1

A SZALICILSAV-FÜGGŐ VÉDEKEZÉSI MECHANIZMUSOK ÉS A

STRESSZTOLERANCIA KAPCSOLATÁNAK VIZSGÁLATA

BÚZÁBAN

KOVÁCS VIKTÓRIA

ELTE Biológia Doktori Iskola (Dr. Erdei Anna)

Kísérletes Növénybiológia Doktori Program (Dr. Szigeti Zoltán)

Témavezetők:

Dr. Pál Magda

tudományos főmunkatárs

Dr. Janda Tibor

tudományos tanácsadó

Martonvásár

2014

2

TARTALOMJEGYZÉK

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ................................................................................................. 5

1. BEVEZETÉS ........................................................................................................................ 7

2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS ................................................................................................ 8

2.1. Általánosságban a növények és stressz kapcsolatáról ......................................................... 8

2.2. A növények védekező rendszere. ........................................................................................ 9

2.2.1 Az enzimatikus védekezőrendszer .................................................................................. 10

2.2.2 . A nem-enzimatikus védekező rendszer ......................................................................... 16

Aszkorbát. ................................................................................................................................. 16

Fenolok ..................................................................................................................................... 16

2.2.3. Védelemben szerepet játszó egyéb vegyületek .............................................................. 17

Poliaminok ................................................................................................................................ 17

2.3. Biotikus és abiotikus stresszorok okozta változások ......................................................... 18

2.3.1. A lisztharmatfertőzés hatásai .......................................................................................... 18

2.3.2. A kadmiumstressz hatásai .............................................................................................. 20

2.3.3. A szárazságstressz hatásai .............................................................................................. 22

2.3.4. Az UV-B sugárzás hatásai .............................................................................................. 24

2.4. Szalicilsav a növényekben ................................................................................................. 26

2.4.1. A szalicilsav élettani hatásai ........................................................................................... 26

2.4.2. A szalicilsav bioszintézise ............................................................................................. 27

2.4.3. A szalicilsav szerepe biotikus és abiotikus stresszek során............................................ 29

2.4.4. A szalicilsav hatásmechanizmusa és annak szabályozása .............................................. 32

3. KUTATÁSI CÉL ............................................................................................................... 37

4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK ...................................................................................... 38

4.1. Növényi anyag, növénynevelés, kezelések paraméterei .................................................... 38

4.1.1. Búza növények nevelése és kezelése földben ................................................................ 38

Szántóföldi kísérlet ................................................................................................................... 38

Üvegházi kísérlet ...................................................................................................................... 38

4.1.2. Búzanövények nevelése és kezelése tápoldaton ............................................................. 40

4.2. Vizuális morfológiai változások értékelése ....................................................................... 42

Lisztharmat-fertőzöttség mértékének fenotípusos meghatározása ........................................... 42

Levélcsavarodás mértékének pontozása PEG-kezelt növényeken ........................................... 42

4.3. Relatív klorofilltartalom mérése ........................................................................................ 42

3

4.4. Klorofill fluoreszcencia indukció mérése .......................................................................... 43

4.5. Szalicilsav-extrakció és mennyiségi analízis..................................................................... 43

4.6. Poliaminok mennyiségi analízise ...................................................................................... 45

4.7. Korizmát-szintázt és izokorizmát-szintázt kódoló gének (CS és ICS) kifejeződésének

vizsgálata valós idejű PCR-rel .................................................................................................. 46

4.8. A fenilalanin-ammónia-liáz (PAL) aktivitásának meghatározása ..................................... 46

4.9. Antioxidáns enzimek kivonása és aktivitás mérése ........................................................... 47

4.9.1. Glutation-reduktáz .......................................................................................................... 47

4.9.2. Glutation-S-transzferáz ................................................................................................... 47

4.9.3. Kataláz ............................................................................................................................ 48

4.9.4. Aszkorbát-peroxidáz....................................................................................................... 48

4.9.5. Gvajakol-peroxidáz ........................................................................................................ 48

4.9.6. Monodehidro-aszkorbát-reduktáz ................................................................................... 48

4.10. Prolintartalom meghatározása ......................................................................................... 49

4.11. Lipidperoxidáció meghatározása ..................................................................................... 49

4.12. Statisztikai analízis .......................................................................................................... 50

5. EREDMÉNYEK ................................................................................................................. 51

5.1. Levélrozsda- és lisztharmatfertőzés hatásainak vizsgálata nagyszámú búza genotípusban

szántóföldi körülmények között ............................................................................................... 51

5.2. Lisztharmatfertőzés hatásai búza genotípusokban üvegházi körülmények között ............ 56

5.2.1. A lisztharmatfertőzés hatásai szelektált, fiatalkori búza genotípusokra ......................... 56

5.2.2. A lisztharmatfertőzés hatásai felnőttkori Thatcher-alapú közel izogén búza vonalakra 60

5.3. Különböző abiotikus stresszek hatásai négy, eltérő SA-tartalmú búza genotípusra ......... 65

5.3.1. A kadmium hatásai ......................................................................................................... 65

5.3.2. A PEG-kezelés hatásai ................................................................................................... 73

5.4. Az UV-B sugárzás, Cd- és/vagy PEG-kezelés önálló, illetve kombinált hatásai

búzanövényekre ........................................................................................................................ 79

5.4.1. Morfológiai változások ................................................................................................... 79

5.4.2. Változások a prolintartalomban ...................................................................................... 81

5.4.3. Változások az MDA-tartalomban ................................................................................... 82

5.4.4. A különböző kezelések hatásai az oHCA- és SA-tartalomra ......................................... 83

5.4.5. Változások a PAL aktivitásában ..................................................................................... 84

5.4.6. Változások az antioxidáns enzimek aktivitásában ......................................................... 85

6. EREDMÉNYEK MEGVITATÁSA .................................................................................. 87

4

6.1. Nagyszámú búzagenotípus vizsgálata szántóföldi körülmények között ........................... 87

6.2. Biotikus stressz hatásai 4 különböző búzagenotípusban ................................................... 89

6.3. Különböző abiotikus stresszek hatásai búzában ................................................................ 93

6.3.1. Különböző koncentrációjú Cd hatásai búzanövényekben .............................................. 93

6.3.2. A PEG-kezelés hatásai búzanövényekre ...................................................................... 100

6.3.3. Az UV-B sugárzás hatásai Cd- vagy PEG-kezelt búzában .......................................... 105

7. ÖSSZEFOGLALÁS ......................................................................................................... 109

8. SUMMARY ....................................................................................................................... 111

9. FELHASZNÁLT IRODALOM ...................................................................................... 113

PUBLIKÁCIÓS JEGYZÉK. ............................................................................................... 141

Az értekezés alapjául szolgáló publikációk ............................................................................ 141

Az értekezés témájához közvetlenül nem kapcsolódó publikációk ....................................... 143

Köszönetnyilvánítás ............................................................................................................... 144

5

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE

ACN: acetonitril

AGM: agmatin

APX: aszkorbát-peroxidáz

ASC: aszkorbát

BA: benzoesav

CAD: kadaverin

CS: korizmát-szintáz

DHA: dehidroszkorbát

DHAR: dehidroaszkorbát-reduktáz

DTNB: 5,5´-ditio-bis-(2-nitro-benzoesav)

EDTA: etiléndiamin-tetraecetsav

Fm’: maximális fluoreszcencia fényadaptált állapotban

Fs: steady state fluoreszcencia fényadaptált állapotban

G-POD, POD: (gvajakol-)peroxidáz

GR: glutation-reduktáz

GSH: redukált glutation

GSSG: oxidált glutation

GST: glutation-S-transzferáz

γ-EC: γ-glutamil-cisztein

ICS: izokorizmát-szintáz

KAT: kataláz

MDA: malondialdehid

MDHA: monodehidro-aszkorbát

MDHAR: monodehidroxiaszkorbát-reduktáz

MeOH: metanol

NADH: β-nikotinsavamid-adenin-dinukleotid, redukált

NADP+: β-nikotinsavamid-adenin-dinukleotid-foszfat, oxidált

NADPH: β-nikotinsavamid-adenin-dinukleotid-foszfat, redukált

NahG: szalicilát-hidroxiláz enzimet kódoló gén

oANI: orto-anizinsav

oHCA: orto-hidroxifahéjsav, orto-kumársav

PA: poliamin

6

PAL: fenilalanin-ammónia-liáz

PC: fitokelatin

PCS: fitokelatin-szintáz

pHBA: para-hidroxi-benzoesav

PPFD: fotoszintetikus foton áram sűrűség (photosynthetic photon flux

density)

PS I: első fotokémiai rendszer

PS II: második fotokémiai rendszer

PUFA: többszörösen telítetlen zsírsav (polyunsaturated fatty acid)

PUT: putreszcin

PVP: polivinil-pirrolidon

ROS: reaktív oxigénformák (reactive oxygen species)

Rubisco: ribulóz-1,5-bifoszfát-karboxiláz/oxigenáz

SA: szalicilsav

SAR: szisztemikus szerzett rezisztencia (systemic acquired resistance)

SPD: spermidin

SPN: spermin

TBA: tiobarbitursav

TCA: triklór-ecetsav

7

1. BEVEZETÉS

Napjaink egyik legfontosabb kérdése, hogy lesz-e elegendő élelmiszer bolygónk egyre

növekvő lakossága számára. Évről évre súlyos élelmiszeripari és gazdasági károkat

eredményeznek a szélsőséges időjárás okozta változások, úgymint az aszály, az egyre

erőteljesebb UV-B és -C sugárzás, a hatalmas szélviharok, az ár- és belvizek, az enyhe telek

és az ezek következtében felszaporodó kártevők, valamint a gyorsan módosuló patogén

ágensek élelmezésre használt növényeink termésminőségére és termésmennyiségére kifejtett

negatív hatásai. Szerte a világon szakemberek ezrei dolgoznak azon, hogy a különböző

gyümölcs-, zöldség- és gabonaféléket ellenállóbbá tegyék egy vagy inkább több károsító

tényezővel szemben lehetőleg termésveszteség nélkül, sőt inkább növelve az áruba bocsátható

termékek mennyiségét.

A másik kérdés, hogy a megtermelt növények és a belőlük készített élelmiszerek milyen

minőségűek. Ma már sokan gondolják úgy, nem elegendő a létfenntartásunk számára kielégítő

táplálékhoz jutnunk, hanem annak az emberi egészség számára még hasznosabbnak kell

lennie. Részben ez a gondolat motiválja azokat a kutatásokat, amelyek során például egy-egy

növény fehérjetartalmát még jobban megemelik (banán, szója), amelyeknek főleg az éhínség

által sújtott országokban van nagy jövője; vagy a termés aminosav-tartalmát az emberi

szervezet számára felhasználható legideálisabb összetételűvé alakítják. Hasonló jelentőségű

terület a növények általi vakcina-termeltetés is. Annak érdekében, hogy a növények

minőségét úgy befolyásoljuk, hogy azok sokkel egészségesebbek és hasznosabbak legyenek

az emberi egészség számára, nem szükséges rögvest genetikailag módosított növényeket

előállítanunk és használnunk. Számos gyógyszerünk előde növényi eredetű volt és

hatóanyagaikat ma is használjuk. Ilyen például a szalicilsav (SA) is, melynek acetilált formája

Aspirin néven közismert láz- és fájdalomcsillapító, melyet nemcsak a fűzfák tartalmazzák,

hanem más növények is. Hasznossága a humán gyógyászatban vitathatatlan. Ha a növényeket

kezeljük vele (exogén módon), sok esetben, koncentrációtól és fajtól függően, védi azokat a

káros hatásoktól, például a hidegtől. De mi a helyzet a növény saját SA-tartalmával? Ha a

növény nagyobb mennyiségben tartalmazza, akkor ugyanolyan ellenálló lesz, mintha kívülről

kapná a SA-at? Esetleg még ellenállóbb lesz, vagy a SA mennyiségének nincs jelentősége a

különféle károsító hatásokkal szembeni ellenállóképesség szempontjából?

A felmerülő kérdések miatt jelen kutatás célja a búza különböző stresszkörülmények

között adott élettani válaszainak jobb megismerése az endogén SA-szintjük tükrében.

8

2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS

2.1 . Általánosságban a növények és a stressz kapcsolatáról

A növényi stressz ma elfogadott definíciója a következő: „a stressz az a fiziológiai

állapot, amelyben a növények növekedése, fejlődése és szaporodása a környezeti terhelés

miatt a genomban meghatározott lehetőségek alatt marad” (Larcher 1987-ben

megfogalmazott definíciója alapján). Vagyis a növény környezetének (abiotikus) tényezői -

mint pl. a hőmérséklet, a fény, a páratartalom, a levegő-, víz- és talajminőség, valamint a

különböző élőlények (biotikus tényezők), mint az egyéb növények, az ember, az állatok,

gombák, baktériumok, vírusok - kisebb-nagyobb mértékben eltolják a növények életterének

minőségét az optimálistól a kedvezőtlenebb (ún. pejus), esetleg a rossz tartományba. Ez a

növények számára stresszhelyzetet jelent, amikor is attól függően, hogy egy stresszor (stresszt

kiváltó tényező) mennyi ideig és milyen mértékben van jelen, illetve a genomjában kódolva a

növénynek milyen mértékű védekezésre van lehetősége az adott stresszorral szemben, a

növény alkalmazkodhat, akklimálódhat, majd akklimatizálódhat a kialakult kedvezőtlen

helyzethez. Ez úgy lehetséges, hogy a növény a stresszort vagy elkerüli, mint a lombhullató

fák a téli fagyok okozta károsodásokat lombkoronájuk elvesztésével és anyagcseréjük

drasztikus csökkentésével, vagy pedig ellenáll neki, tolerálja azt. A különböző stresszek

általános, illetve az adott stresszorra jellemző, speciális folyamatokat egyaránt beindítanak a

növényi testben, melyek közötti kapcsolat azonban sok esetben még nem tisztázott.

Általánosnak tekinthetők az elsődleges stresszek (alacsony vagy magas hőmérséklet,

szárazság, só, nehézfémek) által kiváltott másodlagos stresszekre (pl. ozmotikus-, oxidatív

stresszre) adott válaszok főbb folyamatai, pl. az utóbbi esetében keletkező reaktív

oxigénformák (ROS) semlegesítéséért felelős mechanizmusok és azok szabályozásában részt

vevő jelátviteli utak működése. Ezt bizonyítja például az is, hogy számos tanulmány szerint az

abiotikus és biotikus stresszek általánosan csökkentik a növények növekedését és

terméshozamát (Kaur és Gupta, 2005; Manickavelu és mtsai, 2010; Sepehri és Golparvar,

2011; van Ginkel és Ogbonnaya, 2007), amely világszerte komoly gazdasági károkat okoz.

Speciális válasznak tekinthető viszont az, hogy a fent említett általános folyamatok elemei

vajon melyik növényben, növényfajban milyen mértékben vesznek részt a védelemben. Ez a

növényvédelemmel és nemesítéssel foglalkozó szakemberek számára különösen fontos

kérdés. Minél többet tudunk ezekről a védelmi mechanizmusokról, annál célzottabban lehet

9

egy-egy, sőt egyszerre akár több, a növényeket, különösen a gabonaféléket károsító

tényezővel szembeni rezisztencia növelésének érdekében kutatásokat végezni.

2.2 . A növények védekező rendszere

A növényen belül a stresszorok által okozott változások a morfológiai, élettani,

molekuláris és genetikai szinteken egyaránt megmutatkoznak. A stresszindukált gének

termékeinek egyik csoportját olyan anyagok alkotják, melyek közvetlen védelmet nyújthatnak

a stresszekkel szemben, mint például a különböző ozmoprotektánsok szintézisére reagáló

enzimek, antifreeze (fagyásvédő vagy fagyásgátló) fehérjék, chaperonok (dajkafehérjék) és

detoxifikáló enzimek. A másik csoportja magába foglalja a génexpressziós és jelátviteli

útvonalakat, melybe beletartoznak pl. a transzkripciós faktorok, protein kinázok és a

foszfoinozitid anyagcsere enzimei (Kaur és Gupta, 2005).

A másodlagosan jelentkező oxidatív stressz a normális növényi anyagcsere (pl. a

légzés és a fotoszintézis) működése során, valamint stressz hatására, a molekuláris oxigénből

(O2) keletkező ROS-ok túlzott mértékű felszaporodása miatt alakul ki (1. ábra).

1. ábra: A reaktív oxigénformák (ROS) keletkezésének sematikus ábrája (Sharma és mtsai, 2012 után).

Az O2 aktivációja két különböző úton történhet (1. ábra). Az O2 lépcsőzetes,

monovalens redukciója szuperoxid aniongyök (O2•−), hidrogén-peroxid (H2O2), majd

hidroxilgyök (•OH) keletkezéséhez vezet, míg az O2 energia-abszorpciója során szinglet

10

oxigén (1O2) keletkezik. A szuperoxid aniongyök nem enzimatikusan könnyen, spontán H2O2-

dá dizmutálódik, de ezt a reakciót a szuperoxid-dizmutáz (SOD) enzim is katalizálhatja. A

H2O2 vízzé történő átalakítását a kataláz (KAT), a gvajakol-peroxidáz (G-POD, POD) és az

aszkorbát-peroxidáz (APX) végzi (Sharma és mtsai, 2012). A ROS természetétől függően

egyes típusok rendkívül toxikusak (pl. a O2•−). A különböző stresszorok (nehézfémek,

szárazság, patogének, stb.) fokozzák felhalmozódásukat. Az intracelluláris ROS fokozott

mennyisége már károsíthatja a sejtszerkezetet, a fehérjéket, lipideket, szénhidrátokat és

nukleinsavakat is, mely végső soron oxidatív stresszt okoz (Gill és Tuteja, 2010b; Kocsy és

mtsai, 2011). Ennek elkerülése érdekében a sejtek enzimatikus (a fent említett ROS-t

átalakító/eltávolító enzimek) és nem-enzimatikus antioxidáns folyamatai gyorsan

detoxifikálják ezeket. Egyfelől a növények különböző mechanizmusokkal védekeznek az

abiotikus és biotikus stresszek által megemelt ROS szintek okozta károsodások ellen.

Másfelől viszont maguk is ROS-okat termelnek (H2O2) az aerob anyagcsere során, melyeket

mint szignál molekulákat használják a különböző folyamatok, úgymint a patogének elleni

védelem, a programozott sejthalál és a sztómák viselkedésének irányítására (Apel és Hirt,

2004; Gechev és mtsai, 2006; Karuppanapandian és mtsai, 2011; Sharma és mtsai, 2012).

2.2.1 Az enzimatikus védekezőrendszer

Az alábbi fejezetben felsorolt enzimek (1. táblázat) közös jellemzője, hogy a

különböző ROS-okat és egyéb gyököket eltávolítják az adott növényi részből.

Enzim EC szám Katalizált reakció

szuperoxid-dizmutáz 1.15.1.1 O2· - + O2

· - + H+ ↔ 2H2O2 + O2

kataláz 1.11.1.6 2H2O2 ↔ O2 + 2H2O

glutation-peroxidáz 1.11.1.12 2GSH + PUFA-OOH ↔ GSSG + PUFA + 2H2O

glutation-S-transzferáz 2.5.1.18 RX + GSH ↔ HX + R-S-GSH*

foszfolipid-hidroperoxid glutation-peroxidáz 1.11.1.9 2GSH + PUFA-OOH (H2O2) ↔ GSSG + 2H2O**

aszkorbát-peroxidáz 1.11.1.11 AA + H2O2 ↔ DHA + 2H2O

peroxidázok (pl. gvajakol-peroxidáz) 1.11.1.7 Donor + H2O2 ↔ oxidált donor + 2H2O***

monodehidroaszkorbát-reduktáz 1.6.5.4 NADPH + 2MDHA ↔ NADP+ + 2AA

dehidroaszkorbát-reduktáz 1.8.5.1 2GSH + DHA ↔ GSSG + AA

glutation-reduktáz 1.6.4.2 NADPH + GSSG ↔ NADP+ + 2GSH

* az R lehet alifás, aromás vagy heterociklusos csoport; az X lehet szulfát, nitrit vagy halogenid csoport

** a reakció H2O2-dal lassú

*** az AA elektrondonorként szerepelhet

1. táblázat: A ROS eltávolító és detoxifikáló enzimek és az általuk katalizált reakciók (Blokhina és mtsai, 2003

után).

11

Ez több módon történhet. Az első esetben az enzim teljesen hatástalanítja a káros gyököt,

ilyenek a peroxidázok és a KAT, melyek a H2O2-ot vízzé bontják. A második lehetőség, hogy

a ROS-t olyan formává alakítják át, melyet más enzimek már hatástalanítani tudnak (pl. a

SOD). A harmadik lehetőség a reaktív gyök konjugátum képzése és áthelyezése, bezárása pl.

a vakuólumba (glutation-S-transzferáz, GST).

2.2.1.1 Az aszkorbát-glutation ciklus

2. ábra: Az aszkorbát-glutation ciklus (Locato és mtsai, 2013). A fehér négyzetekben levő enzimek az állati és

növényi sejtekben egyaránt aktívak, a szürke négyzetben levő kizárólag a növényekben van jelen. APX:

aszkorbát-peroxidáz; MDHAR: monodehidroaszkorbát-reduktáz; DHAR: dehidroaszkorbát-reduktáz; GR:

glutation-reduktáz.

Az aszkorbát-glutation ciklus, más néven a Foyer-Halliwell-Asada ciklus (2. ábra)

végzi a kloroplasztiszokban keletkező H2O2 semlegesítését, mivel itt nincs KAT-aktivitás. A

ciklus elemei az aszkorbát és a glutation oxidált és redukált formái, illetve az ezeket átalakító

vagy felhasználó enzimek, név szerint az APX, a monodehidroaszkorbát-reduktáz (MDHAR),

a dehidroaszkorbát-reduktáz (DHAR) és a glutation-reduktáz (GR).

Aszkorbát-peroxidáz (EC 1.11.1.11)

Az APX egy olyan vastartalmú protein, mely erősen specifikus az aszkorbátra (ASC)

mint elektrondonorra. Az aszkorbát-glutation ciklusban a H2O2 vízzé történő bontását

katalizálja az alábbi reakció szerint:

2 ASC + H2O2 → 2 DHA + 2 H2O

12

Különböző APX izoformák találhatóak a szubcelluláris sejtszervecskékben, úgymint a

kloroplasztiszokban, a mitokondriumokban, a peroxiszómákban és magában a citoszólban

(Caverzan és mtsai, 2012), melyeknek mint védő elemeknek, fontos és közvetlen szerepük

van a különböző környezeti stresszekkel szemben.

Monodehidroaszkorbát-reduktáz (EC 1.6.5.4)

A MDHAR az egyszeresen oxidált ASC-t (monodehidro-aszkorbát, MDHA)

NADP(H) jelenlétében közvetlenül regenerálja, amely azonban maga is egy eredményes

elektron akceptor (Asada, 2006; Noctor és Foyer, 1998). Az MDHA közvetlenül aszkorbáttá

történő redukciója a fotoszintetikus elektrontranszportláncból származó elektron

felhasználásával megy végbe. Akárcsak az APX, a kloroplasztiszon kívül a

mitokondriumokban és a peroxiszómákban is megtalálható, ahol a H2O2 eltávolítását végzi

(Mittler, 2002). Azt is leírták, hogy a megnövekedett MDHAR-aktivitás hozzájárul a

paradicsom hidegtűréséhez (Stevens és mtsai, 2008). Egy hetes zöld- és feketebab-

növényekben (Vigna mungo L. Hepper cv. Co4) n a Cr3+

és Cr6+

fokozta a MDHAR

aktivitását (Karuppanapandian és Manoharan, 2008).

Dehidroaszkorbát-reduktáz (EC 1.8.5.1)

A DHAR a kétszeresen oxidált ASC-t (dehidroaszkorbát, DHA) közvetlenül

regenerálja miközben a GSH-t oxidálja. Az ASC újrahasznosításának fontos szabályozójaként

szolgál. Az APX által oxidált ASC először MDHA-tá oxidálódik, ami spontán

diszproporcionálódás vagy újabb oxidáció során DHA-tá alakul, melyet a DHAR redukál

vissza ASC-tá. A DHAR sebesség-korlátozó mennyiségben expresszálódik és hozzájárul a

szimplasztikus, illetve apoplasztikus ASC pool méretének és a redox állapotának

szabályozásához (Chen és Gallie, 2006). Nagy mértékű kifejeződése fokozza a dohány- és

Arabidopsis-növények ellenállását a környezeti stresszekkel szemben (Chen és Gallie, 2006;

Eltayeb és mtsai, 2007).

Glutation-reduktáz (EC 1.6.4.2)

A GR egy NADPH-függő heterotetramer enzim, mely bár a növényben több helyen

is előfordul (citoszólban, mitokodriumokban, kukoricában a mezofill sejtekben) (Doulis és

13

mtsai, 1997), a legnagyobb aktivitást az aszkorbát-glutation ciklushoz kötődve a

kloroplasztiszban mutatja. Itt a DHAR enzimmel ellentétesen működve a GSSG → GSH

átalakulást katalizálja az alábbiak szerint:

GSSG + NADPH + H+ → 2 GSH + NADP

+

Ennek további jelentősége, hogy működése révén befolyásolja a DHAR működését is, így

befolyásolja a GSH:GSSG arány szabályozását, ezáltal a sejt redox állapotát, továbbá a

DHAR-on keresztül szerepe van a DHA → ASC átalakulásban, amely a H2O2 további

detoxifikációját segíti elő és beindítja a különböző védekező folyamatokat (Szalai és mtsai,

2009). Ennek jelentősége különösen stressznek kitett növényekben mutatkozik meg, ahol a

GR általában fokozott aktivitást mutat, melynek szerepe lehet a stresszel szembeni ellenálló-

képesség kialakulásában (Kocsy és mtsai, 2001).

2.2.1.2 . Egyéb antioxidáns enzimek

Szuperoxid-dizmutáz (EC 1.15.1.1)

Ez a fémtartalmú enzim a szuperoxid-aniongyök dizmutációval történő átalakítását

katalizálja oxigénné és H2O2-dá az alábbi reakcióban:

2 O2˙¯ + 2 H+ → O2 + H2O2

Minden aerob szervezetben megtalálható; növényekben a kloroplasztiszokban, a

mitokondriumokban, a glioxi- és peroxiszómákban szerepe különösen fontos, mivel itt

képződhet szuperoxidgyök. Az enzim aktív oldalán található háromféle fémion, kofaktor

alapján megkülönböztethetünk Cu/Zn-SOD-ot, mely feladatát a citoszólban, a kloroplasztisz

sztómában és a peroxiszómában látja el; Mn-SOD-ot, mely szintén a peroxiszómában,

valamint a mitokondrium mátrixában található; továbbá Fe-SOD-ot, mely elsősorban a

prokariótákra jellemző, növényekben csak néhány család kloroplasztiszaiban fordul elő

(Bowler és mtsai, 1994). A SOD-ok képezik az első védelmi vonalat a káros oxigénformák

ellen. Transzgénikus réti csenkeszben a Cu/Zn-SOD-ot és az APX-t kódoló gének egyidejű

túlexpresszáltatása megvédte a növényt az oxidatív stresszel szemben több abiotikus stressz

esetén (Lee és mtsai, 2007). Ez az enzim nehézfémszennyezésre érzékeny, feketebab

gyökerében krómkezelések hatására csökkent az aktivitása (Karuppanapandian és Manoharan,

2008).

14

Kataláz (EC 1.11.1.6)

Ez a 4 alegységből felépülő hem-tartalmú enzim a legtöbb élőlényben előfordul. A

H2O2-ot, annak koncentrációjától függően dizmutációval vízzé alakítja. Magas szubsztrát-

koncentráció esetén a gyorsabb, úgynevezett katalitikus utat katalizálja:

2 H2O2 → 2 H2O + O2,

míg alacsony szubsztrát-koncentráció (H2O210-6

M) mellett a peroxidatikus utat.

Ebben az esetben H+-donorként különböző vegyületek (etanol, ASC, RH2) szerepelhetnek:

RH2 + H2O2 → R + 2 H2O

A KAT növényekben nagy mennyiségben megtalálható a peroxiszómákban, továbbá a

citoszólban és a mitokondriumokban (Karuppanapandian és mtsai, 2011), viszont a

kloroplasztiszban szerepét az APX veszi át. Bár több molekula H2O2 átalakítására képes,

mégis kisebb az affinitása a H2O2-hoz, mint az APX-nak. A zárvatermőkben három gén

kódolja a KAT-t (Sharma és mtsai, 2012). Willekens és mtsai (1995) a dohánygének

expressziós mintázata alapján osztályozták ezt az enzimet. Az I. osztály KAT-ai a

fotoszintetikus szövetekben fejeződnek ki és a fény által szabályozottak. A II. osztályba sorolt

KAT-ok nagyobb mértékben expresszálódnak a szállítószövetekben, ugyanakkor a III.

osztályba tartozó KAT-ok nagy mennyiségben vannak jelen a magokban és a fiatal

magoncokban. A KAT aktivitása búzafélék gyökerében alacsonyabb, mint a levelekben.

Rézzel szemben érzékeny durum növényekben Cu-kezelés hatására aktivitása megnőtt

(Sgherri és mtsai, 2001).

Gvajakol-peroxidáz (EC 1. 11.1.7)

Ez az enzim a III. osztályba tartozó peroxidázok (POD-ok) közé tartozik, melyeket a

növényekben multigén családok kódolnak. A csoport tagjai általában tartalmaznak egy

ferriprotoporfirin IX prosztetikus csoportot. In vivo különböző fenolokat, fenolszármazékokat,

míg in vitro sokféle vegyületet (gvajakol, pirogallol, benzoesav, stb.) oxidálnak (Mika és

Lüthje, 2003). A laboratóriumi vizsgálatok során alkalmazott oxidálandó anyag alapján

beszélhetünk gvajakol-peroxidázról, pirogallol-peroxidázról, stb.

A következő reakciót katalizálják:

DH2 + H2O2 (ROOH) → D + 2 H2O (ROH+H2O),

ahol a DH2 az elektrondonor.

15

Fémtartalmúak, kb. 40-50 kDa nagyságú monomerekből épülnek fel. Az izoenzimek magas

száma és a figyelemre méltó katalitikus sokoldalúságuk lehetővé teszi számukra, hogy részt

vegyenek számos fiziológiai és fejlődési folyamatban a növény életciklusa során (Mika és

Lüthje, 2003; Mika és mtsai, 2010; Passardi és mtsai, 2004; 2005). Megtalálhatóak a

kloroplasztiszokban, a mitokondriumokban, az endoplazmatikus retikulumban, a

vakuólumban, a sejtfalban és a citoszólban (Karuppanapandian és mtsai, 2011). Részt vesznek

az etilén képződésében, az auxin katabolizmusában – amely hormonnak kritikus szerepe van a

növényi növekedésben és fejlődésben –, a ROS-ok (szuperoxid, hidroxil gyök) képződésében,

illetve eliminálásában és egyéb öregedési folyamatokban. Kiemelkedő szerepet játszanak a

patogén organizmusokkal szembeni védekezésben. Aktivitásuk fokozódását figyelték meg

babban Pseudomonas syringae pv. phaseolica (Ádám és mtsai, 1995), uborkában

Colletotrichum lagenarium (Dalisay és Kuć, 1995), napraforgóban Alternaria helianthi

(Anjana és mtsai, 2007), illetve búzában sárga- vagy csíkosrozsda-fertőzést (Asthir és mtsai,

2010; Flott és mtsai, 1989) követően. A POD-ok sejtvédő hatása elsősorban az enzimreakció

során létrejött oxidált termékek fiziológiai szerepében rejlik, de nem elhanyagolható a H2O2

semlegesítésének jelentősége sem.

Glutation-S-transzferáz (EC 2.5.1.18)

A GST számos fehérje összefoglaló neve, melyeket egy rendkívül divergens, ősi

géncsalád kódol. Ezek a citoszólban található enzimek oldható dimerekből épülnek fel,

melyek mindegyike rendelkezik aktív kötőhellyel, ami glutation és hidrofób ligandumok

megkötésére képes. A GST-k a glutationfüggő izomerizációkat, a toxikus szerves

hidroperoxidok redukcióját, illetve különféle herbicidek konjugációját és detoxifikációját

katalizálják, eközben kofaktorként GSH-t használnak (Dixon és mtsai, 2010). A növényi

GST-k a GSH-t elektrofil xenobiotikumokhoz kötik, ezáltal megjelölve azokat a vakuoláris

szekrécióhoz. Továbbá a másodlagos anyagcseretermékek és származékaik (reaktív

oxilipinek, fenolok és flavonoidok) nem-katalitikus szállítását és tárolását végzik (Dixon és

mtsai, 2010; Edwards és mtsai, 2000), úgymint az antocianinok vakuólumokba történő

transzportálását (Sakihama és mtsai, 2002). Ezen kívül részt vesznek a kéntartalmú

másodlagos anyagcsere-termékek (egyes illóanyagok és glükózinolátok) szintézisében is.

16

2.2.2 . A nem-enzimatikus védekező rendszer

A nem-enzimatikus védelmi rendszer tagjai közé különböző kis molekulatömegű

vegyületek tartoznak. Ide sorolhatóak egyes vitaminok (ASC, tokoferol, A- és K-vitamin),

karotinoidok (pl. β-karotin), alkaloidok, tiolvegyületek (cisztein, GSH, stb.), fenolos

vegyületek (fahéjsav és benzoesav származékok), flavonoidok (kvercetin, miricetin, rutin) és

egyes nyomelemek (cink, vas, szelén) is (Gratão és mtsai, 2005; Valko és mtsai., 2006). A

teljesség igénye nélkül bővebben csak az ASC, valamint a 2.4. fejezetben a dolgozatban

szereplő fenolvegyületek közé tartozó szalicilsav (SA) és annak prekurzorai kerülnek

bemutatásra.

Aszkorbát

Az ASC-ot (aszkorbinsav, C-vitamin) az 1900-as évek elején hexuronsav néven írták

le. Szent-Györgyi Albert 1931-ben megjelent cikkében úgy jellemezte, hogy nagy redukáló

erővel és reverzibilis oxidálhatósággal rendelkezik. Az aszkorbát-glutation ciklus tagja. Ez a

vegyület egyike a legfontosabb oldódó redox molekuláknak, melyek kulcsfontosságú szerepet

játszanak különböző anyagcsereutak megfelelő működésében. Regenerálja az oxidatív

károsodásból származó egyéb metabolitokat, többek között a tokoferolokat, és megvédi a

ROS-ok okozta irreverzibilis oxidációtól számos enzim (pl. a hidroxilázok) katalitikus oldalát

(De Gara és mtsai, 2000). Sok reakcióban vesz részt, mint szubsztrát vagy kofaktor (De Gara

és mtsai, 2010; Lodge, 2008). Gombákban, protozoákban, növényekben és állatokban, eltérő

bioszintézis utakon, egyaránt szintetizálódik.

Fenolok

A fenolvegyületek, mint pl. a flavonoidok, tanninok, sztilbének, hidroxifahéjsavak,

benzoesavak, ligninek és különböző származékaik, a növényi szövetekben nagy

mennyiségben előforduló, változatos másodlagos anyagcseretermékek, melyek a sikiminsav

és fenilpropanoid útvonalak, illetve a pentóz-foszfát ciklus köztes termékeiből származnak

(Randhir és mtsai, 2004). Közös jellemzőjük, hogy fenolcsoportot tartalmaznak, innen ered

összefoglaló nevük is. Az emberi szervezet számára szintén rendkívül hasznos anyagok, egyes

polifenolok bizonyítottan jelentős védelmet nyújtanak az öregedéssel és számos krónikus

betegséggel, úgymint a kardiovaszkuláris megbetegedéssel (CVD), rákkal, diabétesszel,

17

különböző fertőzésekkel szemben (Pandey és Rizvi, 2009). A polifenolok ideális kémiai

szerkezettel rendelkeznek a szabad gyökök befogásához és kimutatták, hogy in vitro sokkal

hatásosabb antioxidánsok, mint az aszkorbát vagy a tokoferolok (Karuppanapandian és mtsai,

2011). A fenolvegyületek antioxidatív tulajdonságai az elektrondonorként való magas

reaktivitásukból, a polifenol eredetű gyökök elektronokat delokalizáló és stabilizáló

képességéből, illetve az átmeneti fémionokat keláló képességükből (a Fenton-reakció

leállítása által) ered. Szintézisüket az UV-sugárzás és a patogénfertőzések egyaránt serkentik

(Pandey és Rizvi, 2009). Számos nehézfém-szennyezésnek kitett növény gyökerében magas

fenolvegyület-szintet találtak (Winkel-Shirley, 2002). Sakihama és mtsai (2002) úgy találták,

hogy az Al, a Zn, a Ca, a Mg és a Cd stimulálja a fenoxilgyökök által indukált

lipidperoxidációt. A fenolvegyületek stabilizálják a membránokat azok fluiditásának

csökkentésével, a ROS-ok diffúziójának akadályozásával és a peroxidatív reakciók

korlátozásával (Arora és mtsai, 2000; Blokhina és mtsai, 2003). Antioxidáns hatásukat úgy is

kifejthetik, hogy a szabadgyökláncok terminátoraiként, valamint a lipidperoxidációt

katalizálni képes redox-aktív fémionok csapdázóiként működnek. Részt vehetnek a növényi

sejtek ROS-eltávolító kaszkádjában is (Winkel-Shirley, 2002).

2.2.3 . Védelemben szerepet játszó egyéb vegyületek

Poliaminok

A poliaminok (PA) csoportja - név szerint a diamin putreszcin (PUT), a triamin

spermidin (SPD), a tetramin spermin (SPN), a kadaverin (CAD) és az agmatin (AGM) -,

kisméretű, pozitív töltésű, alifás aminok, és az utóbbi kettő kivételével minden növényi

sejtben megtalálhatóak. A PA-ok képesek kötődni a negatív töltésű molekulákhoz, vagyis a

nukleinsavakhoz, savas foszfolipidekhez és különböző fehérjékhez, ezáltal védő szerepük van

stresszkörülmények között (Liu és mtsai, 2007). Szabad, konjugált (kis molekulákhoz, pl.

fenolos savakhoz asszociált) és kötött (különféle makromolekulákhoz asszociált) formában

egyaránt előfordulnak. Arról is beszámoltak, hogy a PA-ok egyes stresszorokkal szemben

védekező válaszokat váltanak ki (Hussain és mtsai, 2011), továbbá, hogy nemcsak a ROS-ok

eltávolításában játszanak szerepet, hanem az antioxidáns enzimeket kódoló gének

kifejeződésében is, mint aktivátorok. A PUT, SPD és SPN szabad formái a legjelentősebbek a

növényekben. Kuznetsov és Shevyakova (2007) azt is leírták, hogy a konjugált formájú PA-

ok sokkal hatásosabb ROS-eltávolítók, mint a szabad formájúak.

18

2.3 . Biotikus és abiotikus stresszorok okozta változások

2.3.1 . A lisztharmatfertőzés hatásai

A lisztharmatok az Erysiphales rendbe tartozó externális, biotróf aszkuszos gombák,

melyek a gazdasági növények egyik legismertebb, legközönségesebb és leggyorsabban

módosuló kórokozói. A világ valamennyi mérsékelt övi növénytermesztő régiójában

ismertek. Az időjárástól függően az általuk okozott fertőzés kisebb-nagyobb mértékben

minden évben megjelenik (Leath és Bowen, 1989), és mind maga a fertőzés, mind a fertőzés

elleni vegyszeres védekezés komoly gazdasági, utóbbi környezeti és egészségügyi károkat is

okozhat. Az enyhe telet követő rendkívül csapadékos és meleg nyár, mint amilyen a 2014-es

is volt Magyarországon, megfelelő környezeti feltételeket biztosít a telepek fejlődése számára,

így a lisztharmat aktuális problémák forrása. Ez a kórokozó felelős például a hazai

szőlőtermés jelentős veszteségéért, valamint részben az időben nem learatott kalászos

gabonafélék és a napraforgó minőségromlásáért is.

A lisztharmatok nevüket a növények levelein, szárain, termésein kialakuló, fehér-

szürkésfehér színű, lisztszerű micéliumaikról kapták. Kompatibilis gazda-patogén interakció

esetén, árpában a Blumeria graminis f.sp. hordei konídiumai már kb. 10-12 órával az árpa

levélfelszínére kerülésük után csírázni kezdtek, majd kialakultak a fertőzéshez szükséges

appresszóriumok, végül a hausztóriumok, melyek a micéliummal ellentétben behatoltak a

bőrszöveti sejtekbe, ahonnan tápanyagot vettek fel (Cowley és Waters, 2002). A

gombamicélium által fedett hajtásfelszíneken csökkenhet a potenciálisan fotoszintetizáló

felület. Cukorrépában a lisztharmat csökkentette a fotoszintetikus elektrontranszport

hatékonyságát, valamint a nem ciklikus fotofoszforiláción keresztüli ATP-képződést, amely a

CO2 asszimilációjának csökkenéséhez vezetett (Magyarosy és mtsai, 1976).

Gabonanövényeknél, ha a fertőzés fiatal korban érte a növényeket, azok növekedése és

fejlődése csökkent, a hajtások elfonnyadtak, elsatnyultak. A felnőttkori fertőzés csökkentette a

gabonafélék szemtermésének mennyiségét és minőségét, különösen akkor, ha a zászlós

leveleket a kalászolás és szemtelítődés időszakában támadta meg a lisztharmat (Griffey és

mtsai, 1993). A búzalisztharmat (Blumeria graminis (DC.) Speer f.sp. tritici Ém. Marchal)

erős fertőzéskor fogékony búzafajtán akár 40%-os termésveszteséget is okozhat. Éppen ezért

a búzanemesítési programokban még mindig jelentős szelekciós kritérium a lisztharmattal

szembeni ellenállóság. A rezisztens fajták sikeres létrehozásához nélkülözhetetlen a növények

védekező és szabályozási folyamatainak alapos ismerete.

19

A lisztharmatfertőzés általános kísérő jelensége az oxidatív stressz kialakulása a

növényekben, amelyet a ROS-ok fokozott termelődése és felhalmozódása vált ki (bővebben

lásd a 2.3. fejezetben). Az ez elleni növényi védelem szerves részét képezik az antioxidáns

enzimek (GR, KAT, APX, G-POD). Gabonafélékben működésük biotikus stressz során

tapasztalt változásairól számos esetben beszámoltak (Asthir és mtsai, 2010; Harrach és mtsai,

2008; Ivanov és mtsai, 2005). A G-POD biotikus stressz esetén kulcsfontosságú szerepet tölt

be (Scott-Craig és mtsai, 1995); hiszen egyike azoknak az enzimeknek, amelyek a

kórrezisztenciáért felelősek a különféle gazda-patogén kapcsolatokban, az olyan

folyamatokon keresztül, mint amilyen a lignifikáció is (Moldenhauer és mtsai, 2006). Árpa

növények első levelének metil-jazmonátos kezelése szignifikánsan csökkentette a második

leveleken a lisztharmat (Blumeria graminis f. sp. hordei) fertőzését, továbbá jelentősen

megemelte a védelemmel kapcsolatos enzimek, úgymint a fenilalanin-ammóni-liáz (PAL) és a

peroxidázok, aktivitását (Walters és mtsai, 2002).

Az Erysiphales rend tagjai befolyásolják a különféle, növekedésben,

immunválaszokban szerepet játszó anyagok mennyiségét és minőségét, pl. a PA-okét.

Árpában a lisztharmat már 1-4 órával a fertőzést követően megemelte a szabad PUT és SPD,

valamint a konjugált formájú PUT, SPD és SPN mennyiségét, amely együtt járt a PA-ok

bioszintézisében (ornitin-dekarboxiláz, arginin-dekarboxiláz, S-adenozil-metionin-

dekarboxiláz), illetve katabolizmusában (diamin-oxidáz, poliamin-oxidáz) szerepet játszó

enzimek aktivitás-növekedésével (Cowley és Waters, 2002). Hasonló eredményeket okoz az

első levelek metil-jazmonátos kezelése árpában, ugyanakkor a kezelt növények második

leveleiben csak a konjugált PA formák mennyisége emelkedett meg, a szabad formáké nem

(Walters és mtsai, 2002). A lisztharmatfertőzés a fenolvegyületek közé tartozó rezveratrol és

glikozidjainak mennyiségét is jelentősen megnövelte szőlőbogyók héjában, és ez szoros

összefüggésben állt a fertőzés mértékével (Romero-Pérez és mtsai, 2001).

Inkompatibilis gazda-lisztharmat kapcsolat esetén a hausztóriumok nem tudnak

behatolni a sejtekbe, a növény specifikus, a patogénnel szembeni rezisztenciáért felelős

génekkel rendelkezik, amely hiperszenzitív reakciót (HR) vált ki, ami a gazdasejtek

pusztulásához vezet (Cowley és Waters, 2002). A HR jelátviteli rendszerének tagjaként a SA

fontos szerepet tölt be a patogéntámadással szembeni védekező folyamatokban (bővebben

lásd a 2.4.3. fejezetben) (Catinot és mtsai, 2008; Horváth és mtsai, 2007). A megnövekedett

endogén SA szintekről fertőzésnek kitett levelekben különféle növényfajok esetén számoltak

be, míg az exogén SA alkalmazása számos biotikus stresszel szemben képes volt indukálni a

rezisztenciát (Chaturvedi és Shah, 2007).

20

2.3.2 . A kadmiumstressz hatásai

A kadmium (Cd) egy nehézfém, amely legnagyobb mennyiségben az erőművek,

kohók, üzemek tevékenysége révén, a szennyvíziszappal és egyéb hulladékokkal kerül a

környezetbe. Többek között a különböző ötvözetek galvanizálására, a festék-, akkumulátor- és

műtrágyagyártásban használják, de előfordul a dízel-és fűtőolajokban is, emiatt a nagy

forgalmú utak mentén nagyobb mennyiségben kerül a talajba, a levegőbe, sőt a növényzetbe

is (Bakirdere és Yaman, 2008; Khan és mtsai, 2011; Naszradi és mtsai, 2004). A nem

szennyezett talajokban a Cd koncentrációja átlagosan 0,04−0,32 μM, mérsékelten szennyezett

talajokban 0,32−1 μM körüli. Azonban az ettől nagyobb mennyiségű Cd-ot tartalmazó

talajokon már csak ezt a fémet tolerálni, illetve hiperakkumulálni képes fajok, például egyes

disznóparéjfélék (Amaranthus retroflexus L.), pillangósvirágúak (Phaseolus acutifolius A.

Gray), keresztesvirágúak (Thlaspi caerulescens, Arabidopsis halleri) és fűzfafélék (Salix

viminalis L.) élnek meg (Cosio és mtsai, 2004; Schmidt, 2003). A különböző elemek

felvételét számos tényező befolyásolja, úgy, mint a talaj pH értéke, egyéb fém- és

szervesanyag-tartalma, éppen ezért a talaj magas nehézfém-koncentrációja nem mindig jár

együtt a növények megnövekedett fémtartalmával.

A Cd, mint kétértékű fémion képes más, szintén kétértékű fémionokat helyettesíteni,

például az esszenciális elemek közzé tartozó cinket és vasat, ezért már kis koncentrációban is

nagyon mérgező a növények, az állatok és az emberek számára egyaránt. Mivel a Cd-ot a

növények képesek felhalmozni a szervezetükben, az a táplálékláncon keresztül bekerülhet az

állatokba és az emberekbe, ahol többek között károsítja a mitokondriumokat és apoptózis

vagy nekrózis általi sejthalált indukál, ami később szövetgyulladáshoz és fibrózishoz vezethet

(Thijssen és mtsai, 2007), ezen kívül a máj, a vesék, a csontok, az ivarszervek, az

idegrendszer kóros elváltozását okozza (Nordberg, 2003).

A Cd-stressz összetett jelenség, amely több párhuzamos és egymást követő változást,

eseményt indukál a növényekben (Pál és mtsai, 2006a). Először a gyökerekben okoz

változásokat, mivel ez a rész érintkezik először a talajban, vízben található

szennyezőanyaggal, ahonnan a Zn2+

-, Fe2+

- és Ca2+

-csatornákon keresztül juthat be a

gyökérsejtekbe (Clemens, 2006), onnan pedig a szállítórendszeren keresztül feljuthat a

hajtásba. Az egyik leglátványosabb hatása a növekedés mértékének csökkentése (Das és

mtsai, 1997), ez azonban függ az adott növény fajától, az alkalmazott Cd koncentrációjától és

a kezelés időtartamától. Napraforgónövények 16 napig tartó, 0,1-1 mM CdCl2 kezelése

koncentrációfüggő növekedésgátlást mutatott, de minden kezelt mag kicsírázott, magonccá

21

fejlődött és életben maradt a kezelés alatt (Groppa és mtsai, 2007). Borsó növények 50 µM

CdCl2-os kezelése jelentősen gátolta a levelek és gyökerek növekedését, valamint a klorofill-

tartalmat (Sandalino és mtsai, 2001). Kukoricában az 1-40 mg/L hidropónikus oldathoz

adagolt Cd csökkentette a gyökér és a hajtás száraz tömegét, illetve a levelek klorofill-

tartalmát a szövetek Cd-tartalmával fordított arányban (Root és mtsai, 1975). A paradicsomok

hajtásai is ellenálltak a nagy dózisú (250 µM CdCl2) Cd-nak, annak ellenére, hogy

növekedésgátlás jelentkezett (Delpérée és Lutts, 2008). Kukoricában a 0,5 mM Cd már egy

nap elteltével csökkentette a gyökerek életképességét és a második fotokémia rendszer (PSII)

kvantumhatásfokát (Pál és mtsai, 2002). Çanakci és Karaboğa (2013) arról számolt be, hogy a

25, 50, illetve 100 µM Cd uborkában egyaránt csökkentette a levélmegnyúlást, a száraz és

friss tömeget, valamint a fotoszintetikus pigmentek mennyiségét.

Carr és Murphy (2002) szerint a nem toxikus mennyiségű Cd javíthatja a növények

ellenálló-képességét, azok ellenállóvá válhatnak a szállítórendszerüket támadó vírusokkal

szemben. Viszont nagyobb koncentrációban a Cd zavarja a nukleinsavak, fehérjék és

klorofillok szintézisét, és inaktiválja a PSII reakciócentrumát, ami klorózishoz, intenzív ROS-

képződéshez, lipidperoxidációhoz, összességében oxidatív stresszhez és a fotoszintézis

csökkenéséhez vezet (Prasad és mtsai, 2004; Sobrino-Plata és mtsai, 2009). Ezen kívül a Cd

erős komplexeket képez a kéntartalmú peptidekkel és fehérjékkel. A növények különböző

mechanizmusokkal védekeznek a nehézfémek okozta károsodások ellen, ilyen folyamatok

például a fémek kizárása, aktív kiválasztása a sejtekből, mozgásuk korlátozása az érzékeny

szövetekben, a fémionok sejtfalhoz kötése, szerves molekulák általi kelációja és

kompartmentalizációja a vakuólumokban (Benavides és mtsai, 2005; Gratão és mtsai, 2005).

Ezekben a mechanizmusokban szerepet játszanak többek között a különféle tiolvegyületek. A

GSH és prekurzorainak nehézfémek okozta mennyiségi változásairól számos növényfaj esetén

beszámoltak (Çanakci és Karaboğa, 2013; Gill és Tuteja, 2010a). A GSH a nehézfémkötő

fehérjékhez tartozó fitokelatinok (PC-k) prekurzora is, melyek szintén felhalmozódnak Cd-

nak kitett búzában (Stolt és mtsai, 2003). 3 hetes lucernanövények GSH-, homoglutation-

(hGSH) és PC-tartalma jelentősen megemelkedett 7 napig tartó 3, 10 és 30 M Cd-kezelést

követően (Sobrino-Plata és mtsai, 2009). Az oxidatív stressz károsításának csökkentése

érdekében megváltozik az antioxidáns védőfolyamatok működése is (Groppa és mtsai, 2001;

2008a,b). A Cd, a tiolokon kívül, az egyéb nem-enzimatikus vegyületeket felhalmozódását,

köztük az aszkorbátét, szintén indukálja (Shan és mtsai, 2012). Továbbá úgy találták, hogy a

Cd-kezelés fokozza az APX és G-POD aktivitását egy kevésbé Cd-érzékeny búza

genotípusban, mialatt a jobban érzékenyben ezek az értékek a kontroll szinten maradtak, vagy

22

csak magasabb Cd-koncentráció esetén emelkedtek meg. Azonban növényfajtól, genotípustól

függően, a magasabb koncentrációk vagy a hosszabb időtartamú kezelés gátolhatja az

antioxidáns enzimeket (Hegedűs és mtsai, 2001; Lin és mtsai, 2007). 0,5 mM Cd csökkentette

a KAT, APX és GR-aktivitást, a GSH- és klorofill-tartalmat, ugyanakkor fokozta a

lipidperoxidációt napraforgó (Gallego és mtsai, 1999), illetve búza (Groppa és mtsai, 2001)

levelében. 15 napos 50 μM-os Cd-kezelés csökkentette a GSH- és ASC-tartalmat, a GR, KAT,

G-POD és Cu/Zn-SOD aktivitását, mialatt a Mn-SOD-ét csekély mértékben megemelte

borsóban (Rodríguez-Serrano és mtsai, 2006). A vízi növények különösen érzékenyek a Cd-

ra, így az már 5 μM-os koncentrációban alkalmazva redukálja a GR és a GST működését vízi

jácint (Eichhornia crassipes (Mart.) Solms) és Salvinia auriculata Aubl. növények

gyökerében, viszont a levelekben megemeli a GST-aktivitást (Vestena és mtsai, 2011).

A Cd fokozza a fitohormonok és hormonhatású anyagok mennyiségét is. Borsóban

az 50 μM Cd megemelte a jázmonsav (JA) és az etilén mennyiségét (Rodríguez-Serrano és

mtsai, 2006; 2009). A Cd megnövelte a szabad SA-tartalmat árpa- (Metwally és mtsai, 2003),

borsó- (Rodríguez-Serrano és mtsai, 2006) és kukoricanövények (Pál és mtsai, 2005; 2006a)

gyökerében. Arabidopsis thaliana-ban 500 μM Cd drasztikus SA-szintemelkedést idézett elő,

ami viszont már fokozta a Cd-indukálta oxidatív stressz káros hatásait (Zawoznik és mtsai,

2007). Továbbá ez a nehézfém növeli ezeken kívül egyéb fenolvegyületek (fahéjsav-

származékok) és a flavonoidok (epikatekin, rutin) mennyiségét is (Márquez-García és mtsai,

2012).

2.3.3 . A szárazságstressz hatásai

A szárazság egyike azoknak a környezeti stresszeknek, amelyek a gabonaföldek

károsításával a legnagyobb gazdasági károkat okozzák szerte a világon (Sepehri és Golparvar,

2011). A növények magjai különösen ellenállóak a kiszáradással szemben, ennek

köszönhetően hosszú időn át és viszontagságos körülmények között is biztosítják az adott faj

fennmaradását. Viszont a csírázáskor különösen érzékennyé válnak a vízhiányra, a bennük

genetikailag kódolt, adott mértékű ellenálló-képesség csak pár nappal a csírázás után

fejeződik ki (Bogdan és Zagdańska, 2006), és a növény fejlődése során folyamatosan változik,

melyet a különböző környezeti hatások jelentősen befolyásolnak. Maga a szárazság mint

stressz nem jár egyedül, ozmotikus és oxidatív stresszel együtt jelentkezik, és ezek együttes

hatása a növényi szervezetet számos szinten befolyásolja. Rövidtávon a vízhiány legkorábbi

jele, hogy csökken a növény vízpotenciálja, emiatt felborul a homeosztázis és ozmotikus

23

stressz alakul ki. A leglátványosabb változást a fenotípus szintjén láthatjuk, amikor a

morfológiai változások már egyértelműen mutatják a növény vízhiányos állapotát. A

fűféléknél ilyen például a levelek saját tengelyük körüli csavarodása, illetve a levéllemez

kívülről befelé történő összetekeredése (O'Toole és Cruz, 1980), valamint a levél

vastagságának csökkenése. Ezt a sejtek turgorának csökkenése okozza, amelyet a vízvesztés

vált ki. A hosszú távú vízhiány redukált hajtásnövekedéshez, a levélfelület és a sztómasűrűség

csökkenéséhez, ezzel ellentétesen viszont a gyökérzet növekedéséhez vezet. Deák és mtsai

(2011) megfigyelték, hogy a szárazsággal szemben toleránsabb búzafajták levelei kisebbek

voltak és alacsonyabb sztómasűrűséggel rendelkeztek, mint az érzékeny fajtáké.

A hatékony növényi védelemért különböző, gyors és hatékony folyamatok

aktiválódnak, melyek összehangolt működése szükséges a stresszhatások okozta károsodások

kivédéséhez és megelőzéséhez. Az ozmotikus stressz Ca2+

-ionok, nitrogén-monoxid (NO),

H2O2 és abszcizinsav (ABA) felhalmozódását váltják ki a sejtekben, legelőször a gyökér

sejtjeiben, amelyek jelátvivőkként működnek és számos ponton befolyásolják a védekezést.

Ilyen pontok pl. a gyökerek hosszának és az oldalgyökerek számának növelése, ezek

vízfelvételének növelése, továbbá a sztómazáródás serkentése, gátolva ezzel a növényi testben

lévő víz transzspiráción keresztüli távozását (Pospišilová, 2003). Ez azonban gátolja a

gázcserét, a szén-dioxid mennyisége megnő, míg az oxigén mennyisége lecsökken az

intercelluláris térben. Ezzel ellentétben a fotoszintetikus elektrontranszport a stressz ellenére

magasabb szinten maradhat. Az elektrontranszport működése és a CO2-fixáció közötti

egyensúly felborulása esetén viszont az elektronok a molekuláris oxigénre kerülhetnek

(Bencze és mtsai, 2011). Ez ROS-ok keletkezéséhez vezet (Niedzwiedz-Siegien és mtsai,

2004), melyek túlzott mennyisége viszont már károsítja a szervezetet, kialakul az oxidatív

stressz. Az antioxidáns enzimek közül jelentősen nőtt a SOD, a KAT és a glutation-peroxidáz

aktivitása, amelyek értékei magasabbak voltak közepes vízhiány esetén, mint magas

vízhiánynál szójában (Masoumi és mtsai, 2010). Hasonló eredményeket kaptak napraforgóban

(Pourtaghi és mtsai, 2011), Astragalus fajokban (Tan és mtsai, 2006), árpában (Salekjalal és

mtsai, 2012), búzában (Bencze és mtsai, 2011; Wu és mtsai, 2012) és rizsben (Shehab és

mtsai, 2010). Az oxidatív stressz során képződő H2O2 szignálmolekulaként szerepet játszik a

különböző jelátviteli utakon, továbbá gátolja az akvaporinok vízcsatorna-aktivitását a

gyökerekben (Parent és mtsai, 2009). Az ABA szintén hasonló hatást fejthet ki, ugyanakkor

koncentrációjától függően serkentheti is az akvaporinok működését (Beaudette és mtsai,

2007), ezen kívül szerepet játszik a gyökérnövekedés serkentésében, az etilénképződés

gátlásában (Tanaka és mtsai, 2005), a citokininek felhalmozódásában (Pospišilová és mtsai,

24

2005), és az enzimatikus antioxidáns rendszer aktiválásában, továbbá az ABA-függő

jelátviteli utakon keresztül egyes stressztoleranciáért felelős gének aktiválásában. Szárazság

hatására megfigyelhető a különböző ozmolitok (glicinbetain, prolin, poliolok, cukrok, stb),

felhalmozódása a növényekben, melyek elősegítik a víz megtartását (Bencze és mtsai, 2011;

Kameli és Lösel, 1993; Mohammadkhani és Heidari, 2008). PEG-gel indukált

szárazság/ozmotikus stressz esetén kukoricában megemelkedett az oldható cukrok

mennyisége, mialatt a keményítő-tartalom lecsökkent (Mohammadkhani és Heidari, 2008),

ugyanezt tapasztalták búzában (Bogdan és Zagdańska, 2006) is.

2.3.4 . Az UV-B sugárzás hatásai

Az ultraibolya (UV) sugárzás a fény hullámhosszától függően négy tartományra

osztható: UV-A-ra (315–425 nm), UV-B-re (280–315 nm), UV-C-re (185–280 nm) és UV-V-

re (100-185 nm). A sztratoszférikus ózonréteg elnyeli az UV-V és UV-C egészét, valamint az

UV-B sugárzás alacsonyabb hullámhosszú részét, de az elvékonyodása, továbbá az

ózonlyukak méretének és mennyiségének növekedése miatt nő a földfelszínt elérő, az élő

szervezetre káros hatású UV-B és sajnos az UV–C sugárzás mértéke is (Alexieva és mtsai,

2001; Häder és mtsai, 2007), melyek megváltoztathatják a növények ismert

stressztényezőkkel szembeni adaptív folyamatait. Bár az UV-B változatos módon befolyásolja

a magasabbrendű növényeket, általános hatása, hogy a legtöbb növényfaj esetén csökkenti a

növekedést, a levélfelület nagyságát és vastagságát - a paliszád és mezofil szövetek

elvékonyításán keresztül -, továbbá a levélnyél hosszát is (Kakani és mtsai, 2003a; Zuk-

Golaszewska és mtsai, 2003). Ennek hátterében a növényi sejteken belül három különböző

szintet, a genomot, a fotoszintetikus apparátust és a membránokat érintő változások állnak. A

nukleinsavak szintjén az UV-B hatására a DNS egymáshoz közel lévő pirimidin bázisai

dimereket képezhetnek, amelyek mutációt idéznek elő a replikáció alatt, és gátolják az érintett

DNS szakaszon található gének kifejeződését (Hollósy, 2002). Ugyanakkor az UV-B rövid

idő alatt serkenti a védelemben szerepet játszó gének expresszióját, míg a fotoszintetikus

komplexekhez kötődőket gátolja (Agrawal és mtsai, 2009). A növények UV-B-vel szembeni,

az evolúció során régóta kialakult védekező képességéről tanúskodik az UVR8 (UV

Resistance Locus 8) UV-B fotoreceptor fehérje megléte Arabidopsis-ban és más fajokban,

amely egy kromatinhoz kötődő UV-B-specifikus jelátviteli komponens, ami különféle gének

expressziós szabályozásán keresztül befolyásolja az UV-védelmet (Hideg és mtsai, 2013;

Kaiserli és Jenkins, 2007). Az UV-B második támadási pontja a fotoszintetikus rendszer,

25

melynek működését közvetve és közvetlenül egyaránt befolyásolja (Kakani és mtsai, 2003b).

A 280 nm és ez alatti sugárzás már szignifikánsan csökkenti a fotoszintetikus hatékonyságot

és a PSII kvantumhatásfokát. Ennek oka, hogy a PSII rendkívül érzékeny az UV-B és –C

sugárzásra, különösen a D1 és D2 fehérjék reakciócentrumai (Jansen és mtsai, 1998; Zlatev és

mtsai, 2012). A fotokémiai rendszerek károsodása ROS-képződést és az oxidatív stressz

kialakulását vonja magával, melynek csökkentése érdekében fokozódik az antioxidáns

védelmi rendszer működése az antioxidáns enzimek indukcióján és a nem-enzimatikus

antioxidánsok (pl. fenolos vegyületek) serkentett szintézisén keresztül (Kakani és mtsai,

2003b; Majer és Hideg, 2012). A 280 nm-nél nagyobb, de a látható fénynél kisebb

hullámhosszú sugárzás közvetlenül károsíthatja a kloroplasztisz ultrastruktúráját, ennek

eredményeként a levelek klorotikussá válnak (Jansen és mtsai, 1998). A harmadik célpontot a

membránok jelentik (An és mtsai, 2000). Az UV-B tavaszibúza-növények leveleiben

megváltoztatja a mikroszomális membránok szerkezeti komplexitását és funkcióját.

Drasztikusan csökkenti a foszfolipid-tartalmat, növeli a membránlipidek viszkozitását, ezáltal

csökkenti a membránok fluiditását. Az UV-B ezen kívül csökkenti a zsírsavak mennyiségét,

ami lipidperoxidációt indukál (Zlatev és mtsai, 2012).

Az alacsonyabb dózisú UV-B stressz bár morfológiai, anyagcsere és génexpressziós

változásokat okoz, főleg az antioxidáns rendszer stimulálásán keresztül a növények általános

akklimációjához vezet, vagyis védelmet nyújthat más stresszekkel, vagy későbbi nagyobb

UV-dózissal szemben (Kakani és mtsai, 2003b, Majer és Hideg, 2012). Árpában az UV-B

sugárzás indukálta a fő H2O2-detoxifikáló enzimek (APX, POD, GR) aktivitását, és az

előkezelések (200 mM NaCl, ill. a 45 perc 45 °C) fokozták az enzimatikus válaszokat, ezeken

keresztül pedig a stressztoleranciát (Çakirlar és mtsai, 2011).

Az UV-B hatásai a természetben más stresszekkel, például szárazsággal, extrém

hőmérséklettel, más hullámhosszú és/vagy dózisú fénnyel, antropogén hatásokkal, együtt

jelentkeznek. Mivel a különböző stresszorok gyakran ugyanazokon a jelátviteli utakon,

folyamatokon keresztül befolyásolják a növényi szervezetet, fontos lehet a növényt érő

stresszhatások sorrendje, minősége, időtartama és ezeknek a stresszhatásoknak az egymással

való kapcsolata, szinergizmusa vagy éppen antagonizmusa. Mivel a stresszorok többsége

külön-külön is szerepet játszik a gabonatermés mennyiségi és minőségi romlásában, amely

komoly károkat jelent, a tudósok, növénynemesítők és –termesztők világszerte olyan

kutatásokra összpontosítanak, amelyek célja a gabonafélék minél több stresszorral szembeni

toleranciájának kialakítása, fokozása. Éppen ezért több és több információra van szükségünk a

különböző stresszorokkal, stresszhatásokkal szembeni növényi válaszokról, védekező

26

mechanizmusokról, melyhez remélhetőleg ez a dolgozat is hozzájárul az egyes abiotikus

stresszek egyéni, illetve kombinált hatásainak vizsgálatából származó eredményeivel.

2.4 . Szalicilsav a növényekben

2.4.1 . A szalicilsav élettani hatásai

A SA, más néven 2-hidroxi-benzoesav, régóta ismert gyógyító hatásáról (Roth és

Majerus, 1975). Acetilált formáját napjainkban az Aszpirin hatóanyagaként láz- és

fájdalomcsillapításra, a trombózis kialakulásának csökkentésére széles körben használják.

Korábban terápiás szerként alkalmazták például az autoimmun betegség, a szisztémás lupus

erythematosus (SLE) és a reumás ízületi gyulladás (rheumatoid arthritis, RA) kezelésére

(Mottram, 2003). Megtalálható ezen kívül számos kozmetikumban (samponokban,

testápolókban, arckrémekben) is.

Növényekben szerepe lehet az anyagcsere-folyamatokban, a biotikus és az abiotikus

stresszekkel szemben egyaránt (erről bővebb információ a 2.4.3. fejezetben található),

ugyanakkor más mechanizmusokban is közreműködhet. Régóta ismert, hogy a termogén

növények, mint amilyenek a kontyvirágok (Arum sp.), a voodoo liliom (Sauromatum guttatum

S.) és a mocsári káposzta (Symplocarpus foetidus L.) is, kalorigén anyaga ez a vegyület.

Előbbiekben virágzáskor megemeli a virágok hőmérsékletét (akár 10-12 C-kal), az alternatív

oxidáz expressziójának fokozásával, ezzel segítve az illatanyagok könnyebb kibocsátását,

ezáltal a virágok megporzását végző rovarok csalogatását (Raskin és mtsai, 1990); utóbbiban

a hőmérséklet emelése által védi ezt a nem-fagytűrő növényt az alacsony hőmérséklettől, így

az még a hóval borított talajon is életben maradhat (Knutson, 1974).

A SA és analógjai fokozták a levélterület és száraztömeg nagyságát kukoricában és

szójában (Khan és mtsai, 2003). Továbbá búzaszemek alacsony koncentrációjú SA-oldatba

(10−5

M) áztatása megemelte a fiatal növények leveleinek számát, valamint friss- és

száraztömegét (Hayat és mtsai, 2005; Hussein és mtsai, 2007).

A SA-kezelés fokozta a fotoszintézist a klorofill-tartalom és a Rubisco karboxiláz

aktivitásának növelésével búzában (Singh és Usha, 2003) és Brassica fajokban (Hayat és

mtsai, 2010), továbbá membrán-depolarizációt, retardált etilénszintézist és gátolt sebzési

választ eredményezett szójában (Zhao és mtsai, 1995). Moharekar és mtsai (2003) arról

számoltak be, hogy a SA serkentette a karotenoidok és a xantofillok bioszintézisét, továbbá

fokozta a deepoxidáció arányát a klorofill pigmentek és a klorofill-a/b arány ezzel egyidejű

27

csökkentésével búza és Vigna radiata (L.) R. Wilczek növényekben. Az exogén SA már 0,01

mM koncentrációban alkalmazva megemelte a nettó fotoszintetikus rátát, a CO2-fixáció

hatékonyságát, a nitrát-reduktáz aktivitását és a magtermelést Brassica juncea-ban

(Fariduddin és mtsai, 2003). Kukoricában 0,01 M SA stimulálta a sótoleranciát a

fotoszintetikus folyamatok aktiválásán át (Khodary, 2004). Az SA ezen kívül védi a

fotoszintetikus apparátust az oxidatív károsodástól az antioxidáns rendszer aktiválásán

keresztül (Krantev és mtsai, 2008).

2.4.2 A szalicilsav bioszintézise

A SA bioszintézise három ismert úton történhet (Métraux, 2002). A sikiminsav

útvonalon keresztüli szintézist először mikroorganizmusokban fedezték fel, később biotikus

stressznek kitett növényekben is, ahol az 5-enolpiruvilsikimát-3-foszfátot a korizmát-szintáz

(CS) korizmáttá alakítja, amely az izokorizmát-szintáz (ICS) segítségével izokorizmáttá

alakul, ebből pedig az izokorizmát-piruvát-liáz (IPL) SA-at képez (Nugroho és mtsai, 2001;

Wildermuth és mtsai, 2001). Stressznek kitett Arabidopsis-növények kloroplasztiszaiban a

SA-szintézis elsősorban az izokorizmát-felhasználó útvonalon át történik (Dempsey és mtsai,

2011). Tríciummal jelölt SA-ban történő előáztatás után megnőtt a CS-t és ICS-t kódoló

gének expressziója borsó magoncok epikotiljában (Szalai és mtsai, 2011).

3. ábra: A szalicilsav bioszintézis útvonalai (Métraux, 2002 után). CS: korizmát-szintáz, ICS: izokorizmát-

szintáz, PAL: fenilalanin-ammónia-liáz

28

A másik két út a fenilpropanoid útvonalból indul ki. Itt a fenilalanin a fenilalanin-

ammónia-liáz (PAL, EC 1.6.5.4) hatására fahéjsavvá alakul, majd attól függően, hogy egy

dekarboxilációs vagy egy hidroxilációs lépés következik-e, elválik egymástól a két út. Ha a

fahéjsav oldallánca először karboxilálódik, benzoil-glükóz (a benzoesav, BA, glükozilált

formája) keletkezik, amely egy hidroxilációt követően SA-vá alakul. Ha a fahéjsav először

hidroxilálódik, akkor o-kumársav, más néven o-hidroxifahéjsav, majd dekarboxiláció után SA

képződik (Métraux, 2002). A három útvonal egymással kapcsolatban áll a korizmát-mutáz

enzimen keresztül, amely a korizmát L-arogenáttá történő átalakulását katalizálja, ami azután

L-fenilalaninná alakul (Ogawa és mtsai, 2005). Radioaktív jelöléses módszerrel bizonyították,

hogy a SA fahéjsavból keletkezik a PAL aktivitása által és azt, hogy a dohány PAL-t kódoló

génjeinek csendesítése vagy a kémiailag gátolt PAL-aktivitás csökkentette a patogén-indukált

SA-felhalmozódást Arabidopsis-ban, uborkában és burgonyában (Chen és mtsai, 2009).

Métraux (2002) szerint a fenilpropanoid útvonal SA-bioszintézisben betöltött szerepe

biotikus stressz során elhanyagolható a sikiminsav útvonaléhoz képest, ennek ellentmond

Ogawa és mtsai (2006) megállapítása, mely szerint a dohánymozaik vírussal fertőzött dohány

növények leveleiben ez az út az elsődleges. Ugyanakkor azt is felfedezték, hogy habár az

ózonnak kitett dohányban a BA-on keresztül történt a SA-képződés, mialatt az ICS aktivitása

és mRNS szintje nem változott, ugyanakkor az ózon-kezelt Arabidopsis thaliana-ban az ICS-

en keresztül zajlott a SA-termelődés (Ogawa és mtsai, 2005). Transzformált dohányban

bakteriális ICS vagy IPL géneket fuzionáltattak egy erős növényi promóterhez, amely SA-

túltermelést és a gének konstitutív expresszióját váltotta ki (Verbene és mtsai, 2000).

Arabidopsis-ban az ICS1 gén kódolja a plasztiszokban található ICS-t, mely Pseudomonas

syringae avirulens törzseivel történő inokulációt követően SA-felhalmozódást és a

szisztemikus szerzett rezisztencia (Systemic Acquired Resistance, SAR) kialakulását idézte

elő a szisztémás leveleken (Wildermuth és mtsai, 2001). Azt is leírták, hogy az ózonstressz

drámai hatást fejt ki a prekorizmát-útvonal szabályozására dohány növényben (Jansik és

mtsai, 2005).

A képződő szabad formájú SA szintje változatos kémiai módosítások által

szabályozódik, amely hosszú távon segítheti a SA-transzportot vagy kiegészítheti a szabad SA

által indukált stresszválaszok aktivációját (Chen és mtsai, 2009). Az viszont máig tisztázatlan

kérdés, hogy vajon a PAL vagy az ICS útvonal felelős-e a SA-felhalmozódásáért, és vezet

biotikus stressz esetén a szisztemikus szerzett rezisztencia kialakulásához, továbbá, hogy

melyik útvonal/útvonalak aktiválódnak abiotikus stresszek hatására.

29

2.4.3 . A szalicilsav szerepe biotikus és abiotikus stresszek során

A SA stresszkörülmények között betöltött szerepét számos növényfajban vizsgálták

(Bandurska és Stroinski, 2005; Cameron és mtsai, 1999; Delaney és mtsai, 1994; Krantev és

mtsai, 2008).

Önmagában a SA is okozhat stresszt a növények számára. Vízkultúrában nevelt

paradicsomban az 1 mM SA csökkentette többek között a sztómakonduktanciát (gs), a

maximális CO2-fixációs rátát, a fotoszintetikus kvantumhatásfokot és a Rubisco karboxilációs

hatásfokát, majd végül a növények pusztulását okozta (Poór és mtsai, 2011). Őszi búza

(Triticum aestivum cv. Dogu-88) levelében 24 óra elteltével, a 0,5 mM SA-kezelés

csökkentette a transzspirációt és a sztómakonduktanciát, mialatt fokozta a lipidperoxidáció

mértékét és a peroxidázok szintjét (Yordanova és Popova, 2007). Arabidopsis thaliana

Landsberg erecta ökotípusában a 0,1; 0,5; 1; 2; 3 és 5 mM SA-kezelések fokozták a H2O2-

termelést, a lipidperoxidációt és a fehérjék oxidatív károsodását, továbbá klorofill- és

karotinoid izomerek képződését eredményezték (Rao és mtsai, 1997). Ezen kívül a magasabb

SA koncentráció gátolta, míg az alacsonyabb serkentette a gyökér és hajtásnövekedést a

sztómazáródás befolyásolásán keresztül számos növényfajban (Gutiérrez-Coronado és mtsai,

1998; Hussein és mtsai, 2007; Manthe és mtsai, 1992). Szintén búzában az exogén SA

csökkentette a transzspirációt (Luo és mtsai, 2009) és gátolta a cisz-ABA-indukált

sztómazáródást; 0,05 mM koncentrációban alkalmazva pedig serkentette a gyökér apikális

merisztémáinak sejtosztódását, fokozta az ABA és indolecetsav (IAA) felhalmozódását, de

nem befolyásolta a citokinin-szintet (Shakirova és mtsai, 2003). Kakukkfűben (Thymus

daenensis Celak.) az SA-kezelés csökkentette a vízhiány növekedésre és az esszenciális

olajtartalom mennyiségére, ill. összetételére kifejtett negatív hatását (Pirbalouti és mtsai,

2014). A SA befolyásolja a Rhizobium-ok és hüvelyes növények között szimbiózist is. Az 1-5

mM SA gátolja a pillangósvirágúak gümőképződését, és csökkenti a nóduszok számát

szójában (Lian és mtsai, 2000). Az ettől alacsonyabb SA-koncentráció a gümőképződés

mértékének csökkenését idézi elő Vicia sativa és borsó növényekben, ugyanakkor Phaseolus

vulgaris, Lotus japonicus és szója esetén határozott csomóképződés, de a noduláció

elmaradása volt megfigyelhető (van Spronsen és mtsai, 2003). 0,1 illetve 0,5 mM SA növelte

az APX és G-POD aktivitását, valamint az oHCA és a SA mennyiségét, ugyanakkor

csökkentette a PA-szinteket fiatal borsó növényekben (Szalai és mtsai, 2011).

Biotikus stressz során a SA szükséges a SAR kialakulásához, melyet egy helyi,

patogénnel, mikróbával, vagy egy effektorral kapcsolatos molekuláris esemény vált ki

30

(Conrath, 2011), és ahol az SA, pontosabban ennek metilált formája, az endogén jelátvivő

molekula szerepét tölti be. Maga a SAR a növényi rezisztencia azon fajtája, amikor a növény

egy korábbi, kisebb mértékű fertőzés vagy valamilyen vegyszeres kezelés hatására ellenállóvá

válhat egy későbbi, már nagy károkat okozó fertőzéssel vagy mérgezéssel, pl. permetezéssel

szemben. Továbbá a SA szerepet játszik a hiperszenzitív reakció (HR) kialakításában,

melynek köszönhetően a rezisztens gazdanövény sejtjei a fertőzés közvetlen környezetében a

programozott sejthalál révén elpusztítják önmagukat, annak érdekében, hogy a kórokozót is

elpusztítva megakadályozzák a betegség további terjedését, elszigetelve azt a még ép

szövetektől. Pasqualini és mtsai (2002) úgy találták, hogy dohány növényben a SA modulálja

a hiperszenzitív sejthalált. Paradicsomban (Lycopersicon esculentum. Mill cv. Vollendung) a

SAR mesterségesen is kiváltható volt benzo-(1,2,3)-tiadiazol-7-karbotioiksav-S-metilészter

(BTH) kezeléssel, amely a SA szintetikus analógja, és megvédte a növényt a 7 nappal későbbi

uborkamozaik vírus sárga törzsének fertőzése (CMV-Y, yellow strain of Cucumber mosaic

virus) által okozott nekrózistól (Anfoka, 2000).

A SA-at katekollá átalakító enzim, a SA-hidroxiláz, fokozott működése gátolja a SA-

felhalmozódását, ezáltal a SAR kialakulását is. A Pseudomonas putida-ból származó, a SA-

hidroxilázt kódoló NahG gént hordozó transzgénikus dohány- (Nicotiana benthamiana

Domin) és Arabidopsis-növények, valamint a SA-termelésre képtelen Arabidopsis sid2

mutánsok fogékonyak voltak a patogénfertőzésre, bennük nem alakult ki SAR (Delaney és

mtsai, 1994). A vírusfertőzések egyrészről a sejtek stresszválaszát, a SA mennyiségének

növekedését, másrészről a növényi fejlődés csökkenését idézik elő. Ezek hatására számos gén

indukálódik, mint például a β-1-3-glukanázt, a hősokkfehérjéket (HSP), kitinázokat kódolók

és több, patogenezissel kapcsolatos (PR, pathogenesis-related) gén, mint amilyen a PR-1 is

(Whitham és mtsai, 2006).

A SA másik formája, a metil-SA, melynek képződését, a plasztiszokban, SA-ból a

SA-karboxil-metil-transzferáz (SAMT) katalizálja (Huang és mtsai, 2003; Kumar és Klessig;

2003), szintén szerepet játszik a SAR kialakulásában. Gyors mobilizálhatósága miatt a SA

helyett ez funkcionál jelmolekulaként és a patogénfertőzéstől távolabbi szövetekben indukálja

a növényi védelmi rendszert (Park és mtsai, 2007), gátolva ezzel a fertőzés okozta károk

növekedését.

A SA exogén alkalmazása indukálja az ozmotikus stresszel szembeni toleranciát

(Hussain és mtsai, 2010; Najafian és mtsai, 2009a,b). Búzanövénykék ozmotikus stresszel

szembeni toleranciája csökkent nitrogén-monoxid hatására, mivel az lefékezte az indukált

oxidatív stresszt redukáló SA-jelátvitelt (Alavi és mtsai, 2014). Rozmaring- (Rosmarinus

31

officinalis L.) és kakukkfű- (Thymus vulgaris L.) növények levelére permetezve a 150, 300,

valamint 450 ppm SA is védelmet nyújtott az 50, 100, illetve 150 mM NaCl által okozott

stresszel szemben (Najafian és mtsai, 2009a,b). Sóstressznek kitett növényekben a SA-kezelés

hajtás- és gyökérnövekedést indukált, továbbá növelte a fotoszintetikus rátát, a

sztómakonduktanciát és a vízfelhasználás hatásfokát, ezzel szemben csökkentette a

transzspirációs rátát és a sejtek ionáteresztő képességét a kezeletlen növényekhez viszonyítva.

Paradicsomban 10 mM SA az oxidatív védelmi mechanizmusok aktiválásán és egyes

ozmolitok felhalmozásán keresztül fokozta a NaCl-dal szembeni toleranciát (Szepesi és mtsai,

2005). Búzában 0,05 mM SA-val történő kezelés csökkentette a fitohormonok szintjének

sóstressz alatt bekövetkező változásait, megakadályozta az IAA- és a citokinin-tartalom

csökkenését, és ez által redukálta a növény növekedésének stressz-indukálta gátlását

(Shakirova és mtsai, 2003). SA-kezelt növényekben ABA-felhalmozódás is megfigyelhető,

amely elősegíti az antistressz-reakciók kifejeződését, pl. a prolin-akkumulációt. Marcińska és

mtsai (2013) megállapították, hogy búza exogén SA-val vagy ABA-val, továbbá PEG-gel

történő kezelése javítja, különösen a toleráns genotípusokban, a PEG-indukált ozmotikus

stressz káros hatásait a jobb ozmotikus beállításon keresztül, melyet inkább a prolin- és

szénhidrát-tartalom növelésén keresztül érnek el, mintsem az antioxidáns kapacitás fokozásán

át. Ezzel szemben hőstressz esetén az exogén SA, ABA, illetve 1-aminociklopropán-1-

karboxilsav (ACC , az etilén prekurzora) a magas hőmérséklet okozta oxidatív stressz hatását

az antioxidáns rendszer indukcióján át csökkentették, növelve ezzel az Arabidopsis-növények

hőtoleranciáját (Larkindale és Knight, 2002).

Janda és mtsai (1999) kimutatták, hogy a SA exogén alkalmazása laboratóriumi

körülmények között fokozza a kukorica hidegtűrését. Őszi búzában a 24 órás 0,5 mM SA-

előkezelés szintén védelmet nyújtott a hidegkezeléssel szemben, amely a hideg okozta

Rubisco (ribulóz-1,5-biszfoszfát-karboxiláz/oxigenáz) aktivitás és klorofill-tartalom

csökkenésének gátlásában, valamint az antioxidáns enzimek (APX, KAT, POD) és a glikolát-

oxidáz aktivitásának növelésében nyilvánult meg (Yordanova és Popova, 2007). Pál és mtsai

(2011) szerint átfedés lehet a SA-kapcsolt stresszválasz és az ABA-indukálta hidegakklimáció

között hidegkezelt kukoricában.

Kukorica és árpa szemek 6 órás 500 µM SA oldatban való áztatása fokozta a belőlük

kifejlődött, 14 napos növénykék 10, 15, ill. 25 μM Cd-mal szembeni toleranciáját. Ugyanez a

hatás volt megfigyelhető, amikor 0,5 mM, tápoldathoz adagolt, SA-val kezelték az árpa

növényeket, vagy 8 órán át 250, illetve 1000 μM SA-oldatban magáztatott len (Linum

usitatissimum L.) növénykéket vizsgáltak (Belkadhi és mtsai, 2014). Az exogén SA növelte a

32

gyökér- és hajtáshosszt, a száraz- illetve frisstömeget, továbbá gátolta a lipidperoxidációt,

melyet az MDA-tartalom alapján követtek nyomon 25 μM Cd jelenlétében (Metwally és

mtsai, 2003). Tápoldatban lévő Cd jelenlétében a levélre permetezett 0,4 mM SA növelte a

hüvelyek és a szárelágazások számát, ugyanakkor csökkentette a gyökér száraztömegét, a

növény magasságát, továbbá a szártagok hosszát szójában, a SA-as permetezés ismétlése

pedig negatív hatást gyakorolt a magasságra és a szártagok számára (Akbari és mtsai, 2013).

A Cd-kezelések által megnövelt prolintermelés, lipidperoxidáció-szint és ionkiáramlás

mértéke csökkent a SA-előkezelt növényekben. A Cd ezen kívül kukoricában csökkentette az

APX és drasztikusan emelte a SOD aktivitását, ugyanakkor a SA-előkezelt növényekben

megnövekedett APX, SOD és erősen redukált KAT aktivitás volt megfigyelhető (Krantev és

mtsai, 2008). Az exogén SA csökkentette a 25 μM Cd-kezelés által indukált antioxidáns

enzimaktivitásokat árpában (Metwally és mtsai, 2003). A Cd-szenzitív Phaseolus aureus és

Cd-toleráns Vicia sativa magjainak 100 μM SA-ban való áztatása csökkentette az 50 μM Cd

által indukált H2O2, illetve O2·- akkumulációját, valamint növelte a SOD, KAT és APX

aktivitását (Zhang és mtsai, 2011). Az exogén SA befolyásolja a növényi részek ásványi

anyagtartalmát is. Lucernában a 10 μM SA-kezelés elősegítette a Cd-felhalmozódását,

továbbá fokozta a Cd K-, Mg-, Ca- és Fe-tartalomra kifejtett negatív hatását a gyökerekben,

azonban a hajtásokban ennek ellentéte, a K-, Mg- és Ca-szintek növelése volt a jellemző,

melyet a SA és a Cd külön-külön, illetve együttesen is indukált (Dražić és mtsai, 2006).

Ezeken kívül az SA védő tevékenysége magában foglalja a különböző antistressz

programok fejlesztését és a növekedési folyamatok helyreállításának gyorsítását a stressz

megszűnése után (Shakirova és mtsai, 2003).

2.4.4 . A szalicilsav hatásmechanizmusa és annak szabályozása

A SA hatása, illetve hatásmechanizmusa sokféle lehet a növényi testben. Számos

jelátviteli útvonal eleme, melyek mind részt vesznek a stresszorok elleni védelemben. A

teljesség igénye nélkül, csak a dolgozathoz legszorosabban kapcsolódókat emelem ki

pontokba szedve, elsősorban az endogén SA-ra összpontosítva.

i) Patogénfertőzés hatására a SA először felhalmozódik a növény fertőzött leveleinek

kloroplasztiszaiban, majd lipidoldékony MeSA-vá alakulva átlép a plasztiszmembránon

keresztül a citoplazmába (Kumar és Klessig, 2003), ahol a SABP2 (SA-binding protein 2)

metilészteráz aktivitása által visszaalakulhat SA-vá és kifejtheti hatását a rezisztencia

útvonalakra (Herrmann és Weaver, 1999). A MeSA-SA átalakulás megváltoztatja a

33

citoplazma redoxpotenciálját, ami aktiválja az NPR1-et (nonexpressor of pathogenesis-

related protein genes 1), amely egy transzkripciós kofaktor, és a védekező válaszok, köztük a

SAR egyik nélkülözhetetlen, kulcsfontosságú regulátora a növényekben (Mou és mtsai,

2003). Normál körülmények között az NPR1 a citoplazmában multimer formában van jelen,

azonban ahhoz, hogy beléphessen a sejtmagba, monomerekre kell bomlania (Kinkema és

mtsai, 2000). A sejtmagban ezután a monomer NPR1 kapcsolódik a bZIP transzkripciós

faktorok TGA vagy OBF családjának tagjaihoz, transzkripciós kaszkádot indít el, és aktiválja

olyan védekező gének expresszióját, mint pl. a PR-1 (Despres és mtsai, 2003; Fan és Dong,

2002; Johnson és mtsai, 2003; Whitham és mtsai, 2006; Zhou és mtsai, 2000). Mindezek

mellett pedig szabályozottan gátolja az alap celluláris folyamatok, mint a fotoszintézis génjeit,

mintegy előtérbe helyezve a növényi immunválaszokat a növény növekedése árán (Spoel és

Dong, 2012).

ii) Megfigyelték azt is, hogy a helyi patogénfertőzés serkenti a MeSA-on kívül a

glicerol-3-foszfát (G3P) mint mobilis immunszignál molekula, illetve a lipid-transzfer

fehérjék (DIR1 (Defective in Induced Resistance 1), AZI1 (Azelaic Acid Induced 1))

képződését (Jung és mtsai, 2009). Ezután ezek a vegyületek a növény szállítórendszerén

keresztül eljutnak annak szisztemikus, nem fertőzött részeibe, ahol indukálják a SA

akkumulációját (4. ábra). A SA ezután a korábban leírt módon indukálja az antimikrobiális

aktivitással rendelkező PR fehérjék szekrécióját (Ward és mtsai, 1991), továbbá kiváltja a

hisztonok metilációját és egyéb kromatin-módosulásokat, amelyek előkészítik/felkészítik

(priming) az immunkapcsolt géneket a fokozott expresszióra és immunmemóriát, valamint

szomatikus homológ rekombinációval a BRCA2 (Breast Cancer Susceptibility 2) és RAD51

működésén keresztül az immunitás transzgenerációs memóriáját hozza létre (Spoel és Dong,

2012).

34

4. ábra: A SA szerepe és hatásmechanizmusa biotikus stressz során (Spoel és Dong, 2012).

iii) A SA befolyásolja más vegyületek, pl. a JA, metil-jazmonát (MeJA), etilén, ABA

mennyiségét és hatásait (Jones és Dangl, 2006), és fordítva (Ogawa és mtsai, 2005; Pál és

mtsai, 2013b). A JA, akárcsak a SA, védő szerepet tölt be biotikus stressz alatt, védi a

növényt a rovaroktól és a nekrotróf patogénektől. Hatása különböző védő gének aktiválását

eredményező jelkaszkádon keresztül nyilvánul meg (Li és mtsai, 2002), mely nem azonos a

SA által befolyásolttal, bár vannak közös pontjaik, ilyen az NPR1 is, ami a két jelátviteli út

közötti kapcsolat kritikus modulátora (Beckers és Spoel, 2006; Dong, 2004). Az Arabidopsis

WRKY62 a WRKY III. transzkripciós faktor család tagja, amelyet a SA és MeJA is indukál.

Már nagyon alacsony SA koncentráció esetén a citoszólikus NPR1 irányítja a MeJA-indukált

WRKY62-expressziót, ami így leszabályozza a JA-válasz LOX2 és VSP2 gének expresszióját

(Mao és mtsai, 2007). Szintén Arabidopsis-ban vizsgálták a glükoziltranszferáz UGT76B1-et,

mint a SA-JA jelátviteli kapcsolatának újabb szereplőjét. Megállapították, hogy az UGT76B1

35

patogénfertőzés hiányában csökkenti a SA-függő növényi védelmet, elősegítve ez által a JA

választ, továbbá késlelteti az öregedést (von Saint Paul és mtsai, 2011). Ebből is látható, hogy

a SA és JA jelátvitele többnyire akadályozza egymást. Korábban egyértelmű antagonizmusról

számoltak be a JA és a SA között, azonban egyre több ennek ellentmondó adat kerül

napvilágra (Beckers és Spoel, 2006; Mika és mtsai, 2010; Proietti és mtsai, 2013; Thaler és

mtsai, 2012). Hőstressznek kitett Arabidopsis növényeken végzett vizsgálatok alapján

Larkindale és Knight (2002) feltételezték, hogy a SA, ABA és etilén által indukált oxidatív

stressz elleni védelemben ez a három vegyület a Ca2+

/CaM-jelátviteli úton keresztül fejti ki

hatását.

iv) Du és mtsai (2009) Arabidopsis-ban leírtak egy mechanizmust, melyben a Ca2+

szignál a SA-mediált immunválaszhoz kalmodulinon, AtSR1-en (Arabidopsis thaliana

responsive 1), egy Ca2+

/kalmodulin-kötő transzkripciós faktoron és az EDS1 (enhanced

disease susceptibility 1 protein) SA regulátoron keresztül kapcsolódik. Arabidopsisban a

megnövekedett SA szintek önmagukban elegendőek ahhoz, hogy fokozott immunválaszt és

redukált növekedést okozzanak. Az AtSR1 interakcióba lép az EDS1 promóterével és

represszálja annak expresszióját. A SA degradáló enzim, a NahG, expressziója egyaránt

szupresszálja a kórrezisztenciát és a retardált növekedést néhány megemelkedett SA-szintű

kórrezisztens (acd6, bon1, ssi1) mutánsban, de más mutánsokban (mpk4 és dnd1) csak a

kórrezisztenciát. A folyamatos PR1 expressziója gátolt az Atsr1-1 NahG növényekben és

mind az Atsr1-1 NahG, mind a vad típusú NahG növények sokkal érzékenyebbek a

Pseudomonas syringae fertőzésre, mint a vad típusú növények. Az EDS1 képes dimert

képezni és kölcsönhatásba lépni a PAD4-gyel (phytoalexin deficient 4), amely szintén a SA-

felhalmozódás pozitív regulátora (Bartsch és mtsai, 2006).

v) A SA befolyásolja az enzimatikus és nem-enzimatikus antioxidáns rendszert is,

amelynek serkentett működésén keresztül fokozza a növények különböző stresszorokkal - pl.

paraquattal, ózonnal, nehézfémekkel, alacsony és magas hőmérséklettel, szárazsággal -

szembeni toleranciáját (Choudhury és Panda, 2004; Krantev és mtsai, 2008; Larkindale és

Huang, 2004; Metwally és mtsai, 2003, Pál és mtsai, 2011). Ugyanakkor ez a vegyület képes

közvetlenül kötődni a KAT enzimhez, amelynek gátlása miatt megemelkedik a H2O2-szint

(Conrath és mtsai, 1995). Dohányon, Arabidopsis-on, uborkán és paradicsomon végzett

kísérletek során kiderült, hogy a SA-kötő fehérje, a SABP, valójában egy SA-gátolt KAT

enzim, ami a SA kötődésekor elveszíti funkcióját, szerepe az, hogy serkenti a PR-1 gén

expresszióját és fokozza a különböző patogénekkel, pl. a dohánymozaik vírussal szembeni

toleranciát (Conrath és mtsai, 1995; Sánchez-Casas és Klessig, 1994). Rao és mtsai (1997)

36

szerint viszont az SA-indukált H2O2-termelés a Cu/Zn-SOD fokozott aktivitásával állt

kapcsolatban Arabidopsis-ban és független volt a KAT, ill. APX működésétől. A H2O2 magas

szintje serkenti az annak eliminálásáért felelős egyéb antioxidáns enzimek aktivitását

(Çakirlar és mtsai, 2011), továbbá jelmolekulaként nagymértékben befolyásolja a

proteinfoszfatázok, kinázok, ioncsatornák működését, az ABA-függő és –független jelátviteli

utakat, amelyek szerepet játszanak a stressztolerancia kialakításában (Köhler és mtsai, 2003;

Pei és mtsai, 2000; Rhee, 2006). Szárazságstressznek kitett paradicsom vagy sóstressznek

kitett Brassica juncea növények levelére permetezve a SA fokozta a KAT, POD és SOD

működését (Hayat és mtsai, 2008; Yusuf és mtsai, 2008). A SA az antioxidánsok másik

csoportját képező tiolok mennyiségét is növeli. Megemelte a GSH-tartalmat és a GSH/GSSG-

arányt borsóban (Srivastava és Dwivedi, 1998), Arabidopsis-ban (Borsani és mtsai, 2001),

illetve nikkel-hiperakkumuláló Thlaspi fajokban (Freeman és mtsai, 2005), ezáltal indukálva

azok stressztoleranciáját. A GSH aktiválhatja az NPR1 és protein foszfatáz 2C fehérjék

szabályozását, amelyek a SA és ABA jelzés fontos elemei (Meinhard és mtsai, 2002; Mou és

mtsai, 2003). Fagopyron tartaricum levelek 150 mg l-1

SA-kezelése már 24-48 órán belül

indukálta a flavonoid bioszintézis enzimeit kódoló géneket, név szerint a kalkone-szintáz

(FtCHS), flavonol-szintáz (FtFLS-like), flavon-3-hidroziláz (FtF3H) és a 4-kumaroil-CoA-

ligáz (Ft4CL) génjeit, amely a rutin mennyiségének nagymértékű emelkedését okozta (Sun és

mtsai, 2012).

Felmerül a kérdés, hogy vajon a növény saját, endogén SA-mennyisége egyáltalán

befolyásolja-e a különböző stresszorokkal szembeni ellenálló-képességet. Ha igen, milyen

mértékben és hogyan? Az exogén SA hatásairól fent számos információ található. Kérdés

továbbá az is, hogy az endogén és az exogén SA hatásmechanizmusa azonos-e, vagy sem, ha

nem, akkor milyen mértékben térnek el egymástól? Vajon szükséges-e egy adott SA-szint a

stressztolerancia kialakításához? Ha igen, akkor az alacsony SA-szint hatásai fokozhatóak-e,

esetleg szükség szerint kompenzálhatóak-e exogén SA-kezeléssel? Jelen dolgozat témája az

endogén SA hatásainak vizsgálatára korlátozódott, abban a reményben, hogy sikerül néhány

kérdésre választ találni.

37

3. KUTATÁSI CÉL

A kutatás célja a búza különböző stresszkörülmények között adott élettani válaszainak jobb

megismerése a kezdeti endogén szalicilsavszintjük tükrében. Elsősorban arra kerestük a

választ, hogy:

Egyes búzafajtáknak és vonalaknak milyen az endogén SA- és PA-tartalma?

Változik-e ezeknek az anyagoknak, különösen a SA-nak a mennyisége és minősége

biotikus, illetve abiotikus stresszkörülmények között. Ha igen, hogyan?

Miként befolyásolják a különböző stresszek a növényi védekezőrendszert?

Van-e kapcsolat a SA-függő illetve egyéb védekezési mechanizmusok között?

Befolyásolja-e a növény alap SA-szintje annak stresszekkel szembeni toleranciáját?

A fent leírtakon kívül a munka egyes fázisai az alábbi kérdéskörök szerint tagolódtak:

Az első kísérletsorozatban célunk nagyszámú búzagenotípus (fajták és közel-izogén

vonalak) endogén SA- és PA–tartalmának meghatározása volt kontroll, illetve

mesterséges levélrozsda- és természetes lisztharmatfertőzésnek kitett növényekben.

Vizsgáltuk, hogy vajon a kétféle kórokozó mely genotípusokat milyen sikerességgel

képes fertőzni, és azt, hogy ez kapcsolatban áll-e a vizsgált két vegyület kiindulási és

fertőzés által befolyásolt mennyiségével.

A második kísérletsorozatban célunk a szántóföldi eredmények alapján kiválasztott

genotípusokban a mesterséges lisztharmatfertőzés hatásainak vizsgálata volt ellenőrzött,

üvegházi körülmények között.

A harmadik kísérletsorozatban célunk a Cd-stressz hatásainak jobb megismerése volt

korábban már vizsgált genotípusokban. Ennek érdekében magas (500µM) illetve

alacsony (50µM) koncentrációban alkalmazott Cd SA-bioszintézisre és anyagcserére,

valamint az antioxidáns védekezőrendszerre kifejtett hatásait vizsgáltuk különböző

fejlettségi állapotban lévő növényekben azok Cd-mal szembeni toleranciájának

függvényében.

A negyedik kísérletsorozatban célunk a PEG-indukálta ozmotikus és szárazságstressz

hatásainak jobb megismerése volt a korábban vizsgált, négy búzagenotípusban.

Az ötödik kísérletsorozatban célunk az UV-B sugárzás egyedüli, illetve Cd-stressz vagy

PEG-indukált ozmotikus stresszel kombinált hatásainak jobb megismerése volt egy

választott búzafajtában.

38

4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK

4.1. Növényi anyag, növénynevelés, kezelések paraméterei

4.1.1. Búza növények nevelése és kezelése földben

Szántóföldi kísérlet

A szántóföldi kísérletek során 22 búza genotípus levelének SA- és PA-szint

vizsgálatára került sor, köztük Thatcher-alapú közel-izogén vonalakat (TC, TC1, TC2C, TC3,

TC3BG, TC3KA, TC9, TC11, TC18, TC19, TC24, TC25, TC26, TC28, TC29, TC33, TC34)

és Martonvásáron nemesített őszi búzafajtákat (Mv Béres, Mv Hombár, Mv Marsall,

Martonvásári 8=Mv 8 és Mv Regiment) használtunk (Kovács és mtsai, 2012). A Thatcher-

alapú közel-izogén vonalak szemei eredetileg Dr. James A. Kolmer-től (Cereal Disease

Laboratory, USDA St. Paul, MN, USA) származtak. Ezek a vonalak jól ismert levélrozsda-

rezisztenciáért felelős géneket hordoztak (Lr1, Lr2, Lr3, Lr9, Lr11, Lr18, Lr19, Lr24, Lr25,

Lr26, Lr28, Lr29, Lr33, Lr34), és különböző mértékű toleranciát mutattak a levélrozsdával

szemben. A kísérletre az MTA Agrártudományi Kutatóközpont, Mezőgazdasági Intézet

rozsdakertjében került sor. A szemek egyenként 1,4 m hosszú, kétsoros parcellákba lettek

ültetve, egymástól 15 cm-re. A növények levélmintáinak leszedésére a mesterséges,

levélrozsdával történő inokuláció után került sor. A rozsdakertben a vizsgált növények

(GS37) köré fogékony búzaváltozatok voltak ültetve, a fertőzéshez a levélrozsda uredospóra

keveréke lett felhasználva a Zadoks és mtsai (1974) által leírtak alapján. A spóraszuszpenzót

injekciós fecskendő segítségével a növényekbe injektálták. Ezt követően a patogének

természetes módon terjedtek szét a növényben a befecskendezésük helyétől. A mesterséges

levélrozsda-fertőzésen kívül egyes genotípusokon kisebb-nagyobb mértékben megjelent a

természetes lisztharmatfertőzés is. A begyűjtött mintákat a zászlós levelek alatti első és

második levelek képezték a kontroll és fertőzött növények esetén egyaránt. A kontroll

növényekről a fertőzés előtt, a fertőzöttekről az inokuláció után 14 nappal szedtünk mintákat.

Üvegházi kísérlet

Növénynevelés:

A szántóföldi kísérletek alapján 11 különböző búza genotípust (Alcedo, Mv Marsall,

Mv Toborzó, Mv Béres, Mv Hombár, Mv 8, TC33, TC29, TC26, TC19 és TC9) választottunk

ki, melyek üvegházi körülmények között, fiatal (7 napos) korban lisztharmatfertőzésnek lettek

kitéve.

39

A fiatalkori kísérletekben is használt genotípusok közül négy, levélrozsdával

szemben ismert rezisztenciagént hordozó Thatcher-alapú közel-izogén vonal (TC9:

Thatcher*6/Transfer, TC19: Thatcher*7/Translocation4, TC26: Thatcher*6/ST-1.25, TC33:

Thatcher*6/P.I.58548) lett kiválasztva, és felnőtt (GS45) korban lisztharmatfertőzésnek

kitéve.

A búzavonalak növénykéi 2 °C-os, 28 napos vernalizációt követően 2:1 arányú

föld:homok keverékbe, 11x18 cm-es cserepekbe (2 db növény/cserép); a fiatalkori kísérlethez

50x40 cm-es faládákba (50 db növény/sor/genotípus, 11 genotípus/faláda; 3 db kontroll és

6db fertőzött láda) lettek ültetve, majd mintaszedésig az üvegházban 22/16 °C-on

(nappal/éjszaka), természetes és mesterségen fényen, 16 órás fotoperiódus mellett lettek

nevelve.

Fertőzés:

Az inokuláció a lisztharmat ismert virulenciaspektrumú (melyet különböző hordozó

gének segítségével határoztak meg: Pm0, 1, 2, 3a, 3b, 3c, 3d, 3f, 4a, 4b, 5, 6, 7, 8, 17, 2+6,

2+4b+8, 1+2+9 és 2+Mld) patotípusait tartalmazó keverékével történt. Az inokulációra a

konídiumok levélfelületre szórásával, a növények 7 napos, illetve GS45 felnőtt állapotában

került sor Zadoks és mtsai (1974) módszere alapján.

Mintavétel:

A fiatalkori növények esetében minden levél, felnőttkori növények esetében minden

vonal 8-8 cserepéről, a zászlós levelek alatti első, második és harmadik levelek lettek leszedve

mintának, a kontroll és fertőzött növények esetén egyaránt, 3 nappal és 7 nappal az

inokulációt követően.

A leszedett mintákat azonnal folyékony nitrogénben fagyasztottuk, majd

feldolgozásig -80 °C-on tároltuk. Azonban az antioxidáns enzimaktivitás-méréshez

gyűjtötteket folyékony nitrogénes fagyasztás helyett először -20, majd -80°C-on tároltuk.

Előkísérletek során mérhető különbségeket tapasztaltunk a kétféle fagyasztási mód között, az

előbbi módszer alkalmazása nagyobb mértékben károsította a vizsgált működő fehérjéket,

mint az utóbbi. A leírt mintaszedési eljárást alkalmaztuk minden, a későbbiekben leírt kísérlet

során is.

40

4.1.2. Búzanövények nevelése és kezelése tápoldaton

Az előkísérletek eredményei alapján négy, eltérő endogén SA tartalmú (Kovács és

mtsai, 2012) búza (Triticum aestivum L.) genotípust, kettő viszonylag magas endogén SA

tartalmú Thatcher-alapú közel izogén vonalat (TC19=Thatcher*7/Translocation4,

TC33=Thatcher*6/P.I.58548) és kettő viszonylag alacsony SA tartalmú martonvásári őszi

búza fajtát (Mv 8 és Mv Hombár) használtunk a további kísérletekhez. Ezeket használtuk a

Cd-, illetve PEG-kezeléses kísérletekhez, míg a szintén alacsonyabb SA-tartlamú Mv Emesét

az UV-B- és/vagy Cd- vagy PEG-kezeléses kísérlethez.

A szemeket 3 napig Milli-Q vízzel nedvesített szűrőpapíron, sötétben, 22 °C-on

csíráztattuk. Erre azért volt szükség, mert a tápoldatban történő nevelés technikai feltételei

nem megfelelőek a búzaszemek csíráztatása számára. A szemek nehezen helyezhetőek el úgy

az alkalmazott fémrácsokon, hogy a csírázáshoz elegendő folyadékot kapjanak, de ne

száradjanak ki a tápoldat párolgása ellenére se, továbbá ne is ússzanak a tápoldatban, amely

szintén gátolja a csírázást.

MAKROELEMEK MIKROELEMEK

0,3125 mM KNO3 11,92 μM HBO3

0,45 mM Ca(NO3)2 4,57 μM MnCl2*4H2O

0,0625 mM KH2PO4 0,191 μM ZnSO4*7H2O

0,125 mM MgSO4*7H2O 0,08 μM CuSO4*5H2O

0,024 μM (NH4)6Mo7O24*4H2O

15,02 μM FeSO4*7H2O

23,04 μM Na2EDTA*5H2O

2. táblázat: A növényneveléshez használt módosított Hoagland tápoldat összetétele

A kicsírázott növényeket ezután főzőpohárban (12 növény/főzőpohár), 300 ml módosított

összetételű (1. táblázat) Hoagland tápoldatban, az MTA ATK Mezőgazdasági Intézet Fitotron

épületének Conviron PGR-36 típusú növénynevelő kamrájában (Controlled Environments

Ltd, Winnipeg, Kanada) neveltük 20/18 °C-on 75% relatív páratartalom és 16/8 óra fény/sötét

periódus (PPFD: 250 μmol m-2

s-1

) mellett. A növények megfelelő tápanyag- és levegő-

ellátottsága miatt kétnaponta a tápoldatok teljes cseréjére, a köztes napokon pedig az

elpárolgott oldatok pótlására került sor.

41

4.1.2.1. Kadmiumkezelések paraméterei

Magas kadmium-koncentráció

A növények egy részét normál növekedési feltételek mellett (a 4.1.2. fejezetben

leírtak szerint), a másik felét 500 M Cd(NO3)2-ot tartalmazó tápoldaton neveltük 11 napig. A

kezelést követően mintát szedtünk minden növény leveléből és gyökeréből.

Alacsony kadmium-koncentráció

A növények egyharmadát normál növekedési feltételek mellett neveltük, ezután 17 és

24 napos korban mintát szedtünk a levélből és a gyökérből. A növények második harmadát 50

M Cd(NO3)2-ot tartalmazó tápoldaton neveltük 17 napig, majd levél- és gyökérmintát

szedtünk. A növények harmadik harmadát 17 napig normál körülmények között neveltük,

azután 7 napig a tápoldathoz adagolt 50 M Cd(NO3)2-tal kezeltük, majd a 24 napos korban

levél- és gyökérmintát szedtünk. A gyökérmintákat mérés és fagyasztás előtt először

csapvízben, utána 92,2 mM EDTA-oldatban, majd Milli-Q vízben mostuk, a felesleges

folyadékot pedig papírtörlővel itattuk le. Ezzel a módszerrel a gyökereken maradt Cd

keletálható, és a tápoldat egyéb összetevőivel együtt a gyökereken maradó mennyisége

minimálisra csökkenthető, ezáltal a mérési eredmények pontosabbá, megbízhatóbbá tehetőek.

4.1.2.2. Polietilén-glikollal (PEG) történő kezelések paraméterei

A kísérletek során a 17 napos, normál körülmények közötti nevelés (a 4.1.2.

fejezetben leírtak szerint) után a növények egyik felét megtartottuk kontrollnak, a másik

felének tápoldatához 15 %-ban PEG-6000-et adtunk. Öt nap elteltével levél- és gyökérmintát

szedtünk mind a kontroll, mind a kezelt növényekből.

4.1.2.3. UV-B sugárzással történő előkezelés/edzés paraméterei

A martonvásári Mv Emese búzafajta szemeit a 4.1.2. fejezetben leírtak szerint

csíráztattuk ki, majd a növénykéket módosított Hoagland tápoldatot tartalmazó

főzőpoharakban (12 növény/főzőpohár) neveltük az MTA ATK Mezőgazdasági Intézet

Fitotron épületének Conviron GB-48 típusú növénynevelő kamrájában (Controlled

Environments Ltd, Winnipeg, Kanada) 20/18°C-on 75% relatív páratartalom mellett. A

42

növényeket két csoportra osztottuk. Az első csoportot a 16/8 órás fény/sötét periódus (PPFD:

250 μmol m-2

s-1

) során normál megvilágításnak (fehér fény) tettük ki, míg a másik csoportot

fehér fénynek és egyidejűleg alkalmazott UV-B sugárzásnak tettük ki. Az UV-B-t 7 darab

UV-B Narrowband TL 100W/01 típusú Philips lámpa szolgáltatta, melynek maximális

sugárzása 311 nm-nél található. Az UV-B sugárzás dózisa a kontroll növények esetében 38

Watt cm-2

, míg az UV-B-kezelteknél 430 Watt cm-2

volt. A két hetes növényeket mindkét

megvilágítás esetén három csoportra osztottuk; egy részük volt a kontroll, második részük 50

μM Cd(NO3)2-ot kapott 7 napig, a harmadik részük 15% PEG-6000-et kapott 5 napig a

tápoldathoz adagolva. A kezelések végén az első, második és harmadik levelekből, illetve a

gyökerekből szedtünk mintát.

4.2. Vizuális morfológiai változások értékelése

Lisztharmat-fertőzöttség mértékének fenotípusos meghatározása

A levélbetegségek intenzitásának értékelésére általánosan használt Saari-Prescott

pontozási skálát (0-9) (Saari és Prescott, 1975) alkalmaztuk minden búzafajta, illetve

Thatcher-alapú közel-izogén búzavonal 16-16 növényének pontozására a lisztharmatfertőzés

utáni hetedik napon, szántóföldi és üvegházi körülmények között egyaránt.

Levélcsavarodás mértékének pontozása PEG-kezelt növényeken

Pázsitfűféléknél a levélcsavarodás a levél vízhiányra adott válaszának erős

megnyilvánulásaként értelmezhető. Ha a növények a stressz megjelenésének korai

szakaszában levélcsavarodást mutatnak, az arra utal, hogy gyenge a szárazsággal szembeni

toleranciájuk. A levelek csavarodásának pontozására egy 1-től 5-ig terjedő skála alapján

került sor, ahol az 1 az alig vagy egyáltalán nem csavarodott levelet jelöli, míg az 5 a teljesen

összecsavarodottat (O'Toole és Cruz, 1980). A levelek látható csavarodásának pontozására a

PEG-kezelés ötödik napján történt.

4.3. Relatív klorofilltartalom mérése

A relatív klorofilltartalom meghatározásához egy SPAD-502 klorofill mérő (Minolta

Camera Co., Ltd, Japán) berendezést használtunk. A SPAD-502 mérő a levélen keresztül méri

a vörös (650 nm) és az infravörös (940 nm) sugárzások áteresztőképességi együtthatóját,

43

transzmittanciáját, és egy relatív SPAD mérő értéket számol. A mérések a második vagy

harmadik teljesen kifejlett levélen történtek.

4.4. Klorofill fluoreszcencia indukció mérése

A PSII kvantumhatásfokát a F/Fm’ [(Fm’- Fs)/ Fm’] klorofill fluoreszcencia indukciós

paraméterrel jellemeztük, ahol az Fm’ és az Fs a maximum és a steady-state klorofill

fluoreszcencia szinteket mutatja fényadaptált állapotban. Ennek mérése teljesen kifejlett

leveleken, egy impulzus amplitúdó modulált fluorométerrel (PAM-2000, Walz, Effeltrich,

Németország) történt (Janda és mtsai, 1994).

4.5. Szalicilsav-extrakció és mennyiségi analízis

A SA mennyiségi és minőségi elemzését HPLC-vel Meuwly és Métraux (1993)

módszere szerint a következőképpen végeztük:

0,5 g növényi mintát folyékony nitrogénben, 0,25 g kvarchomok segítségével

dörzsmozsárban homogenizáltuk, 2 ml 70 %-os metanolt 250 ng orto-anizinsavat (oANI:

belső standard) és 25 μg para-hidroxi-benzoesavat (pHBA: extrakciós carrier) adtunk hozzá.

Vortexeltük, majd a 4 °C-on 10000 g-vel 10 percig tartó centrifugálást követően a felülúszót

félretettük. A csapadékot 2 ml 90%-os metanollal újra extraháltuk, vortexeltük, 4 °C-on

10000 g-vel 10 percig ismét centrifugáltuk. Az így képződött felülúszót a korábban

félretetthez hozzáöntöttük és vákuumbepárlóban vizes fázisig bepároltuk. Ezután 1 ml 5%-os

(w/v) TCA-t adtunk a mintákhoz, vortexeltük, 4 °C-on 10 percig 10000 g-vel centrifugáltuk.

A felülúszóból a szabad SA-t 4 ml ciklohexán:etilacetát = 1:1 (v/v) elegyével extraháltuk. A

felső szerves fázist Pasteur-pipettával üvegfiolákba átvittük, vákuumbepárlóban szárazra

pároltuk és a mérésig −20 °C-on tároltuk. Az alsó vizes fázisból a kötött formájú SA savas

hidrolízissel szabadítható fel, ezért a csövek tartalmához 25 μl 1 mg ml-1

pHBA-t, 5 μl 0,05

mg ml-1

oANI-t és 1,3 ml 8N HCl-t adtunk, ezután 80 °C-on 60 percig inkubáltuk, majd a fent

leírtak szerint extraháltuk. Az üvegfiolákba átpipettázott felső szerves fázisokat

vákuumbepárlóban szárazra pároltuk és felhasználásig -20 °C-on tároltuk.

Az így előkészített és tárolt mintákat a folyadékkromatográfiás mérés előtt az „A”

szolvens 500 μl-ében visszaoldottuk és membránszűrőn átszűrtük. A méréshez Waters típusú

HPLC-t (WATERS, Milford, MA, USA) használtunk, mely a következő részegységekből állt:

44

W2690 pumparendszer (mely tartalmazott egy automata mintaadagolót,

oszloptermosztátot és gradiens keverésre alkalmas pumparendszert), UV/VIS diódasoros

(W996) és egy W474 scanning fluoreszcens detektor. A mérési adatok kiértékelése

Millenium32 program (WATERS, Milford, MA, USA) segítségével történt. A mintából 40 μl-

t injektáltunk az 5 μm szemcseméretű, 150x4,6 mm méretű Supelcosil ABZ-Plus analitikai

oszlopra. A mérés során kétféle szolvenst használtuk (A: 12,5 mM Na-acetát (pH 2,6), 15%

ACN; B: 100% ACN). Az elválasztáshoz használt gradiens program a 3. táblázatban található.

Az oszlophőmérséklet az elemzés során 40°C volt. Detektáláshoz a diódasoros UV/VIS

detektorral 230 és 300 nm között teljes spektrumot vettünk fel, melynek egyik célja az, hogy

minden vegyületet a maximális abszorbanciánál tudjunk kiértékelni, másrészt a jellemző UV

spektrum alapján is lehet azonosítani a csúcsot a retenciós idő mellett (benzoesav, orto-

hidroxi-fahéjsav és SA). A vizsgált vegyületek közül az orto-hidroxi-fahéjsav (oHCA) és a

SA fluoreszkál is. Detektálásuk 317 nm gerjesztési és 436 nm kisugárzási (oHCA), illetve 305

nm gerjesztési és 407 nm kisugárzási hullámhosszon (SA) történt.

Idő (perc)

Áramlási

sebesség

(ml/perc)

A % B %

1 0 1 100 0

2 1 1 100 0

3 3 1 95 5

4 5 1 95 5

5 18 1 45 55

6 20 1 0 100

7 20,1 1,4 0 100

8 25 1 0 100

9 27 1 100 0

10 31 1 100 0

2. táblázat: Az SA és oHCA elválasztásához használt gradiens program.

45

4.6. Poliaminok mennyiségi analízise

A mintaelőkészítés során 0,2 g növényi mintát folyékony nitrogénben eldörzsöltünk,

1 ml 0,2 M jéghideg perklórsavval extraháltunk, majd 20 percig jégben állni hagytuk. Ezután

4 °C-on 20 percig 10000 g-vel centrifugáltuk. 100 μl felülúszóból danzil-kloriddal

származékot képeztünk Smith és Davies (1985) alábbi módszere szerint:

Származékképzés: 100 μl mintához 200 μl telített nátrium-karbonátot és 400 μl

acetonban oldott danzil-kloridot (5 mg ml-1

) adtunk. Összerázás után 60 °C-on sötétben 60

percig inkubáltuk, majd 100 μl 100 mg ml-1

töménységű prolin oldatot adtunk hozzá, és

további 30 percig szobahőmérsékleten sötétben inkubáltuk. Ezután a danzilszármazékokat

500 μl toluollal 30 másodpercig extraháltuk, és a szerves fázist vákuum alatt bepároltuk. A

maradékot 1 ml 100 % metanolban felvettük 0,2 μm pórusméretű teflon membránszűrőn

átszűrtük és Waters típusú HPLC-vel (WATERS, Milford, MA, USA) elemeztük, mely a

következő részegységekből állt: W 2690 rendszer, mely tartalmaz egy automata

mintaadagolót, oszloptermosztátot és gradiens keverésre alkalmas pumparendszert; és ehhez

egy W474 típusú scanning fluoreszcens detektort csatlakoztattunk.

A mérési adatok kiértékelése Millenium32 program (WATERS, Milford, MA, USA)

segítségével történt. A fent leírt módon származékképzett mintából 2 μl-t injektáltunk a 18 μm

szemcseméretű Supelcosil C18 töltetű 20x2,1 mm-es előtét oszlopra, mely után egy 100x2,1

mm analitikai oszlop volt kötve, amelyben Hypersil ODS 5 μm szemcseméretű töltet volt. A

mérés során kétféle szolvenst használtuk (A: 44 % ACN; B: 7:3=ACN:MeOH). Az

elválasztáshoz használt gradiens program a 4. táblázatban található. Az elemzés során az

áramlási sebesség 0,5 ml/perc, az oszlophőmérséklet 40 °C volt. A danzil-kloriddal

származékképzett poliaminok detektálása fluoreszcens detektorral 340 nm-es gerjesztési és

515 nm-es kisugárzási hullámhosszon történt.

Idő (perc) A % B %

0 100 0

13 3 97

14 0 100

18 0 100

19 100 0

31 100 0

3. táblázat: Poliaminok elválasztásához használt gradiens program.

46

4.7. Korizmát-szintázt és izokorizmát-szintázt kódoló gének (CS és ICS) kifejeződésének

vizsgálata valós idejű PCR-rel

A CS és ICS gének expressziós vizsgálatához levél- és gyökérmintákat szedtünk (a 3

független biológiai ismétlésen kívül 4-4 technikai ismétlést alkalmaztunk, 1 kezelés = 3

biológiai ismétlés = 3x4 technikai ismétlés). Az RNS izolálása TRIzol reagenssel (Life

Technologies, Carlsbad, CA, USA), a minták kezelése „DNase I”-gyel, tisztítása „RNeasy

Plant Mini Kit”-tel (Qiagen, Hilden, Németország) történt a gyártó utasításai szerint. Az

izolált RNS mennyiségét és tisztaságát fotometriásan (NanoDrop ND-1000 UV-Vis

spectrophotometer, NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA) határoztuk meg. 150 ng

RNS reverz transzkripciója „High Capacity RNA-to-cDNA kit”-tel (Applied Biosystem,

Foster City, CA, USA) történt. A valós idejű polimeráz láncreakció (real-time PCR)

kivitelezése a SYBR Green detekciós módszerrel, a gyártó által mellékelt leírás szerint, és

gén-specifikus primerekkel történt egy Applied Biosystems 7500 készülékkel (Applied

Biosystems, Foster City, CA, USA). A endogén kontroll a búza β-aktin (AY663392) gén volt

(forward: GACAATGGAACCGGAATGGTC; reverse:

GTGTGATGCCAGATTTTCTCCAT). A CS gén (búza CS1: GH456415.1; forward:

GCGGCCATCGTCTCCACCAT; reverse: GGCCGAGGTACAGGGAGGGA) és ICS gén

(búza ICS: EV254155.1; forward: TTCAGCTCCACCAAACCAACCA; reverse:

GGTTTGCCCACTGAAGAAGCG) primerei ismert Triticum EST-k és génszekvenciák

magasan konzervált régióira specifikusan lettek megtervezve, előállításukat a Sigma-Aldrich

Co. LLC. vállalat végezte. Az endogén kontroll és a specifikus gének küszöb ciklus (threshold

cycle, Ct) értékei közötti relatív arányt minden minta esetében kiszámoltuk.

4.8. A fenilalanin-ammónia-liáz (PAL) aktivitásának meghatározása

1 g levelet, illetve gyökeret dörzsmozsár segítségével homogenizáltunk 4 ml

jéghideg 50 mM Tris-HCl (pH 8,8) pufferben, amely 5 mM -merkaptoetanolt és 4% (w/v)

PVP-t tartalmazott. A homogenizátumot 10 percig 10000 g-vel centrifugáltuk, majd a

felülúszót használtuk az enzimaktivitás meghatározásához. A 2,75 ml reakcióelegyben 50

mM L-fenilalanin, 50 mM Tris-HCl (pH 8,8) puffer és 250 l felülúszó volt. A reakciót a

növényi extraktummal indítottuk el, 37 °C-on inkubáltuk, és 1 óra elteltével 10 % TCA-val

állítottuk le. 5 perces centrifugálás (10000 g) után a PAL aktivitását spektrofotometriásan

határoztuk meg. Az enzim működését jelző transz-fahéjsav képződését követhetjük nyomon,

47

a 290 nm-en mért abszorbancia növekedése révén (Gao és mtsai, 2008). A PAL-aktivitást U-

ban (unit, enzimatikus aktivitás egység), 1 g frisstömegre vonatkoztatva adtuk meg.

4.9. Antioxidáns enzimek kivonása és aktivitás mérése

Az első öt antioxidáns enzim (GR, GST, KAT, APX és G-POD) aktivitásának

elemzéséhez 0,5 g növényi szövetet dörzsmozsárban, kvarchomok segítségével, 2,5 ml, 3 mM

MgCl2-ot és 1 mM EDTA-t tartalmazó jéghideg 0,5 mM Tris-HCl pufferben (pH 7,5)

homogenizáltunk. A mintákat hűtött centrifugában 10000 g-vel 10 percig centrifugáltuk,

majd a felülúszót szétosztottuk Eppendorf csövekbe. A GR aktivitását a friss mintákból, a

többi enzim aktivitását egyszer, -20 °C-on fagyasztott mintákból mértük spektrofotométerrel

(Shimadzu UV-VIS 160A, Kyoto, Japán). Mérésig a mintákat jégen tartottuk, a méréseket

szobahőmérsékleten végeztük. A hatodik enzim, a MDHAR vizsgálatához ettől eltérő minta-

előkészítési módszert alkalmaztunk, amely a 4.9.6. fejezetben olvasható. Az aktivitásértékeket

minden esetben nkat-ban, 1 g frisstömegre vonatkoztatva adtuk meg.

4.9.1. Glutation-reduktáz

A GR aktivitásának meghatározása során 412 nm-en mértük az 5,5’-ditio-bis-(2-

nitro-benzoesav) (DTNB) redukcióját Smith és mtsai (1988) módszere alapján. A 3 ml

össztérfogatú reakcióelegy 75 mM Na-foszfát puffert (pH 7,5), 0,15 mM dietiléntriamin-

pentaecetsavat, 0,75 mM 5,5’-ditio-bis-(2- nitro-benzoesav)-at, 0,1 mM NADPH-t, 0,5 mM

oxidált glutationt és a reakciót indító 50 l növényi mintát tartalmazta.

4.9.2. Glutation-S-transzferáz

A GST aktivitásának meghatározása során az S-2,4-dinitrofenil-glutation képződését

mértük 340 nm-en Mannervik és Guthenberg (1981) módszere szerint. A 3 ml össztérfogatú

reakcióelegy 72,7 mM Na-foszfát puffer (pH 6,5), 3,6 mM redukált glutationt és 1 mM 1-

kloro-2,4-dinitro-benzént tartalmazott. A reakciót 100 l mintával indítottuk el.

48

4.9.3. Kataláz

A KAT aktivitását 240 nm-en a H2O2 fogyásával követtük nyomon (Janda és mtsai,

1999). A 3 ml össztérfogatú reakcióelegy 0,44 M Tris-HCl puffert (pH 7,4), 0,0375% H2O2 és

50 l növényi mintát tartalmazott. A reakciót a H2O2 hozzáadásával indítottuk.

4.9.4. Aszkorbát-peroxidáz

Az APX aktivitásának meghatározása során az aszkorbinsav fogyását 290 nm-en

követtük nyomon (Janda és mtsai, 1999). A 3 ml össztérfogatú reakcióelegy 0,2 M Tris-HCl

puffert (pH 7,8), 5,625 mM aszkorbinsavat és növényi mintát tartalmazott. A reakciót 0,042

% H2O2-dal indítottuk el.

4.9.5. Gvajakol-peroxidáz

A G-POD aktivitásának meghatározása Ádám és mtsai (1995) módszere szerint 470

nm-en történt a gvajakol oxidációjának nyomon követésével. A 3 ml össztérfogatú

reakcióelegy 88 mM Na-acetát puffert (pH 5,5), 0,88 mM gvajakolt és a növényi mintát

tartalmazta. A reakciót 0,0375 % H2O2 hozzáadásával indítottuk el.

4.9.6. Monodehidro-aszkorbát-reduktáz

Az MDHAR aktivitásának mérése Krivosheeva és mtsai (1996) módosított

módszerén alapul. A 0,5 g növényi anyagot dörzsmozsárban homogenizáltuk, majd 1,75 ml

extrakciós puffert (melynek összetétele: 2 % polivinilpirrolidon (PVP), 1 mM EDTA, 1 mM

L-aszkorbát, 0,25 % Triton-X 100 és 50 mM nátrium-foszfát puffer (pH 7,6)) adtunk a

mintákhoz. Az aszkorbát-peroxidáz aktivitását 750 μl 50 mM Na-foszfát pufferben (pH:7,6)

készült telített ammónium-szulfát oldat hozzáadásával gátoltuk. A minták 4 °C-on 10 percig

10000 g-vel történő centrifugálása után a reakcióelegy 2 mL Na-foszfát puffert (pH 7.0), 300

μl 20 mM GSH oldatot, 300 μL 2 mM dehidroaszkorbátot és 100 μL felülúszót tartalmazott.

A dehidroaszkorbát aszkorbáttá redukálódását a Shimadzu UV-VIS 160A (Kyoto, Japán)

spektrofotométerrel 265 nm-en, szobahőmérsékleten mért abszorbancia növekedésén

keresztül követtük nyomon.

49

4.9.6.1. G-POD izoenzimek vizsgálata poliakrilamid-gélelektroforézissel

A G-POD izoenzimek elválasztása 10 %-os nem-denaturáló poliakrilamid géleken,

1,5 óra, 25 mA áramerősség és maximális feszültség alkalmazásával történt Janda és mtsai

(1999) módosított módszere alapján. A peroxidáz izoenzimek azonosításához a gélek 15

percig 0,68 mM benzidint, 5,5 mM gvajakolt, 0,63 mM MnCl2-ot és 5 mM H2O2-ot

tartalmazó, 0,2 M Na-acetát pufferben lettek festve. A kiváltott színreakció leállításához 7 %-

os ecetsav oldat lett használva. A minták fehérjetartalmának meghatározására Bradford (1976)

módszere alapján került sor.

4.10. Prolintartalom meghatározása

Bates és mtsai (1973) módszere alapján 0,5 g növényi anyagot 1 g kvarchomok

segítségével 4 ml Milli-Q vízben homogenizáltuk, majd 10 percig 4 °C-on és 10000 g-vel

centrifugáltuk. A felülúszót vízzel kiegészítettük 10 ml-re, majd 2,5 ml felülúszót 3,4 ml

ecetsavas ninhidrin reagenssel (12,5 mg ml-1

) reagáltattunk. 5 ml toluollal történő extrahálás

után a prolintartalmat 518 nm-en Shimadzu UV-VIS 160A (Kyoto, Japán)

spektrofotométerrel mértük. Standardként 250 μg ml-1

prolin törzsoldatból 0,5; 0,75; 1,0; 1,25

és 1,5 μg ml-1

hígítási sor alapján kalibrációs egyenest készítettünk. A prolintartalmat μg-ban,

1g frisstömegre vonatkoztatva adtuk meg.

4.11. Lipidperoxidáció meghatározása

A lipidperoxidáció meghatározása az MDA-tartalom mérésén alapszik. Az

előkészítés során 0,2 g növényi mintát dörzsmozsárban 600 μl 0,1 %-os (w/v) TCA-val

eldörzsöltünk, majd 12000 g-vel 10 percig centrifugáltuk. A felülúszó 300 μl-éhez 2 ml 0,5 %

(w/v) TBA-t tartalmazó 20 %-os (w/v) TCA-t adtunk és az elegyet 90 °C-on 30 percig

inkubáltuk. Az MDA-tartalom meghatározása spektrofotometriásan, 532 nm-en történt, a 600

nm-en mért nem specifikus abszorpció figyelembevételével. Az MDA-tartalmat nmol g-1

friss

tömegben adtuk meg (Thomas és mtsai, 2004).

50

4.12. Statisztikai analízis

Az eredmények 10 ismétlés átlagai a klorofill-a fluoreszcencia indukciós mérések és

a klorofilltartalom esetében, 5 ismétlés átlagai az MDA- és prolintartalom, a PAL, illetve az

antioxidáns enzimek aktivitásainak meghatározása és a HPLC-s analízisek, 3 ismétlés átlagai

a CS és ICS gének expressziós szintjeinek meghatározása során. Mivel az általunk vizsgált

paramétereket az öregedési folyamatok is befolyásolhatják (Prochazkova és mtsai, 2001), a

paraméterek változásait az azonos korú kontroll növényekben mért értékekhez hasonlítottuk.

A szignifikancia vizsgálathoz Student-féle kétmintás t-próbát, illetve Duncan-féle tesztet

használtunk. A vizsgált paraméterek közötti kapcsolat vizsgálatához pedig elvégeztük a

paraméterek korrelációs elemzését.

51

5. EREDMÉNYEK

5.1. Levélrozsda- és lisztharmatfertőzés hatásainak vizsgálata nagyszámú búza

genotípusban szántóföldi körülmények között

Az első kísérletsorozatban arra kerestük a választ, hogy vajon a különböző

búzafajták, illetve vonalak milyen SA- és PA-szintekkel rendelkeznek kontroll és

stresszkörülmények között, milyen a levélrozsdával szembeni ellenálló képességük, továbbá

arra, hogy van-e kapcsolat a fent említett két vegyület kiindulási és/vagy stresszindukált

szintje valamint a növények patogénnel szembeni toleranciája között. Ennek érdekében 22

búza genotípust mesterséges levélrozsda-fertőzésnek tettünk ki, majd vizsgáltuk a fertőzés

élettani folyamatokra gyakorolt hatásait.

A mintaszedés idején, néhány genotípuson nem voltak láthatóak a fertőzés tünetei.

Habár 14 nappal az inokulációt követően levélrozsdafoltok jelentek meg a TC, TC1, TC3BG,

TC11, TC24, TC25, TC26, TC28, TC33 és TC34 közel-izogén vonalakon, a fertőzés nem

terjedt át a fertőzés helyétől távolabb eső levelekre. A többi genotípuson nem volt a sikeres

fertőzést igazoló látható tünet. Mindezek mellett számos genotípuson megjelent a természetes

lisztharmatfertőzés. Kicsi, fehér telepek jelentek meg a fogékony búzafajták/vonalak levelein,

és jelentős különbségek mutatkoztak a különböző genotípusokon uralkodó fertőzés

súlyosságában is. A fogékony genotípusokon a lisztharmat telepei a növények föld feletti

részein mindenhol megjelentek (a Saari-Prescott skálán 9 és 7 pontot kaptak). A mérsékelten

ellenálló genotípusokon a telepek csak a növények alsó levelein jelentek meg, közel a

szárhoz, mialatt az ellenálló genotípusokon alig volt látható néhány telep (3 és 1 pontot kaptak

a Saari-Prescott skálán). A fenotípusos vizsgálat alapján elmondható, hogy a TC1, TC2C,

TC3, TC3BG, TC11, TC24, TC25, TC26, TC28, TC29, TC33 és a TC34 meglehetősen

fogékony, míg a TC, TC3KA, TC9, TC18, TC19, Mv 8, Mv Marsall, Mv Béres, Mv

Regiment és Mv Hombár sokkal ellenállóbb a lisztharmatfertőzéssel szemben.

A szabad SA-szint egy nagyságrenddel alacsonyabb volt a levélmintákban, mint a

kötött SA-szint, és néhány esetben a kimutathatósági határ alatt is volt, ezért a teljes SA-

tartalom főleg a kötött SA-ból állt (5. ábra). A totál endogén SA-tartalom a kontroll növények

leveleiben körülbelül 150 és 2500 ng g–1

friss tömeg (FW) között mozgott.

52

5. ábra: A 22 szántóföldön nevelt búza genotípus kontroll és patogénekkel fertőzött leveleinek összes endogén

SA-tartalmának mennyiségi változásai levélrozsda- illetve lisztharmatfertőzést követően szántóföldi

körülmények között. A feltüntetett szignifikanciaszintek a SA-tartalom értékeinek kontroll és kezelt növények

között mért különbségét jelentik adott genotípus esetén (* : p 0,05; ** : p0,01; *** : p0,001) (n=5; SD).

A legmagasabb SA-szint a TC1-ben, a TC3BG-ben, a TC19-ben és a TC33-ban volt, míg 200

ng g–1

FW-nél alacsonyabb érték a 4 martonvásári fajtában, az Mv Marsallban, Mv

Regimentben, Mv Hombárban és az Mv 8-ban, volt mérhető. A fertőzést követően a SA

mennyisége a legtöbb genotípusban jelentősen megnőtt. Kivételt képezett az Mv Marsall,

TC1, TC2C, TC3, TC9, TC18, TC19, TC34 és az Mv 8, ahol ez a növekedés nem volt

szignifikáns. A növekedés mértéke 1,3-6-szoros tartományon belül mozgott. A legkisebb

emelkedés a TC1, TC19 és TC29, a legmagasabb az Mv Regiment, Mv Hombár és az Mv 8

esetében volt megfigyelhető. A TC3BG és TC3KA vonalakban nem történt változás.

A mintákból a szabad formájú PA-ok (AGM, CAD, PUT, SPD és SPN)

mennyiségének elemzésére került sor (6. ábra). Az AGM és a CAD mennyisége a

kimutathatósági határ alatt volt.

53

6. ábra: A 22 különböző búza genotípus kontroll és fertőzött növényeinek levelében mért szabad formájú PA-ok

(PUT - putreszcin, SPD - spermidin, SPN - spermin) mennyiségi változásai levélrozsda- illetve

lisztharmatfertőzést követően szántóföldi körülmények között. A feltüntetett szignifikanciaszintek a PA-tartalom

értékeinek kontroll és kezelt növények között mért különbségét jelentik adott genotípus esetén (* : p 0,05; ** :

p0,01; *** : p0,001) (n=5; SD).

A SPD-tartalom volt a legmagasabb minden vizsgált búza genotípusban (6/B. ábra).

A PUT-tartalom eltérő volt a 22 genotípus kontroll növényeiben, de 14 nappal a fertőzés után

drasztikusan megnőtt minden vonalban, illetve fajtában (6/A. ábra). 1,6-3,5-szörös növekedést

mértünk, a TC29-ben a legalacsonyabbat, az Mv Regimentben pedig a legmagasabbat. A

SPD-tartalom mutatta a legnagyobb varianciát a vizsgált genotípusok kontroll növényeiben. A

fertőzés után szignifikánsan emelkedett a TC2C, TC3BG, TC11, TC26 és TC33 közel-izogén

Thatcher-alapú vonalakban, az Mv 8-ban viszont csökkent, a többi genotípusban pedig nem

54

változott. A SPN-tartalom szintén változatos képet mutatott a kontroll növényekben, a

legkevesebb SPN a TC9-ben, TC28-ban és a TC29-ben, a legtöbb a TC18-ban, az Mv 8-ban

és az Mv Marsallban volt (6/C. ábra). A fertőzés csak a TC11, TC26 és TC28 esetében

okozott szignifikáns növekedést, míg az Mv 8-ban szignifikáns csökkenés volt megfigyelhető,

a többi genotípusban a fertőzés kevésbé befolyásolta az SPN mennyiségét.

Az antioxidáns enzimek (GR, GST, KAT, APX és G-POD) aktivitásai nem mutattak

nagy különbségeket a 22 genotípus kontroll növényeiben (7. ábra). A fertőzés befolyásolta az

enzimaktivitásokat, de minden enzim esetében máshogyan. A GR aktivitásában minden

genotípusban kismértékű növekedés volt megfigyelhető, mely viszont csak a TC2C-ben, TC3-

ban, TC3BG-ben, TC3KA-ban, TC9-ben, TC18-ban, TC19-ben és az Mv Regimentben volt

statisztikusan szignifikáns (7/A. ábra). A GST aktivitása is nőtt a fertőzést követően és ez a

növekedés szignifikáns volt a TC2C, TC3, TC3BG, TC3KA, TC18, TC19, TC34, Mv Marsall

és az Mv Regiment esetében (7/B. ábra). A biotikus stressz befolyásolta a KAT aktivitását is,

mely jelentősen csökkent a fertőzés hatására minden genotípusban (7/C. ábra). Az APX

aktivitás, 14 nappal a fertőzést követően, szintén szignifikánsan csökkent a kontrollhoz képest

minden búzaváltozatban, kivéve a TC3-ban, a TC26-ban, az Mv Marsallban és az Mv 8-ban

(7/D. ábra). A G-POD aktivitása jelentős mértékben csökkent a fertőzés után a TC2C,

TC3KA, TC9, TC18, TC19, TC26, TC29 és a TC33 esetében a kontrollhoz viszonyítva (7/E.

ábra).

55

7. ábra: Az antioxidáns enzimek (GR – glutation-reduktáz, GST – glutation-S-transzferáz, KAT – kataláz, APX

– aszkorbát-peroxidáz, G-POD – gvajakol-peroxidáz) aktivitásában bekövetkező változások búzanövények

leveleleiben levélrozsda- illetve lisztharmatfertőzést követően szántóföldi körülmények között. A feltüntetett

szignifikanciaszintek az antioxidáns enzimek aktivitás-értékeinek kontroll és kezelt növények között mért

különbségét jelentik adott genotípus esetén (* : p 0,05; ** : p0,01; *** : p0,001) (n=5; SD).

56

5.2. Lisztharmatfertőzés hatásai búza genotípusokban üvegházi körülmények között

5.2.1. A lisztharmatfertőzés hatásai szelektált, fiatalkori búza genotípusokra

A szántóföldi körülmények között jelentkező sokféle stresszhatás kiküszöbölése

érdekében a további kísérletekre üvegházban került sor, amelyekben az előző kísérletek

eredményei alapján 11 különböző, magas illetve alacsony SA-tartalmú, genotípust

választottunk ki. A ΔF/Fm’ klorofill-a fluoreszcencia indukciós paraméter 3 nappal a fertőzés

után csekély, míg 7 nappal a fertőzést követően jelentősebb mértékű csökkenést mutatott,

viszont a genotípusok között nem volt jelentős különbség (az adatok nincsenek feltüntetve).

Habár a levelek kiindulási teljes klorofill-tartalma az Alcedoban és a martonvásári nemesítésű

búzafajtákban, az Mv 8 kivételével, magasabb volt, mint a Thatcher-alapú közel-izogén

vonalakban, a lisztharmat 7 nap elteltével sem okozott számottevő változást egyik

genotípusban sem (az adatok nincsenek feltüntetve). Valamennyi genotípus esetén,

toleranciától függetlenül, azonos mértékben jelentek meg a lisztharmatfertőzés tünetei.

5.2.1.1. A SA-tartalom változása lisztharmatfertőzés hatására

A növények endogén SA-tartalma számos tényezőtől függhet, mint pl. a növény

egyedfejlődési szintje, élettani állapota, stb., melyeket a növénynevelés körülményei

jelentősen befolyásolhatnak. A fiatal kontroll búzanövénykék levelében a szabad és kötött SA

mennyisége széles határok között mozgott (a szabad SA-szintek 87-329 ng, a kötött SA-

szintek 54-106 ng SA g-1

FW közötti értékek voltak mérhetőek), ezen kívül az öregedés

hatására egyaránt csökkent minden genotípusban (8. ábra). A Thatcher-alapú közel izogén

vonalak közül a legalacsonyabb szabad SA-tartalommal a TC26 és TC29, ezzel szemben a

legmagasabbal a TC33 és a TC19 rendelkezett.

A szabad SA 3 nappal a fertőzést követően minden búzaváltozatban csökkent, de ez

csak a genotípusok felében volt szignifikáns. Hasonló volt a tendencia a 7 napos növényekben

is, az Alcedo, az Mv Béres, az Mv 8, a TC33, a TC29 és a TC9 kivételével, minden esetben

jelentős mértékű csökkenést mértünk. A kötött SA már 3 nappal a fertőzés után megnőtt az

Mv Toborzó, Mv Béres és TC33 levelében, mialatt a TC26-ban, a TC19-ben és a TC9-ben

csökkent, viszont 7 nappal a fertőzés után csak az Mv Marsall esetén tapasztaltunk

emelkedést, míg az Mv Toborzó és a TC29 kötött SA-mennyiségének visszaesését mértük, a

genotípusok többségében pedig nem találtunk számottevő változást.

57

8. ábra: A szabad és kötött SA mennyiségében bekövetkező változások 3, illetve 7 nappal a lisztharmatfertőzést

követően fiatal Thatcher-alapú közel-izogén búza vonalak leveleiben üvegházi körülmények között. A

feltüntetett szignifikanciaszintek a SA-tartalom értékeinek kontroll és kezelt növények között mért különbségét

jelentik adott genotípus esetén (* : p 0,05; ** : p0,01; *** : p0,001) (n=5; SD).

5.2.1.2. Változások az antioxidáns enzimek aktivitásában lisztharmatfertőzés hatására

A különböző vizsgált búza-genotípusokban az enzimatikus antioxidánsok alap

aktivitása széles tartományban mozgott (9. ábra). A többi genotípushoz képest magas kezdeti

GR-aktivitással rendelkezett az Mv Hombár, Mv Béres és a TC26 (9/A. ábra). Az öregedés

mindenhol mérsékelte ennek az enzimnek a működését. A fertőzést követő 3. napon

szignifikáns csökkenést tapasztaltunk az Mv Béres, Mv Hombár és TC19 esetében, míg

csekély növekedést az Alcedo levelében, a többi genotípusban viszont számottevő változás

nem volt mérhető. 7 nappal a fertőzés után szignifikáns változást csak az Mv Marsall GR-

aktivitásában találtunk. Az GST aktivitása (9/B. ábra) szintén nagy különbségeket mutatott a

kontroll növényekben, aktivitása a legtöbb esetben nagymértékben csökkent az öregedés

hatására. A fertőzés eltérő mértékben befolyásolta az egyes genotípusokban mérhető GST-

aktivitás értékeit. 3 nappal a fertőzés után fokozott GST-aktivitás volt mérhető az Mv

Marsallban, a TC33-ban és a TC29-ben, viszont szignifikáns csökkenést csak az Mv Hombár

58

aktivitása esetén találtunk. Ezzel szemben 7 nappal a fertőzést követően a genotípusok

többségében szignifikánsan megnőtt az aktivitás. A kontroll növények KAT aktivitása (9/C.

ábra) hasonlónak bizonyult minden búzagenotípusban, csak a TC26-é volt kicsit magasabb, és

egyöntetű visszaesés volt megfigyelhető az öregedés következtében. A 3 napja fertőzött

növények KAT-aktivitásában szignifikáns csökkenést csak az Mv Béresnél és a TC19-nél

tapasztaltunk, mialatt a többi genotípusban a lisztharmatfertőzés nem okozott jelentős mértékű

változást. A 7 napos mintákban viszont serkentett KAT-működést találtunk az Mv Marsall,

Mv Béres, Mv 8, TC33, TC29 és TC26 levelében. Az APX aktivitása (9/D. ábra) az öregedést

követően drasztikusan csökkent, a lisztharmatfertőzés 3 nap elteltével, az Mv Toborzót, a

TC33-at és a TC19-et leszámítva, elhanyagolható mértékű változást idézett elő, míg 7 nap

elteltével minden esetben fokozta az aktivitást. A G-POD működése (9/E. ábra) változatos

képet mutatott. A kontroll növényekben az öregedés csak néhány genotípusban fokozta az

aktivitást, a többi esetben nem befolyásolta azt. A fertőzés már 3 nappal később indukálta az

Alcedoban, Mv Marsallban, Mv 8-ban és TC26-ban, valamint jelentősen csökkentette a

TC33-ban, TC19-ben és TC9-ben; viszont 7 nappal később a legtöbb genotípusban

szignifikánsan megemelte a G-POD aktivitását.

59

9. ábra: Az antioxidáns enzimek (GR – glutation-reduktáz, GST – glutation-S-transzferáz, KAT – kataláz, APX

– aszkorbát-peroxidáz, G-POD – gvajakol-peroxidáz) aktivitásában bekövetkező változások 3, illetve 7 nappal a

lisztharmattal történő inokulációt követően fiatalkorú búzanövények levelében. A feltüntetett

szignifikanciaszintek az antioxidáns enzimek aktivitás-értékeinek kontroll és kezelt növények között mért

különbségét jelentik adott genotípus esetén (* : p 0,05; ** : p0,01; *** : p0,001) (n=5; SD).

60

5.2.2. A lisztharmatfertőzés hatásai felnőttkori Thatcher-alapú közel izogén búza

vonalakra

A fiatal és a kifejlett növények toleranciája eltérhet egymástól. Ezt a fent leírtak is

tanúsítják, azonban a szántóföldi kísérlet során számos egyéb stresszor is jelen volt a

növénynevelés ideje alatt, így a szántóföldön nőtt idősebb növények eltérő mértékben

megmutatkozó lisztharmattal szembeni toleranciájára más tényezők is hatással lehettek. Ezért

a lisztharmatfertőzés stressztoleranciára gyakorolt hatásának pontosabb meghatározásához a

fiatalkori kísérletben használt genotípusok közül négyet kiválasztottunk, a növényeket

üvegházi körülmények között kalászolás előtti állapotig neveltük, majd a korábbi kísérlethez

hasonlóan lisztharmatfertőzésnek tettük ki.

5.2.2.1. Fenotípusos különbségek és fotoszintetikus aktivitás

Lisztharmatfertőzés után kicsi, fehér vagy szürke telepek jelentek meg minden

fertőzött búza vonal levelén üvegházi körülmények között. Azonban a négy vonalnál jelentős

különbségek voltak megfigyelhetőek a betegség/kór súlyosságában és a szimptómák

fejlődésének arányában. A Saari-Prescott skála (Saari és Prescott, 1975) alapján, ahol a 0 a

tünetmentes, a 9 pedig a nagyon fogékony növényt jelöli, a TC26 9-es fertőzöttségi pontot

kapott, mivel a telepek a növények minden részét beborították, a TC33 viszont csak 7 pontot,

mert ennél a betegség kisebb mértékben terjedt szét. A másik két vonalon a szürke

lisztharmattelepek csak az alacsonyabban lévő leveleken, azoknak is a szárhoz közelebb eső

részén jelentek meg, ezért a TC9 1 pontot, míg a TC19 3-at kapott. Ezek alapján úgy találtuk,

hogy a TC33 és a TC26 meglehetősen fogékony a lisztharmatfertőzésre, viszont a TC19 és a

TC9 sokkal ellenállóbbnak bizonyult. Ezen különbségek ellenére a ΔF/Fm’ klorofill-a

fluoreszcencia indukciós paraméter, amely a PSII kvantumhatásfokát jelzi, jelentősen nem

változott még 7 nappal a fertőzést követően sem a kontroll növényekben, sem pedig az

inokulált növényekben. (10. ábra).

61

10. ábra: A PSII kvantumhatásfokát jelző F/Fm’ paraméter változásai 3, illetve 7 nappal a lisztharmatfertőzés

után felnőtt korú búzában. (n=10; SD).

5.2.2.2. Az endogén szalicilsav mennyiségi és minőségi változásai

11. ábra: A szabad és kötött SA mennyiségében bekövetkező változások 3, illetve 7 nappal a

lisztharmatfertőzést követően felnőtt korú Thatcher-alapú közel-izogén búza vonalak leveleiben üvegházi

körülmények között. A feltüntetett szignifikanciaszintek a SA-tartalom értékeinek kontroll és kezelt növények

között mért különbségét jelentik adott genotípus esetén (* : p 0,05; ** : p0,01; *** : p0,001) (n=5; SD).

A szabad SA-tartalom 2-5-ször alacsonyabb volt a levélben, mint a kötött forma

(glükozid-kötött SA). A kötött és a szabad endogén SA szintje jelentősen magasabb volt a

TC19-ben és a TC33-ban, mint a TC26-ban és a TC9-ben. A TC33, TC26 és TC19 kontroll

növényeiben a szabad SA-szint az öregedés hatására megnőtt, mialatt a kötött SA-tartalom a

TC33 és TC19 esetében kismértékben csökkent, míg a másik két búzavonalban nem változott.

Lisztharmatfertőzést követően a szabad SA mennyisége nem változott számottevően, kivéve a

TC9 vonalban, ahol 43%-os növekedés volt mérhető a 3. napon. A fertőzés a kötött SA

62

szintjét jelentősen csökkentette (33%) a TC33 3 napos mintáiban. 7 nappal a fertőzés után,

azonban a kötött SA-tartalom drasztikusan megnőtt a TC33-ban (56%) és a TC19-ben (82%)

egyaránt, amíg a másik két genotípusban csak kicsi változás volt megfigyelhető (11. ábra).

5.2.2.3. Eltérések az enzimatikus antioxidáns rendszerben

A négy búza vonal kontroll növényeiben az antioxidáns enzimek aktivitása

változatos képet mutatott (12/I. A-E ábra).

12/I. ábra: Az antioxidáns enzimek (GR – glutation-reduktáz, GST – glutation-S-transzferáz, KAT – kataláz,

APX – aszkorbát-peroxidáz, G-POD – gvajakol-peroxidáz) aktivitásában bekövetkező változások 3, illetve 7

nappal a lisztharmatfertőzést követően felnőtt korú Thatcher-alapú közel-izogén búza vonalak leveleiben

üvegházi körülmények között. A feltüntetett szignifikanciaszintek az antioxidáns enzimek aktivitás-értékeinek

kontroll és kezelt növények között mért különbségét jelentik adott genotípus esetén (* : p 0,05; ** : p0,01;

*** : p0,001) (n=5; SD).

A 3 napos kontrollban a GST aktivitása szignifikánsan alacsonyabb volt a TC26-ban,

mint a TC33-ban (12/I. B. ábra, a statisztikus különbség az ábra könnyebb áttekinthetősége

érdekében nincs feltüntetve), továbbá a KAT aktivitás is jelentősen alacsonyabb volt a TC26-

63

ban, mint a TC33-ban és a TC9-ben (12/I. C. ábra). Az ugyanezen a napon szedett kontroll

mintákban az APX alacsonyabb volt a TC19-ben, mint a TC9-ben (12/I. D. ábra). A 7 napos

kontrollokban a GR aktivitás a TC19-ben sokkal magasabb, mint a TC9-ben és a TC26-ban.

A GST aktivitás is magasabb a TC19-ben, mint a TC26-ban és a TC33-ban, azonban a KAT

és APX esetén nincs számottevő különbség. A legkifejezettebb változás a G-POD esetében

volt mérhető, melynek aktivitása a TC19 és a TC26 vonalakban fele akkora volt a TC9-éhez

és a TC33-éhoz képest a 3 napos mintákban, ezzel szemben a 7 napos mintákban már nem

figyelhetőek meg ezek a különbségek (12/I. E. ábra).

Az öregedés csak a TC19 vonal GR aktivitásában (12/I. A. ábra), a TC33 GST

aktivitásában, a TC26 KAT aktivitásában, valamint a G-POD aktivitásban okozott jelentős

változásokat, utóbbi esetében nagymértékű növekedést.

A lisztharmatfertőzés minden vizsgált közel izogén búzavonalban befolyásolta

ezeknek az enzimeknek az aktivitását, de eltérő módon. A 7 napos mintákban némileg

(körülbelül 12 és 33%-ban) megemelte a GR aktivitását a TC19-ben és a TC26-ban. 16%-os

GST aktivitás-növekedést okozott a 3 napos TC33 mintákban, ami 66%-ra nőtt a fertőzés

hatására a 7. napra a 7 napos kontrollhoz viszonyítva, mialatt a TC19-ben és a TC33-ban a

fertőzés csak a GST aktivitást emelte meg 40, illetve 48%-kal a 7 napra. A lisztharmat minden

vonalban aktiválta az APX-et. A mért aktivitás-növekedés 3 nappal a fertőzés után csak a

TC26-ban volt jelentős (17%), azonban a 7. napra minden vonalban nagymértékűvé vált

(TC9: 50 %, TC19: 45 %, TC26: 46 %, TC33: 56 %). A fertőzést követően a KAT aktivitás

csak a 7 napos TC19-ben (42%) és TC26-ban (43%) emelkedett szignifikánsan. A G-POD

aktivitása viszont drasztikusan megnőtt minden vonalban már a 3. napra (TC9: 47 %, TC 19:

165 %, TC26: 315%, TC33: 88 %), mely tovább emelkedett a 7. napra, különösen a TC19 és

a TC26 esetén (hozzávetőlegesen 61 és 47 %-kal).

Lisztharmatfertőzés hatására a legnagyobb különbségeket mutató G-POD-ot nem-

denaturáló poliakrilamid gélen vizsgálva minden búzavonalban 4 különböző izoenzim volt

elkülöníthető (POD1, POD2, POD3 és POD4) mind a 3 napos, mind a 7 napos mintákban

(12/II. ábra), kivéve a TC26-ot, ahol a POD4 hiányzott.

64

12/II. ábra: A különböző gvajakol-peroxidáz (G-POD, POD) izoenzimek aktivitásában lisztharmatfertőzés

hatására bekövetkező változások búzanövények leveleiben 3, illetve 7 nappal a fertőzést követően.

A POD1 a legkisebb elektroforetikus mobilitású izoenzim. Ez adta a legintenzívebb sávot

minden mintában és a fertőzöttekben még erősebben látszott. A POD2 nagyobb

elektroforetikus mobilitással rendelkezett, mint a POD1, a kontroll mintákban csak a TC26-

ban jelent meg, míg a fertőzöttekben minden genotípusban, a TC26-ban pedig felerősödött. A

POD3 és a POD4 sávjai gyengébben látszottak, mint az előző két izoenziméi. A POD3

elektroforetikus mobilitása nagyobb, mint a POD2-é, de kisebb, mint a POD4-é, és nagyobb

aktivitást mutat a kontrollokban, különösen a TC19-ben, mint a fertőzött mintákban. A POD4,

a legnagyobb elektroforetikus mobilitású izoenzim, a TC33, TC19 és TC9 kontroll és

fertőzött mintáiban egyaránt megjelent, de hiányzott a TC26-ból. A POD izoenzimek

aktivitása 7 nappal fertőzés után a 3 naposhoz hasonló mintázatot mutatott. A TC26 kontroll

növényeinek POD aktivitása 7 nappal később jól láthatóan megnőtt a 3. napon mértekhez

képest.

A különböző paraméterek közötti korrelációs kapcsolat elemzése bár nem mutatja az

ok-okozati összefüggéseket, és csak a lineáris korrelációt jelzi, azonban hasznos

információval szolgálhat a korrelációk irányát és közelségét/szorosságát illetően. Ezért

elvégeztük az általunk vizsgált paraméterek korrelációs analízisét, amely azt mutatta, hogy a

GR működése szorosan összefüggött a szabad SA mennyiségével, valamint a GST, a KAT és

az APX aktivitásával (5. táblázat). A GST aktivitása pozitívan korrelált a kötött SA szintjével,

65

továbbá az APX és G-POD aktivitásokkal, de a szabad SA-val csak kevésbé. A KAT

működése is összefüggésben állt a másik két H2O2 eliminálásért felelős enzim aktivitásával.

5. táblázat: A felnőtt búzanövényekben vizsgált paraméterek közötti korrelációs elemzés eredménye

lisztharmattal történő fertőzés után.

5.3. Különböző abiotikus stresszek hatásai négy, eltérő SA-tartalmú búza genotípusra

Ebben a fejezetben két martonvásári, alacsony össz endogén SA-tartalommal

rendelkező őszi búza fajtával (Mv Hombár, Mv 8), illetve két Thatcher-alapú, magas totál

SA-tartalommal rendelkező közel-izogén vonallal (TC33 és TC19) végzett kísérletek

eredményeiről számolok be, melyeket az előző méréssorozatok alapján választottunk ki, és

használtunk modellként a további stresszélettani vizsgálatokhoz, hogy összefüggést keressünk

a SA-tartalom és egyéb, az akklimatizációs folyamatokban szerepet játszó komponensek

között.

5.3.1 . A kadmium hatásai

5.3.1.1 . A búza genotípusok Cd-toleranciájának meghatározása

Az előkísérletek során különböző koncentrációjú (750, 500, 200, 100 és 50 µM)

Cd(NO3)2-ot tartalmazó tápoldatban neveltünk búza növényeket azzal a céllal, hogy a további

66

kísérletek számára megtaláljunk azokat a koncentrációértékeket, amelyeknél a Cd látványosan

befolyásolja az általunk vizsgált folyamatokat, de nem pusztítja el a növényeket. Az

eredmények alapján az alábbi kísérleteket végeztük el.

Az első kísérletben két különböző Cd-koncentrációt (500µM és 50µM) alkalmaztunk

közvetlenül a csírázás után, annak érdekében, hogy megállapítsuk a vizsgált négy genotípus

Cd-mal szembeni toleranciájának mértékét. A 11 napig, 500µM (0,5 mM) Cd-ot tartalmazó

tápoldaton nevelt növények növekedése jelentős mértékben csökkent, a leveleik sárgulni

kezdtek, a gyökereik beszürkültek és biomasszájuk sokkal kevesebb volt, mint a kontroll

növényeké. Ez különösen a TC33 vonalnál mutatkozott meg. A PSII kvantumhatásfoka

(PSII), melyet aF/Fm’ klorofill-a fluoreszcencia indukciós paraméter mutat, a Cd-kezelést

követően minden genotípusban csökkent. A legjobban a TC33-ban, a legkevésbé az Mv

Hombárban (13. ábra).

13. ábra: A kontroll és kezelt növények levelében mért ΔF/Fm’ értékek változásai alacsony, illetve magas

koncentrációjú Cd-mal történő kezelést követően. A feltüntetett szignifikanciaszintek a ΔF/Fm’ értékek kontroll

és kezelt növények között mért különbségét jelentik adott genotípus esetén (* : p 0,05; ** : p0,01; *** :

p0,001) (n=10; SD).

A Cd-mal szembeni tolerancia fokában hasonló különbségek voltak tapasztalhatók

akkor is, amikor a csírázás után 17 napig 50µM Cd-ot tartalmazó tápoldaton neveltük a

növényeket. Bár ebben az esetben a stressz tünetei kevésbé kifejezettek (14. ábra).

67

14. ábra: Fenotípusos különbségek a csírázást követő (A), illetve a későbbi fejlődési állapotban alkalmazott (B)

50 M Cd-os kezelések hatására az Mv Hombár kontroll és kezelt növényei között.

7 nap elteltével, a mintaszedéskor, a TC19, Mv Hombár és Mv 8 Cd-kezelt növényei

kétlevelesek, míg a TC33-é csak másfél levelesek voltak. A levélcsúcsok itt is minden

genotípusnál sárgultak, bár nem olyan erőteljesen, mint a magasabb Cd-koncentráció

alkalmazásakor. A legmagasabb F/Fm’ paraméter itt is az Mv Hombárban volt mérhető (13.

ábra).

A második kísérlet során, amikor az 50 µM Cd-os kezelésre a növények egy későbbi

fejlődési állapotában került sor (17 nappal a csírázást követően), a kezelést követő 7 nap

elteltével a Cd nem váltott ki látható tüneteket az Mv Hombárban, az Mv 8-ban is csak

csekély növekedésgátlást. Ezzel szemben a Thatcher-vonalakban, különösen a TC33-ban, a

gátolt növekedés mellett, kismértékű klorózis és hervadás is jelentkezett.

5.3.1.2 . A Cd-kezelések hatásai a SA és prekurzorainak tartalmára

Habár a kontroll növények szabad SA-tartalma a két martonvásári fajtában

alacsonyabb, a közel-izogén vonalakban magasabb volt, a 11 napos, magas (0,5 mM) Cd-

koncentrációjú tápoldaton nevelt növényekben fokozott mértékű SA-felhalmozódást

figyeltünk meg minden genotípusban, szabad és kötött formában egyaránt (15. ábra). A

kontroll növények kötött SA-szintje az Mv Hombárban volt a legalacsonyabb, a TC33-ban

pedig a legmagasabb.

68

15. ábra: A szabad és kötött SA mennyiségében bekövetkező változások a kontroll és a 0,5 mM Cd-mal kezelt

növények levelében 11 nappal a kezelés után. A feltüntetett szignifikanciaszintek a SA-tartalom értékeinek

kontroll és kezelt növények között mért különbségét jelentik adott genotípus esetén (* : p 0,05; ** : p0,01;

*** : p0,001) (n=5; SD).

Alacsony (50 M) Cd-koncentráció alkalmazásakor a SA szintek szabad és kötött

formában egyaránt magasabbak voltak a levélben, mint a gyökérben minden vizsgált

genotípusban (16. ábra). A csírázástól kezelt növények közül a TC19-ben volt mérhető a

legmagasabb össz SA-tartalom (szabad+kötött) (16/A-B. ábra). A Cd-kezelés drasztikus

mértékben megemelte a kötött SA-szintet mind a négy búzafajtában, illetve vonalban, míg a

szabad SA szintje csak a TC19-ben mutatott szignifikáns növekedést. A BA-tartalomban

(16/C-D. ábra) nem volt kifejezett különbség a négy genotípus 17 napos kontrolljaiban. A

szabad BA-tartalmak ugyanolyan arányúak a levelekben és a gyökerekben, mialatt a kötött

forma mennyisége magasabb a levelekben, mint a gyökerekben. A korai Cd-kezelés a szabad

BA-t csak a TC19-ben emelte meg, míg a kötött BA-t minden búzaváltozatban, méghozzá a

TC33 kivételével, minden esetben szignifikánsan. A kontroll növényekben a szabad formájú

oHCA mennyisége a kimutathatósági határ alatt volt, míg a kötött formáé (16/E és J. ábra)

nem különbözött a genotípusokban, és magasabb volt a levélben, mint a gyökérben.

A 7 napig tartó 50 M Cd-os kezelés (16. F-J ábra) a szabad SA esetében mérsékelt

változásokat okozott, a kötött formához viszonyítva, bár minden genotípus levelében

nagymértékű SA-felhalmozódás volt megfigyelhető. Itt a szabad SA mennyisége 2-6-

szorosára, a kötött SA-é 2-14-szeresére nőtt (16/F-G. ábra). A gyökerekben csak az Mv

Hombár és az Mv 8 SA-tartalma növekedett meg, szabad és kötött formában egyaránt, a

Thatcher-alapú közel-izogén vonalaké nem. A BA mennyisége a levélben szignifikáns, 1,5-

szörös növekedést csak a kötött formában az Mv Hombárban mutatott (16/H-I. ábra) a kezelés

hatására, viszont a gyökerekben megnőtt a mennyisége az Mv 8-ban és a TC33-ban. A szabad

69

BA mennyisége a legtöbb esetben nem változott a 24 napos Cd-kezelt növényekben, ellenben

az Mv Hombár és Mv 8 gyökereiben lecsökkent. A kötött oHCA szignifikánsan

megemelkedett (1,5-6-szorosan) a TC19, az Mv 8 és az Mv Hombár levelében (16/J. ábra),

valamint az Mv 8 gyökerében.

16. ábra: Az 50 M Cd-os kezelés hatásai a SA-bioszintézis útvonal elemeinek mennyiségére különböző

fejlettségi állapotú búzanövényekben. A feltüntetett szignifikanciaszintek a SA-, BA-, illetve oHCA-tartalom

értékeinek kontroll és kezelt növények között mért különbségét jelentik adott genotípus esetén (* : p 0,05; ** :

p0,01; *** : p0,001) (n=5; SD).

70

5.3.1.3 . Változások a PAL aktivitásában Cd stressz hatására

A 24 napos növényeknél a kezdeti PAL aktivitás a martonvásári fajták (Mv 8 és Mv

Hombár) leveleiben magasabb volt, mint a Thatcher-alapú vonalaké (TC19 és TC33), és ezek

a különbségek szignifikánsak voltak az Mv 8 és a TC19 vagy a TC33 között (17. ábra, a

statisztikus különbségek az ábra könnyebb áttekinthetősége érdekében nincsenek feltüntetve).

Ezzel szemben a martonvásári genotípusok gyökereiben kicsit alacsonyabb volt a PAL

aktivitása, mint a másik két genotípusban, de ez az eltérés csak az Mv Hombár és a TC19

között volt statisztikusan szignifikáns. A 7 napos Cd-kezelés hatására ennek az enzimnek az

aktivitása jelentősen indukálódott a TC19 és a TC33 levelében, de nem változott, vagy

csökkent az a Mv Hombárban. A Cd-kezelt növények gyökereiben megnőtt PAL aktivitás

volt mérhető, amely csak a TC33-ban volt szignifikáns a kontrollhoz viszonyítva.

17. ábra: A PAL aktivitásának változásai a 7 napos Cd-kezelés hatására a vizsgált 4 búza genotípus levél- és

gyökérmintáiban. A feltüntetett szignifikanciaszintek a PAL enzim aktivitásértékeinek kontroll és kezelt

növények között mért különbségét jelentik adott genotípus esetén (* : p 0,05; ** : p0,01; *** : p0,001) (n=5;

SD).

5.3.1.4 . A CS és ICS gének expressziójának elemzése Cd-kezelés után

A real-time PCR analízis eredménye azt mutatta, hogy a 24 napos növények (17+7

nap) levelében és gyökerében hasonló a CS gén expressziós szintjének tendenciája (16. ábra),

és a Cd-kezelés alig befolyásolta azt. Az ICS gén expressziós szintje mind a négy

genotípusban hasonló volt, a gyökerekben pedig magasabbnak bizonyult, mint a levelekben.

71

A kezelés csak az Mv 8-ban okozott csekély, ámde statisztikusan szignifikáns növekedést (18.

ábra).

18. ábra: A Cd-kezelés hatásai a 24 napos növények CS és ICS génjeinek expressziós szintjére a vizsgált négy

búza genotípusban. A feltüntetett szignifikanciaszintek a CS és ICS gének expressziós értékeinek kontroll és

kezelt növények között mért különbségét jelentik adott genotípus esetén (* : p 0,05; ** : p0,01; *** : p0,001)

(n=3; SD).

5.3.1.5 . A Cd-kezelés hatásai az enzimatikus antioxidáns rendszerre

A csírázástól 50 M Cd-ot tartalmazó tápoldaton nevelt növények levelében még 17

nap elteltével is az enzimatikus antioxidáns rendszer fokozott működését figyeltük meg (19

A-E. ábra). A G-POD és APX esetében a Cd hatására szignifikáns aktivitásnövekedés volt

mérhető, azonban sem a kezelt, sem a kontroll növényekben nem volt genotípusbeli

különbség (19/E és D ábrák). A KAT aktivitása a TC19 kivételével minden genotípusban

indukálódott, különösen a TC33-ban (19/C ábra). A GST-t eltérő módon befolyásolta a

hosszan tartó nehézfémszennyezés (19/B. ábra). Aktivitása az Mv Hombárban és a TC19-ben

jelentősen lecsökkent, mialatt az Mv 8-ban és a TC33-ban kis mértékben ugyan, de

megemelkedett. A GR viszont egyértelműen csökkent működést mutatott minden

genotípusban (19/A ábra). Érdekesség, hogy míg a két peroxidáznál nem található különbség

a genotípusok kontroll növényei között, addig a másik három enzimnél igen. A legkisebb

enzimaktivitás az Mv 8-nál mérhető, míg a többi búzagenotípusnál, különösen az Mv

Hombárban ettől magasabb értékek találhatóak.

72

19. ábra: Az alacsony koncentrációban alkalmazott Cd (50 M) hatása az antioxidáns enzimek (GR – glutation-

reduktáz, GST – glutation-S-transzferáz, KAT – kataláz, APX – aszkorbát-peroxidáz, G-POD – gvajakol-

peroxidáz) aktivitására a négy búzagenotípusban. A feltüntetett szignifikanciaszintek az antioxidáns enzimek

aktivitás-értékeinek kontroll és kezelt növények között mért különbségét jelentik adott genotípus esetén (* : p

0,05; ** : p0,01; *** : p0,001) (n=5; SD).

73

A 24 napos kontroll növényekben a kiindulási antioxidáns enzimaktivitások csak

néhány esetben mutattak genotípusfüggő különbséget (19/F-J. ábra). A levelek GR aktivitása

szignifikánsan magasabb volt az Mv Hombárban, mint az Mv 8-ban és a TC33-ban, mialatt a

gyökereké az Mv Hombárban volt a legalacsonyabb (19/F ábra, a statisztikus különbségek az

ábra könnyebb áttekinthetősége érdekében nincsenek feltüntetve). A G-POD aktivitás a

levelekben és a gyökerekben egyaránt hasonló volt mind a négy genotípusban (19/J. ábra). A

legalacsonyabb KAT aktivitás a TC33 levelében és az Mv Hombár gyökerében volt mérhető

(19/H. ábra). A legalacsonyabb APX és a GST-aktivitás a TC33 levelében és a TC19

gyökerében volt (19/I. és G. ábrák). A növények 7 napos 50 M Cd-os kezelése után ezeknek

az enzimeknek az aktivitása a levelekben jelentősen nem változott, kivéve a G-POD-ot,

amelyé a TC19-ben nőtt, és a GST-t, amelyé az Mv Hombárban kifejezetten csökkent. Ezzel

ellentétben, a gyökerekben szignifikáns változások mutatkoztak meg, különösen a GR, a KAT

és a GST esetében. Az Mv Hombár és az Mv 8 gyökerének GR aktivitása Cd hatására

megnőtt. A G-POD-aktivitás a TC33-ban csökkent, mialatt a KAT aktivitása az Mv

Hombárban megnőtt, a másik három genotípusban pedig lecsökkent. Az APX aktivitásában

nem volt mérhető változás, mialatt a GST minden genotípus gyökerében indukálódott.

5.3.2 . A PEG-kezelés hatásai

5.3.2.1. Morfológiai és fotoszintetikus változások a PEG-kezelés hatására

A vízhiány korai hatásai már 5 nappal a PEG-kezelést követően mind a négy

genotípusnál jelentkeztek. Ez a csökkent levél- és gyökérbiomasszában, a levelek

csavarodásában és hervadásában mutatkozott meg, de a tünetek erőssége eltérést mutatott a

búzagenotípusok között (20. ábra). A TC33 és az Mv Hombár levelei mutattak a leginkább,

illetve a legkevésbé kifejezett levélcsavarodást, ezért a TC33 5, míg az Mv Hombár 3 pontot

kapott az 1-től 5-ig terjedő levélcsavarodási skálán (O'Toole és Cruz, 1980), ahol az 1 a

legkevésbé, az 5 a legjobban csavarodó levelet jelöli. Az Mv 8 és a TC19 tünetei a kettő

közzé estek, így ezek 4-4 pontot kaptak. A száraz tömeg/friss tömeg arány minden

genotípusban hasonló volt, a PEG-kezelés minden esetben fokozta azt, és a gyökerekben ez az

arány sokkal nagyobb volt, mint a levelekben. A Mv Hombár gyökerében kicsit nagyobb

különbség volt mérhető, mint a másik három búzaváltozatban.

74

20. ábra: A vizsgált négy búzagenotípus 5 napos PEG-kezelés okozta morfológiai változásai. A bal oldali

növények a kontrollok, a jobb oldaliak a PEG-kezeltek.

A kontroll növények aktuális kvantumhatásfok (PSII) értékei nem mutattak genotípusbeli

eltérést. A PEG az Mv Hombárban kevésbé, a többi genotípusban nagyobb mértékben okozott

csökkenést ebben a paraméterben, de ez a változás egyik esetben sem volt szignifikáns

(adatok nincsenek bemutatva).

5.3.2.2. A prolintartalom változása

A prolintartalom nagyobb volt az Mv Hombár és az Mv 8 gyökerében, mint a

Thatcher-alapú vonalakéban. A levelekben az Mv Hombárban volt a legtöbb, a TC33-ban

pedig a legkevesebb a kiindulási prolinmennyiség. A PEG-kezelés drasztikus mértékben

megemelte a prolinszintet a levelekben és a gyökerekben egyaránt. A mért értékek hasonlóak

voltak a négy genotípusban, a levelekben magasabbak, a gyökerekben ettől kicsit

alacsonyabbak, kivéve a TC33-at, ahol a levélben a legmagasabb prolinmennyiség volt

mérhető (21. ábra). Azonban a kiindulási és a stressz-indukált változások mértéke

genotípusonként eltért, ami különösen a gyökerekben volt számottevő. Az Mv Hombár és Mv

8 gyökerében a nagyobb kiindulási prolinszint az 5 napos 15%-os PEG-kezelés hatására csak

75

kismértékben nőtt, mialatt a közel-izogén Thatcher-alapú vonalak alacsony prolinszintje

szignifikáns emelkedést mutatott. A levelekben a legkiemelkedőbb változás a TC33-ban volt,

amelyben a legkisebb kezdeti prolinszinthez a legmagasabb stressz okozta változás társult.

21. ábra: Az 5 napos PEG-kezelés hatása a prolintartalomra a négy búzagenotípus levelében és gyökerében. A

feltüntetett szignifikanciaszintek a prolintartalom értékeinek kontroll és kezelt növények között mért különbségét

jelentik adott genotípus esetén (* : p 0,05; ** : p0,01; *** : p0,001) (n=5; SD).

5.3.2.3. A PEG-kezelés hatásai a SA-tartalomra

A szabad és a kötött formájú SA mennyiségének kontroll körülmények közötti

genotípusbeli különbségei jól detektálhatóak (22. ábra). A szabad SA kiindulási szintje az Mv

Hombár és az Mv 8 levelében kisebb, míg a két Thatcher-alapú közel-izogén vonaléban

nagyobb volt. A legnagyobb szabad SA-tartalom a TC19-ben, ettől némileg kevesebb a

TC33-ban, míg az Mv Hombárban és az Mv 8-ban ezektől kisebb, azonos mennyiségű volt

mérhető. A gyökerekben, az Mv 8 kivételével, a levélben találtaktól kevesebb szabad SA volt

jelen. Hasonló volt a helyzet a kötött SA mennyiségében is. A levélben mért kötött SA-

tartalom szintén a két TC genotípusban volt a legnagyobb, ezt sorrendben az Mv 8 és az Mv

Hombár követte. A gyökerek kötött SA-mennyisége sokkal kisebb volt, mint a leveleké,

genotípusos különbséget pedig csak a TC19 esetében mutatott, ahol a többihez képest

nagyobb értékeket mértünk. A kötött SA mennyisége levelekben és gyökerekben egyaránt

körülbelül tízszerese volt a szabad SA-énak.

76

22. ábra: Az 5 napos PEG-kezelés hatása a szabad és kötött szalicilsav (SA) mennyiségére a négy

búzagenotípus levél- és gyökérmintáiban. A feltüntetett szignifikanciaszintek a SA-tartalom értékeinek kontroll

és kezelt növények között mért különbségét jelentik adott genotípus esetén (n=5; SD).

Az 5 napig tartó 15 %-os PEG-gel történő kezelés hatására sem a szabad, sem a

kötött SA mennyisége nem mutatott szignifikáns változást a vizsgált szervekben. Ha a kapott

eredményeket a minták száraz tömegére vonatkoztatva adjuk meg, akkor a kezelés minden

genotípusban csökkenti az eredményeket, jelentős mértékű csökkenést viszont csak a TC33 és

a TC19 gyökerének kötött SA-szintjében láthatunk. A többi esetben, habár markánsabbak a

különbségek, mégsem beszélhetünk szignifikáns változásról. Ahogyan a kötött SA kiindulási

szintjei, úgy a PEG által csökkentett mennyiségei között sem mutatkozott meg egyértelmű,

genotípusos vagy fajtacsoportra jellemző különbség a levelek esetében, ezzel szemben a

gyökerekben a Thatcher-alapú közel-izogén vonalakban jelentősen kisebb mennyiség volt

mérhető, mint a martonvásári nemesítésű búzafajtákban.

5.3.2.4. A PEG-kezelés hatásai az antioxidáns enzimek aktivitására

Az aszkorbát-glutation ciklus enzimei közül a GR és a MDHAR aktivitása (23/A. és

B. ábra) a levelekben magasabb, mint a gyökerekben, és a PEG a legtöbb esetben

szignifikánsan megnövelte azt. A legmagasabb GR-aktivitás az Mv Hombár levelében volt

(23/B. ábra). Az APX kevésbé aktív a TC19 kontroll gyökerében, mint a többi genotípusban.

A kontroll növények levelében az APX leginkább az Mv Hombárban, legkevésbé a TC19-ben

volt aktív (23/C. ábra). A PEG-kezelés indukálta ezt az enzimet különösen a martonvásári

fajták gyökerében, továbbá az Mv 8 és a TC19 levelében. A kezelést követően a legkisebb

APX aktivitás az Mv Hombár levelében volt mérhető, a kontroll növényekhez viszonyítva. A

77

GR-t a kezelés pozitívan befolyásolta minden búza genotípusban, viszont genotípusok közötti

különbség sem a kontroll, sem pedig a kezelt növények gyökerében nem volt.

23. ábra: Az 5 napos PEG-kezelés hatása az antioxidáns enzimek (GR – glutation-reduktáz, GST – glutation-S-

transzferáz, KAT – kataláz, APX – aszkorbát-peroxidáz, G-POD – gvajakol-peroxidáz) aktivitására a különböző

búzagenotípusok levél- és gyökérmintáiban. A feltüntetett szignifikanciaszintek az antioxidáns enzimek

aktivitás-értékeinek kontroll és kezelt növények között mért különbségét jelentik adott genotípus esetén (* : p

0,05; ** : p0,01; *** : p0,001) (n=5; SD).

Bár a KAT-aktivitás eltéréseket mutatott a genotípusok leveleiben, valódi szignifikáns

különbségek a kezelés hatására, az Mv 8 kivételével, nem találhatóak a búzagenotípusok

között (23/D. ábra). A gyökerekben nem volt genotípusos különbség sem a kontroll, sem a

kezelt növények esetében, bár a PEG jelentősen megemelte az aktivitást. A G-POD aktivitása

a kontroll növényekben hasonló volt, továbbá a levelekben alacsonyabbnak bizonyult, mint a

gyökerekben (23/E. ábra). A PEG szignifikánsan megnövelte az aktivitást minden vizsgált

genotípus levelében, a TC33 és TC19 esetében sokkal erőteljesebben, mint a másik két

fajtában. A többi antioxidáns enzim közül a GST aktivitása a levelekben a kezelés hatására

78

nem változott, míg a gyökerekben minden esetben szignifikánsan megemelkedett, különösen

az Mv Hombárban és a TC19-ben (23/F. ábra). Ha számoltunk a PEG-kezelés jelentős

vízcsökkentő hatásával és az enzimek mért aktivitás értékeit a minták száraz tömegére

vonatkoztatva adtuk meg, azt kaptuk, hogy a MDHAR és a G-POD a PEG-kezelés hatására

fokozottabban működött minden genotípus levelében. Viszont a többi enzim aktivitása

csökkent mindkét vizsgált szervben és ez a csökkenés az APX, a G-POD és a GR esetében

szignifikánsnak bizonyult.

5.3.2.5. A vizsgált paraméterek korrelációelemzése

A friss mintákra vonatkoztatott adatok szerint szignifikánsan pozitív korreláció

található a SA formák között; a kötött SA-szint, illetve a GR, a KAT és a MDHAR aktivitása

között; továbbá az aszkorbát-glutation ciklus enzimei közül a GR és a MDHAR, valamint a

KAT aktivitása között. Viszont a G-POD aktivitása szignifikánsan negatív korrelációt

mutatott a kötött SA-szinttel, illetve a GR és a KAT aktivitásával is (6. táblázat).

(A dolgozatban szereplő kísérletek során, az adatok összehasonlítása érdekében, törekedtem

az azonos mértékegységek használatára, ezért a PEG-kezelés különböző komponensekre

kifejtett hatását is számszerűsítve a minták friss tömegére vonatkoztatva adtam meg, ahol

viszont szükséges a helyes értékeléshez, ott az Eredmények megvitatása c. fejezet szövegében

jeleztem a száraz tömegre vonatkoztatott változások mértékében bekövetkező esetleges

eltéréseket, mivel a kezelés okozta vízvesztés jelentősen befolyásolhatja a kapott eredmények

tendenciáját.)

79

6. táblázat: A PEG-kezeléssel indukált szárazságstressznek kitett növényekben mért paraméterek közötti

korrelációs kapcsolat elemzése.

5.4. Az UV-B sugárzás, Cd- és/vagy PEG-kezelés önálló, illetve kombinált hatásai

búzanövényekre

Mivel a természetben egyszerre több stresszor van jelen, melyek befolyásolják a

növényi növekedést, fejlődést, ezért életszerű többféle, már önmagában is stresszt okozó

tényező növényekre gyakorolt hatásainak egyidejű vizsgálata. A földi élet számára az egyik

legáltalánosabb stresszor az UV-B sugárzás és a szárazság; a SA-függő védelmi

mechanizmusok jobb megértése szempontjából pedig a Cd-mal történő kezelés bizonyult

informatívnak, ezért ezeknek a stressztényezőknek az egyedüli, valamint kombinált hatásait

vizsgáltuk az Mv Emese őszibúza fajtában, különös tekintettel a stressztoleranciára.

5.4.1. Morfológiai változások

Már a kísérlet elején, amikor a 3 napos előcsíráztatott növények tápoldatba kerültek

rövid időn belül eltérés mutatkozott a különböző fényviszonyokon nevelt növények között. A

normál (fehér) fénnyel megvilágított hajtások a normális növekedési, fejlődési ütemnek

megfelelően zöldültek, de a normál fény és UV-B sugárzás együttes alkalmazása a hajtások

80

mag felőli részének antociános, vöröses elszíneződését idézték elő (24. ábra), a fejlődő

levelek azonban itt is zöldek voltak. Az idő előre haladtával a vöröses szín halványult, majd

eltűnt, a kezelés kezdetekor már egyik növényen sem volt látható.

24. ábra: A normál fényen nevelt növénykék hajtásai zöldek maradtak (A), ezzel szemben az UV-B sugárzásnak

kitett búzahajtásokon antocián-felhalmozódás okozta vöröses elszíneződés volt megfigyelhető (B).

25. ábra: A PEG-, illetve Cd-kezelés hatásai az eltérő fényviszonyok mellett nevelt búzanövényekre.

A kontroll/normál fényviszonyokon nőtt növények növekedéséhez képest, az UV-B

sugárzás a 21 nap alatt önmagában szemmel látható hajtásretardációt okozott, mialatt a

gyökérzet fejlődését nem befolyásolta. A Cd stressz UV-B sugárzással kombinálva hasonló

fenotípusos megjelenést eredményezett, mint amit az egyedüli UV-B stressz esetén találtunk,

de a leveleken sárguló területek is megfigyelhetőek voltak, melyek meghaladták a Cd normál

fényen kifejtett hatásának mértékét (25. ábra).

81

A F/Fm’ klorofill-a fluoreszcencia indukciós paraméter azt mutatta, az ebben a

kísérletben alkalmazott kezelések egyike sem okozott szignifikáns változást a PSII

kvantumhatásfokában (az adatok nincsenek feltüntetve). Azonban az 5 napos PEG-kezelés

után normál fényen a növények hervadása volt megfigyelhető, amikor viszont UV-B fénnyel

lett kombinálva, az UV-B növekedésgátló hatása mellett, a hervadás nem jelentkezett. Az

O'Toole- és Cruz-féle levélcsavarodási skála (1980) szerint a PEG-kezelt növények 5 pontot,

az UV+ PEG-kezeltek 1 pontot kaptak. Mialatt sem a PEG-, sem pedig az UV-B-kezelés nem

befolyásolta a relatív klorofill-tartalmat, addig a Cd csökkentette azt mind a normál

fényviszonyok, mind az UV-B-vel kiegészített fényviszonyok között nevelt növényekben (26.

ábra).

26. ábra: A Cd- vagy PEG-kezelés hatása a normál (fehér), illetve normál és kiegészítő UV-B fényen nevelt

búzanövények relatív klorofill-tartalmára. A különböző betűvel jelzett értékek szignifikánsan, p 0,05

valószínűségi szinten különböznek egymástól. (n=10; SD).

5.4.2. Változások a prolintartalomban

A levél prolinszintjét a Cd és a PEG a normál, ill. kiegészítő UV-B-n nevelt

növényekben is megemelte ugyan, de ennek mértéke elhanyagolható, az UV-B pedig önállóan

nem befolyásolta azt. Ezzel párhuzamosan a PEG-kezelés UV-B-vel kombinálva, vagy a

nélkül nagy prolintartalom-növekedést okozott a gyökerekben (27. ábra).

82

27. ábra: A Cd- vagy PEG-kezelés hatása a prolin mennyiségére normál (fehér), illetve normál és kiegészítő

UV-B fényen nevelt búzanövények levelében és gyökerében. A különböző betűvel jelzett értékek szignifikánsan,

p 0,05 valószínűségi szinten különböznek egymástól. (n=3; SD).

5.4.3. Változások az MDA-tartalomban

A levelek MDA szintje jelentősen megnőtt Cd-, valamint PEG-kezelés után, illetve a

kiegészítő UV-B-n nevelt növényekben, de a legmagasabb növekedés az UV-B-vel kombinált

Cd stressz esetén volt mérhető (28. ábra). A gyökerekben az MDA-tartalom kis mértékben

emelkedett meg, mely statisztikusan jelentős volt a Cd-mal vagy PEG-gel kezelt

növényekben, ha azok UV-B sugárzásnak is ki voltak téve.

28. ábra: A Cd- vagy PEG-kezelés hatása a malondialdehid (MDA) mennyiségére normál (fehér), illetve normál

és kiegészítő UV-B fényen nevelt búzanövénykék levelében és gyökerében. A különböző betűvel jelzett értékek

szignifikánsan, p 0,05 valószínűségi szinten különböznek egymástól. (n=3; SD).

83

5.4.4. A különböző kezelések hatásai az oHCA- és SA-tartalomra

A 21 napos növényekben az összes oHCA-tartalom kb. kétszer olyan magas volt,

mint az összes SA-tartalom (29-30. ábra). A gyökerekben a szabad oHCA mennyisége a

kimutathatósági határ alatt volt. A levelek és a gyökerek szabad és a kötött SA mennyisége,

valamint a levelek szabad és kötött oHCA-tartalma a kezelés után hasonló mintázatot

mutatott.

29. ábra: A Cd- vagy PEG-kezelés hatása a szabad és kötött szalicilsav (SA) mennyiségére normál (fehér),

illetve normál és kiegészítő UV-B fényen nevelt Mv Emese növénykék levelében és gyökerében. A különböző

betűvel jelzett értékek, melyek a szabad és kötött SA-formákra együttesen vonatkoznak, szignifikánsan, p 0,05

valószínűségi szinten különböznek egymástól. (n=3; SD).

Az 50 M Cd-os kezelés önmagában szignifikánsan megnövelte a teljes SA-tartalmat

a levelekben, de UV-B sugárzással együttesen alkalmazva az UV-B tovább már nem fokozta

a Cd önálló hatását (29. ábra). A gyökérben a totál SA-mennyiségben mért változások

mintázata hasonló a levélben mértekhez, de ebben az esetben a Cd-kezelésen kívül, mind a

PEG, mind az UV-B külön-külön és kombinálva is statisztikusan szignifikáns növekedést

okozott a kontrollhoz viszonyítva. A kombinált UV+PEG-kezelés a gyökérben további SA-

tartalom-növekedést okozott a PEG által indukált változásokhoz képest, és ennek mértéke

meghaladta az UV-B által egyedül kifejtett SA-szint emelését is. A levélben azonban az

UV+PEG-kezelés hatásának mértéke a kombinációt alkotó két stresszhatás eredményei között

található. A legmagasabb SA-tartalom-növekedés a levélben az egyedüli Cd- és a kombinált

UV+Cd-kezelés esetén volt mérhető, mialatt a gyökérben csak az UV+Cd-kezelés esetén.

A gyökérben a szabad oHCA mennyisége kimutathatósági határ alatti, a levélben

pedig alacsony volt (30. ábra). Mennyiségét minden kezelés megemelte, ugyanez látható a

84

kötött formájú oHCA esetében is, leszámítva a PEG-kezelés hatását a levélben, azonban a

kezelések között statisztikusan igazolható változás nem volt detektálható, kivéve a kombinált

UV+Cd- és UV+PEG-kezeléseknél. A Cd és az UV-B külön-külön és kombinált kezelés

(UV+Cd) formájában egyaránt megemelte a levelek teljes oHCA-tartalmát (30. ábra),

önmagában az UV-B nagyobb mértékben, mint az egyedüli Cd-kezelés, viszont a kiegészítő

UV-B-n nevelt növényekben az UV-B hatására megemelkedett oHCA-mennyiséget a Cd-

kezelés tovább már nem tudta növelni.

30. ábra: A Cd- vagy PEG-kezelés hatása a szabad és kötött orto-hidroxifahéjsav (oHCA) mennyiségére normál

(fehér), illetve normál és kiegészítő UV-B fényen nevelt Mv Emese növénykék levelében és gyökerében. A

különböző betűvel jelzett értékek szignifikánsan, p 0,05 valószínűségi szinten különböznek egymástól. (n=3;

SD).

A PEG-kezelés önmagában nem tudta befolyásolni a levél teljes oHCA-tartalmát, de amikor a

növények kiegészítő UV-B sugárzás mellett nőttek, növelte azt, bár ennek mértéke elmarad az

UV-B egyedüli hatásáétól (30. ábra). A gyökérben minden alkalmazott kezelés (Cd, PEG,

UV-B) megemelte a kötött oHCA-szintet, a legkifejezettebb változás a kombinált kezelések

(UV+Cd és UV+PEG) esetében mutatkozott meg.

5.4.5. Változások a PAL aktivitásában

A kezdeti PAL-aktivitás körülbelül 2,5-szer magasabb volt a gyökerekben, mint a

levelekben (31. ábra). A levél PAL-aktivitásában csak a PEG-kezelés okozott csekély, de

statisztikusan szignifikáns emelkedést a kontrollhoz viszonyítva, mialatt a gyökérét minden

kezelés eltérő mértékben megnövelte. A Cd-kezelés alacsonyabb növekedést okozott a gyökér

PAL-aktvitásában, mint a PEG vagy az UV-B. Bár ennek az enzimnek az aktivitása a

85

kiegészítő UV-B fényen nevelt növények gyökerében a kontroll növényekéhez képest

magasabb volt, a kombinált UV+Cd-, illetve UV+PEG-kezelés ezt tovább már nem tudta

fokozni.

31. ábra: A Cd- vagy PEG-kezelés hatása a fenilalanin-ammónia-liáz (PAL) enzim aktivitására normál (fehér),

illetve normál és kiegészítő UV-B fényen nevelt növények leveleiben és gyökereiben. A különböző betűvel

jelzett értékek szignifikánsan, p 0,05 valószínűségi szinten különböznek egymástól. (n=3; SD).

5.4.6. Változások az antioxidáns enzimek aktivitásában

A különböző kezelések antioxidáns enzimaktivitásra gyakorolt hatásai a 32. ábrán

láthatóak. A 21 napos búza növények leveleiben egyik kezelés sem befolyásolta a GR

aktivitását (32/A. ábra). A gyökerekben a PEG-kezelés önmagában és UV-B stresszel

kombinálva is jelentősen növelte ennek az enzimnek az aktivitását. A legnagyobb növekedés

az UV+PEG-kezelés esetén volt mérhető. Az 50 M Cd-os kezelés vagy az UV-B sugárzás

külön-külön nem okozott statisztikusan szignifikáns változást, azonban ezek kombinációja

növelte a gyökerekben a GR-aktivitást.

Csak az UV+Cd-kezelés okozott jelentős csökkenést a levelek GST-aktivitásában

(32/B. ábra). Ezzel ellentétben, a gyökerekben önmagában a Cd és a PEG növelte, az UV-B

sugárzás nem befolyásolta a GST-t. Amikor a Cd- vagy PEG-kezelés az UV-B stresszt

követte, szintén megemelkedett az aktivitás, de ennek mértéke hasonló volt az UV-B nélkül

mérthez.

Ámbár a KAT aktivitása a kiegészítő UV-B fényen nőtt növények leveleiben

jelentősen magasabb volt a normál fényen nőtt kontroll növényekéhez képest, mikor az UV-B

Cd stresszel lett kombinálva, az aktivitás nem változott (32/C. ábra). Amikor viszont az UV-B

86

PEG-kezeléssel lett kombinálva hasonló növekedés volt tapasztalható, mint amit az UV-B

sugárzás önmagában okozott. A gyökerekben azonban sem az UV-B, sem a Cd- vagy PEG-

kezelés, sem pedig ezek kombinációja nem befolyásolta a KAT-t.

Az APX aktivitása jelentősen nem változott a levelekben az alkalmazott kezelések

hatására (32/D. ábra). A gyökerekben is csak az UV-B stresszt követő Cd- vagy PEG-kezelés

eredményezett szignifikáns növekedést.

Érdekes módon, az UV-B sugárzással kiegészített fényen nevelt növények leveleiben

a G-POD aktivitása szignifikánsan alacsonyabb volt a kontroll növényekben mértekhez képest

(32/E. ábra). Bár, amikor az UV-B stresszt PEG-kezelés követte, a G-POD aktivitás ugyan

megemelkedett, ennek ellenére továbbra is a kontroll értékek alatt maradt. Ezzel szemben, a

gyökerekben a G-POD-aktivitás a PEG-kezelés után szignifikánsan megnőtt. Az UV-B nem

befolyásolta, amikor viszont Cd-mal vagy PEG-gel lett kombinálva, statisztikusan

szignifikánsan megnövelte azt.

32. ábra: A Cd- vagy PEG-kezelés hatása az antioxidáns enzimek (GR – glutation-reduktáz, GST – glutation-S-

transzferáz, KAT – kataláz, APX – aszkorbát-peroxidáz, G-POD – gvajakol-peroxidáz) aktivitására normál

(fehér), illetve normál és kiegészítő UV-B fényen nevelt búzanövények leveleiben és gyökereiben. A különböző

betűvel jelzett értékek szignifikánsan, p 0,05 valószínűségi szinten különböznek egymástól. (n=3; SD).

87

6. EREDMÉNYEK MEGVITATÁSA

6.1. Nagyszámú búza genotípus vizsgálata szántóföldi körülmények között

Azért, hogy búzanövényekben pontosabb képet kapjunk a biotikus stressz,

esetünkben a levélrozsda (Puccinia triticina) és a lisztharmat (Erysiphe graminis (DC.) Speer

f. sp. tritici Em. Marchal) védekező rendszerre kifejtett hatásairól, továbbá, hogy

megállapíthassuk, van-e összefüggés a különböző védővegyületek kiindulási és/vagy

stresszindukált szintje, valamint az egyes búza genotípusok kórokozókkal szembeni

ellenállósága között, több martonvásári búzafajta, illetve különböző ismert levélrozsda-

rezisztencia (Lr) géneket hordozó Thatcher-alapú közel-izogén búzavonal (22 különböző

genotípus) vizsgálatára került sor. A martonvásári nemesítésű fajták betegségekkel szembeni

ellenálló-képességéről számos adat állt rendelkezésünkre, azonban a Thatcher-alapú

vonalakról, a levélrozsdával szembeni toleranciájukon kívül, nem volt ilyen jellegű

információnk, ezért különösen a jövőbeni kísérletes munka számára szükségesnek tartottuk

ezek tanulmányozását. A szántóföldi kísérletek alatt a levélrozsdával mesterségesen inokulált

növényeken, genotípustól függően, kisebb-nagyobb mértékben megjelent a természetes

lisztharmatfertőzés is. A fenotípusos vizsgálat során azt tapasztaltuk, hogy csak

levélrozsdával szemben a TC, csak lisztharmattal szemben a TC2C, TC3 és TC29 vonalak

mutattak érzékenységet, viszont a TC1, TC3BG, TC11, TC24, TC25, TC26, TC28, TC33 és

TC34 vonalak mindkét patogénre fogékonynak bizonyultak. Ezzel szemben a TC, TC3KA,

TC9, TC18, TC19, Mv 8, Mv Marsall, Mv Béres, Mv Regiment és Mv Hombár sokkal

ellenállóbb volt a lisztharmatfertőzéssel szemben, mint más búzagenotípusok.

Az egyes genotípusok ellenállóképességének hátterében álló folyamatok jobb

megismerése érdekében meghatároztuk azok kiindulási illetve fertőzés utáni SA- és PA-

tartalmát, valamint az antioxidáns enzimek aktivitását. A dolgozat e részének alapját adó

publikáció (Kovács és mtsai, 2012) volt az első, amely egyidejűleg hasonlította össze

különböző levélrozsda- és lisztharmat-toleranciával rendelkező búza genotípus teljes SA-

tartalmát, PA-szintjeit és antioxidáns enzimaktivitásait.

Különböző növényfajok leveleiben korábban már tanulmányozták az endogén SA-

tartalom növekedését biotikus stressz alatt (Huang és mtsai, 2005), továbbá úgy találták, hogy

az exogén SA-kezelés fokozza a patogénfertőzéssel szembeni ellenálló-képességet

(Chaturvedi és Shah, 2007). Azt is megállapították, hogy a SA felkészítette a növényeket a

88

védekezés fokozott indukciójára (Thulke és Conrath, 1998). Hückelhoven és mtsai (1999)

szerint a lisztharmat árpában nem okozott SA-felhalmozódást. Továbbá az árpa SA-szintje

alacsony maradt Erysiphe graminis f.sp. hordei-vel vagy E. graminis f.sp. tritici-vel történő

fertőzés után is, viszont a Pseudomonas syringae pv. syringae-vel történő inokulációt

követően megnőtt (Vallelian-Bindschedler és mtsai, 1998). A vizsgált 22 búzafajta, illetve

vonal elemzése után a genotípusok teljes SA-tartalmában szignifikáns különbségek

mutatkoztak a fertőzés előtt. A martonvásári nemesítésű vonalak SA-szintjei meglehetősen

alacsonyak, míg a Thatcher-alapú közel-izogén vonalaké közepesek vagy magasak voltak. A

levélrozsda-fertőzés és a megjelent természetes lisztharmatfertőzés után a SA-tartalom a

genotípusok több mint felében, martonvásári és Thatcher-alapú búzaváltozatokban egyaránt,

megemelkedett. Habár a levélrozsdával, és különösen a lisztharmattal szemben rezisztens

genotípusok aránya a martonvásári fajták között magasabbnak bizonyult, mint a

Thatcher-alapú vonalak között, nem találtunk kapcsolatot a SA-tartalom kezdeti vagy

patogén-indukálta változásai és a toleranciaszint között. Az is lehetséges, hogy a saját

eredményeink és a más szerzők által leírtak közötti különbséget az eltérő kísérleti

körülmények okozták.

Asthir és mtsai (2010) a búza PA bioszintézisének biotikus és abiotikus stressz alatti

korai aktivációját írták le. Lisztharmat hatására árpában megnőtt a PUT, a SPD és a SPN

szintje (Cowley és Walters, 2002). Egy másik patogén gomba, a sárgarozsda is

megnövekedett PA-tartalmat idézett elő egy fertőzésre fogékony búza vonalban (Asthir és

mtsai, 2010). Azt is megállapították, hogy a PA-ok változatos biotikus stresszorokkal

szemben váltanak ki növényi védekező válaszokat (Hussain és mtsai, 2011). Az általunk

végzett kísérletben, a fertőzés előtt a PA-ok közül a SPD esetében voltak a legkifejezettebb

különbségek mérhetők a 22 búza genotípusban. Alacsony és magas SPD-tartalmú genotípus a

martonvásári és a Thatcher-alapú genotípusok között egyaránt volt. A biotikus stressz

szignifikáns növekedést okozott a PUT-tartalomban minden genotípusban, míg a másik két

PA mennyiségét, az SPD-t és a SPN-t, alig befolyásolta. A PUT, a SPD és SPN

előanyagaként, valószínűleg felhalmozódott a két másik PA szintézise előtt. A kezdeti és a

stresszindukált PA-szintek közötti különbségek nem korreláltak a biotikus

stressztényezőkkel szembeni tolerancia fokával.

A növényi betegségek az antioxidáns rendszer fokozott működését, köztük az

antioxidáns enzimekét, váltják ki számos növényfajban, de az ellenálló és fogékony

genotípusok közötti különbségekről szóló tanulmányok számos ellentmondást tartalmaznak.

A levélrozsda KAT- és GST-aktivációt okoz ellenálló búza genotípusban, mialatt a fogékony

89

genotípusokban ezek az enzimek gátlás alá kerültek (Ivanov és mtsai, 2005). Árpában a

peroxidázok, a SOD, a GST, az APX és a GR erőteljesen indukálódtak a fogékony

genotípusokban már 5-7 nappal a lisztharmattal való fertőzést követően, míg kevésbé

kifejezett patogén-indukált növekedés volt megfigyelhető a rezisztens növények inokulált

leveleiben (Harrach és mtsai, 2008). A sárga- vagy csíkosrozsda-fertőzés szintén a SOD, a

KAT és a peroxidázok stimulációjához vezetett a fogékony búza vonalakban (Asthir és mtsai,

2010). Az antioxidáns enzimek kezdeti aktivitásaiban nagy különbségek nem voltak

megfigyelhetőek az elvégzett kísérlet körülményei között. Csekély növekedés volt mérhető a

GR, szignifikáns növekedés a GST aktivitásában, mialatt a KAT, az APX és a G-POD

aktivitása csökkent a biotikus stressz után. Az érzékeny és fogékony búza genotípusok

levélrozsda- és lisztharmat-fertőzésekre adott antioxidáns válaszai között mérhető

különbséget nem találtunk. Meg kell azonban jegyezni, hogy a szántóföldi körülmények

között nevelt növényekben mért változások nem csak a vizsgált biotikus stressztényezőknek

volt köszönhető, hanem az öregedésnek és/vagy különböző abiotikus stresszeknek is.

Az eredmények alapján az a következtetés vonható le, hogy bár a SA, a PA-ok

és az antioxidáns enzimek fontos szerepet játszanak a biotikus stresszel szembeni

védekező mechanizmusban, nincs kapcsolat a védő vegyületek kezdeti vagy stressz

hatására megváltozott mennyisége, illetve a levélrozsdával vagy lisztharmattal szembeni

tolerancia foka között az általunk vizsgált genotípusokban szántóföldi körülmények

között. A megfigyelt változások sokkal inkább az adott genotípusra jellemző

sajátosságok voltak, semmint toleranciafüggő jellegzetességek.

6.2. Biotikus stressz hatásai 4 különböző búzagenotípusban

A szántóföldi körülmények között fennálló egyéb stresszhatások elkerülése

érdekében üvegházi körülmények között vizsgáltuk a lisztharmat által indukált védekezési

mechanizmusokat a szántóföldi kísérlet eredményei alapján kiválasztott búza genotípusok,

fiatal és felnőtt (GS45 állapotú) növényeiben. A szántóföldi és az üvegházi körülmények

növényekre gyakorolt hatásainak összehasonlíthatósága érdekében a hangsúly a felnőtt korú

búzákból származó eredményeken van, azonban nem szabad elfelejtenünk, hogy a különböző

életkorú növények egymástól eltérő válaszokat adhatnak. Az alábbiakban a fiatal

növénykéken végzett kísérlet eredményeit csak ott taglalom, ahol jelentős eltérést

tapasztaltunk az egyaránt lisztharmatfertőzésnek kitett, de eltérő fejlettségi állapotú búzák

között.

90

Régóta ismert, hogy a lisztharmatfertőzés gátolja a fotoszintézist (Prokopová és

mtsai, 2010). Mindazonáltal, annak ellenére, hogy a fertőzés jelei egyértelműen

megmutatkoztak a növényeken, a lisztharmat nem volt hatással a PSII kvantumhatásfokára.

Azonban, bizonyos védelmi mechanizmusok megváltozott működése egyes esetekben már

korán, a fertőzést követő harmadik napon észlelhető volt a növényekben.

A lisztharmat okozta fertőzés enzimatikus antioxidáns rendszerre kifejtett serkentő,

illetve gátló hatását számos esetben leírták (Ashry és Mohamed, 2011; El-Zahaby és mtsai,

1995; Harrach és mtsai, 2008), továbbá azt is, hogy erre a patogénre érzékeny vagy ezzel

szemben ellenálló gabonafélékben a fertőzés különbözőképpen befolyásolhatja az antioxidáns

enzimaktivitást (lásd a 6.1. fejezetben). Asthir és mtsai (2009, 2010) leírták, hogy érzékeny

búza vonalakban a sárgarozsda okozta kór is stimulálja a G-POD, a SOD és a KAT

aktivitását, de a tünetek hiánya miatt ezeknek a paramétereknek a változásait a rezisztens

vonalakban nem vizsgálták meg a fertőzés során. A különböző gombás betegségekben

szenvedő gabonafélék peroxidáz izoenzim-mintázatának változásai (Flott és mtsai, 1989;

Johnson és Lee, 1978; Scott-Craig és mtsai, 1995) azt mutatták, hogy a fogékony és ellenálló

genotípusok a fertőzés után részben hasonló, részben különböző indukált vagy gátolt G-POD

izoenzim-mintázatot mutatnak, a G-POD gének expressziója miatt (Baga és mtsai, 1995). Azt

is kimutatták, hogy egy védelemhez kötődő intercelluláris árpa peroxidáz expressziója

transzgénikus dohányban nem fokozta a rezisztenciát (Kristensen és mtsai, 1997). Az általunk

vizsgált négy búza genotípus kezdeti enzimaktivitás-szintjei között kifejezett különbségek

csak a G-POD esetén voltak mérhetőek, amelynek aktivitása fele olyan nagy volt egy

rezisztens (TC19) és egy szenzitív (TC26) vonalban, mint a másik két genotípusban. Azonban

ezek a különbségek később, a 7 napos kontroll növényekben az öregedés hatására eltűntek. A

kísérlethez olyan felnőtt növényeket használtunk, melyeken már megjelentek a zászlós

levelek. A kezelés időtartama meglehetősen rövid volt, de mivel a növényeket cserépben

neveltük, lehetséges, hogy a kontroll növényekben mért változásokat a levelek öregedése

okozta. A G-POD izoenzim mintázatának vizsgálatára is sort került azért, hogy

megvizsgáljuk, vajon a fertőzés új izoformák indukciójához, vagy az ismert izoenzimek

mennyiségének változásaihoz vezet-e. Az eredmények alapján elmondható, hogy a TC9,

TC19 és TC33 vonalak izoenzim-mintázata a kontroll és a fertőzött növényekben egyaránt

hasonló. A G-POD2 sávja hiányzott a 3 és a 7 napos kontrollokból, de a fertőzést követően

megjelent, 7 nappal a fertőzés után nagyobb intenzitással, mint 3 nappal. A TC26-ban

azonban ez az izoenzim már a 3 napos kontroll növényekben is jelen volt, az öregedés pedig

fokozta az intenzitását. A fertőzés drasztikus növekedést idézett elő a G-POD2 aktivitásában

91

és sávjának intenzitása folyamatosan nőtt az öregedés hatására. Mivel az öregedés önmagában

is fokozta ennek a sávnak az erősségét, a fertőzésnek kevesebb hatása volt 7 nappal a fertőzés

után. A G-POD2 fertőzést követő megjelenése a másik három genotípusban vezethetett a G-

POD aktivitás fotometriásan mért növekedéséhez (Pál és mtsai, 2013a). Melgar és mtsai

(2006) 5 Williams- és Harosoy-alapú közel-izogén szója vonalban, amelyek eltérő rassz-

specifikus rezisztencia géneket (rps, Rps1-k, Rps2, Rps3 és Rps6) hordoztak, vizsgálták az

oldódó POD-ok akkumulációját az idő függvényében, eltérő Phytophtora sojae rasszokkal

történő fertőzés során. Az eredmények azt mutatták, hogy a POD aktivitásának

megemelkedését a fertőzött növényekben befolyásolta az eltelt idő, a növény genetikai

háttere, a közel-izogén vonal minősége és a Phytophtora rasszok is. Anjana és mtsai (2007)

napraforgóban (Helianthus annuus L.) vizsgálták a levélfoltosságot okozó nekrotróf patogén,

az Alternaria helianthi G-POD izoformákra (PO1, PO2 és PO3) gyakorolt hatásait egy

kórokozóra rezisztens és egy fogékony genotípusban üvegházi körülmények között. A PO1

jelen volt mindkét genotípus különböző időpontokban vett mintáiban, de a relatív intenzitása

a rezisztensekben végig nagyobb, a fogékonyakban pedig alacsonyabb volt, különösen 12 és

48 órával a fertőzés után. A PO2-t és a PO3-t 2 órával a fertőzés után észlelték a rezisztens

fertőzött mintákban, az intenzitásuk csökkent a 4. és 8 órában, de ismét megemelkedett a 12.

órában. A fogékony genotípus fertőzött mintáiban a PO2 és a PO3 24 órával az inokuláció

után magasabb intenzitást mutatott, mint a korábbi időpontokban. A 48. órában a PO2

maximális felhalmozódást mutatott, viszont a PO3 eltűnt.

A korreláció analízis pozitív, lineáris kapcsolatot mutatott a legtöbb enzim aktivitása

között, azonban, különbségek a lisztharmatfertőzésre adott antioxidáns válaszok között a két

ellenálló (TC9 és TC19), valamint a két fogékony (TC26 és TC33) vonal között nem lehetett

kimutatni (Pál és mtsai, 2013a). Az eredmények arra utalnak, hogy az antioxidáns

enzimek aktivitásában mért változások a fertőzés következményei és nem a rezisztencia

okai.

A különböző patogének által okozott fertőzések eltérő mértékben befolyásolták a

különböző SA-formák mennyiségét árpában (Hückelhoven és mtsai, 1999; Vallelian-

Bindschedler és mtsai, 1998). Ugyanakkor, habár a SA fontos szerepet tölt be a SAR

kialakulásában (Park és mtsai, 2007; Thulke és Conrath, 1998; Ward és mtsai, 1991;

Wildermuth, 2001), a SAR megnyilvánulása nem mindig korrelált a SA szisztemikus

felhalmozódásával (Cameron és mtsai, 1999), melynek hátterében más vegyületek, például az

azelainsav, akkumulációja is állhat (Conrath, 2011; Jung és mtsai, 2009). Ezen kívül

feltételezhető, hogy a SA-felhalmozódás az egyes növényfajokban patogén-specifikus,

92

továbbá függ a fertőzés és a mintavétel közötti időintervallum hosszától. Ezzel magyarázható,

hogy a felnőtt korú növények esetén a teljes SA-tartalomban nem tudtunk nagy növekedést

kimutatni, a fiatalkorú növényekben pedig, különösen a szabad SA-tartalomban sok esetben

jelentős mértékű csökkenést tapasztaltunk a lisztharmatfertőzést követően. Pozitív, egyenesen

arányos korrelációt találtunk a szabad és kötött SA-tartalmak között, de nem volt kapcsolat a

SA-tartalom változásai és a toleranciaszint között. Ezen felül az öregedés vagy a fertőzés által

okozott változások nem magyarázhatóak egyszerűen a szabad és kötött formák közötti

átalakulással, mivel az egyik forma növekedését nem követi a másik csökkenése (Pál és mtsai,

2013a). Az exogén SA-kezelés fokozta a gabonafélék hidegtűrését (Horváth és mtsai, 2007;

Janda és mtsai, 1999), és növelte néhány antioxidáns enzim (GR és G-POD) aktivitását. A

búzán végzett kísérletek során az exogén SA-kezelés nem fokozta a torsgombával

(Gaeumannomyces graminis var. tritici) szembeni toleranciát, mert a PAL és a peroxidázok

aktivitása nem stimulálódott a gyökerekben (Seah és mtsai, 1996). A TMV-fertőzött (Tobaco

Mosaic Virus, dohánymozaik vírus) dohány peroxidáz génjének expresszióját a spermin

indukálta, és nem a szalicilát által aktivált hiperszenzitív reakció (Hiraga és mtsai, 2000).

Miután az endogén SA-tartalom a G-POD-aktivitástól eltérő mintázatot mutatott a leírt

kísérleti körülmények között, és a szabad és kötött SA nem korrelált szignifikánsan a G-

POD aktivitással, nem valószínű, hogy a SA-nak közvetlen, pozitív szerepe lenne a G-

POD indukciójában. Viszont ennek ellentéte feltételezhető a GR esetében, ahol

szignifikáns, pozitív korrelációs kapcsolatot találtunk a szabad SA és a GR-aktivitás

között (Pál és mtsai, 2013a).

A PA-ok számos funkciójuk mellett antioxidáns szerepet is betöltenek.

Bioszintézisük korai aktivációját leírták búzában mind az abiotikus, mind a biotikus

stresszekre adott válaszban (Asthir és mtsai, 2010). Stresszkörülmények között a növényfajok

az endogén PA-szinteket tekintve különböző válaszokat mutatnak, néhányuk felhalmozza a

PA-okat, míg mások PA-szintje nem változik vagy csökken, amikor kedvezőtlen környezetbe

kerül (Liu és mtsai, 2007). Hasonló eredményeket találtak árpában is, ahol a szabad PUT és

SPN, valamint a konjugált PUT, SPD és SPN mennyisége megnőtt a lisztharmattal történő

inokulációt követően (Cowley és Walters, 2002). Az általunk végzett kísérletben, mind a négy

búzavonalban a szabad és kötött formájú SPD és SPN felhalmozódott 7 nappal a

lisztharmatfertőzés után (Pál és mtsai, 2013a). Mint a SPD és SPN előanyaga, a PUT

valószínűleg felhasználódott ezen anyagok szintézisére, amelyek azután konjugált formában

raktározódtak. Ezeket az eredményeket a korrelációs kapcsolatok elemzése is alátámasztotta,

mivel a szabad PA-ok szoros, pozitív, szignifikáns kapcsolatban álltak a konjugált formákkal.

93

Antioxidáns hatásaik egyike az lehet, hogy a PA-ok képesek szabályozni az antioxidáns

enzimek génjeinek expresszióját, Liu és mtsai (2007) szerint ugyanis a SPN serkentette a

peroxidáz gének kifejeződését dohányban. Mivel az általunk végzett kísérletben a SPD-

tartalom szignifikánsan korrelált a mért antioxidáns enzimaktivitásokkal, feltételezhető, hogy

összefüggés van a PA-ok és az antioxidáns enzimek között (Pál és mtsai, 2013a). Egyes

publikációk szerint a SA-kezelés befolyásolja a PA-ok katabolizmusát (Szepesi és mtsai,

2011) és mennyiségét (Németh és mtsai, 2002). Azt is kimutatták, hogy dohánynövényekben

a TMV fertőzés utáni SPN akkumuláció stimulálja két fontos mitogén-aktivált fehérje kináz

(MAPK) aktivitását – a sebzés-indukált fehérje kinázét és a SA-indukált fehérje kinázét,

melyek részt vesznek a növényi védekezésben (Takahashi és mtsai, 2003). Bizonyítékot

találtak arra, hogy búzában a SA-val, a JA-val és a MAPK-val összefüggő jelátviteli

útvonalak részt vesznek a lisztharmat-rezisztencia kifejeződésében, és ebben az általuk

befolyásolt SAR gének pozitív szerepet játszanak (Meng és mtsai, 2002). Azt gondolják, hogy

kapcsolat van az endogén SA- és PA-tartalmak és az antioxidáns aktivitások, valamint a

növények különféle biotikus stresszekkel szembeni érzékenysége vagy ellenállósága között

(Liu és mtsai, 2007; Talieva és Kondrat’eva, 2002). Ebben a kísérletben a korrelációs elemzés

szignifikáns, pozitív összefüggést mutatott a szabad és konjugált SPD- és SPN-, valamint a

szabad SA-szintek között (Pál és mtsai, 2013a).

Összefoglalva, habár egyes esetekben szoros, pozitív korreláció volt található a

SA- és az antioxidáns enzimaktivitások között, valamint ezek mindegyikének fontos

szerepe lehet a védekezési mechanizmusokban, ebben a kísérletben nem volt közvetlen

kapcsolat ezeknek a paramétereknek a változásai és a lisztharmatfertőzéssel szembeni

tolerancia szintje között. Nem szabad elfelejteni azt sem, hogy ezeket a paramétereket a

szeneszcencia is befolyásolhatja. A biotikus fertőző ágens, továbbá a fertőzés és az

elemzés között eltelt idő intervalluma befolyásolhatja ezeknek a védővegyületeknek az

alap szintjeit és a fertőzés által indukált változásait.

6.3. Különböző abiotikus stresszek hatásai búzában

6.3.1. Különböző koncentrációjú Cd hatásai búzanövényekben

A nehézfémek növényekre és a táplálékláncon keresztül az állatokra, emberekre

kifejtett károsító hatásairól számos esetben beszámoltak (Benavides és mtsai, 2005; Groppa és

mtsai, 2008a,b; Khan és mtsai, 2011; Thijssen és mtsai, 2007; Zhou és mtsai, 2014). A Cd

bár a természetben relatíve ritkán fordul elő, nagymértékű toxicitása miatt már kis

94

koncentrációban is rendkívül veszélyes, ezért a növényi védelmi rendszert már kis

mennyiségben is nagymértékben indukálja. Ezen kívül a kísérletek során azért is ezt a fémet

használtuk, mert tudjuk, hogy a Cd jelentősen befolyásolja a SA-bioszintézist (Pál és mtsai,

2005, 2006a; Zawoznik és mtsai, 2007), így a SA-val kapcsolatos védekező mechanizmusok

Cd-kezeléssel indukálhatóak.

Ugyanakkor az irodalmi adatok szerint a SA nehézfémstressz alatti szerepe

meglehetősen ellentmondásos. A SA-as előkezelés számos növényfajban csökkentette a Cd-

toxicitást (Çanakci és Karaboğa, 2013; Krantev és mtsai, 2008; Metwally és mtsai, 2003),

azonban a SA hidropónikus oldatban való alkalmazása súlyosbította a Cd-stressz tüneteit (Pál

és mtsai, 2002). A Cd-indukált SA-felhalmozódást különféle növényekben leírták, bár a

pontos szerepe még tisztázatlan. Arabidopsis thaliana-ban a 0,5 mM Cd-kezelés

háromszorosára emelte a SA-tartalmat, de azt is megállapították, hogy az endogén SA

fokozhatja a Cd okozta oxidatív károsodást (Zawoznik és mtsai, 2007). Rizsben, melynek a

búzáéhoz képest magas az alap SA-tartalma, a SA-előkezelés megnövekedett endogén SA-

szintet eredményezett és védelmet nyújtott a későbbi Cd-kezelés, H2O2 által közvetített,

toxikus hatása ellen (Chao és mtsai, 2010). Az elvégzett kísérletek során a 11 napos 500 µM

Cd-os kezelés drasztikus mértékben megemelte mind a négy vizsgált genotípus szabad és

kötött SA-tartalmát. Minden növény redukált növekedést és fokozott klorózist mutatott, a

gyökerek csökevényesek és elágazásmentesek voltak, melyek a nehézfém mérgezés tipikus

tünetei. Megállapítottuk, hogy ez az alkalmazott Cd-koncentráció olyan mértékben károsítja a

búza növényeket, hogy azok Cd-mal szembeni toleranciája, illetve a kezelésre adott élettani

válaszaik közötti különbségek megállapítása nem lehetséges, így alacsonyabb Cd-

koncentráció (50 µM) alkalmazása vált szükségessé. Mivel a Cd gátolja a csírázást (az 500

µM Cd 92 %-ban, az 50 µM Cd pedig 27 %-ban), előcsíráztatott növényeket használtunk.

A növények egy csoportját már a csírázást követően 50 µM Cd-nak tettük ki. Rajtuk

szintén megfigyelhetőek voltak, az előzőekhez hasonlóan, a Cd-mérgezés jellegzetes tünetei,

a csökkent hajtás és gyökérnövekedés, illetve fejlődés, a levelek sárgulása a kloroplasztiszok

degradációja, a csökkent vízellátottság és egyéb folyamatok miatt (Sobrino-Plata és mtsai,

2009), ellenben ezek mértéke elmaradt a magasabb Cd-koncentrációnál tapasztaltaktól. Az

idősebb növények 7 napos Cd-kezelését követően eltérések mutatkoztak a genotípusok

morfológiai és fotoszintetikus teljesítménye között. Az 1 hetes 50 µM Cd-os kezelés az Mv

Hombárnál nem okozott látható elváltozást, az Mv 8-ban is csak kismértékben csökkentette a

növekedést, mialatt a Thatcher-alapú vonalakban, különösen a TC33-ban, már nemcsak

növekedésgátlást, hanem csekély klorózist és hervadást is kiváltott. Ennek ellenére a

95

fotoszintézis hatékonysága nem mutatott szignifikáns csökkenést. Az eredményeink alapján

megállapítható, hogy az Mv Hombár ellenállóbb, míg az Mv 8, a TC19 és különösen a TC33

érzékenyebb volt a Cd-mal szemben.

A korábbi eredmények azt mutatták, hogy a Cd növelte a BA, oHCA és SA szintjeit

kukoricában, és ezek a változások korreláltak a Cd koncentrációjával (Pál és mtsai, 2005). Az

elvégzett kísérlet során bizonyítást nyert, hogy a Cd-kezelés búza növényekben fokozza a

kötött oHCA és az SA akkumulációját, - utóbbinak inkább annak szintézisén, mint szabad és

kötött formáinak emelésén keresztül - különösen a levelekben.

A korai izotópos vizsgálatok alapján feltételezhető, hogy a növények a SA-at

fenilalaninból fahéjsavon és oHCA-n keresztül állítják elő, ahol a PAL katalizálta fenilalanin-

fahéjsav átalakulás a szintézisút fontos szabályozó lépése, míg a legújabb genetikai

vizsgálatok azt mutatták ki, hogy a SA nagy részének előállítása izokorizmáton keresztül

korizmátból történik. Az is lehetséges, hogy az adott növényben a PAL- és az ICS-útvonalak

egyaránt részt vesznek a SA bioszintézisében és az anyagcsere vagy szabályozó hálózaton

keresztül a két út eltérő választ ad stresszkörülmények között, és ez függ a vizsgált növény

fajától (Chen és mtsai, 2009). A saját eredményeink is azt mutatják, hogy nemcsak a

növényfajoknak, hanem a különböző növényi szerveknek is eltérőek a Cd stresszre adott SA-

val kapcsolatos válaszai. Habár a PAL-aktivitás szignifikánsan nőtt a Thatcher-alapú vonalak

leveleiben, a martonvásári genotípusokban viszont nem, ezek a változások aligha

magyarázzák a megfigyelt drámai SA felhalmozódást. Mivel a Cd-kezelés alig befolyásolta a

CS és ICS gének expressziós szintjét, úgy tűnik, hogy a levelek SA-szintjének növekedése, a

PAL-aktivitás fokozott indukciójának hiánya ellenére, a gyökérben képződő, majd a levelekbe

szállítódó prekurzorainak köszönhető, amely az Mv 8 és Mv Hombár gyökereiben csak

csekély Cd-indukált SA-szintnövekedést vagy akár csökkent szabad BA-tartalmat

eredményezett.

A SA szabályozása meglehetősen összetett jelenség. Nagyon kevés szabad és kötött

formájú SA-at tartalmazó, egészséges dohánylevelekben, TMV-vel történt fertőzés után,

nagymértékben megemelkedett a kötött SA-tartalom. Egy átmeneti csökkenés volt

megfigyelhető a kötött BA mennyiségében, párhuzamosan a szabad BA és szabad SA kezdeti

emelkedésével, ami azt jelezte, hogy a kötött BA nagyobb valószínűséggel lehet a SA

közvetlen prekurzora (Chong és mtsai, 2001). A saját kísérletünkben azt találtuk, hogy a

kontroll búza levelek szintén kevés SA-t és oHCA-t tartalmaznak, mind a szabad, mind a

kötött formában. Mivel a Cd-mal szemben mérsékelten toleráns TC19-ben volt a

legmagasabb a kötött SA, BA és oHCA-tartalom, a négy genotípus közül, nincs

96

kapcsolat a fenolvegyületek alap szintje és a Cd-tolerancia foka között. A Cd-indukálta

szabad és kötött SA, valamint kötött oHCA változásai sokkal kifejezettebbek voltak a

levelekben, mint a gyökerekben. Érdekes, hogy a Cd csak a kevésbé toleráns Mv Hombár és

Mv 8 gyökerében növelte kis mértékben a szabad és kötött SA-tartalmat, habár a gyökér SA

szintje és a Cd-tolerancia közötti kapcsolat nem egyértelmű. Salix viminalis-ban a SA-szintet

nem befolyásolja sem a Cd-, sem a réz-, sem pedig a cinkkezelés, de hasonlóan a mi

eredményeinkhez, nem volt különbség a nehézfémekkel szemben ellenálló, illetve azokra

érzékeny klónok SA szintje között a kontrollokban (Landberg és Greger, 2002). Az oHCA-

ról, mely a legnagyobb mértékű növekedést mutatta Cd-os kezelés után, korábban

megállapították, hogy antioxidáns tulajdonságokkal rendelkezik (Foley és mtsai, 1999), ezért

az eredmények alapján feltételezhető, hogy amellet, hogy a SA prekurzora, szerepe van a Cd-

ra adott antioxidáns válaszban is.

A nehézfémek antioxidáns rendszerre kifejtett hatását Brassica juncea (Markovska

és mtsai, 2009), Platycladus orientalis, Sophora japonica (Zhou és mtsai, 2014), kukorica

(Pál és mtsai, 2006a,b), árpa és egyéb fajokban (Gzyl és mtsai, 2009; Markovska és mtsai,

2009) egyaránt leírták. A Cd oxidatív stresszt okoz és fokozza a védő vegyületek szintézisét

(Gratão és mtsai, 2005), többek között a fitokelatinokét, a tiolvegyületekét, az ASC-ét, és

befolyásolja az antioxidáns enzimek aktivitását pl. Pinus sylvestris-ben, nyárfa hibridekben

(Populus x Canescens) (Schutzendübel és mtsai, 2007), lucernában (Sobrino-Plata és mtsai,

2009) és búzában (Zhao, 2011). A képződő ROS-ok az antioxidáns rendszer serkentésén túl

szerepet játszanak egyéb védelmi folyamatokban is, mint jelátvivők (Karuppanapandian és

mtsai, 2011). Öt, különböző Cd-toleranciával rendelkező mustárfajta vizsgálata azt mutatta,

hogy a legellenállóbb genotípus magasabb toleranciája az antioxidáns enzimek közötti jobb

koordinációnak volt köszönhető (Gill és mtsai, 2011). Habár hasonló alap antioxidáns

enzimaktivitásokat mértek, a Cd stressz különböző változásokat indukált toleráns és szenzitív

uborka vonalak sejtjeiben (Gzyl és mtsai, 2009). Az elvégzett kísérlet eredményei azt

mutatták, hogy az antioxidáns enzimek aktivitásának alap szintje nem különbözik jelentősen a

vizsgált négy búza genotípusban, annak ellenére, hogy különbségek figyelhetőek meg a Cd-

mal szembeni toleranciájukban. A 17 napig Cd-nak kitett búza levelekben a H2O2

eliminálásáért felelős enzimek, a KAT, az APX és a G-POD, aktivitásai szignifikánsan

megemelkedtek, mialatt a GR-é és a GST-é a legtöbb esetben jelentős mértékben csökkent.

Ezzel szemben a 7 napos, idősebb kori Cd-kezelés szinte alig befolyásolta a levél antioxidáns

aktivitásait, kivételt ez alól a TC33 és TC19 G-POD aktivitása, valamint az Mv Hombár GST-

aktivitása jelentett, előbbiek szignifikánsan nőttek, míg utóbbi szignifikánsan csökkent.

97

Markovska és mtsai (2009) 5 napos 10, 30, 50 és 100 µM Cd-nak kitett indiai mustár

növényekben az aszkorbát-glutation ciklus enzimeinek fokozott aktivitásáról, ellenben a

ciklus rendezetlenné vált működéséről számoltak be, vagyis a Cd már kismértékben szétzilálta

a növényi védelmet, ami a fotoszintetikus rendszer károsodásához vezethet. Nikkellel kezelt

kávénövények sejtjei gyors APX-aktivitás növekedést mutattak, bár az aktivitások trendje alig

mutatott eltérést a két vizsgált Ni-koncentráció (0,05 mM és 0,5 mM) között (Gomes-Junior

és mtsai, 2006). Transzgénikus réti csenkesz növényben a Cd-, illetve az arzénkezelés még

nagyobb mértékben megnövelte a Cu/Zn-SOD és az APX gének expresszióját a

kloroplasztiszokban, mint a kontroll növényekben, ezzel szemben az arzénnak kitett

levelekben mindkét enzim csökkent aktivitást mutatott más nehézfém-kezelésekhez

viszonyítva és nem találtak szignifikáns különbséget a kontroll és a transzgénikus növények

között (Lee és mtsai, 2007). Ennek magyarázata az lehet, hogy a különböző kezelések eltérő

mértékben indukálhatják az egyes izoformákat kódoló gének expresszióját, a képződő

fehérjék aktivitása viszont összeadódhat és a mérések során nem elkülöníthetők egymástól az

egyes izoenzimek aktivitásbeli különbségei. Az Mv Hombár levelében bár magasabb volt a

kiindulási GR-aktivitás, mint a másik három búza genotípusban, a Cd-kezelés ennél az

enzimnél sem okozott változást. A 24 napos növények leveleiben hiányzó Cd-indukálta

aktivitásváltozás arra utal, mint az a vizuális elemzéskor is megfigyelhető volt, hogy a

nehézfém károsító hatása még alig nyilvánul meg a levelekben, hiszen nem a levél, hanem a

gyökér az első növényi rész, amely érintkezik a tápoldathoz adott Cd-mal. Ezt támasztja alá

az APX aktivitás változatlansága is a kezelés hatására, mivel ez az enzim a normális növényi

növekedéshez elengedhetetlenül szükséges és csökkent működése retardált fejlődést okoz

(Caverzan és mtsai, 2012). Az érzékenyebb Thatcher-alapú vonalak fokozódó G-POD

aktivitása viszont sejtette, hogy a kezelés rövid időtartama miatt nem detektálható a Cd

hatása. A levélcsúcsok sárgulása már a mérgezés tüneteinek egyike, vagyis a hosszabb

időtartamú kezeléskor már a levelek enzimatikus antioxidáns védelmi rendszere is

indukálódik. A kezelés okozta oxidatív stressz során képződő H2O2 eltávolítását a

gyökerekben a rendkívül megemelkedett KAT-aktivitás biztosította. A Cd szignifikánsan

megemelte a GR aktivitását mindkét martonvásári fajta gyökerében, mialatt a Thatcher-alapú

közel-izogén vonalakban nem volt különbség. A megnövekedett GR-aktivitások az Mv 8-ban

és az Mv Hombárban korreláltak a teljes GSH-tartalomban megfigyelt növekedéssel, továbbá,

kapcsolatban állhattak ebben a két genotípusban a gyökér GSH/GSSG arányának

növekedésével is (Kovács és mtsai, 2014b). A GSH-nak védő szerepe van a fémmérgezéssel

szemben, így a GSH-tartalom növekedése növelheti a nehézfém stresszel szembeni toleranciát

98

(Zagorchev és mtsai, 2013). A magas GSH/GSSG-arányt a GR biztosítja, és a stressztoleráns

genotípusokban általában magasabb arány mérhető, mint a stresszre érzékenyekben (Kocsy és

mtsai, 2004). Ennél fogva a GR-aktivitásban, a GSH-tartalomban és a GSH/GSSG-arányban

megfigyelt különbségek kapcsolatban vannak a Cd-tolerancia mértékével a vizsgált négy búza

genotípusban (Kovács és mtsai, 2014b). A növényi stressztolerancia kapcsolatban áll a

növény ASC-szintjével is (Zhang, 2013). Az általunk vizsgált búza fajták, illetve vonalak

közül a teljes ASC-tartalom a legmagasabb az Mv Hombár (a legellenállóbb genotípus), a

legalacsonyabb pedig a TC33 (a legérzékenyebb genotípus) levelében volt (Kovács és mtsai,

2014b). Szintén szignifikáns növekedést írtak le a teljes ASC-tartalomban durumbúza-

növények gyökereiben Cd-stressz alatt, és ez a növekedés összefüggésben állt a Cd-kezelés

által okozott magasabb DHA-tartalommal, mialatt a levelekben a kezelés nem befolyásolta

sem a teljes, sem az oxidált formájú ASC-t (Paradiso és mtsai, 2008).

Azt is leírták, hogy a Cd a PC-k szintézisét is stimulálta durumbúza gyökereiben,

különösen a PC3-ét, mialatt a levelekben nem történt PC-szintézis (Paradiso és mtsai, 2008).

Korábban Pál és mtsai (2006b) arról számoltak be, hogy a kukorica gyökereiben 1 nappal a 10

M Cd-os kezelés után a PC2-szint megemelkedett, de nem változott a leveleiben. Ezekhez az

eredményekhez hasonlóan, az elvégzett kísérlethez kapcsolódóan azt találtuk, hogy az 50 M

Cd növelte a PC-k mennyiségét, valamint a fitokelatin-szintáz (PCS) aktivitását a Cd-mal

szemben ellenállóbb Mv Hombárban és Mv 8-ban, különösen azok gyökereiben (Kovács és

mtsai, 2014b). Másrészről viszont, nem minden növény válaszol PC szintézissel a Cd-ra. Az,

hogy Salix-ban Cd-stressz után PC-ok nem voltak kimutathatóak, azt feltételezi, hogy a

nehézfémstresszel szembeni védelem a Salix fajokban független a PC-októl (Landberg és

Greger, 2002).

Az antioxidáns rendszer változásai és számos egyéb védő mechanizmus (pl.

nehézfém-detoxifikáció) aktivációja is köthető a jelátvivő SA aktivitásához

stresszkörülmények között (Çanakci és Karaboğa, 2013; Horváth és mtsai, 2007; Szalai és

mtsai, 2013). Ezen eredmények alapján, a fitokelatinok jelentőségén kívül, a GSH központi

szerepe a búza Cd-mal szembeni toleranciájában egyértelmű, az optimális redoxállapot és a

fém-detoxifikáció tekintetében egyaránt (Kovács és mtsai, 2014b). Ezt megerősítik Huang és

mtsai (2010) eredményei is, továbbá a Son és mtsai (2014) által leírtak, amely szerint

dohányban az exogén 0,1 mM illetve 1 mM GSH enyhítette vagy visszafordította a Cd, Cu,

illetve Zn-kezelések negatív hatásait a nehézfémtől és a GSH koncentrációjától függően.

Erős korreláció volt kimutatható a levelekben a szabad és kötött SA formák

mennyisége között, továbbá a kötött SA is pozitívan korrelált a kötött oHCA-val, mialatt a

99

szabad BA és kötött SA negatív szignifikáns korrelációban álltak egymással. A SA

mennyisége, szabad és kötött formában egyaránt, pozitívan korrelált a G-POD- és PCS-

aktivitással, valamint a -glutamil-cisztein- (-EC) tartalommal, míg negatívan az ASC

mennyiségével (Kovács és mtsai, 2014b). A gyökerekben a szabad és/vagy kötött SA-tartalom

szignifikáns kapcsolatot mutatott a GSH, -EC, PC3 és ASC-tartalmakkal, valamint a GR és

GST-aktivitásokkal, azonban a szabad BA negatív viszonyban állt az utóbbi paraméterekkel

(Kovács és mtsai, 2014b). Az antioxidáns rendszer tagjai pozitív korrelációban álltak

egymással és a fém detoxifikáló rendszerrel is. A leírt eredmények azt is jelezhetik, hogy a

Cd-stressz alatti megnövekedett SA növelhette a GSH-tartalmat, és ezen keresztül

indukálhatta az antioxidáns és fémdetoxifikáló rendszert, amely folyamatok segítik a

búzanövénykék Cd-mal szembeni stressztoleranciáját (Kovács és mtsai, 2014b). Ezek az

eredmények egybevágnak azokkal a korábbi felfedezésekkel, ahol a SA-szintek kontrollálása

volt szükséges az optimális fotoszintézishez és redox-homeosztázishoz (Mateo és mtsai,

2006). Továbbá, kapcsolatot találták a SA és GR vagy GST között a búza x lisztharmat, mint

gazda x patogén interakció során (Pál és mtsai, 2013a). Egy másik tanulmányban a SA-

előkezelés védte az árpa növényeket a Cd-toxicitástól (Metwally és mtsai, 2003), és redukálta

az antioxidáns enzimaktivitások Cd-általi fokozódását. A SA PC-szintézist befolyásoló

hatását is leírták kukoricában Cd stressz alatt (Szalai és mtsai, 2013). Ezek az eredmények

arra utaltak, hogy a SA nem az antioxidáns rendszer szintjén csökkentette a Cd toxicitását,

hanem egyéb mechanizmusokon, mint például a fém detoxifikáción keresztül. Ugyanakkor

azt is meg kell említeni, hogy az exogén SA hatásai nem egyenértékűek a stresszindukált

endogén SA hatásmechanizmusával.

Az eredményeink azt mutatják, hogy a Cd-stressz számos védővegyület

szintézisét indukálta a különböző toleranciafokkal rendelkező búza növényekben. Habár

a Cd-nak való kitettség az általunk vizsgált genotípusokban serkenti a SA-szintézist,

különösen a levelekben, nincs közvetlen kapcsolat az alap, vagy stressz-indukált SA-

szintek és a Cd-tolerancia foka között. A SA bioszintézis útvonalainak vizsgálata során

feltételezhető, hogy nem a korizmáton, illetve izokorizmáton át, hanem a BA-n és/vagy

oHCA-n keresztüli szintézis útvonal lehet a felelős a Cd által indukált drámai SA-

akkumulációért. Habár a kötött formájú BA közvetlenül nem szolgál pool-ként a SA-

szintézis számára.

Noha, a SA-mediált jelzés és a védő mechanizmusok közötti kapcsolat eltérő lehet a

levelekben és a gyökerekben, a pozitív korreláció egyes SA-val kapcsolatos vegyületek és a

védőanyagok között arra utal, hogy a SA-val kapcsolatos jelzés is szerepet játszhat a

100

nehézfémstresszel szembeni akklimációban, habár a közvetlen kapcsolat még tisztázatlan és

további kutatást igényel.

6.3.2. A PEG-kezelés hatásai búzanövényekre

A búza védekező rendszerének és stresszválasz-reakcióinak jobb megismerése

érdekében vizsgáltuk ugyanezeknek a genotípusoknak az élettani változásait

szárazság/ozmotikus stressz alatt. A szárazságra adott növényi válaszok közül az első a

sztómák bezáródása, ami gátolja a transzspirációt és a gázcserét, ezáltal a fotoszintézis

hatékonyságát (Bencze és mtsai, 2011; Chaves és mtsai, 2003; Cornic, 2000). A hajtások

PEG-kezelés miatti vízvesztése a levelek turgorvesztését, elvékonyodását, saját tengelyük

körüli tekeredését és a levéllemez csavarodását okozta minden általunk vizsgált genotípusban.

Ezek a morfológiai elváltozások a fűfélékre jellemző, vízhiányra adott válaszok erőteljes

megnyilvánulásai (O'Toole és Cruz, 1980). A legerőteljesebb tünetek a TC33-on, míg a

legenyhébbek az Mv Hombáron látszottak, a TC19 és Mv 8 tünetei a kettő közé tehetőek a

kontroll növényekhez viszonyítva. Bár az 5 napos PEG-kezelés jól látható morfológiai

változást okozott minden genotípusnál, a PSII kvantumhatékonyságát mutató PSII

értékekben szignifikáns eltérés nem volt látható, az általunk alkalmazott, stresszt nem okozó

fényviszonyok mellett ez a fotoszintetikus paraméter nem alkalmas a szárazságstresszel

szembeni ellenálló-képesség mértékének jellemzésére (Adir és mtsai, 2003; Skillman, 2008).

Ezzel ellentétben a vizsgált növényi részek prolintartalma már megfelelő, mint stresszmarker

(Anjum és mtsai, 2012; Mohammadkhani és Heidari, 2008). A prolin mennyisége minden

genotípus levelében és gyökerében jelentősen megemelkedett, különösen a TC33 levelében

(Kovács és mtsai, 2014c), amely a PEG-kezelés okozta károsodás elleni védekezés jele.

Dohánysejteken végzett kísérletek során megállapították, hogy a külsőleg adagolt prolin és

glicinbetain növeli a NaCl-dal szembeni toleranciát az antioxidáns enzimek serkentésén

keresztül, továbbá úgy találták, hogy a prolinkezelés eredményesebben indukálja az

antioxidáns védelmi rendszert, mint a glicinbetain (Hoque és mtsai, 2007). A NaCl és a PEG

egyaránt ozmotikus és oxidatív stresszt idéz elő a növényi szervezetben, továbbá a só és a

szárazság stressz jelátvitele nagyrészt azonos (Zhu, 2002), ezért feltételezhető, hogy a prolin

védő hatása nemcsak só, hanem szárazságstressz esetén is részben ilyen módon nyilvánul

meg.

A szárazság stressz egyaránt befolyásolja az antioxidáns védekező rendszert és a SA

szintet. A PEG O2 .−

, H2O2- és MDA-akkumulációt váltott ki uborkában (Fan és mtsai, 2014)

101

és búzában (Niedzwiedz-Siegien és mtsai, 2004). Ezek szignálmolekulaként is szerepet

játszanak szárazság stressz során, valamint indukálják az antioxidáns védelmet. Csírázást

követően 2-3 napos búza növények szárított hajtásaiban a GR aktivitása csak a kezelést

követő 0,5-1 órában nőtt, utána csökkenni kezdett, míg a KAT és a SOD aktivitása

folyamatosan emelkedett (Niedzwiedz-Siegien és mtsai, 2004). Marcińska és mtsai (2013)

leírták, hogy búzában a PEG-kezelés növelte a totál antioxidáns aktivitást fogékony fajtában,

valamint a prolintartalmat szárazsággal szemben fogékony és toleráns fajtákban egyaránt,

ezzel szemben a PEG+SA vagy PEG+ABA-kezelések nem befolyásolták ezeket a

paramétereket. A kísérleteink során az 5 napos PEG-kezelés után az aszkorbát-glutation

ciklus enzimei, különösen a MDHAR és a GR, fokozott működést mutattak a vizsgált

búzanövények levelében. Ennek jelentősége, hogy ez a ciklus védi a kloroplasztiszban

található fotoszintetikus rendszereket a szárazság stressz következményeként jelentkező ROS-

felhalmozódás káros hatásaitól (Bencze és mtsai, 2011). A MDHAR szignifikáns aktivitás-

növekedése alapján az APX aktivitásának szintén szignifikáns, emelt működését

feltételeznénk, hiszen a MDHAR regenerálja a MDHA-ot az APX számára hasznosítható

ASC-tá. A legtöbb genotípus esetén ezt is tapasztaltuk, azonban az Mv Hombár kezelt

növényeiben számottevő változás nem volt mérhető, ellenben ebben a búzafajtában volt a

legmagasabb a kiindulási APX-aktivitás. Ugyanezt figyeltük meg a GR esetében is. Az Mv

Hombáréhoz képest minden genotípus kiindulási GR aktivitása alacsonyabb volt és ezekben a

PEG-kezelés jelentősen indukálta ezt az enzimet. A kevésbé érzékeny Mv Hombár magasabb

kezdeti GR aktivitása a magasabb kiindulási GSSG-tartalommal magyarázható, melyet a Cd-

mal végzett kísérletek során is tapasztaltunk (Kovács és mtsai, 2014b). Ezt támasztja alá

Skladanka és mtsainak (2012) eredménye is, amely szerint a szárazság- és gombarezisztens

Festulolium arundinacea hibridje, a F. pabulare kontrollált körülmények között magasabb

GSSG tartalommal rendelkezett, mint az érzékenyebb F. braunii vagy Lolium perenne

fűfajok. Úgy tűnik, hogy a kloroplasztisz védelmében az MDHAR szerepe a legjelentősebb.

Hasonló eredményről számoltak be paradicsomon (Lycopersicon esculentum) és vad,

sótoleráns rokonán (Lycopersicon pennellii) végzett kísérletek során (Mittova és mtsai, 2000),

valamint rizsben is (Sharma és Dubey, 2005).

A gyökerek fokozott, PEG-indukálta GR-aktivitása összhangban volt a rendkívül

intenzív GST-működéssel. Ennek magyarázata, hogy a GR katalizálta reakcióban képződő

GSH szubsztrátként, illetve kofaktorként szolgál a GST számára, amely ez által képes

redukálni a stressz hatására képződő hidroperoxidokat (Ball és mtsai, 2004; Dixon és mtsai,

2010), valamint detoxifikálni egyes elektrofil vegyületeket, metabolitokat azok GSH-val

102

történő konjugálásán keresztül. Ezen kívül, a gyökerek ROS-okkal szembeni védelméhez

nagyban hozzájárul a KAT és kisebb mértékben az APX megnőtt aktivitása a kezelt

növényekben. Az eredményeink alapján elmondható, hogy a genotípusok közül a

szárazsággal szemben legkevésbé érzékeny búzafajtában, az Mv Hombárban volt

mérhető a legmagasabb APX és GR-aktivitás, melyet a szárazság tovább már nem

növelt, ugyanakkor a többi búzagenotípusban csak az antioxidáns enzimek aktivitása

alapján, nem lehetett egyértelműen meghatározni a szárazsággal szembeni toleranciájuk

mértékét. Az eredményeinket alátámasztják Bencze és mtsai (2011) által leírtak, amelyek

szerint a vizsgált búzafajták közül a legkevésbé, illetve leginkább szárazságtoleránsak

kizárólag az antioxidáns enzimaktivitás (APX, KAT, GR és GST) értékeik alapján is

elkülöníthetőek egymástól, azonban a többi fajta esetében nem lehet egyértelmű párhuzamot

vonni az enzimaktivitások szárazság stressz indukálta változásai, valamint a

szárazságtolerancia foka között. Rövid időtartamú szárazságstressznek kitett uborka növények

gyökerében szintén fokozott KAT-, POD-, APX- és SOD-működést mértek, ezzel ellentétben

viszont csökkent az antioxidáns vegyületek (ASC, GSH) mennyisége, valamint a GR-,

DHAR, MDHAR aktivitása, ami arra utalt, hogy a H2O2 és O2 .−

eltávolítását végző

enzimatikus tevékenység sokkal fontosabb szerepet játszik az uborkanövénykék gyökerének

védelmében, mint a nem-enzimatikus rendszer (Fan és mtsai, 2014).

Szárazságtoleráns őszi tritikáléban a fenolos vegyületek felhalmozódtak, míg az

érzékeny genotípusban mennyiségük csökkent (Hura és mtsai, 2009). Rizsben a PEG- és a

nitrogén-monoxid-kezelések egyaránt jelentős mértékben megemelték az oldható fenolok

teljes mennyiségét, valamint a bioszintézisükben szerepet játszó PAL aktivitását, melyet az

oxidatív stresszkörülmények indukáltak (Shehab és mtsai, 2010). A kísérlet során a PEG

hatására a szabad és kötött formájú SA-szintek jelentős mértékben nem változtak a négy

búzagenotípusban, és a kezelést követően nem mutattak egyértelmű genotípusos különbséget.

Ha a mért adatokat a minták friss tömege helyett azok száraz tömegére vonatkoztatva adjuk

meg, számolva a PEG-kezelés okozta vízvesztéssel, a szabad és kötött SA-tartalmak

kismértékű, de a legtöbb esetben nem szignifikáns csökkenést mutatnak, különösen a

gyökerekben, a legkisebb mértékű változást itt is az Mv Hombárban kaptuk, míg a

legnagyobbakat a Thatcher-alapú közel-izogén vonalaknál. Az eredményeink alapján úgy

tűnik, hogy a növényeknek az alkalmazott kezelés ellen nincs szükségük több SA-ra, azt

a PEG-kezelés alatt egy adott értéknél limitálja. Ennek hátterében a szárazságstressz

elleni védelemben szerepet játszó egyéb mechanizmusok állhatnak, mint például az

ABA-függő folyamatok (Barnabás és mtsai, 2008; Liu és mtsai, 2006; Parent és mtsai,

103

2009), amelyek viszont magasabb SA-szintnél már gátolódhatnak a két vegyület

antagonizmusa miatt (Marcińska és mtsai, 2013; Meguro és Sato, 2014). A gyökerek

stressz hatására változó kötött SA-tartalma azonban szoros kapcsolatban állt a glutation és

prekurzorainak (cisztein, γ-EC) PEG hatására mutatott szignifikáns mennyiségi

növekedésével (Kovács és mtsai, 2014c), továbbá a GR és a GST enzimek fokozott

aktivitásával, ami arra utal, hogy a SA a gyökerekben a tiolvegyületeken keresztül fejtette ki

védő hatását a szárazságstresszel szemben, melyet kiegészített a serkentett, KAT általi H2O2-

elimináció. Viszont, ha figyelembe vesszük a PEG-kezelés okozta vízvesztést és korrigáljuk

az adatokat, akkor, amíg a gyökerekben az antioxidáns enzimek aktivitása és a kötött SA

mennyisége a kezelés hatására csökkenő tendenciát mutatott, addig a tiolok mennyisége

szignifikánsan megemelkedett, vagyis a tiolok mennyiségi változásaiért csak részben felelős a

SA. A gyökerekkel ellentétben, a levelekben viszont a tiolok szerepe csökkent, melyet a PEG

hatására nem fokozódó, sőt inkább csökkenő GST-aktivitás mutat, a KAT szerepét pedig nagy

részben átvették a peroxidázok (G-POD, APX) valamint a MDHAR. A levélben

megfigyelhető PEG-okozta megnövekedett MDHAR-aktivitás szoros összefüggésben állt a

levelek megemelt prolintartalmával, ami viszont az általunk elvégzett kísérletben nem állt

összefüggésben a SA-tartalommal, bár ennek ellenkezőjéről korábban már beszámoltak.

Misra és Saxena (2009) leírták, hogy 0,5 mM exogén SA serkentette a prolinszintézist a 100

mM NaCl-dal kezelt lencsenövényekben a prolin metabolizmus jelentős befolyásolása által (a

bioszintézisét fokozta, ugyanakkor a lebontását gátolta), és hatása erőteljesebb volt, mint a

NaCl-kezelésnek önmagában. Továbbá azt is megállapították, hogy az exogén SA és a NaCl

hatása összeadódik és az általuk közösen kiváltott nagymértékű prolin-felhalmozódás a

sztóma zárósejtek turgorának fenntartásához vezet, amely segíti a sóstresszel, ozmotikus

stresszel szembeni védelmet. Az intenzív prolintermelés ezen kívül biztosítja a megfelelő

NADPH-szintet többek között a GR és az MDHAR működéséhez is, vagyis az antioxidáns

enzimek támogatásán keresztül aktiválja a védekező rendszer egyéb elemeit is (Ashraf és

Foolad, 2007; Xu és mtsai, 2009). A prolin- és SA-tartalom közötti kapcsolatban megfigyelt

ellentmondás a SA és az ABA antagonizmusával magyarázható, hiszen a prolin-akkumulációt

az ABA-függő és ABA-független, esetünkben SA-függő jelátviteli utak egyaránt mediálhatják

(Zhu, 2001; 2002).

Habár az exogén SA által abiotikus stressz során indukált védekező folyamatokról

(Alavi és mtsai, 2014; Hussain és mtsai, 2010; Misra és Saxena, 2009), valamint az endogén

SA biotikus stressz alatt játszott védő szerepéről számos esetben beszámoltak (Conrath, 2011;

Rivas-San Vicente és Plasencia, 2011; Spoel és Dong, 2012), ugyanakkor az endogén SA

104

maga is stresszor lehet a növény számára. Arabidopsis thaliana vad típusú Col-O és SA-

hiányos NahG mutánsának vizsgálatakor kiderült, hogy az endogén SA ROS-t generál a

fotoszintetikus szövetekben só- és ozmotikus stressz alatt (Borsani és mtsai, 2001), ami

oxidatív stresszt vált ki. Ezt a gondolatmenetet követve az eredményeink arra is utalhatnak,

hogy az endogén SA kiindulási szintje búzában is kifejthet stresszhatást, melyet a növény a

fokozott prolintermelésen keresztül az antioxidáns rendszer aktiválásával kompenzál

szárazság stressz esetén. A MDHAR és a GR egyaránt NADPH-t igényel a működéséhez,

emiatt egymás versenytársai a redukáló erőért. A SA-ról Cd-stressz esetén is bebizonyosodott,

hogy pozitív kapcsolatban van a tiolvegyületekkel, amelyek védik a növény a Cd káros

hatásaitól, vagyis a védekező rendszer kulcsfontosságú tagjai (Ball és mtsai, 2004; Kovács és

mtsai, 2014b). Szárazság stressz során a tiolok védelemben betöltött szerepe szintén rendkívül

jelentős (Shehab és mtsai, 2010), vagyis a bioszintézisüket indukáló SA védő hatása is

szükséges ezzel a stresszel szemben. A túlságosan magas SA-szint viszont már károsíthatja a

növényt, ezért a növény csökkenti a SA-mennyiségét, a felesleg káros hatása ellen pedig

védekezésképpen prolint szintetizál, ami indukálja a MDHAR-t. Ennek az elméletnek az

igazolásához viszont nincs elegendő bizonyítékunk, valamint nem a legmagasabb kezdeti SA-

tartalmú búzavonal, a TC19, esetén mértük a legnagyobb PEG-indukált prolinszintet, ezért

további vizsgálatok elvégzése szükséges. Valószínűbbnek látszik az a feltételezés, miszerint

az általunk vizsgált négy búza genotípusban a szárazságstressz káros hatásainak

csökkentése érdekében nem a SA-függő folyamatok dominálnak, ugyanakkor azok

hatása csak részben tér el a SA-étól.

Bár a magasabb kezdeti SA-szinttel rendelkező genotípusok közöl a TC33

szárazsággal szemben érzékenyebbnek bizonyult, az alacsonyabb SA-szintűek közül

pedig az Mv Hombár ellenállóbbnak, a kezelésre adott válaszok jellege általános, nem

mutatott genotípusok közötti eltérést, nem volt egyértelmű összefüggésben a

toleranciafokkal. Hasonló eredményeket kaptunk rizsben is (Pál és mtsai, 2014).

Érdekesség, hogy a TC33 az eddigi eredmények alapján nemcsak a szárazsággal,

hanem a Cd-mal és a lisztharmattal szemben is érzékenyebbnek látszott a többi vizsgált

genotípusnál, az Mv Hombár viszont ellenállóbbnak. Hasonló összefüggésről számoltak be

Sgherri és mtsai (2001), akik szerint a Triticum durum szárazsággal szemben ellenállóbb

fajtája toleránsabbnak bizonyult Cu-zel szemben, mint a szárazságra érzékenyebb fajta.

Lehetséges volna, hogy a fokozott szenzitivitás hátterében a magasabb alap SA-szint áll, vagy

105

a túlzott érzékenység idéz elő megemelkedett SA-szintet? Ezek megválaszolása további

vizsgálatokat igényel.

6.3.3. Az UV-B sugárzás hatásai Cd- vagy PEG-kezelt búzában

A korábbi kísérleteinket kiegészítve harmadik abiotikus stresszorként vizsgáltuk az

UV-B sugárzásra adott válaszokat egy martonvásári nemesítésű búzafajtán, az Mv Emesén,

amely tulajdonságaiban rendkívül hasonlít az Mv Hombárhoz. Számos esetben írtak a

kiegészítő és környezeti UV-B sugárzás növényi növekedésre, anyagcserére, morfológiai,

élettani és biokémiai változásaira kifejtett közvetett és közvetlen hatásairól a különböző

növényfajokban (Alexieva és mtsai, 2001, 2003; Bieza és Lois, 2001; He és mtsai, 2011;

Mishra és Agrawal, 2006; Solovchenko és Merzlyak, 2008; Xu és Sullivan, 2010; Zlatev és

mtsai, 2012). Az UV-B stressz és más stresszfaktorok közötti kölcsönhatás vizsgálata segíthet

a növények változó környezeti feltételekhez való alkalmazkodásának megértésében. Ennek a

kísérletnek a fő célja az volt, hogy felfedjük, hogyan befolyásolja a folyamatos UV-B

sugárzás, növeli-e vagy csökkenti a Cd- vagy a szárazság stressz hatását, továbbá vizsgáljuk a

SA, mint szignál molekula, szintézisének és anyagcsere változásainak feltételezett szerepét,

mely szerepet játszhat a különböző stresszorokkal szembeni akklimációs folyamatokban.

Másfelől arra is kerestük a választ, hogy az UV-B sugárzás hogyan befolyásol bizonyos SA-

val kapcsolatos stresszválaszokat, amelyek fontosak lehetnek a szárazság vagy Cd-kezeléssel

szembeni védekezési mechanizmusokban, búza növényekben. Mindamellett az UV-B

sugárzás szárazsággal vagy Cd-mal kombinált, a SA szintézisére és mennyiségére kifejtett

hatásairól, ugyanolyan kísérleti feltételek mellett nevelt búza növényekben, még nem

számoltak be.

A klorofill- és prolintartalom változásait is leírták az egyedüli UV-B-re, illetve

kombinált UV-B és nehézfém- vagy szárazság stresszre adott válaszként számos

növényfajban, de az UV-B hatása függ annak időtartamától és intenzitásától, továbbá az

alkalmazott stressz-faktorok sorrendje is befolyásolhatja az eredményeket (Alexieva és mtsai,

2003; Mishra és Agrawal, 2006; Singh és mtsai, 2009). Ebben a kísérletben a kiegészítő UV-

B sugárzás alatt nevelt növényekben retardált növekedés volt megfigyelhető és a Cd fokozott

oxidatív stresszt eredményezett, amely a leveleken, különösen a levélcsúcsokon, kifejezett

sárguló területek formájában nyilvánult meg, mialatt az UV-B előkezelés vagy edzés

enyhítette a PEG-kezelés által fokozott hervadást. A Cd-kezelés egyedül, valamint UV-B-vel

együtt jelentősen csökkentette a totál klorofill-tartalmat, míg a prolinszint szignifikáns

106

növekedést csak a PEG-kezelés után mutatott normál és UV-B-vel kiegészített normál fényen

egyaránt. A Cd- és PEG-kezelések, valamint az UV-B stressz önmagában jelentősen növelte a

levelek lipidperoxidációját, a gyökérben viszont csak a kombinált kezelések (UV+Cd, illetve

UV+PEG) eredményeztek MDA-szint emelkedést. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy

mind a Cd, mind a PEG, mind pedig az UV-B-kezelés károsodást idézhetnek elő a búza

növényekben, de a hatásmechanizmusuk eltérő (Kovács és mtsai, 2014a).

A SA abiotikus stresszkörülmények közötti hatásmechanizmusával kapcsolatban

ellentmondásos eredményekről számoltak be, mint például a Cd-kezelés okozta SA-

felhalmozódásról (Metwally és mtsai, 2003; Pál és mtsai, 2005), az exogén SA-kezelés

nehézfémekkel szembeni jótékony hatásáról (Krantev és mtsai, 2008; Popova és mtsai, 2009),

ugyanakkor az általa kiváltott oxidatív stressz kialakulásáról, illetve gyökérzet-károsításáról

(Pál és mtsai, 2002). Ebben a munkában, a levelekben és gyökerekben mért totál SA-tartalom

változásai hasonló mintázatot mutattak, és összességében elmondható, hogy Cd-nak nagyobb

hatása volt a SA-szintre, mint a PEG-nek vagy az UV-B-nek önmagában, továbbá az UV-B

nem tudta tovább fokozni a Cd-indukált SA-felhalmozódást. Az UV-B sokkal hatásosabban

tudta emelni az SA-tartalmat, mint a PEG-kezelés, de e két kezelés kombinálása hasonló

emelkedést okozott, mint az egyedüli UV-B. Ezekkel ellentétben, az UV-B sugárzás egyedül

nagyobb levél oHCA-tartalom növekedést okozott, mint a Cd-kezelés magában, miközben a

kombinált UV+Cd-kezelés nem emelte statisztikusan szignifikánsan a Cd hatásait.

Érdekesség, hogy bár a PEG-kezelésnek önmagában, a levélben, nem volt hatása a totál

oHCA-tartalomra, a kombinált UV+PEG annak fokozódását eredményezte, de ennek értéke

még mindig elmarad az UV-B-indukálttól. Másfelől, a gyökérben az UV+PEG-kezelés

bizonyult a leghatásosabbnak, mivel a legmagasabb kötött oHCA-akkumulációt

eredményezte. Korábban, ezekhez hasonlóan, kukorica növénykék leveleiben Cd stressz által

kiváltott endogén SA-szintnövekedést találtak, amely összefüggésbe hozható a Cd-kezelt

növények levelében megfigyelt oxidatív stresszel, továbbá a fenolvegyületek között a

legmagasabb akkumulációt a kötött oHCA esetében találták (Pál és mtsai, 2005).

Az endogén SA-tartalom szárazságstressz alatti változásait számos esetben leírták

(Abreu és Munné-Bosch, 2008; Bandurska és Stroinski, 2005), ebben a kísérletben úgy

találtuk, hogy a PEG-kezelés csak a gyökerekben indukálta a fenolvegyületek

felhalmozódását, a levelekben nem, de UV-B sugárzással együtt mind a levelek, mind a

gyökerek SA- és oHCA-szintje szignifikánsan megnőtt. Árpa növények levelében és

gyökerében az összes SA mennyiségének megemelkedését is leírák, amikor a

szárazságstresszt UV-B sugárzás előzte meg (Bandurska és Cie’slak, 2013). A megnőtt SA-

107

tartalom lehet a felelős az UV-B hervadást csillapító hatásáért, amit önmagában a PEG-

kezelés okoz. Ez a megfigyelés összhangban van egy nemrégiben készült tanulmánnyal, ahol

az Arabidopsis SUMO E3 ligázát kódoló SIZ1 gén hiányáról számoltak be, amely csökkent

sztómanyílást és erősebb szárazság toleranciát okozott a SA-indukálta ROS-felhalmozódás

szabályozásán keresztül (Miura és mtsai, 2013). Mivel a sztómanyílás irányítása fontos a

vízhasználat hatékonysága és szabályozása számára, valamint válasz a szárazságra, az UV-B

stressz-indukálta SA-akkumulációnak lehet pozitív hatása a PEG-kezelt növényekben. A SA

turgorfenntartásban betöltött közvetett vagy közvetlen szerepét a korábbi kísérletek

eredményei is megerősítették (lásd a 6.3.2. fejezetben). Ezek szerint kapcsolat van a

sztómanyílás szabályozásában szerepet játszó prolin fokozott akkumulációja és a

megváltozott SA-szintek között (Kovács és mtsai, 2014c). Továbbá, amióta kimutatták, hogy

az oHCA antioxidáns tulajdonságú (Foley és mtsai, 1999), az eredmények alapján

feltételezhető, hogy az oHCA-tartalom növekedése a SA-bioszintézistől független is lehet

és szerepet játszhat a Cd-ra, szárazságra és UV-B stresszre adott antioxidatív válaszban.

A PAL-aktivitást, mely egy kritikus enzim a növények metabolizmusában, a

ligninek, flavonoidok, antocianinok és egyszerű fenolsavak szintézisében (Li és mtsai, 2014),

stimulálta az UV-B sugárzás (Jóźwiak-Żurek és mtsai, 2011), a Cd stressz (Pawlak-Sprada és

mtsai, 2011) vagy a PEG-kezelés (Shehab és mtsai, 2010). Érdekesség, hogy míg a PAL-

aktivitás a levelekben kisebb változásokat mutatott, addig a gyökerekben minden kezelés meg

tudta emelni azt, különösen a PEG, UV-B és UV+PEG esetében, bár a kombinált kezelések

összeadódott hatása nem volt megfigyelhető. Ezek az eredmények összhangban vannak a SA

és az oHCA változásaival a gyökérben, de a Cd-kezelt növények levelében mért magasabb

SA- és oHCA-tartalmakat, az UV-B vagy PEG-kezelt növényekhez viszonyítva, nem kísérte

magasabb PAL-aktivitás, amely nem tudta megmagyarázni ezeket a különbségeket. Árpában

azt találták, hogy a szárazság vagy UV-B által indukált SA-akkumulációt fokozott PAL és

benzoesav-hidroxiláz enzimaktivitás kísérte (Bandurska és Cie’slak, 2013). Ráadásul a

stresszindukálta SA- és oHCA-tartalmak változásainak hasonló mintázata alapján

feltételezhető, hogy a SA az oHCA-n keresztül játszhat meghatározó szerepet, hasonlóan a

rizsben találtakhoz (Pál és mtsai, 2013a).

Ebben a munkában az alkalmazott kezelések különböző mértékben aktiváltak több, a

növények akklimációjában szerepet játszó rendszert, úgymint az antioxidáns enzimeket és a

fenilpropanoid útvonalat. A vizsgált növényi részek, a levelek és a gyökerek, eltérően

reagáltak. Az UV-B és a Cd összeadódott hatása megnövekedett GR és APX aktivitást és

gyökérpoliamin-szintet eredményezett (Kovács és mtsai, 2014a), amely összefüggésben állhat

108

a gyökerek fenolos vegyületeinek megemelkedett szintjével és megnyilvánult az UV-B

sugárzás Cd-kezelt növényekre gyakorolt negatív hatásaként. A kiegészítő UV-B-t és Cd-ot

kombináló kezelések sokkal hangsúlyosabb változásokat eredményeztek az antioxidáns

enzimaktivitásokban és az antioxidáns vegyületek mennyiségében borsóban (Agrawal és

mtsai, 2009). Az UV-B és PEG-kezelés kombinációja nem fejtett ki összeadódott hatást az

antioxidáns enzimek aktivitására, jelezve, hogy bár mind az UV-B, mind a PEG indukálja a

stresszt, kombinációjuk nem tudott megnövekedett károsodást okozni a búza növényekben.

Úgy találták, hogy az exogén SA-kezelés késlelteti a levélcsavarodást az antioxidáns enzimek

indukálása és az ozmoprotektánsok modulálása révén PEG-indukálta ozmotikus stressz során

(Demiralay és mtsai, 2013; Marcińska és mtsai, 2013). Azonban, ebben a kísérletben az

antioxidáns védekezési mechanizmusok nem álltak kapcsolatban a fenolvegyületek

szintjeiben megfigyelt változásokkal. Hasonlóan a mostani eredményekhez, néhány esetben

az UV-B sugárzásnak nehézfém vagy szárazság stresszel együtt lehet szinergista vagy

antagonista hatása az antioxidáns rendszerre (Alexieva és mtsai, 2003; Mishra és Agrawal,

2006), alapvetően az alkalmazott UV-B-kezelés módszerétől, körülményeitől és intenzitásától

függően.

Összefoglalásként elmondható, hogy az UV-B sugárzásnak pozitív és negatív

hatásai egyaránt vannak azonos körülmények között nevelt búza növényekben a

másodlagos, abiotikus stresszfaktortól függően. A tapasztalt védő vagy károsító hatások

kapcsolatban állhatnak a fenol vegyületek mennyiségében megfigyelt változásokkal. A

SA különböző szerepe és hatásmechanizmusa magyarázhatja a különböző mértékben

megnövekedett SA-szinteket a Cd- vagy PEG-kezelés esetében az UV-B-vel kiegészített

normál fényen nevelt növényekben. Az UV-B sugárzás alatt alkalmazott PEG-kezelés nem

okozott hervadást, és ez feltételezhetően a sokkal kifejezettebb SA-felhalmozódásnak volt

köszönhető, amely a kombinált kezelés során védelmet nyújthat a szárazságstresszel szemben

búzanövényekben. Ezekkel ellentétben, a Cd-kezelt növényekben a drámai SA-akkumuláció,

melyet az UV-B tovább már nem növelt, kifejezett oxidatív stresszt eredményezett és

aktiválta az antioxidáns rendszert, illetve más védő vegyületeket, mint amilyenek a

poliaminok is (Kovács és mtsai, 2014a). Bár a gyökér PAL aktivitásának változásait követik a

gyökér oHCA- és SA-szintjeinek változásai, azok mennyisége a levelekben annak ellenére is

növekszik, hogy a levél fokozott PAL-aktivitása hiányzik.

109

7. ÖSSZEFOGLALÁS

♦ Munkánk során számos martonvásári nemesítésű búzafajta és Thatcher-alapú közel-izogén

búzavonal alap és biotikus stressz által indukált SA- és PA-szintje lett meghatározva

szántóföldi körülmények között, mely a jövőbeni kutatások számára szolgálhat

információval.

♦ Az eredményeink alapján elmondható, hogy a vizsgált búzagenotípusokban a SA

mennyisége minden általunk alkalmazott kezelés hatására megváltozott: UV-B sugárzás,

Cd-stressz illetve felnőttkori biotikus stresszek hatására megnőtt, utóbbi két esetben

erőteljesebben, míg szárazságstressz, továbbá fiatalkori lisztharmatfertőzés hatására alig

változott vagy csökkent a SA-szint.

♦ Bár a SA részt vesz a búza növényeket érő különböző stresszek elleni védelemben, a

kiindulási mennyisége vagy stresszindukált változásai nincsenek kapcsolatban a növények

adott stresszel szembeni toleranciájának fokával.

♦ A TC33 Thatcher-alapú közel-izogén vonalról megállapítottuk, hogy magas kiindulási

endogén SA-tartalommal rendelkezik, továbbá minden alkalmazott kezelésre érzékenyen

reagál. Utóbbi miatt a búzafajták rezisztenciájának fokozását célzó nemesítési munkák

számára nem javasolt, mint lehetséges keresztezési partner, ugyanakkor a stresszekre való

fogékonysága és az egyéb búza genotípusokhoz képes magas alap SA-szintje közötti ok-

okozati viszony feltárásához további vizsgálatok szükségesek, melyekhez ideális

modellnövény lehet.

♦ Azt is megfigyeltük, hogy a vizsgált genotípusokban minden alkalmazott kezelés hatására,

a károsodás/károsítás mértékének mérséklése érdekében, aktiválódott az antioxidáns

védekező rendszer, melynek stresszekre adott válaszainak jellege általánosnak tekinthető,

nem mutatott egyértelmű genotípusfüggést. Kivételt képzett az Mv Hombár, amelynek

magasabb kezdeti antioxidáns enzimaktivitása magasabb szárazság-toleranciával párosult.

♦ A SA a lisztharmatfertőzött, a Cd-, illetve PEG-kezelt növényekben az antioxidáns

rendszer, így például a GR és GST enzimek serkentett működésén keresztül fejti ki védő

hatását, ugyanakkor a szárazságstressz során a SA-on kívül más vegyületek is

befolyásolhatják ezen antioxidáns enzimek aktivitását.

♦ A SA bioszintézise abiotikus stresszek során nagy valószínűséggel a fenilpropanoid

útvonalon keresztül történik, a sikiminsav útvonal szerepe ezekben a kísérletekben, a

mintaszedés idején elhanyagolható volt.

110

♦ A fenilpropanoid útvonal abiotikus stresszkörülmények közötti jelentősége más védő

vegyületek fokozott szintézise miatt is fontos, erre bizonyíték például az UV-B

sugárzásnak kitett fiatal búza növények antociános elszíneződése is, ezért elképzelhető,

hogy emiatt szerepe fontosabb volt a kísérleteink során, mint a sikiminsav útvonalé.

♦ Az UV-B sugárzás általunk alkalmazott dózisa és ideje jótékony, ún. eustressznek vagy

edzésnek minősült, és habár gátolta a búza növénykék növekedését és fejlődését,

ugyanakkor enyhítette a szárazság stressz hatásait, ezzel szemben viszont fokozta a Cd

által okozott károsodás mértékét.

111

8. SUMMARY

♦ In the course of the work the initial and biotic stress-induced levels of endogenous SA and

PA in numerous Martonvásár-bred wheat cultivars and near-isogenic lines of Thatcher

were determined under field and greenhouse conditions, providing information that could

be useful in future research.

♦ The results indicated that the SA quantity changed in response to all the treatments applied,

rising in the case of UV-B radiation, Cd stress and biotic stressing in the adult stage,

especially for the two latter, and exhibiting little change or decreasing in the case of

drought stress and powdery mildew infection in young plants.

♦ Although SA is involved in the protection of wheat plants from various stress factors,

neither the initial level of SA nor the changes induced by stress were related to the extent

of tolerance exhibited by plants to a given stress.

♦ The near-isogenic Thatcher line TC33 was found to respond sensitively to all the

treatments applied. It is therefore not recommended for use as a crossing partner when

breeding for enhanced resistance. However, it could be an ideal model plant for further

studies aimed at revealing a possible cause and effect relationship between its

susceptibility to stress and the fact that it has a higher initial SA level than the other wheat

genotypes.

♦ It was also observed that all the treatments applied to the test genotypes resulted in the

activation of the antioxidant defence system to diminish the extent of damage. However,

this could be regarded as a general stress response, as it did not exhibit any clear

dependence on genotype. The only exception was Mv Hombár, where higher initial

antioxidant enzyme activity was associated with better drought tolerance.

♦ In plants infected with powdery mildew or treated with Cd or PEG, SA exerts its protective

effect via the antioxidant system, e.g. through the enhanced functioning of the GR and

GST enzymes, while in the case of drought stress the activity of these antioxidant enzymes

may also be influenced by compounds other than SA.

♦ It appears extremely likely that the biosynthesis of SA follows the phenylpropanoid

pathway in the case of abiotic stress effects, while the role of the shikimic acid pathway

was negligible at the sampling times used in the present experiments.

♦ The significance of the phenylpropanoid pathway under abiotic stress conditions is

enhanced by the greater synthesis of other protective compounds, as proved by the

112

anthocyanin pigmentation of young wheat plants exposed to UV-B radiation, so this could

be why it played a more important role than the shikimic acid pathway in the present work.

♦ The UV-B dose and exposure time used in these experiments proved to have a beneficial

(eustress) or hardening effect, and although it inhibited the growth and development of the

wheat seedlings, it mitigated the effects of drought stress. On the other hand, it increased

the level of damage caused by Cd.

113

9. FELHASZNÁLT IRODALOM

Abreu, M.E., Munné-Bosch, S. (2008). Salicylic acid may be involved in the regulation of

drought-induced leaf senescence in perennials: A case study in field-grown Salvia

officinalis L. plants. Environmental and Experimental Botany, 64, 105-112.

Ádám, A.L., Bestwick, C.S., Barna, B., Mansfield, J.W. (1995). Enzymes regulating the

accumulation of active oxygen species during the hypersensitive reaction of bean to

Pseudomonas syringae pv. phaseolicola. Planta, 197, 240-249.

Adir, N., Zer, H., Shochat, S., Ohad, I. (2003). Photoinhibition – a historical perspective.

Photosynthesis Research, 76, 343-370.

Agrawal, S.B., Singh, S., Agrawal, M. (2009). Ultraviolet-B induced changes in gene

expression and antioxidants in plants. Advances in Botanical Research, 52, 47-86.

Akbari, M., Baradaran Firouzabadi, M., Asghari, H., Farrokhi, N., Ghorbani, H. (2013).

Complimentary response of salicyclic acid and cadmium on growth and yield traits of

soybean. International Journal of Agronomy and Plant Production, 4, 1684-1696.

Alavi, S.M.N., Arvin, M.J., Kalantari, K.M. (2014). Salicylic acid and nitric oxide alleviate

osmotic stress in wheat (Triticum aestivum L.) seedlings. Journal of Plant Interactions,

9, 683-688.

Alexieva, V., Sergiev, I., Mapelli, S.,Karanov, E. (2001). The effect of drought and ultraviolet

radiation on growth and stress markers in pea and wheat. Plant, Cell and Environment,

24, 1337-1344.

Alexieva, V., Ivanov, S., Sergiev, I., Karanov, E. (2003). Interaction between stresses.

Bulgarian Journal of Plant Physiology, Special Issue, 1-17.

An, L., Feng, H., Tang, X., Wang, X. (2000). Changes of microsomal membrane properties in

spring wheat leaves (Triticum aestivum L.) exposed to enhanced ultraviolet-B

radiation. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology, 57, 60–65.

Anfoka, G.H. (2000). Benzo-(1,2,3)-thiadiazole-7-carbothioic acid S-methyl ester induces

systemic resistance in tomato (Lycopersicon esculentum. Mill cv. Vollendung) to

Cucumber mosaic virus. Crop Protection, 19, 401-405.

Anjana, G., Kini, K.R., Shetty, H.S., Prakash, H.S. (2007). Differential expression of

sunflower peroxidase isoforms and transcripts during necrotrophic interaction with

Alternaria helianthi. Russian Journal of Plant Physiology, 54, 513–517.

114

Anjum, S.A., Farooq, M., Xie, X.Y., Liu, X.J., Ijaz, M.F. (2012). Antioxidant defense system

and proline accumulation enables hot pepper to perform better under drought. Scientia

Horticulturae, 140, 66–73.

Apel, K., Hirt, H. (2004). REACTIVE OXYGEN SPECIES: Metabolism, oxidative stress,

and signal transduction. Annual Review of Plant Biology, 55, 373-399.

Arora, A., Byrem, T.M., Nair, M.G., Strasburg, G.M. (2000). Modulation of liposomal

membrane fluidity by flavonoids and isoflavonoids. Archives of Biochemistry and

Biophysics, 373, 102–109.

Asada, K. (2006). Production and scavenging of reactive oxygen species in chloroplasts and

their functions. Plant Physiology, 141, 391–396.

Ashraf, M., Foolad, M.R. (2007). Roles of glycine betaine and proline in improving plant

abiotic stress resistance. Environmental and Experimental Botany, 59, 206-216.

Ashry, N.A., Mohamed, H.I. (2011). Impact of secondary metabolites and related enzymes in

flax resistance and or susceptibility to powdery mildew. World Journal of Agricultural

Sciences, 7, 78-85.

Asthir, B., Koundal, A., Bains, N. S. (2009). Kinetic and thermodynamic behaviour of wall-

bound peroxidase from wheat leaves infected with stripe rust. Plant Growth

Regulation, 59, 117–124.

Asthir, B., Koundal, A., Bains, N.S., Mann, S.K. (2010). Stimulation of antioxidative

enzymes and polyamines during stripe rust disease of wheat. Biologia Plantarum, 54,

329–333.

Baga, M., Chibbar, R.N., Kartha, K.K. (1995). Molecular cloning and expression analysis of

peroxidase genes from wheat. Plant Molecular Biology, 29, 647–662.

Bakirdere, S.,Yaman, M. (2008). Determination of lead, cadmium and copper in roadside soil

and plants in Elazig, Turkey. Environmental Monitoring and Assessment, 136, 401–

410.

Ball, L., Accotto, G.P., Bechtold, U., Creissen, G., Funck, D., Jimenez, A., Kular, B.,

Leyland, N., Mejia-Carranza, J., Reynolds, H., Karpinski, S., Mullineaux, P.M.

(2004). Evidence for a direct link between glutathione biosynthesis and stress defense

gene expression in Arabidopsis. The Plant Cell, 16, 2448–246.

Bandurska, H., Cie´slak, M. (2013). The interactive effect of water deficit and UV-B radiation

on salicylic acid accumulation in barley roots and leaves. Environmental and

Experimental Botany, 94, 9– 18.

115

Bandurska, H., Stroinski, A. (2005). The effect of salicylic acid on barley response to water

deficit. Acta Physiologiae Plantarum, 27, 379-386.

Barnabás, B., Jäger, K., Fehér, A. (2008). The effect of drought and heat stress on

reproductive processes in cereals. Plant, Cell and Environment, 31, 11–38.

Bartsch, M., Gobbato, E., Bednarek, P., Debey, S., Schultze, J.L., Bautor, J., Parker, J.E.

(2006). Salicylic acid–independent ENHANCED DISEASE SUSCEPTIBILITY1

signaling in Arabidopsis immunity and cell death is regulated by the monooxygenase

FMO1 and the nudix hydrolase NUDT7. The Plant Cell, 18, 1038-1051.

Bates, L.S., Waldren, R.P.,Teare, I.D. (1973). Rapid determination of free proline for water-

stress studies. Plant and Soil, 39, 205–207.

Beaudette, P.C., Chlup, M., Yee, J., Emery, R.J.N. (2007). Relationships of root conductivity

and aquaporin gene expression in Pisum sativum: diurnal patterns and the response to

HgCl2 and ABA. Journal of Experimental Botany, 58, 1291–1300.

Beckers, G.M, Spoel, S.H. (2006). Fine-tuning plant defense signaling: salicylate versus

jasmonate. Plant Biology, 8, 1-10.

Belkadhi, A., De Haro, A., Soengas, P., Obregon, S., Cartea, M.E., Chaibi, W., Djebali, W.

(2014). Salicylic acid increases tolerance to oxidative stress induced by hydrogen

peroxide accumulation in leaves of cadmium-exposed flax (Linum usitatissimum L.).

Journal of Plant Interactions, 9, 647–654.

Benavides, M.P., Gallego, S.M., Tomaro, M.L. (2005). Cadmium toxicity in plants. Brazilian

Journal of Plant Physiology, 17, 21-34.

Bencze, S., Bamberger, Z., Janda, T., Balla, K., Bedő, Z., Veisz, O. (2011). Drought tolerance

in cereals in terms of water retention, photosynthesis and antioxidant enzyme

activities. Central European Journal of Biology, 6, 376–387.

Bieza, K., Lois, R. (2001). An Arabidopsis mutant tolerant to lethal ultraviolet-B levels shows

constitutively elevated accumulation of flavonoids and other phenolics. Plant

Physiology, 126, 1105–1115.

Blokhina, O., Virolainen, E., Fagerstedt, K.V. (2003). Antioxidants, oxidative damage and

oxygen deprivation stress: a review. Annals of Botany, 91, 179-194.

Bogdan, J., Zagdańska, B. (2006). Changes in the pool of soluble sugars induced by

dehydration at the heterotrophic phase of growth of wheat seedlings. Plant Physiology

and Biochemistry, 44, 787-794.

116

Borsani, O., Valpuesta, V., Botella, M.A. (2001). Evidence for a role of salicylic acid in the

oxidative damage generated by NaCl and osmotic stress in Arabidopsis seedlings.

Plant Physiology, 126, 1024-1030.

Bowler, C., Van Camp, W., Van Montagu, M., Inzé, D., Asada, K. (1994). Superoxide

dismutase in plants. Critical Reviews in Plant Sciences, 13, 199-218.

Bradford, M.M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantification of microgram

quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical

Biochemistry, 72, 248–254.

Çakirlar, H., Çiçek, N., Ekmekçi, Y. (2011). Is the induction of H2O2-detoxifying antioxidant

enzyme activities sufficient to protect barley cultivars from oxidative stress by UV-B

irradiation alone or pretreatment with high temperature and NaCl? Turkish Journal of

Biology, 35, 59-68.

Cameron, R.K., Paiva, N.L., Lamb, C.J., Dixon, R.A. (1999). Accumulation of salicylic acid

and PR-1 gene transcripts in relation to the systemic acquired resistance (SAR)

response induced by Pseudomonas syringae pv. tomato in Arabidopsis. Physiological

and Molecular Plant Pathology, 55, 121–130.

Çanakci, S., Karaboğa, Z. (2013). Some physiological and bichemical responses to cadmium

in salicylic acid applied cucumber (Cucumis sativus L.) seedlings. Pakistan Journal of

Botany, 45, 1963-1968.

Carr, J.P., Murphy, A.M. (2002). Cadmium blocks viral invasion in plants. Nature Cell

Biology, 4, E167 - E168.

Catinot, J., Buchala, A., Abou-Mansour, E., Métraux, J.P. (2008). Salicylic acid production in

response to biotic and abiotic stress depends on isochorismate in Nicotiana

benthamiana. FEBS Letters, 582, 473–478.

Caverzan, A., Passaia, G., Rosa, S.B., Ribeiro, C.W., Lazzarotto, F., Margis-Pinheiro, M.

(2012). Plant responses to stresses: Role of ascorbate peroxidase in the antioxidant

protection. Genetics and Molecular Biology, 35, 1011-1019.

Chao, Y.Y, Chen, C.Y, Huang, W.D, Kao, C.H. (2010). Salicylic acid-mediated hydrogen

peroxide accumulation and protection against Cd toxicity in rice leaves. Plant and Soil,

329, 327-337.

Chaturvedi, R., Shah, J. (2007). Salicylic acid in plant disease resistance. In: Hayat, S.,

Ahmad, A. (eds.), Salicylic Acid: A Plant Hormone. Springer, Dordrecht, The

Netherlands, pp. 335–370.

117

Chaves, M.M., Maroco, J.P., Pereira, J.S. (2003). Understanding plant response to drought:

from genes to the whole plant. Functional Plant Biology, 30, 239-264.

Chen, Z., Gallie, D.R. (2006). Dehydroascorbate reductase affects leaf growth, development,

and function. Plant Physiology, 142, 775–787.

Chen, Z., Zheng, Z., Huang, J., Lai, Z., Fan, B. (2009). Biosynthesis of salicylic acid in

plants. Plant Signaling & Behavior, 4, 493-496.

Chong, J., Pierrel, M.A., Atanassova, R., Werck-Reichhart, D., Fritig, B., Saindrenan, P.

(2001). Free and conjugated benzoic acid in tobacco plants and cell cultures. Induced

accumulation upon elicitation of defence responses and role as salicylic acid

precursors. Plant Physiology, 125, 318-328.

Choudhury, S., Panda, S.K. (2004). Role of salicylic acid in regulating cadmium induced

oxidative stress in Oryza sativa L. roots. Bulgarian Journal of Plant Physiology, 30,

95–110.

Clemens, S. (2006). Toxic metal accumulation, responses to exposure and mechanisms of

tolerance in plants. Biochimie, 88, 1707–1719.

Conrath, U. (2011). Molecular aspects of defence priming. Trends in Plant Science, 16, 524-

531.

Conrath, U., Chen, Z., Ricigliano, J.R., Klessig, D.F. (1995). Two inducers of plant defense

responses, 2,6-dichloroisonicotinic acid and salicylic acid, inhibit catalase activity in

tobacco. Proceedings of the National Academy of Sciences (PNAS), 92, 7143-7147.

Cornic, G. (2000). Drought stress inhibits photosynthesis by decreasing stomatal aperture, not

by affecting ATP synthesis. Trends in Plant Science, 5, 187-188.

Cosio, C., Martinoia, E., Keller, C. (2004). Hyperaccumulation of cadmium and zinc in

Thlaspi caerulescens and Arabidopsis halleri at the leaf cellular level. Plant

Physiology, 134, 716–725.

Cowley, T., Walters, D.R. (2002). Polyamine metabolism in barley reacting hypersensitively

to the powdery mildew fungus Blumeria graminis f. sp. hordei. Plant, Cell and

Environment, 25, 461–468.

Dalisay, R.F., Kuć, J.A. (1995). Persistence of reduced penetration by Colletotrichum

lagenarium into cucumber leaves with induced systemic resistance and its relation to

enhanced peroxidase and chitinase activities. Physiological and Molecular Plant

Pathology, 47, 329–338.

Das, P., Samantaray, S., Rout, G.R. (1997). Studies on cadmium toxicity in plants: a review.

Environmental Pollution, 98, 29-36.

118

Deák, Cs., Jäger, K., Fábián, A., Nagy, V., Albert, Zs., Miskó, A., Barnabás, B., Papp, I.

(2011). Investigation of physiological responses and leaf morphological traits of wheat

genotypes with contrasting drought stress tolerance. Acta Biologica Szegediensis, 55,

69-71.

De Gara, L., Locato, V., Dipierro, S., de Pinto, M.C. (2010). Redox homeostasis in plants.

The challenge of living with endogenous oxygen production. Respiratory Physiology

& Neurobiology, 173, S13–S19.

De Gara, L., Paciolla, C., De Tullio, M.C., Motto, M., Arrigoni, O. (2000). Ascorbate-

dependent hydrogen peroxide detoxification and ascorbate regeneration during

germination of a highly productive maize hybrid: evidence of an improved

detoxification mechanism against reactive oxygen species. Physiologia Plantarum,

109, 7–13.

Delaney, T., Uknes, S., Vernooij, B., Friedrich, L., Weymann, K., Negrotto, D., Gaffney, T.,

Gut-Rella, M., Kessmann, H., Ward, E., Ryals, J. (1994). A central role of salicylic

acid in plant disease resistance. Science, 266, 1247-1250.

Delpérée, C., Lutts, S. (2008). Growth inhibition occurs independently of cell mortality in

tomato (Solanum lycopersicum) exposed to high cadmium concentrations. Journal of

Integrative Plant Biology, 50, 300–310.

Demiralay, M., Sağlam, A., Kadioğlu, A. (2013). Salicylic acid delays leaf rolling by

inducing antioxidant enzymes and modulating osmoprotectant content in Ctenanthe

setosa under osmotic stress. Turkish Journal of Biology, 37, 49-59.

Dempsey, D.M. A., Vlot, A. C., Wildermuth, M. C., Klessig, D.F. (2011). Salicylic acid

biosynthesis and metabolism. The Arabidopsis Book 9e0156. Published by the

American Society of Plant Biologists.

Despres, C., Chubak, C., Rochon, A., Clark, R., Bethune, T., Desveaux, D., Fobert, P.R.

(2003). The Arabidopsis NPR1 disease resistance protein is a novel cofactor that

confers redox regulation of DNA binding activity to the basic domain/leucine zipper

transcription factor TGAI. The Plant Cell, 15, 2181-2191.

Dixon, D.P., Skipsey, M., Edwards, R. (2010). Roles for glutathione transferases in plant

secondary metabolism. Phytochemistry, 71, 338–350.

Dong, X. (2004). NPR1, all things considered. Current Opinion in Plant Biology, 7, 547-552.

Doulis, A.G., Debian, N., Kingston-Smith, A.H., Foyer, C.H. (1997). Differential localization

of antioxidants in maize leaves. Plant Physiology, 114, 1031-1037.

119

Dražić, G., Mihailović, N., Lojić, M. (2006). Cadmium accumulation in Medicago sativa

seedlings treated with salicylic acid. Biologia Plantarum, 50, 239-244.

Du, L., Ali, G.S., Simons, K.A., Hou, J., Yang, T., Reddy, A.S.N., Poovaiah, B.W. (2009).

Ca2+

/calmodulin regulates salicylic-acid-mediated plant immunity. Nature Letters,

457, 1154-1158.

Edwards, R., Dixon, D.P., Walbot, V. (2000). Plant glutathione S-transferases: enzymes with

multiple functions in sickness and in health. Trends in Plant Science, 5, 193-198.

Eltayeb, A.E., Kawano, N., Badawi, G.H., Kaminaka, H., Sanekata, T., Shibahara, T.,

Inanaga, S., Tanaka, K. (2007). Overexpression of monodehydroascorbate reductase in

transgenic tobacco confers enhanced tolerance to ozone, salt and polyethylene glycol

stresses. Planta, 225, 1255–1264.

El-Zahaby, H.M., Gullner, G., Király, Z. (1995). Effects of powdery mildew infection of

barley on the ascorbate-glutathione cycle and other antioxidants in different host-

pathogen interactions. Phytopathology, 85, 1225-1230.

Fan, H.F., Ding, L., Du, C.X., Wu, X. (2014). Effect of short-term water deficit stress on

antioxidative systems in cucumber seedling roots. Botanical Studies, 55, 46.

Fan, W., Dong, X. (2002). In vivo interaction between NPR1 and transcription factor TGA2

leads to salicylic acid-mediated gene activation in Arabidopsis. The Plant Cell, 14,

1377-89.

Fariduddin, Q., Hayat, S., Ahmad, A. (2003). Salicylic acid influences net photosynthetic rate,

carboxylation efficiency, nitrate reductase activity and seed yield in Brassica juncea.

Photosynthetica, 41, 281-284.

Flott, B.E., Moerschbacher, B.M., Reisener, H.J. (1989). Peroxidase isoenzyme patterns of

resistant and susceptible wheat leaves following stem rust infection. New Phytologist,

111, 413–421.

Foley, S., Navaratnam, S., McGarvey, D.J., Land, E.J., Truscott, G., Rice-Evans, C.A. (1999).

Singlet oxygen quenching and the redox properties of hydroxycinnamic acids. Free

Radical Biology and Medicine, 26, 1202-1208.

Freeman, J.L., Garcia, D., Kim, D., Hopf, A., Salt, D.E. (2005). Constitutively elevated

salicylic acid signals glutathione-mediated nickel tolerance in Thlaspi nickel

hyperaccumulators. Plant Physiology, 137, 1082-1091.

Gallego, S.M., Benavides, M.P., Tomaro, M.L. (1999). Effect of cadmium ions on antioxidant

defense system in sunflower cotyledons. Biologia Plantarum, 42, 49–55.

120

Gao, S., Yan, R., Cao, M., Yang, W., Wang, S., Chen, F. (2008). Effects of copper on growth,

antioxidant enzymes and phenylalanine ammonia-lyase activities in Jatropha curcas

L. seedling. Plant, Soil and Environment, 54, 117-122.

Gechev, T.S., Van Breusegem, F., Stone, J.M., Denev, I., Laloi, C. (2006). Reactive oxygen

species as signals that modulate plant stress responses and programmed cell death.

BioEssays, 28, 1091-1101.

Gill, S.S., Khan, N.A., Tuteja, N. (2011). Differential cadmium stress tolerance in five indian

mustard (Brassica juncea L.) cultivars. An evaluation of the role of antioxidant

machinery. Plant Signaling & Behaviour, 6, 293-300.

Gill, S.S., Tuteja, N. (2010a). Cadmium stress tolerance in crop plants Probing the role of

sulphur. Plant Signaling & Behaviour, 6, 215-222.

Gill, S.S., Tuteja, N. (2010b). Reactive oxygen species and antioxidant machinery in abiotic

stress tolerance in crop plants. Plant Physiology and Biochemistry, 48, 909-930.

Gomes-Junior, R.A., Moldes, C.A., Delite, F.S., Gratão, P.L., Mazzafera, P., Lea, P.J.,

Azevedo, R.A. (2006). Nickel elicits a fast antioxidant response in Coffea arabica

cells. Plant Physiology and Biochemistry, 44, 420-429.

Gratão, P.L., Polle, A., Lea, P.J., Azevedo, R.A. (2005). Making the life of heavy metal-

stressed plants a little easier. Functional Plant Biology, 32, 481-494.

Griffey, C.A., Das, M.K., Stromberg, E.L. (1993). Effectiveness of adult-plant resistance in

reducing grain yield loss to powdery mildew in winter wheat. Plant Disease, 77, 618–

622.

Groppa, M.D., Rosales, E.P., Iannone, M.F., Benavides, M.P. (2008a). Nitric oxide

polyamines and Cd-induced phytotoxicity in wheat roots. Phytochemistry, 69, 2609–

2615.

Groppa, M.D., Tomaro, M.L., Benavides, M.P. (2001). Polyamines as protectors against

cadmium or copper-induced oxidative damage in sunflower leaf discs. Plant Science,

161, 481–488.

Groppa, M.D., Tomaro, M.L., Benavides, M.P. (2007). Polyamines and heavy metal stress:

the antioxidant behavior of spermine in cadmium- and copper-treated wheat leaves.

Biometals, 20, 185–195.

Groppa, M.D., Zawoznik, M.S., Tomaro, M.L., Benavides, M.P. (2008b). Inhibition of root

growth and polyamine metabolism in sunflower (Helianthus annuus L) seedlings

under cadmium and copper stress. Biological Trace Element Research, 126, 246–256.

121

Gutiérrez-Coronado, M.A., Trejo-López, C., Larqué-Saavedra, A. (1998). Effects of salicylic

acid on the growth of roots and shoots in soybean. Plant Physiology and Biochemistry,

36, 563–565.

Gzyl, J., Rymer, K., Gwóźdź, E.A. (2009). Differential response of antioxidant enzymes to

cadmium stress in tolerant and sensitive cell line of cucumber (Cucumis sativus L.)

Acta Biochimica Polonica, 56, 723-727.

Häder, D.P., Kumar, H.D., Smith, R.C., Worrest, R.C. (2007). Effects of solar UV radiation

on aquatic ecosystems and interactions with climate change. Photochemical and

Photobiological Sciences, 6, 267–285.

Harrach, B.D., Fodor, J., Pogány, M., Preuss, J., Barna, B. (2008). Antioxidant, ethylene and

membrane leakage responses to powdery mildew infection of near-isogenic barley

lines with various types of resistance. European Journal of Plant Pathology, 121, 21–

33.

Hayat, Q., Hayat, S., Irfan, M., Ahmad, A. (2010). Effect of exogenous salicylic acid under

changing environment: A review. Environmental and Experimental Botany, 68, 14–

25.

Hayat, S., Fariduddin, Q., Ali, B., Ahmad, A. (2005). Effect of salicylic acid on growth and

enzyme activities of wheat seedlings. Acta Agronomica Hungarica, 53, 433–437.

Hayat, S., Hasan, S.A., Fariduddin, Q., Ahmad, A. (2008). Growth of tomato (Lycopersicon

esculentum) in response to salicylic acid under water stress. Journal of Plant

Interactions, 3, 297–304.

He, L., Jia, X., Gao, Z., Li, R. (2011). Genotype-dependent responses of wheat (Triticum

aestivum L.) seedlings to drought, UV-B radiation and their combined stresses.

African Journal of Biotechnology, 10, 4046-4056.

Hegedűs, A., Erdei, S., Horváth, G. (2001). Comparative studies of H2O2 detoxifying enzymes

in green and greening barley seedlings under cadmium stress. Plant Science, 160,

1085-1093.

Herrmann, K.M., Weaver, L.M. (1999). The Shikimate pathway. Plant Physiology, 50, 473-

503.

Hideg, É., Jansen, M.A.K., Strid, A. (2013). UV-B exposure, ROS, and stress: inseparable

companions or loosely linked associates? Trends in Plant Science, 18, 107-115.

Hiraga, S., Ito, H., Yamakawa, H., Ohtsubo, N., Seo, S., Mitsuhara, I., Matsui, H., Honma,

M., Ohashi, Y. (2000). An HR-induced tobacco peroxidase gene is responsive to

122

spermine, but not to salicylate, methyl jasmonate, and ethephon. Molecular Plant-

Microbe Interactions, 13, 210–216.

Hollósy, F. (2002). Effects of ultraviolet radiation on plant cells. Micron, 33, 179-197.

Hoque, M.A., Banu, M.N.A., Okuma, E., Amako, K., Nakamura, Y., Shimoishi, Y., Murata,

Y. (2007). Exogenous proline and glycinebetaine increase NaCl-induced ascorbate–

glutathione cycle enzyme activities, and proline improves salt tolerance more than

glycinebetaine in tobacco Bright Yellow-2 suspension-cultured cells. Journal of Plant

Physiology, 164, 1457-1468.

Horváth, E., Szalai, G., Janda, T. (2007). Induction of abiotic stress tolerance by salicylic acid

signalling. Journal of Plant Growth Regulation, 26, 290-300.

Huang, G.Y., Wang, Y.S., Sun, C.C., Dong, J.D., Sun, Z.X. (2010). The effect of multiple

heavy metals on ascorbate, glutathione and related enzymes in two mangrove plant

seedlings (Kandelia candel and Bruguiera gymnorrhiza). Oceanological and

Hydrobiological Studies, 39, 11-25.

Huang, J., Cardoza, Y.J., Schmelz, E.A., Raina, R., Engelberth, J., Tumlinson, J.H. (2003).

Differential volatile emissions and salicylic acid levels from tobacco plants in

response to different strains of Pseudomonas syringae. Planta, 217, 767-775.

Huang, Z., Yeakley, J., Garcia, E.W., Holdridge, J.D., Fan, J.B., Whitham, S. (2005).

Salicylic acid-dependent expression of host genes in compatible Arabidopsis-virus

interactions. Plant Physiology, 137, 1147-1159.

Hückelhoven, R., Fodor, J., Preis, C., Kogel, K.H. (1999). Hypersensitive cell death and

papilla formation in barley attacked by the powdery mildew fungus are associated with

hydrogen peroxide but not with salicylic acid accumulation. Plant Physiology, 119,

1251–1260.

Hura, T., Hura, K., Grzesiak, S. (2009). Physiological and biochemical parameters for

identification of QTLs controlling the winter triticale drought tolerance at the seedling

stage. Plant Physiology and Biochemistry, 47, 210-214.

Hussain, K., Nawaz, K., Majeed, A., Khan, A., Lin, F., Ghani, A., Raza, G., Afghan, S., Zia-

ul-Hussnain, S., Ali, K., Shahazad, A. (2010). Alleviation of salinity effects by

exogenous applications of salicylic acid in pearl millet (Pennisetum glaucum (L.) R.

Br.) seedlings. African Journal of Biotechnology, 9, 8602–8607.

Hussain, S.S., Ali, M., Ahmad, M., Siddique, K.H.M. (2011). Polyamines: natural and

engineered abiotic and biotic stress tolerance in plants. Biotechnology Advances, 29,

300–311.

123

Hussein, M.M., Balbaa, L.K., Gaballah, M.S. (2007). Salicylic acid and salinity effects on

growth of maize plants. Research Journal of Agriculture and Biological Sciences, 3,

321–328.

Ivanov, S., Miteva, L., Alexieva, V., Karjin, H., Karanov, E. (2005). Alterations in some

oxidative parameters in susceptible and resistant wheat plants infected with Puccinia

recondita f.sp tritici. Journal of Plant Physiology, 162, 275–279.

Janda, T., Szalai, G., Kissimon, J., Páldi, E., Marton, C., Szigeti, Z. (1994). Role of irradiance

in the chilling injury in maize (Zea mays L.) plants. Planta, 208, 175–180.

Janda, T., Szalai, G., Tari, I., Páldi, E. (1999). Hydroponic treatment with salicylic acid

decreases the effects of chilling injury in maize (Zea mays L.) plants. Planta, 208, 175-

180.

Jansen, M.A.K., Gaba, V., Greenberg, B.M. (1998). Higher plants and UV-B radiation:

balancing damage, repair and acclimation. Trends in Plant Science, 3, 131–135.

Jansik, I., Preisokowski, S., Kneifel, H. (2005). Ozone has dramatic effects on the regulation

of the prechorismate pathway in tobacco (Nicotiana tabacum L. cv. Bel W3). Planta,

223, 20-27.

Johnson, C., Boden, E., Arias, J. (2003). Salicylic acid and NPR1 induce the recruitment of

trans-activating TGA factors to a defense gene promoter in Arabidopsis. The Plant

Cell, 15, 1846-1958.

Johnson, L.B., Lee, R.F. (1978). Peroxidase changes in wheat isolines with compatible and

incompatible leaf rust infections. Physiological Plant Pathology, 13, 173–181.

Jones, J.D.G., Dangl, J.F. (2006). The plant immune system. Nature, 444, 323-329.

Jóźwiak-Żurek, A., Kozłowska, M., Nuc, K. (2011). Phenylalanine ammonia lyase under

combined effects of enhanced UV-B radiation and allelopathy stress. Acta Biologica

Cracoviensia Series Botanica, 53, 73-78.

Jung, H.W., Tschaplinski, T.J., Wang, L., Glazebrook, J., Greenberg, J.T. (2009). Priming is

systemic plant immunity. Science, 324, 89–91.

Kaiserli, E., Jenkins, G.I. (2007). UV-B promotes rapid nuclear translocation of the

Arabidopsis UV-B–specific signaling component UVR8 and activates its function in

the nucleus. The Plant Cell, 19, 2662–2673.

Kakani, V.G., Reddy, K.R., Zhao, D., Mohammed, A.R. (2003a). Effects of ultraviolet-B

radiation on cotton (Gossypium hirsutum L.) morphology and anatomy. Annals of

Botany, 91, 817-826.

124

Kakani, V.G., Reddy, K.R., Zhao, D., Sailaja, K. (2003b). Field crop responses to ultraviolet-

B radiation: a review. Agriculture and Forest Meteorology, 120, 191–218.

Kameli, A., Lösel, D.M. (1993). Carbohydrates and water status in wheat plants under water

stress. New Phytologist, 125, 609-614.

Karuppanapandian, T., Manoharan, K. (2008). Uptake and translocation of tri- and hexa-

valent chromium and their effects on black gram (Vigna mungo L. Hepper cv. Co4)

roots. Journal of Plant Biology, 51, 192–201.

Karuppanapandian, T., Moon, J.C., Kim, C., Manoharan, K., Kim, W. (2011). Reactive

oxygen species in plants: their generation, signal transduction, and scavenging

mechanisms. Australian Journal of Crop Science, 5, 709-725.

Kaur, N., Gupta, A.K. (2005). Signal transduction pathways under abiotic stresses in plants.

Current Science, 88, 1771-1780.

Khan, S., Khan, M.A., Rehman, S. (2011). Lead and cadmium contamination of different

roadside soils and plants in Peshawar City, Pakistan. Pedosphere, 21, 351–357.

Khan, W., Prithviraj, B., Smith, D.L. (2003). Photosynthetic responses of corn and soybean to

foliar application of salicylates. Journal of Plant Physiology, 160, 485–492.

Khodary, S.E.A. (2004). Effect of salicylic acid on the growth, photosynthesis and

carbohydrate metabolism in salt stressed maize plants. International Journal of

Agriculture and Biology, 6, 5-8.

Kinkema, M., Fan, W., Dong, X. (2000). Nuclear localization of NPR1 is required for

activation of PR gene expression. The Plant Cell, 12, 2339-2350.

Knutson, R.M. (1974). Heat production and temperature regulation in eastern skunk cabbage.

Science, 186, 746-747.

Kocsy, G., von Ballmoos, P., Rüegsegger, A., Szalai, G., Galiba, G., Brunold, C. (2001).

Increasing the glutathione content in a chilling-sensitive maize genotype using

safeners increased protection against chilling-induced injury. Plant Physiology, 127,

1147-1156.

Kocsy, G., Kobrehel, K., Szalai, G., Duviau, M.P., Buzás, Z., Galiba, G. (2004). Abiotic

stress-induced changes in glutathione and thioredoxin h levels in maize.

Environmental and Experimental Botany, 52, 101-112.

Kocsy, G., Pál, M., Soltész, A., Szalai, G., Boldizsár, Á., Kovács, V., Janda, T. (2011). Low

temperature and oxidative stress in cereals. Acta Agronomica Hungarica, 59, 153-173.

Kovács V., Gondor O.K., Majláth I., Szalai G., Janda T., Pál, M. (2014c). The effects of

drought on plant defence system in wheat genotypes with different salicylic acid

125

content. In: Kőszegi Izabella (szerk.) Advances in Plant Breeding & Biotechnology

Techniques: Book of Abstracts. 96 p. Mosonmagyaróvár, Magyarország, 2014.04.28-

2014.04.29. Martonvásár: Pannonian Plant Biotechnology Association, 2014. pp. 49-

50. (Pannonian Plant Biotechnology Association Conference for PhD Students in Plant

Biology) ISBN:978-963-89129-5-4.

Kovács V., Gondor O.K., Szalai G., Majláth I., Janda T., Pál, M. (2014a). UV-B radiation

modifies the acclimation processes to drought or cadmium in wheat. Environmental

and Experimental Botany, 100, 122– 131.

Kovács, V., Gondor, O.K., Szalai, G., Majláth, I., Janda, T., Pál, M. (2014b). Synthesis and

role of salicylic acid in wheat varieties with different levels of cadmium tolerance.

Journal of Hazardous Materials, 280, 12-19.

Kovács, V., Vida, Gy., Szalai, G., Janda, T., Pál, M. (2012). Relationship between biotic

stress tolerance and protective compounds in wheat genotypes. Acta Agronomica

Hungarica, 60, 131–141.

Köhler, B., Hills, A., Blatt, M.R. (2003). Control of guard cell ion channels by hydrogen

peroxide and abscisic acid indicates their action through alternate signaling pathways.

Plant Physiology, 131, 385-388.

Krantev, A., Yordanova, R., Janda, T., Szalai, G., Popova, L. (2008). Treatment with salicylic

acid decreases the effect of cadmium on photosynthesis in maize plants. Journal of

Plant Physiology, 165, 920-931.

Kristensen, B.K., Brandt, J., Bojsen, K., Thordal-Christensen, H., Kerby, K.B., Collinge,

D.B., Mikkelsen, J.D., Rasmussen, S.K. (1997). Expression of a defence-related

intercellular barley peroxidase in transgenic tobacco. Plant Science, 122, 173–182.

Krivosheeva, A., Tao, D.L., Ottander, C., Wingsle, G., Dube, S.L., Öquist, G. (1996). Cold

acclimation and photoinhibition of photosynthesis in Scots pine. Planta, 200, 296–305.

Kumar, D., Klessig, D.F. (2003). High affinity salicylic acid-binding protein 2 is required for

plant innate immunity and has salicylic acid-stimulated lipase activity. Proceedings of

the National Academy of Sciences (PNAS), 100, 16101-16106.

Kuznetsov, V.V., Shevyakova, N.I. (2007). Polyamines and stress tolerance of plants. Plant

Stress, 1, 50–71.

Landberg, T., Greger, M. (2002). Differences in oxidative stress in heavy metal resistant and

sensitive clones of Salix viminalis. Journal of Plant Physiology, 159, 69-75.

Larcher, W. (1987). Stress bei Pflanzen. Naturwissenschaften, 74, 158-167.

126

Larkindale, J., Huang, B. (2004). Thermotolerance and antioxidant systems in Agrostis

stolonifera: involvement of salicylic acid, abscisic acid, calcium, hydrogen peroxide,

and ethylene. Journal of Plant Physiology, 161, 405–413.

Larkindale, J., Knight, M.R. (2002). Protection against heat stress-induced oxidative damage

in Arabidopsis involves calcium, abscisic acid, ethylene, and salicylic acid. Plant

Physiology, 128, 682-695.

Leath, S., Bowen, K.L. (1989). Effects of powdery mildew, triadimenol seed treatment, and

triadimefon foliar sprays on yield of winter wheat in North California.

Phytopathology, 79, 152-155.

Lee, S.H., Ahsan, N., Lee, K.W., Kim, D.H., Lee, D.G., Kwak, S.S., Kwon, S.Y., Kim, T.H.,

Lee, B.H. (2007). Simultaneous overexpression of both CuZn superoxide dismutase

and ascorbate peroxidase in transgenic tall fescue plants confers increased tolerance to

a wide range of abiotic stresses. Journal of Plant Physiology, 164, 1626-1638.

Li, D., Luo, Z., Mou, W., Wang, Y., Ying, T., and Mao, L. (2014). ABA and UV-C effects on

quality, antioxidant capacity and anthocyanin contents of strawberry fruit (Fragaria

ananassa Duch.). Postharvest Biology and Technology, 90, 56–62.

Li, X., Schuler, M.A., Berenbaum, M.R. (2002). Jasmonate and salicylate induce expression

of herbivore cytochrome P450 genes. Nature, 419, 712-715.

Lian, B., Zhou, X., Miransari, M., Smith, D.L. (2000). Effects of salicylic acid on the

development and root nodulation of soybean seedlings. Journal of Agronomy and

Crop Science, 185, 187–192.

Lin, R., Wang, X., Luo, Y., Du, W., Guo, H., Yin, D. (2007). Effects of soil cadmium on

growth, oxidative stress and antioxidant system in wheat seedlings (Triticum aestivum

L.). Chemosphere, 69, 89-98.

Liu, J.H., Kitashiba, H., Wang, J., Ban, Y., Moriguchi, T. (2007). Polyamines and their ability

to provide environmental stress tolerance to plants. Plant Biotechnology, 24, 117–126.

Liu, J.X., Liao, D.Q., Oane, R., Estenor, L., Yang, X.E., Li, Z.C., Bennett, J. (2006). Genetic

variation in the sensitivity of anther dehiscence to drought stress in rice. Field Crops

Research, 97, 87-100.

Locato, V., Cimini, S., De Gara, L. (2013). Strategies to increase vitamin C in plants: from

plant defense perspective to food biofortification. Frontiers in Plant Science, 4, 152.

doi: 10.3389/fpls.2013.00152

Lodge, J.K. (2008). Molecular actions of ascorbic acid. Current Topics in Nutraceutical

Research, 6, 1–13.

127

Luo, M.H., Yuan, S., Chen, Y.E., Liu, W.J., Du, J.B., Lei, T., Wang, M.B., Lin, H.H. (2009).

Effects of salicylic acid on the photosystem 2 of barley seedlings under osmotic stress.

Biologia Plantarum, 53, 663–669.

Magyarosy, A.C., Schürmann, P., Buchanan, B.B. (1976). Effect of powdery mildew

infection on photosynthesis by leaves and chloroplasts of sugar beets. Plant

Physiology, 57, 486-489.

Majer, P., Hideg, É. (2012). Existing antioxidant levels are more important in acclimation to

supplemental UV-B irradiation than inducible ones: Studies with high light pretreated

tobacco leaves. Emirates Journal of Food and Agriculture, 24, 598-606.

Manickavelu, A., Kawaura, K., Oishi, K., Shin-I, T., Kohara, Y., Yahiaoui. N., Keller, B.,

Suzuki, A., Yano, K., Ogihara, Y. (2010). Comparative gene expression analysis of

susceptible and resistant near-isogenic lines in common wheat infected by Puccinia

triticina. DNA Research, 17, 211–222.

Mannervik, B., Guthenberg, C. (1981). Glutathione transferase (Human placenta). Methods in

Enzymology, 77, 231-235.

Mao, P., Duan, M., Wei, C., Li, Y. (2007). WRKY62 transcription factor acts downstream of

cytosolic NPR1 and negatively regulates jasmonate-responsive gene expression. Plant

and Cell Physiology, 48, 833-842.

Manthe, B., Schulz, M., Schnabl, H. (1992). Effects of salicylic acid on growth and stomatal

movements of Vicia faba L.: Evidence for salicylic acid metabolization. Journal of

Chemical Ecology, 18, 1525-1539.

Marcińska, I., Czyczyło-Mysza, I., Skrzypek, E., Grzesiak, M.T., Janowiak, F., Filek, M.,

Dziurkaemail, M., Dziurkaemail, K., Waligórskiemail, P., Juzońemail, K., Cyganek,

K. Grzesiak, S. (2013). Alleviation of osmotic stress effects by exogenous application

of salicylic or abscisic acid on wheat seedlings. International Journal of Molecular

Sciences, 14, 13171-13193.

Markovska, Y.K., Gorinova, N.I., Nedkovska, M.P., Miteva, K.M. (2009). Cadmium-induced

oxidative damage and antioxidant responses in Brassica juncea plants. Biologia

Plantarum, 53, 151-154.

Márquez-García, B., Fernández-Recamales, M.Á., Córdoba, F. (2012). Effects of cadmium on

phenolic composition and antioxidant activities of Erica andevalensis. Journal of

Botany, 2012, 1-6.

Masoumi, H., Masoumi, M., Darvish, F., Daneshian, J., Nourmohammadi, G., Habibi, D.

(2010). Change in several antioxidant enzymes activity and seed yield by water deficit

128

stress in soybean (Glycine max L.) cultivars. Notulae Botanicae Horti Agrobotanici

Cluj-Napoca, 38, 86-94.

Mateo, A., Funck, D., Muhlenbock, P., Kular, B., Mullineaux, P.M., Karpinski, S. (2006).

Controlled levels of salicylic acid are required for optimal photosynthesis and redox

homeostasis. Journal of Experimental Botany, 57, 1795-1807.

Meguro, A., Sato, Y. (2014). Salicylic acid antagonizes abscisic acid inhibition of shoot

growth and cell cycle progression in rice. Scientific Reports, 4, 1-11.

Meinhard, M., Rodriguez, P.L., Grill, E. (2002). The sensitivity of ABI2 to hydrogen

peroxide links the abscisic acid-response regulator to redox signalling. Planta, 214,

775–782.

Melgar, J.C., Abney, T.S., Vierling, R.A. (2006). Peroxidase activity in soybeans following

inoculation with Phytophthora sojae. Mycopathologia, 161: 37–42.

Meng, L., Xiuying, K., Naxin, H., Ronghua, Z., Jizeng, J. (2002). Gene expression profiling

related to powdery mildew resistance in wheat with the method of suppression

subtractive hybridization. Chinese Science Bulletin, 47, 1990–1994.

Métraux, J.P. (2002). Recent breakthroughs in the study of salicylic acid biosynthesis. Trends

in Plant Science, 7, 332-334.

Metwally, A., Finkemeier, I., Georgi, M., Dietz, K.J. (2003). Salicylic acid alleviates the

cadmium toxicity in barley seedlings. Plant Physiology, 132, 272-281.

Meuwly, P., Métraux, J.P. (1993). Ortho-anisic acid as internal standard for the simultaneous

quantitation of salicylic acid and its putative biosynthetic precursors in cucumber

leaves. Analytical Biochemistry, 214, 500–505.

Mika, A., Boenisch, M.J., Hopff, D., Lüthje, S. (2010). Membrane-bound guaiacol

peroxidases from maize (Zea mays L.) roots are regulated by methyl jasmonate,

salicylic acid, and pathogen elicitors. Journal of Experimental Botany, 61, 831–841.

Mika, A., Lüthje, S. (2003). Properties of guaiacol peroxidase activities isolated from corn

root plasma membranes. Plant Physiology, 132, 1489–1498.

Mishra, S., Agrawal, S.B. (2006). Interactive effects between supplemental ultraviolet-B

radiation and heavy metals on the growth and biochemical characteristics of Spinacia

oleracia L. Brazilian Journal of Plant Physiology, 18, 307-314.

Misra, N., Saxena, P. (2009). Effect of salicylic acid on proline metabolism in lentil grown

under salinity stress. Plant Science, 177, 181-189.

Mittler, R. (2002). Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance. Trends in Plant Science,

7, 405-410.

129

Mittova, V., Volokita, M., Guy, M., Tal, M. (2000). Activities of SOD and the ascorbate-

glutathione cycle enzymes in subcellular compartments in leaves and roots of the

cultivated tomato and its wild salt-tolerant relative Lycopersicon pennellii. Physiologia

Plantarum, 110, 42-51.

Miura, K., Okamoto, H., Okuma, E., Shiba, H., Kamada, H., Hasegawa, P. M., Murata, Y.

(2013). SIZ1 deficiency causes reduced stomatal aperture and enhanced drought

tolerance via controlling salicylic acid-induced accumulation of reactive oxygen

species in Arabidopsis. The Plant Journal, 73, 91-104.

Mohammadkhani, N., Heidari, R. (2008). Drought-induced accumulation of soluble sugars

and proline in two maize varieties. World Applied Sciences Journal, 3, 448-453.

Moharekar, S.T., Lokhande, S.D., Hara, T., Tanaka, R., Tanaka, A., Chavan, P.D. (2003).

Effect of salicylic acid on chlorophyll and carotenoid contents of wheat and moong

seedlings. Photosynthetica, 41, 315–317.

Moldenhauer, J., Moerschbacher, B.M., Van der Westhuizen, A.J. (2006). Histological

investigation of stripe rust (Puccinia striiformis f.sp. tritici) development in resistant

and susceptible wheat cultivars. Plant Pathology, 55, 469–474.

Mottram, P. (2003). Past, present and future drug treatment for rheumatoid arthritis and

systemic lupus erythematosus. Immunology and Cell Biology 81, 350-353.

Mou, Z., Fan, W., Dong, X. (2003). Inducers of plant systemic acquired resistance regulate

NPR1 function through redox changes. Cell, 113, 935–944.

Najafian, S., Khoshkhui, M., Tavallali, V. (2009a). Effect of salicylic acid and salinity in

rosemary (Rosmarinus officinalis L.): Investigation on changes in gas Exchange, water

relations, and membrane stabilization. Advances in Environmental Biology, 3, 322-

328.

Najafian, S., Khoshkhui, M., Tavallali, V., Saharkhiz, M.J. (2009b). Effect of salicylic acid

and salinity in thyme (Thymus vulgaris L.): Investigation on changes in gas exchange,

water relations, and membrane stabilization and biomass accumulation. Australian

Journal of Basic and Applied Sciences, 3, 2620–2626.

Naszradi, T., Badacsonyi, A., Németh, N., Tuba, Z., Batič, F. (2004). Zinc, lead and cadmium

content in meadow plants and mosses along the M3 motorway (Hungary). Journal of

Atmospheric Chemistry, 49, 593–603.

Németh, M., Janda, T., Horváth, E., Páldi, E., Szalai, G. (2002). Exogenous salicylic acid

increases polyamine content but may decrease drought tolerance in maize. Plant

Science, 162, 569–574.

130

Niedzwiedz-Siegien, I., Bogatek-Leszczynska, R., Cômea, D., Corbineau, F. (2004). Effects

of drying rate on dehydration sensitivity of excised wheat seedling shoots as related to

sucrose metabolism and antioxidant enzyme activities. Plant Science, 167, 879-888.

Noctor, G., Foyer, C.H. (1998). Ascorbate and glutathione: keeping active oxygen under

control. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, 49, 249–

279.

Nordberg, G. (2003). Cadmium and human health: A perspective based on recent studies in

China. Journal of Trace Elements in Experimental Medicine, 16, 307–319.

Nugroho, L.H., Verberne, M.C., Verpoorte, R. (2001). Salicylic acid produced by

isochorismate synthase and isochorismate pyruvate lyase in various parts of

constitutive salicylic acid producing tobacco plants. Plant Science, 161, 911-915.

Ogawa, D., Nakajima, N., Sano, T., Tamaoki, M., Aono, M., Kubo, A., Kanna, M., Ioki, M.,

Kamada, H., Saji, H. (2005). Salicylic acid accumulation under O3 exposure is

regulated by ethylene in tobacco plants. Plant and Cell Physiology, 46, 1062-1072.

Ogawa, D., Nakajima, N., Seo, S., Mitsuhara, I., Kamada, H., Ohashi, Y. (2006). The

phenylalanine pathway is the main route of salicylic acid biosynthesis in Tobacco

mosaic virus-infected tobacco leaves. Plant Biotechnology, 23, 395-398.

O'Toole, J.C., Cruz, R.T. (1980). Response of leaf water potential, stomatal resistance, and

leaf rolling to water stress. Plant Physiology, 65, 428-432.

Pál, M., Horváth, E., Janda, T., Páldi, E., Szalai, G. (2005), Cadmium stimulates the

accumulation of salicylic acid and its putative precursors in maize (Zea mays L.)

plants. Physiologia Plantarum, 125, 356-364.

Pál, M., Horváth, E., Janda, T., Páldi, E., Szalai, G. (2006a). Physiological changes and

defence mechanisms induced by cadmium stress in maize. Journal of Plant Nutrition

and Soil Science, 169, 239-246.

Pál, M., Horváth, E., Janda, T., Páldi E., Szalai, G. (2006b). The effect of cadmium stress on

phytochelatin, thiol and polyamine content in maize. Cereal Research

Communications, 34, 65-68.

Pál, M., Janda, T., Szalai, G. (2011). Abscisic acid may alter the salicylic acid-related abiotic

stress response in maize. Journal of Agronomy and Crop Science, 197, 368-377.

Pál, M., Kovács, V., Szalai, G., Soós, V., Ma, X., Liu, H., Mei, H., Janda, T. (2014). Salicylic

acid and abiotic stress responses in rice. Journal of Agronomy and Crop Science, 200,

1–11.

131

Pál, M., Kovács, V., Vida, Gy., Szalai, G., Janda, T. (2013a). Changes induced by powdery

mildew in the salicylic acid and polyamine contents and the antioxidant enzyme

activities of wheat lines. European Journal of Plant Pathology, 135, 35-47.

Pál, M., Szalai, G., Horváth, E., Janda, T., Páldi, E. (2002). Effect of salicylic acid during

heavy metal stress. Acta Biologica Szegediensis, 46, 119-120.

Pál, M., Szalai, G., Kovács, V., Gondor, O.K., Janda, T. (2013b). Salicylic Acid-Mediated

Abiotic Stress Tolerance. In: Shamsul Hayat, Aqil Ahmad, Mohammed Nasser

Alyemeni (szerk.) Salicylic Acid Plant Growth and Development. Netherlands:

Springer Dordrecht Heidelberg, 183-247. (ISBN:978-94-007-6427-9)

Pandey, K.B., Rizvi, S.I. (2009). Plant polyphenols as dietary antioxidants in human health

and disease. Oxidative Medicine and Cellular Longevity, 2, 270-278.

Paradiso, A., Berardino, R., de Pinto, M.C. (2008). Increase in ascorbate–glutathione

metabolism as local and precocious systemic responses induced by cadmium in durum

wheat plants. Plant Cell Physiology, 49, 362-374.

Parent, B., Hachez, C., Redondo, E., Simonneau, T., Chaumont, F., Tardieu, F. (2009).

Drought and abscisic acid effects on aquaporin content translate into changes in

hydraulic conductivity and leaf growth rate: A trans-scale approach. Plant Physiology,

149, 2000-2012.

Park, S.W., Kaimoyo, E., Kumar, D., Mosher, S., Klessig, D. (2007). Methyl salicylate is

critical mobile signal for plant systemic acquired resistance. Science, 318, 113-16.

Pasqualini, S., Della, T.G., Ferranti, F., Ederli, L., Piccioni, C., Reale, L., Antonielli, M.

(2002). Salicylic acid modulates ozone-induced hypersensitive cell death in tobacco

plants. Physiologia Plantarum, 115, 204-212.

Passardi, F., Cosio, C., Penel, C., Dunand, C. (2005). Peroxidases have more functions than a

Swiss army knife. Plant Cell Reports, 24, 255–265.

Passardi, F., Longet, D., Penel, C., Dunand, C. (2004). The class III peroxidase multigenic

family in rice and its evolution in land plants. Phytochemistry, 65, 1879–1893.

Pawlak-Sprada, S., Arasimowicz-Jelonek, M., Podgórska, M., Deckert, J. (2011). Activation

of phenylpropanoid pathway in legume plants exposed to heavy-metals. Part I. Effect

of cadmium and lead on phenylalanine ammonia-lyase gene expression, enzyme

activity and lignin content. Acta Biochimica Polonica, 58, 211–216.

Pei, Z.M., Murata, Y., Benning, G., Thomine, S., Klüsener, B., Allen, G.J., Grill, E.,

Schroeder, J.I. (2000). Calcium channels activated by hydrogen peroxide mediate

abscisic acid signalling in guard cells. Nature, 406, 731-734.

132

Pirbalouti, A.G., Samani, M.R., Hashemi, M., Zeinali, H. (2014). Salicylic acid affects

growth, essential oil and chemical compositions of thyme (Thymus daenensis Celak.)

under reduced irrigation. Plant Growth Regulation, 72, 289-301.

Poór, P., Gémes, K., Horváth, F., Szepesi, A., Simon, M.L., Tari, I. (2011). Salicylic acid

treatment via the rooting medium interferes with stomatal response, CO2 fixation rate

and carbohydrate metabolism in tomato, and decreases harmful effects of subsequent

salt stress. Plant Biology, 13, 105–114.

Popova, L.P., Maslenkova, L.T, Yordanova, R.Y. (2009). Exogenous treatment with salicylic

acid attenuates cadmium toxicity in pea seedlings. Plant Physiology and Biochemistry,

47, 224-231.

Pospišilová, J. (2003). Participation of phytohormones in the stomatal regulation of gas

exchange during water stress. Biologia Plantarum, 46, 491–506.

Pospišilová, J., Vágner, M., Malbeck, J., Trávníčková, A., Batková, P. (2005). Interactions

between abscisic acid and cytokinins during water stress and subsequent rehydration.

Biologia Plantarum, 49, 533-540.

Pourtaghi, A., Darvish, F., Habibi, D., Nourmohammadi, G., Daneshian, J. (2011). Effect of

irrigation water deficit on antioxidant activity and yield of some sunflower hybrids.

Australian Journal of Crop Science, 5, 197-204.

Prasad, S.M., Dwivedi, R., Zeeshan, M., Singh, R. (2004). UV-B and cadmium induced

changes in pigments, photosynthetic electron transport activity, antioxidant levels and

antioxidative enzyme activities of Riccia sp. Acta Physiologiae Plantarum, 26, 423-

430.

Prochazkova, D., Sairam, R.K., Srivastava, G.C., Singh, D.V. (2001). Oxidative stress and

antioxidant activity as the basis of senescence in maize leaves. Plant Science, 161,

765-771.

Proietti, S., Bertini, L., Timperio, A.M., Zolla, L., Caporale, C., Caruso, C. (2013). Crosstalk

between salicylic acid and jasmonate in Arabidopsis investigated by an integrated

proteomic and transcriptomic approach. Molecular Biosystems, 9, 1169-1187.

Prokopová, J., Mieslerová, B., Hlaváčková, V., Hlavinka, J., Lebeda, A., Nauš, J., Špundová,

M. (2010). Changes in photosynthesis of Lycopersicon spp. plants induced by tomato

powdery mildew infection in combination with heat shock pre-treatment.

Physiological and Molecular Plant Pathology, 74, 205–213.

133

Rao, M., Paliyath, G., Ormrod, D.P., Murr, D.P., Watkins, C.B. (1997). lnfluence of salicylic

acid on H2O2 production, oxidative stress, and H2O2-metabolizing enzymes, Salicylic

acid-mediated oxidative damage requires H2O2. Plants Physiology, 115, 137-149.

Randhir, R., Lin, Y.T., Shetty, K. (2004). Phenolics, their antioxidant and antimicrobial

activity in dark germinated fenugreek sprouts in response to peptide and

phytochemical elicitors. Asia Pacific Journal of Clinical Nutrition, 13, 295-307.

Raskin, I., Skubatz, H., Tang, W., Meeuse, B.J.D. (1990). Salicylic acid levels in thermogenic

and non-thermogenic plants. Annals of Botany, 66, 369-373.

Rhee, S.G. (2006). Cell Signaling; H2O2, a necessary evil for cell signaling. Science, 312,

1882-1883.

Rivas-San Vicente, M., Plasencia, J. (2011). Salicylic acid beyond defence: its role in plant

growth and development. Journal of Experimental Botany, 1-18.

Rodríguez-Serrano, M., Romero-Puertas, M.C., Pazmiño, D.M., Testillano, P.S., Risueño,

M.C., del Ríó, L.A., Sandalio, L.M. (2009). Cellular response of pea plants to

cadmium toxicity: cross talk between reactive oxygen species, nitric oxide, and

calcium. Plant Physiology, 150, 229-243.

Rodríguez-Serrano, M., Romero-Puertas, M.C., Zabalza, A., Corpas F.J., Gómez, M., del Río,

L.A., Sandalio L.M. (2006). Cadmium effect on oxidative metabolism of pea (Pisum

sativum L.) roots. Imaging of reactive oxygen species and nitric oxide accumulation in

vivo. Plant, Cell and Environment, 29, 1532-1544.

Romero-Pérez, A.I., Lamuela-Raventós, R.M., Andrés-Lacueva, C., de la Torre-Boronat,

M.C. (2001). Method for the quantitative extraction of resveratrol and piceid isomers

in grape berry skins. Effect of powdery mildew on the stilbene content. Journal of

Agricultural and Food Chemistry, 49, 210–215.

Root, R.A., Miller, R.J., Koeppe, D.E. (1975). Uptake of cadmium—Its toxicity, and effect on

the iron ratio in hydroponically grown corn. Journal of Environmental Quality, 4, 473-

476.

Roth, G.J., Majerus, P.W. (1975). The mechanism of the effect of Aspirin on human platelets.

The Journal of Clinical Investigation, 56, 624-632.

Saari, E.E., Prescott, J.M. (1975). A scale for appraising for foliar intensity of wheat diseases.

Plant Disease Reporter, 59, 377–380.

Sakihama, Y., Cohen, M.F., Grace, S.C, Yamasaki, H. (2002). Plant phenolic antioxidant and

prooxidant activities: phenolics-induced oxidative damage mediated by metals in

plants. Toxicology, 177, 67–80.

134

Salekjalal, M., Haddad, R., Jafari, B. (2012). Effects of soil water shortages on the activity of

antioxidant enzymes and the contents of chlorophylls and proteins in barley.

American-Eurasian Journal of Agricultural & Environmental Sciences, 12, 57-63.

Sánchez-Casas, P., Klessig, D.F. (1994). A salicylic acid-binding activity and a salicylic acid-

inhibitable catalase activity are present in a variety of plant species. Plant Physiology,

106, 1675-1679.

Sandalino, L.M., Dalurzo, H.C., Gómez, M., Romero-Puertas, M.C., del Río, L.A. (2001).

Cadmium-induced changes in the growth and oxidative metabolism of pea plants.

Journal of Experimental Botany, 52, 2115-2126.

Schmidt, U. (2003). Enhancing phytoextraction: the effect of chemical soil manipulation on

mobility, plant accumulation, and leaching of heavy metals. Journal of Environmental

Quality, 32, 1939-1954.

Schutzendübel, A., Schwanz, P., Teichmann, T., Gross, K., Langenfeld-Heyser, R., Godbold,

D.L., Polle, A. (2007). Cadmium-induced changes in antioxidative systems, H2O2

content and differentiation in pine (Pinus sylvestris) roots. Plant Physiology, 127, 887–

898.

Scott-Craig, J.S., Kerby, K.B., Stein, B.D., Somerville, S.C. (1995). Expression of an

extracellular peroxidase that is induced in barley (Hordeum vulgare) by the powdery

mildew pathogen (Erysiphe graminis f. sp. hordei). Physiological and Molecular Plant

Pathology, 47, 407–418.

Seah, S., Sivasithamparam, K., Turner, D.W. (1996). The effect of salicylic acid on resistance

in wheat (Triticum aestivum) seedling roots against the take-all fungus,

Gaeumannomyces graminis var. tritici. Australian Journal of Botany, 44, 499–507.

Sepehri, A., Golparvar, A.R. (2011). The effect of drought stress on water relations,

chlorophyll content and leaf area in canola cultivars (Brassica napus L.). Electronic

Journal of Biology, 7, 49-53.

Sgherri, C., Milone, M.T.A., Clijsters, H., Navari-Izzo, F. (2001). Antioxidative enzymes in

two wheat cultivars, differently sensitive to drought and subjected to subsymptomatic

copper doses. Journal of Plant Physiology, 158, 1439–1447.

Shakirova, F.M., Sakhabutdinova, A.R., Bezrukova, M.V., Fatkhutdinova, R.A.,

Fatkhutdinova, D.R. (2003). Changes in the hormonal status of wheat seedlings

induced by salicylic acid and salinity. Plant Science, 164, 317-322.

135

Shan, C., Dai, H., Sun, Y. (2012). Hydrogen sulfide protects wheat seedlings against copper

stress by regulating the ascorbate and glutathione metabolism in leaves. Australian

Journal of Crop Sciences, 6, 248-254.

Sharma, P., Dubey, R.S. (2005). Modulation of nitrate reductase activity in rice seedlings

under aluminium toxicity and water stress: role of osmolytes as enzyme protectant.

Journal of Plant Physiology, 162, 854–864.

Sharma, P., Jha, A.B., Dubey, R.S., Pessarakli, M. (2012). Reactive oxygen species, oxidative

damage, and antioxidative defense mechanism in plants under stressful conditions.

Journal of Botany, 2012, 1-27.

Shehab, G.G., Ahmed, O.K., El-Beltagi, H.S. (2010). Effects of various chemical agents for

alleviation of drought stress in rice plants (Oryza sativa L.). Notulae Botanicae Horti

Agrobotanici Cluj-Napoca, 38, 139-148.

Singh, B., Usha, K. (2003). Salicylic acid induced physiological and biochemical changes in

wheat seedlings under water stress. Plant Growth Regulation, 39, 137-141.

Singh, S., Mishra, S., Kumari, R., Agrawal, S.B. (2009). Response of ultraviolet-B and nickel

on pigments, metabolites and antioxidants of Pisum sativum L. Journal of

Environmental Biology, 30, 677-684.

Skillman, J.B. (2008). Quantum yield variation across the three pathways of photosynthesis:

not yet out of the dark. Journal of Experimental Botany, 1-15.

Skladanka, J., Adam, V., Zitka, O., Krystofova, O., Beklova, M., Kizek, R., Havlicek, Z.,

Slama, P., Nawrath, A. (2012). Investigation into the effect of molds in grasses on

their content of low molecular mass thiols. International Journal of Environmental

Research and Public Health, 9, 3789-3805.

Smith I.K., Vierheller T.L., Thorne C.A. (1988). Assay of glutathione reductase in crude

tissue homogenates using 5,5’-dithiobis(2-nitrobenzoic acid). Analitical Biochemistry,

175, 408-413.

Smith, M.A., Davies, P.J. (1985). Separation and quantitation of polyamines in plant tissue by

high performance liquid chromatography of their dansyl derivatives. Plant Physiology,

78, 89-91.

Sobrino-Plata, J., Ortega-Villasante, C., Flores-Cáceres, M.L., Escobar, C., Del Campo, F.F.,

Hernández, L.E. (2009). Differential alterations of antioxidant defenses as

bioindicators of mercury and cadmium toxicity in alfalfa. Chemosphere, 77, 946–954.

136

Solovchenko, A.E., Merzlyak, M.N. (2008). Screening of visible and UV radiation as a

photoprotective mechanism in plants. Russian Journal of Plant Physiology, 55, 719-

737.

Son, J.A., Narayanankutty, D.P., Roh, K.S. (2014). Influence of exogenous application of

glutathione on rubisco and rubisco activase in heavy metal-stressed tobacco plant

grown in vitro. Saudi Journal of Biological Sciences, 21, 89–97.

Spoel, S.H., Dong, X. (2012). How do plants achieve immunity? Defence without specialized

immune cells. Nature reviews Immunology, 12, 89-100.

Srivastava, M.N., Dwivedi, U.N. (1998). Salicylic acid modulates glutathione metabolism in

pea seedlings. Journal of Plant Physiology, 153, 409-414.

Stevens, R., Page, D., Gouble, B., Garchery, C., Zamir, D., Causse, M. (2008). Tomato fruit

ascorbic acid content is linked with monodehydroascorbate reductase activity and

tolerance to chilling stress. Plant, Cell and Environment, 31, 1086–1096.

Stolt, J.P., Sneller, F.E.C., Bryngelsson, T., Lundborg, T., Schat, H. (2003). Phytochelatin and

cadmium accumulation in wheat. Environmental and Experimental Botany, 49, 21-28.

Sun, Z., Hou, s., Yang, W., Han, Y. (2012). Exogenous application of salicylic acid enhanced

the rutin accumulation and influenced the expression patterns of rutin biosynthesis

related genes in Fagopyrum tartaricum Gaertn leaves. Plant Growth Regulation, 68,

9–15.

Szalai, G., Horgosi, Sz., Soós, V., Majláth, I., Balázs, E., Janda, T. (2011). Salicylic acid

treatment of pea seeds induces its de novo synthesis. Journal of Plant Physiology, 168,

213–219.

Szalai, G., Krantev, A., Yordanova, R., Popova, L.P., Janda, T. (2013). Influence of salicylic

acid on phytochelatin synthesis in Zea mays during Cd stress. Turkish Journal of

Botany, 37, 708-714.

Szalai, G., Pap, M., Janda, T. (2009). Light-induced frost tolerance differs in winter and

spring wheat plants. Journal of Plant Physiology, 166, 1826–1831.

Szent-Györgyi, A. (1931). On the function of hexuronic acid in the respiration of the cabbage

leaf. The Journal of Biological Chemistry, 90, 385–393.

Szepesi, Á., Csiszár, J., Bajkán, S., Gémes, K., Horváth, F., Erdei, L., Deér, A.K., Simon,

M.L., Tari, I. (2005). Role of salicylic acid pre-treatment on the acclimation of tomato

plants to salt- and osmotic stress. Acta Biologica Szegediensis, 49, 123–125.

137

Szepesi, Á., Gémes, K., Orosz, G., Pető, A., Takács, Z., Vorák, M., Tari, I. (2011). Interaction

between salicylic acid and polyamines and their possible roles in tomato hardening

processes. Acta Biologica Szegediensis, 55, 165–166.

Tanaka, Y., Sano, T., Tamaoki, M., Nakajima, N., Kondo, N., Hasezawa, S. (2005). Ethylene

inhibits abscisic acid-induced stomatal closure in Arabidopsis. Plant Physiology, 138,

2337–234.

Takahashi, Y., Berberich, T., Miyazaki, A., Seo, S., Ohashi, Y., Kusano, T. (2003). Spermine

signaling in tobacco: activation of mitogen-activated protein kinases by spermine is

mediated through mitochondrial dysfunction. The Plant Journal, 36, 820–829.

Talieva, M.N., Kondrat’eva, V.V. (2002). Influence of exogenous salicylic acid on the level

of phytohormones in tissues of Phlox paniculata and Phlox setacea leaves with special

reference to resistance against the powdery mildew causative agent Erysiphe

cichoracearum DC. f. phlogis Jacz. Biology Bulletin, 29, 551–554.

Tan, Y., Liang, Z., Shao, H., Du., F. (2006). Effect of water deficits on the activity of anti-

oxidative enzymes and osmoregulation among three different genotypes of Radix

astragali at seeding stage. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 49, 60-65.

Thaler, J.S., Humphrey, P.T., Whiteman, N.K. (2012). Evolution of jasmonate and salicylate

signal crosstalk. Trends in Plant Science, 17, 260-270.

Thijssen, S., Cuypers, A., Maringwa, J., Smeets, K., Horemans, N., Lambrichts, I., Van

Kerkhove, E. (2007). Low cadmium exposure triggers a biphasic oxidative stress

response in mice kidneys. Toxicology, 236, 29–41.

Thomas, J.C., Perron, M., Davies, E.C. (2004). Genetic responsiveness to copper in the

iceplant, Mesembryanthenuum crystallinum. Plant Science, 167, 259-266.

Thulke, O.U., Conrath, U. (1998). Salicylic acid has a dual role in the activation of defence-

related genes in parsley. Plant Journal, 14, 35–42.

Valko, M., Rhodes, C.J., Moncol, J., Izakovic, M., Mazur, M. (2006). Free radicals, metals

and antioxidants in oxidative stress-induced cancer. Chemico-Biological Interactions,

160, 1-40.

Vallelian-Bindschedler, L., Metraux, J.P., Schweizer, P. (1998). Salicylic acid accumulation

in barley is pathogen specific but not required for defense-gene activation. Molecular

Plant-Microbe Interactions, 11, 702–705.

van Ginkel, M., Ogbonnaya, F. (2007). Novel genetic diversity from synthetic wheats in

breeding cultivars for changing production conditions. Field Crops Research, 104, 86–

94.

138

van Spronsen, P.C., Tak, T., Rood, A.M.M., van Brussel, A.A.N., Kijne, J.W., Boot, K.J.M.

(2003). Salicylic acid inhibits indeterminant-type nodulation but not determinant-type

nodulation. Molecular Plant-Microbe Interactions, 16, 83–91.

Verberne, M.C., Verpoorte, R., Bol, J.F., Blanco, J.M., Linthorst, H.J. (2000). Overproduction

of salicylic acid in plants by bacterial transgenes enhances pathogen resistance. Nature

Biotechnology, 18, 779-83.

Vestena, S., Cambraia, J., Riberio, C., Oliveira, J.A., Oliva, M.A. (2011). Cadmium-induced

oxidative stress and antioxidative enzyme response in water hyacinth and Salvinia.

Brazilian Journal of Plant Physiology, 23, 131-139.

von Saint Paul, V., Zhang, W., Kanawati, B., Geist, B., Faus-Keßler, T., Schmitt-Kopplin, P.,

Schäffner, A.R. (2011). The Arabidopsis glucosyltransferase UGT76B1 conjugates

isoleucic acid and modulates plant defense and senescence. The Plant Cell, 23, 4124-

4145.

Walters, D., Cowley, T., Mitchell, A. (2002). Methyl jasmonate alters polyamine metabolism

and induces systemic protection against powdery mildew infection in barley seedlings.

Journal of Experimental Botany, 53, 747-756.

Ward, E.R., Uknes, S.J., Williams, S.C., Dincher, S.S., Wiederhold, D.L., Alexander, D.C.,

Ahl-Goy, P., Métraux, J.P., Ryals, J.A. (1991). Coordinated gene activity in response

to agents that induce systemic acquired resistance. The Plant Cell, 3, 1085–1094.

Whitham, S.A., Yang, C., Goodin, M.M. (2006). Global Impact: Elucidating plant responses

to viral infection. Molecular Plant-Microbe Interactions, 19, 1207-1215.

Wildermuth, M.C., Dewdney, J., Wu, G., Ausubel, F.M. (2001). Isochorismate synthase is

required to synthesize salicylic acid for plant defense. Nature, 414, 562-565.

Willekens, H., Inze, D., Van Montagu, M., Van Camp, W. (1995). Catalases in plants.

Molecular Breeding, 1, 207–228.

Winkel-Shirley, B. (2002). Biosynthesis of flavonoids and effects of stress. Current Opinion

in Plant Biology, 5, 218–223.

Wu, G.Q., Zhang, L.N., Wang, Y.Y. (2012). Response of growth and antioxidant enzymes to

osmotic stress in two different wheat (Triticum aestivum L.) cultivars seedlings. Plant

Soil and Environment, 58, 534–539.

Xu, C., Sullivan, J.H. (2010). Reviewing the technical designs for experiments with

ultraviolet-B radiation and impact on photosynthesis, DNA and secondary

metabolism. Journal of Integrative Plant Biology, 52, 377–387.

139

Xu, J., Yin, H.X., Li, X. (2009). Protective effects of proline against cadmium toxicity in

micropropagated hyperaccumulator, Solanum nigrum L. Plant Cell Reports, 28, 325-

333.

Yordanova, R., Popova, L. (2007). Effect of exogenous treatment with salicylic acid on

photosynthetic activity and antioxidant capacity of chilled wheat plants. General and

Applied Plant Physiology, 33, 155–170.

Yusuf, M., Hasan, S.A., Ali, B., Hayat, S., Fariduddin, Q., Ahmad, A. (2008). Effect of

salicylic acid on salinity induced changes in Brassica juncea. Journal of Integrative

Plant Biology, 50, 1–4.

Zadoks, J.C., Chang, T.T., Konzak, C.F. (1974). A decimal code for the growth stage of

cereals. Weed Research, 14, 415–421.

Zagorchev, L., Seal, C.E., Kranner, I., Odjakova, M. (2013). A central role for thiols in plant

tolerance to abiotic stress. International Journal of Molecular Sciences, 14, 7405-7432.

Zawoznik, M.S., Groppa, M.D., Tomaro, M.L., Benavides, M.P. (2007). Endogenous salicylic

acid potentiates cadmium-induced oxidative stress in Arabidopsis thaliana. Plant

Science, 173, 190-197.

Zhang, F., Zhang, H., Xia, Y., Wang, G., Xu, L., Shen, Z. (2011). Exogenous application of

salicylic acid alleviates cadmium toxicity and reduces hydrogen peroxide

accumulation in root apoplasts of Phaseolus aureus and Vicia sativa. Plant Cell

Reports, 30, 1475-1483.

Zhang, Y. (2013). Biological role of ascorbate in plants. In: Ascorbic acid in plants, Springer

briefs in plant science, doi: 10.1007/978-1-4614-4127-4_2, 7-33.

Zhao, Y. (2011). Cadmium accumulation and antioxidative defenses in leaves of Triticum

aestivum L. and Zea mays L. African Journal of Biotechnology, 10, 2936-2943.

Zhao, H.J., Lin, X.W., Shi, H.Z., Chang, S.M. (1995). The regulating effects of phenolic

compounds on the physiological characteristics and yield of soybeans. Acta

Agronomica Sinica, 21, 351–355.

Zhou, F., Wang, J., Yang, N. (2014). Growth responses, antioxidant enzyme activities and

lead accumulation of Sophora japonica and Platycladus orientalis seedlings under Pb

and water stress. Plant Growth Regulation, BRIEF COMMUNICATION 1-7.

Zhou, J.M., Trifa, Y., Silva, H., Pontier, D., Lam, E., Shah, J., Klessig, D.F. (2000). NPR1

differentially interacts with members of the TGA/OBF family of transcription factors

that bind an element of the PR-1 gene required for induction by salicylic acid.

Molecular Plant-Microbe Interactions, 13, 191-202.

140

Zhu, J.K. (2001). Cell signaling under salt, water and cold stresses. Current Opinion in Plant

Biology, 4, 401–406.

Zhu, J.K. (2002). Salt and drought stress signal transduction in plants. Annual Review of

Plant Biology, 53, 247-273.

Zlatev, Z.S., Lidon, F.J.C., Kaimakanova, M. (2012). Plant physiological responses to UV-B

radiation. Emirates Journal of Food and Agriculture, 24, 481-501.

Zuk-Golaszewska, K., Upadhyaya, M.K., Golaszewski, J. (2003). The effect of UV-B

radiation on plant growth and development. Plant Soil and Environment, 49, 135–140.

141

PUBLIKÁCIÓS JEGYZÉK

Az értekezés alapjául szolgáló publikációk

Bírált folyóirat-közlemények

Kovács, V., Gondor, O.K., Szalai, G., Majláth, I., Janda, T., Pál, M. (2014a). UV-B radiation

modifies the acclimation processes to drought or cadmium in wheat. Environmental

and Experimental Botany, 100, 122– 131. IF: 2,578.

Kovács, V., Gondor, O.K., Szalai, G., Majláth, I., Janda, T., Pál M. (2014b). Synthesis and

role of salicylic acid in wheat varieties with different levels of cadmium tolerance.

Journal of Hazardous Materials, 280, 12-19. IF: 4,331.

Kovács, V., Vida, G., Szalai, G., Janda, T., Pál, M. (2012). Relationship between biotic stress

tolerance and protective compounds in wheat genotypes. Acta Agronomica Hungarica,

60, 131–141.

Pál, M., Kovács, V., Vida, Gy., Szalai, G., Janda, T. (2013). Changes induced by powdery

mildew in the salicylic acid and polyamine contents and the antioxidant enzyme

activities of wheat lines. European Journal of Plant Pathology, 135, 35-47. IF: 1,413.

Könyvfejezet

Pál, M., Szalai, G., Kovács, V., Gondor, O.K., Janda, T. (2013). Shamsul Hayat, Aqil Ahmad,

Mohammed Nasser Alyemeni (szerk.): Salicylic Acid-Mediated Abiotic Stress

Tolerance. In: Shamsul Hayat, Aqil Ahmad, Mohammed Nasser Alyemeni (szerk.)

Salicylic Acid Plant Growth and Development. Netherlands: Springer Dordrecht

Heidelberg, 183-247. (ISBN:978-94-007-6427-9)

Konferencia-kiadványok, poszterek

Kovács, V., Gondor, O.K., Majláth, I., Szalai, G., Janda, T., Pál, M. (2013). Effects of UV-B

radiation under different abiotic stress conditions in wheat. Studia Universitatis Babeş-

Bolyai Biologia, 1, 53-54.

Kovács, V., Gondor, O.K., Majláth, I., Szalai, G., Janda, T., Pál, M. (2014). The effects of

drought on plant defence system in wheat genotypes with different salicylic acid

content. In: Kőszegi Izabella (szerk.) Advances in Plant Breeding & Biotechnology

Techniques: Book of Abstracts. 96 p. Mosonmagyaróvár, Magyarország, 2014.04.28-

142

2014.04.29. Martonvásár: Pannonian Plant Biotechnology Association, 2014. pp. 49-

50. (Pannonian Plant Biotechnology Association Conference for PhD Students in Plant

Biology) ISBN:978-963-89129-5-4.

Kovács, V., Pál, M., Vida, Gy., Szalai, G., Janda, T. (2011). Effect of powdery mildew

infection on the antioxidant enzyme activities in different lines of Thatcher-based

wheat. Acta Biologica Szegediensis 55, 99-100.

Kovács, V., Pál, M., Vida, Gy, Szalai, G., Janda, T. (2012). Study of antioxidant enzyme

activities in different lines of Thatcher-based wheat during powdery mildew infection.

Abstracts Plant Biology Congress Freiburg 2012 jointly organized by FESPB and

EPSO, Freiburg im Breisgau, 366.p.

Kovács, V., Szalai, G., Janda, T., Pál, M. (2013). Kadmium tolerancia vizsgálata búzában. In:

Hoffmann B, Kollaricsné Horváth M (szerk.) XIX. Növénynemesítési Tudományos

Nap: Összefoglalók. Konferencia helye, ideje: Keszthely, Magyarország, 2013.03.07

Budapest: MTA Agrártudományok Osztályának Növénynemesítési Bizottsága, 2013.

p. 108. (ISBN:978-963-9639-50-8)

Pál, M., Kovács, V., Gondor, O.K., Janda, T., Szalai, G. (2014). Investigation on the

synthesis and role of salicylic acid in wheat varieties with different levels of cadmium

tolerance. Plant Biology Europe, FESPB/EPSO 2014 Congress, Abstract Book Poster

Presentations, Dublin, p46.

Pál, M., Kovács, V., Szalai, G., Janda, T. (2012). A szalicilsav függő védekezési

mechanizmusok kapcsolata egyéb jelátviteli utakkal kalászos gabonafélékben. I. ATK

Tudományos Nap, Felfedező kutatások az Agrártudományi Kutatóközpontban:

Összefoglalók. Martonvásár, ISBN:978-963-8351-40-1.

Pál, M., Kovács, V., Vida, Gy., Szalai, G., Janda, T. (2011). Changes in salicylic acid and

polyamine contents following powdery mildew infection of near-isogenic Thatcher

wheat lines carrying different Lr genes. Acta Biologica Szegediensis 55, 139-141.

Pál, M., Kovács, V., Vida, Gy., Szalai, G., Janda, T. (2012). A stressztűrő képesség és

bizonyos védő vegyületek kapcsolata különböző búza genotípusokban. XVIII.

Növénynemesítési Tudományos Napok: Összefoglalók, Budapest, ISBN: 978-963-

8351-38-8.

Egyéb publikációk

Kovács, V., Vida, Gy., Szalai, G., Janda, T., Pál, M. (2013). A lisztharmat-rezisztencia

élettani háttere búzában. Martonvásár az MTA Agrártudományi Kutatóközpont

143

közleményei 2013/1 XXV. Évfolyam 1. szám, 18-19. (ISSN: 1217-5498) felelős

kiadó: Dr. Bedő Zoltán, felelős szerkesztő: Dr. Veisz Ottó

Az értekezés témájához közvetlenül nem kapcsolódó publikációk

Bírált folyóirat-közlemények

Gondor, O.K, Szalai, G., Kovács, V., Janda, T., Pál, M. (2014). Impact of UV-B on drought-

or cadmium-induced changes in the fatty acid composition of membrane lipid fractions

in wheat. Ecotoxicology and Environmental Safety, 108, 129-134. IF: 2,482.

Kocsy, G., Pál, M., Soltész, A., Szalai, G., Boldizsár, Á., Kovács, V., Janda, T. (2011). Low

temperature and oxidative stress in cereals. Acta Agronomica Hungarica, 59, 153-173.

Pál, M., Kovács, V., Szalai, G., Soós, V., Ma, X., Liu, H., Mei, H., Janda, T. (2014). Salicylic

acid and abiotic stress responses in rice. Journal of Agronomy and Crop Science, 200,

1–11. IF: 2,151.

Konferencia-kiadványok, poszterek

Gondor, O.K., Szalai, G., Janda, T., Kovács, V., Pál, M. (2014). Impact of UV-B on drought

or cadmium induced changes in fatty acid composition of membrane lipid fractions in

wheat. In: Dudits D, Dusha I (szerk.) Fiatal Biotechnológusok Országos Konferenciája

"FIBOK 2014": Program és összefoglalók. 100 p. Szeged, Magyarország, 2014.03.07

Szeged: JATE Press, p. 49. ISBN:978-963-315-167-9.

Pál, M., Kovács, V., Szalai, G., Soós, V., Ma, X., Liu, H., Mei, H., Janda, T. (2014). Effects

of low temperature and drought on rice with different levels of drought tolerance. Plant

Biology Europe, FESPB/EPSO 2014 Congress, Abstract Book Poster Presentations,

Dublin, p54.

Pál, M., Kovács, V., Szalai, G., Soós, V., Ma, X., Liu, H., Mei, H., Janda, T. (2014).

Alacsony hőmérséklet és szárazság hatása eltérő stressztűrő- képességgel rendelkező

rizsfajtákban. In: Veisz Ottó (szerk.) Növénynemesítés a megújuló mezőgazdaságban:

XX. Növénynemesítési Tudományos Nap. 522 p. Budapest, Magyarország, 2014.03.18

Budapest: MTA Agrártudományok Osztályának Növénynemesítési Bizottsága, 344-

348. ISBN:978-963-8351-42-5.

144

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Köszönetemet szeretném kifejezni az MTA Agrártudományi Kutatóközpont

Mezőgazdasági Intézete vezetőségének, hogy lehetővé tette számomra a doktori disszertáció

elkészítését.

Köszönöm Dr. Janda Tibornak, hogy a Növényélettani Osztály vezetőjeként lehetőséget

és helyet biztosított a kutatómunkám elvégzéséhez.

Köszönöm témavezetőimnek, Dr. Pál Magdának és Dr. Janda Tibornak, hogy sok-sok

türelemmel és odafigyeléssel irányították munkámat és segítették szakmai fejlődésemet.

Köszönöm közvetlen kollégáimnak, Dr. Szalai Gabriellának, Dr. Majláth Imrének, Dr.

Darkó Évának és Gondor Orsolya Kingának, hogy tanácsaikra, támogatásukra és segítségükre

mindig számíthattam.

Külön köszönettel tartozom Kóti Gyulánénak† és Kövesdi Ferencnének a kísérletek

kivitelezése során nyújtott lelkiismeretes és nélkülözhetetlen segítségüket, tanácsaikat, építő

jellegű kritikáikat.

Köszönöm Dr. Páldi Emilnek és Jankovicsné Oláh Tímeának támogatásukat.

Köszönettel tartozom a Fitotron Osztály munkatársainak a növénynevelés során nyújtott

mindennemű segítségükért.

Köszönetemet fejezem ki minden kollégámnak, akik bármilyen formában segítették

munkámat.

Szeretném megköszönni szüleimnek, testvéremnek, nagymamámnak és nagypapámnak,

hogy mindig mellettem álltak, szeretetükkel és türelmükkel mindenben támogattak.

Hálásan köszönöm páromnak, hogy derűlátásával, szeretetével és türelmével mindenben

segített, ami nélkül ez a dolgozat nem készülhetett volna el.