����# �� � ������� ��3��#��� � �� ��� ��� �� ��� ���� �� $��������� .%& �8�6 S �8�>�

/3�(��� �� '�� ���� *� ;�74>�A � �3���9��#��� #�#�3+� ������9-��+3 +���#� ��� ���3� �-�� ���� �� ��� ��- ���� �� - ������ ����� ��� � �� � �� �66 �,� .��� $��3���� )%% BE4 S B>7�

/����� ,� �� ;�77<�A ���� ������+ �� ��� �+���# �9- ����� - �3� �� �# ��� ��3����� �� .������� J� #������ .���� ��'� ���� $���� )*B>B S <6B�

/����� �� ����� 1� ;�77>�A %��3����� ��� �� 3��� ���� ����:�� � ,4( 8E7 S 8>5�

/����� �� ����� �� ,� /� ��-� $� $�+ ����� �� ,���� �� *�/����� �� ;�774�A �������� �� #�-������ �������� ��� ���� ���� ���9�+���# �� ��--�3�-� ��� ���� � �3� :��� .3#� /3�� &/. &'E<E6 S E<E<�

/���#� /� /� ��� 1� �� ������ �� :� �� + *� � �3� ,� L� ;�77B�A #������3���� �# � ��-� � �� ����9������ �+���# - �3� �� - �9����� �� � -� �-�� � �� '��� �+����� �� :�� ��3�� ), B�BE S B�<5�

/���#� /� /� � �3� ,� L� ;�778�A ���� �� ��� ���9�+���# - ����� ��.������� J� #������ %./1$ �� & BEE S B>6�

/��� ,� �� :� 3���� �� ���# *� �� �� �� ��� �� $�+ ����� �� ���� � �� L� ;�77<�A . ��- ��9���#��� #���� �� ��� �+���#- ����� - �3� �� �� .������� J� #����� �� ��'��'�# �� ��� ����9���� �� ��� ��� ���� ����� �� :�� ��3�� )/ 5��> S 5�5>�

/���� �� �� $�� �� ,� �� :�3������ $� �� ;�77<�A �� ����3+��� �#����������3� 3+�������� �A � �� L���� 1� $� L�� %� �� G��

;�#���A ��� �� ����3+�� ��#����� ��� �#�� &��'� ���+ � ������ �#�� --� BE8 S B77�

�� �#���� ,� G� ,������ .� .� ����� L� .� ��������� ��L�3��� &� N�� ,� L���� �� ��� ��� �� �� �- �� � ���� �� $ � # �� .� /�� � �� N� ���� � �� �� ������� ��;�778�A � ����# #�� �-���� �� ����� 1*% �3�-�� A ����3� �� ������3�3�� ���# �� ����� -�����+-�� :�� � .%& 5B6 S 5B<�

������� �� �� 3���� .� �� ��� �� ;�777�A ��� ��3 ��� + �3��#�9��� �� ��� �+���# - �3� �� - ����� �� ��#�3+����# �� ����3'����� ���� $���� ���� )* B�B ;.��� 3���

G�� %� �� ������ /� %���� �� ��#��� ,� L� ��## �� /����� +�� �� ;�747�A H���� �� �@- ������ �� -���� ��3���9���#��� ��+3�- �9����� �� 3� ����# ���� �� ����3���� �� �� ����3+��� #� ��� �����-�#� �� #�'���-���� �� '�'� �# �� '�� �� �� ���� /3�� &/ B88 S B87�

G��� �� G� .� ��3� .� /3������� �� �� $�#������� %�'�� ,������� .� ������!��� ,� /������9G��� $� ;�77>�A .��-������# - ���3�� �� ��:. ?������3���� ����� �����# 3��-�9����'� ��9���� $��3���� $��-�+�� ���� ������� .,) 4�B S 4�>�

G��#���� .� �U��� *� $���� ,� %��3�� �� /���� �� ������ � �� L� $�+ ����� �� ;�747�A #������3���� ���������� �#��3������� �� - �3� �� � �� .������� J� #����� .< �+���#- ������ ���� '( ��8 S �5E�

G� �� /� ���� � �� *� L���3�� �� �� %���� 9�3� %� $�#�� �� G������ L� �� ;�775�A L �� ��#�3���� �� �� ����3+�� � �����3�� �@- ������ �� ��� #� ��� #� ��� ����# ������� � �3� :���.3#� /3�� &/. &4 E47E S E766�

G� �� /� ;�774�A �� ����3+�� � ���� �3�� A ���?�� -�+� ���-������� �-� - �3������ �+������ * ���� %3�� ��'� & �8B S�E8�

"��� �� ������ �� �� ����� �� ,� /��� /� �� G�������# �� ������� �� /� $��� � ,� �� $+ # �� .� ;�774�A ��� �������� �� �3�� ��� ��� :9�� ���� #���� �� ��-��3+�� � ���� �3�� �'��� -������� ��- ��9���#��� ����� /� �3�� � % �67 S ��E�

�%5 $� � �����' %� �"��������� �� ��� ����