Revitalizacin de la cepa problemaCualquiera que haya sido el mtodo empleado en la conservacin de las cepas microbianas, cuando stas se recuperan para hacer nuevos lotes para su conservacin o para trabajar con ellas, se recomienda no utilizar directamente las clulas que se han estado guardando, porque stas vienen de una situacin de estrs ms o menos fuerte (sobre todo cuando se han conservado por liofilizacin) y por lo tanto no son adecuadas para ningn tipo de prueba. Primero habra que revitalizarlas o rejuvenecerlas sembrndolas en un medio no selectivo, es decir, un medio que asegure lo ms posible el crecimiento, y a partir de este primer crecimiento ya se puede trabajar con ellas, cultivndolas en medios selectivos cuando sea necesario.Por esto mismo, lo primero que hacemos en sembrar la cepa problema en agar nutritivo y en TSA, ambos medios generales, y aprovechamos tambin para sembrar en agar MacConkey, que es un medio selectivo, en el que se inhibe el crecimiento de las bacterias Gram positivas, y es un medio diferencial, ya que permite diferenciar entre bacterias Gram fermentadoras de lactosa (lact +), que forman colonias rosas, y bacterias Gram no fermentadoras de lactosa (lact ), con colonias amarillo-naranja y medio de color amarillo:

De esta forma vamos a comprobar varias cosas: Si tenemos un cultivo puro o una mezcla de bacterias Por otra parte, vemos en qu medio de cultivo crece mejor (AN o TSA) y ese ser el medio de eleccin para el mantenimiento de la cepa por transferencia peridica que debe realizar el alumno. Desde esta placa se extraen 1-2 colonias y se siembran en un tubo con agar inclinado, perfectamente etiquetado. Se lleva a incubar a la estufa a 37 0C y cuando comprobemos que hay crecimiento, se vuelve a resembrar en otro tubo. De esta manera conseguimos el tubo 1 y el 2, que sern colocados en las gradillas correspondientes del frigorfico. Comparando las placas de TSA y MacConkey se puede extraer la conclusin de si la bacteria es Gram positiva (crece slo en la placa de TSA) o bien, si es Gram negativa (crece en las dos placas) Si observamos cmo son las colonias en la placa de MacConkey, podemos ya ir avanzando algo en su identificacin: si las colonias son rosas es lactosa + y si son amarillas y el medio es amarillo son lactosa .De cualquiera de estas placas podemos hacer la tincin Gram y comprobar al microscopio el tipo de bacteria, la morfologa y el tipo de agrupacin que presenta. Por ejemplo, Gram + cocos en racimos (estafilococos G+).Prueba para confirmar la observacin microscpica con tincin Gram: Prueba Gram KOHProcedimiento: Se coloca en un porta una gota de KOH al 3% y 2-3 colonias de la cepa. Se homogeniza con el asa de siembra describiendo crculos durante 1 minutoSi al levantar el asa de siembra se observa que se ha formado un filamento mucoso, la prueba es positiva e indica que la bacteria es GRAM NEGATIVA (el hidrxido de potasio con los lpidos de la pared G- forma una sustancia mucoide).