aa leninger
TRANSCRIPT
-
8/18/2019 Aa Leninger
1/41
ca
ítu Io
_,
..- ..-
AMINOACIDOS PEPTIDOS
..-
PROTEINAS
3.1
3.2
3.3
3.4
3.5
Aminoácidos
75
Péptidos y proteínas
85
Trabajar
con proteínas
89
Estructura covalente de las proteínas
Secuencias
de
proteínas
y
evolución
96
1 6
u isiera
que
la
pa
l
abra que le prop
ongo
proteí
na .
se
entendiera
como derivada deproteios porque
describe
la sustancia prim i
tiva
o p
rinc
ipa l de la nutr
ició
n anima l
que
l
as planta
s elab
oran
para l
os
h
erbívoros y
que
ésto
s
proporc
i
onan
a los
carnívoros
.
- J. J. Berzelius
ca rta a
G. J. Mulder, 1838
L
s
proteinas
so
n las rnacrornolécu l
as
biológicas más
abun·
clantes
y
eSlán
pre
se
me
s en todas
las cé
lulas
y
en todas las
pa r
le
s de las mismas.
La
s
proteínas t.:
lmbión prp
se ntan
lIua
gran variedad; en lila ::;ola célula se pueden encolllrar miles de
s ~ ;
de prolcfnas
diferentes , que vadan en tamaño desde
péptidos relalivamente pequeños h
a..
-
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2/41
76 Capítulo 3
Amino
ácidos, péptidos y proteínas
FlGURA
3- 1 Algunas funciones
de
las proteínas.
(a
)
la
luz producida
por las luciérnagas
es
el resultado de una reacción en que intervienen
la prolt:Ín
¡¡
'ud(erln
l
y el ATP, ca
ta
li zadJ por el enzimJ luciferasa (véJ
se
Recuadro 1.i-2). (h) los eritroci t
os
cont ien
en
grJndes cJntida d
es
de
la pro teína transportadora
de
oxígeno
hemoglo
b ina. (e) lJ proleínJ
queratina, producida por fodos los vertebrJdos,
es
el componente
es
-
prote
ín
as.
El
pr
imer aminoáci do descubierto fue la asparagiJla
en
1806. El
último
de
los
20 que se
en
contró
fup
la
(reonina,
Qlle no
fu
e identifIcada hast.a 1938.
To
dos los aminoácidos I p
nen nombres comunes o triviales que, en algunos casos , pro
vienen de la fuente de la cual se aislaron inicialmentp. Líl
aspa
ragina se enco ntró por primrr íl. vez en el espá rrago y el
ácido glutámico se encontró
eu
el gluten de trigo; la tirosina Sf'
aisló por primpra vez del qucso (su nombre provielle de l
griego tyro:>, "queso")
y
la glicina (df'1 grif'go gl Jkos,
du
lc(''')
se
de
nominó
de
esta manera debido
a ::ilI
sabor dulce.
los
aminoácidos tienen características
estructurales comunes
Los
20 aminoácidos estándar encontmdos en
la
s proteínas son
a -aminoácidos. Tienen lodos IIn
grupo
cílThoxilo y un
grupo
amino 1Inidos
al
mismo
{¡tomo de
carbonu (e l
c.:a
dJullo
a )
(F
ig.
3-2).
Difiere
ll
unos
de otros
f'n sus cadenas latera les, o
gru
pos Rt que varran
en
es t ru
ctura
, WllIailo y carga f l ~ c t r i c : l y
que influyen
rn
la solllhi lid(lc en agua de l o ~ aminoácidos.
Además
de estos
20 aJ lüJ\oácidos existen muchos más fl
Ue'
se
enCIlf'
nl
,ran con me nor frecue ncia. Algunos de eHos son resi
duos
que
llan sido modificados rlesp\l{is
de
JI sín tesis
de
una
prot
-
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3/41
Para especificar la configuración absolu ta de los cuatro
susLituyentes de los átomos de carbono asimétl;
ros
se ha desa
rrollado Wla noruellcJatura especia
l.
L.c lS corúlguraciones abso
Imas de los azúcares sencillos y los arninoácidos se especificall
mediante el
sistema
u, L (Fig. 3 -4 ), basado
f'1l
la conflguración
absoluta del
azúcar
de rr
es
c
arb
onos glice raJdchfdo, una con
vención propuesta por Emil Fi
sc
her en 1891 . ( Fi
scher
conocía
l
os
grupos que r
odea
n e l át.omo
de
carbono asimétrico del g
li
ce raldehíclo pero tuvo que at
li
vin
ar
su configul'nción absoluta;
su predicción se confi nn ó poste ri ormente por
aw
í lis
is de
di
fracción de rayos X.) Para tocios los
t o ~
Quirales, los
estereoisómeros que tienen una configuración relacionada con
la del
L-g li
ce ralde híclo
se
designan L
y
los estereoisómeros re
lacionados con el D-glice raldehfdo se designan D. Los grupos
funcionales de la L-alanina se hacen coincidi r con los del L-gli
ce raldehído alineando aquellos que pueden intl"rconve
rlir
se
mediante reaccion
es quimi
cas
Si
mpl
es
en
w\
s
ol
o paso. As í, el
grupo
carbox
ilo de la L-alanilla ocu pa la misma posición r
es
pe
cto al carbono quiral
que
el grupo ald
eh
ído del L-g
li
cerald e
hido
, pu
esto que
un aldehído puede convertirse fár.ilmente en
un grupo ca rboxilo en un solo paso media
nt
e ulla ox idación.
Hi
sló ricamente, las denominaciones similares y d
se
utilizaron
para levógiro (ql1e gira la luz a la izqUierda) y dextr ógiro
qu
e
coo-
COO-
•
H H
+
H3
N
NH,
J I : ClI ,
(a)
L-A
l
anina
D-Alanina
COO
-
COO
-
H
,Ñ
- t - H
¡
H- C -
NH
,
I
.
CH
a
CH.
1
(b )
L-A1anina
o-AJanina
COO-
COO
-
I I
Ha
N-
C-
H
H- C
NH,
I
C l [
eH
,
e)
L-Alanina
o-A
lan ina
FIGUR 3 ..3 Estc
rcoi
so mería en los a-aminoác idos. (a) l
os
dos
estereoisúmcros de
1" ~ l b n
la
1-
y la o
-a
laninil, son im
áge nes
e o
pecularcs no superponibles enlrc
sí
(cnantiómeros). (b, e) Dos con
venc iones difer
en
tes para mostrar la con figuración en
el
espacio de
Jos es tereoisó meros.
En las
f6 rmulas de perspectiva (b) los enlaces
con fo
rm
a de cuña se proyectan f
uera
d
el
pla no del papel; los enlaces
a trazos lo hace n hacia
atrás. En las
fórmulas de proyecc ión
(e)
se
su
pone que los enlaces horizonta les se proyectan fuera del plano de l
papel, los enlaces ve rt ical
es
haci . at
rás.
No obstélnt e.
se
utiliZdn a
menudo las í6rmulas de pro
yeccitSn
de modo no sistemático, sin pre
tender representa r una configur ción estereoquímica específica.
3.1 Am
inoácidos 77
' C
I I
O
OHO
O ~
¡
H- C- OH
' CH, OH
CH,OH
L-C
li cer
aldehído
o-G licc
raldehído
COO
000
+ ,
i
H
3
N- C- H
,
H -
C- NH,
I
CH,
CH
3
L-Alanina
IJ-AJanina
FIGUR
3-4
Rel ac
ión estéri
ca
de
lo
s
es
tercois6meros de la alanin .
con la confi guración abso
lut
a del l -
y
o-g
li
ce raldehído.
En
es
ta
s fó r
mulas de perspectiva los carbonos están alineados ve rt icalmente con
el átomo quiral
en el
cen tro. loS carbonos de
est
as molécu las e otán
numerados cmpez;:lIldo por los ca rbonos aldehído- o carboxito-termi
nalcs (
en
rojo) de t
a
3 y de arriba
ab
ajo tal como se mu
estr
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3.1 Aminoácidos 79
Grupos R a polares alifáticos
Grupos
R aromáticos
COO COO
COO - COO - COO - COO -
coo
I
,
I
H
+
I
+
I
+
I I
H,N- C- H
H
3
N C- H
+/ c,
H
3
N- C- H
H, N
H
H,N- C- H H
3
N- C- H
I
I
H , N CH ,
I
I
I
I
H CH,
I I
CH
CH,
/
Ó
Q
, C CH,
I
CH,
CH
g
licina Al n
nina
Prol
ina
Valioa
COO -
COO COO
OH
,
I
+
I
+
I
H, N- C- H
. I
H,N- C- H H,N- C- H
I
Fe
ni
l
alanina
.l iros
ina
Triptófano
CH,
I
H- C- CH,
I
CH,
I
CH
CH,
CH,
/
I I
I
H CH,
CH,
S
Gr
upos
R ca
r ga dos positivame
nte
I
CH,
COO - COO -
COO
-
Le ucin a Is
ol
eucina Mctio n.ina
+
I
+
I
,
I
H, N- C- H
I
H,N- C- H
I
H
3
N- C- H
I
CH,
I
CH,
I
CH,
I
Grup os R polares s
in
carga
CH,
CH,
C- NH
I
I
COO
-
COO - COO - CH ,
I
CH,
1
f H
+
I
+
I
+
I
I
C- N
H,N- C- H
H, N- H
H,N-
H
CH,
NH
H
I
I
I
I
+
CH,OH H- C- OH CH,
+N H
3
C= NH,
I
I
I
CH ,
SH
NH ,
Serina
Tr
e
on
i
na
Ci
steína
Li si
na Arginina
Hi
st idina
COO -
COO
G
rupos R cargado
s n
egativam
e
nt
e
,
I
+
I
H N- C- H H,N- C- H C
OO
- C
OO
. I
I
I
I
,
r
H
,
CH,
I
H
3
N- C- H
I
H,N- C- H
I
/ C'
CH,
CH, CH,
H,N O
I
I
I
COO -
/ C'
CH,
H,N O
I
COO -
Aspara r.,rina
Glu
ta mina Aspartato Glu
tam
ato
FIGURA
3-5
Los 20 aminoácidos es tándar de las proteínas.
la
s fór
mulas estructu ra les muest ran el esta do de ionización que predomina
a pH 7,0. las partt s no sombread as son comunes
ti
todos los amino
ácidos ;
la
s partes sombreadas en rojo son los grupos R. Aunque el
con una estructura cfclica dislintiva. El grupo amino secW1 da
rio (irnino) de los residuos de protina t iene \lna conformación
rígida q Uf' r
educe
la tlcxi bilid
i;ld es t
nlctural de la > regiones po
üpepr.ídicas que contienen este aminoácido .
rupos R aromáticos La
fenilalanina,
la ti.
rosina
y el t rilltó
fano
,
con sus cade nas laLerales aromá ticas, son relativa
mente apo l
ares
(hidrofóbicos). Todos eUos
puede
n
part
i
cipar
en interacciones hidroróbicas. El grupo hidroxilo de la tirosina
puede fo rmar puentes de hidr
ógeno y
cons
titu
ye un g
rup
o
grupo R de la hi st idina se mues tra sin carga, su p ¡¡ (
vé
ase Tab la 3-1
es tal que una f rac ción pequeña pero sig n
if
icativa de estos grupos
está ca rgada posi t
iva
menl c
él
pH 7,0.
f
Wl
cional impo r
ta
n
le
en algun
os
enzi.ma>.
La
Lrusina
y
e l trip
tófano son signH icativamen te más polares que la fe nilalan ina
de
bido al grup o h.idrox
il
o
de
la tirosina y
al
nit rógeno de l
an
i
Uo indólico de l triptófano.
El t
riptó
fano
y
la tirosina,
y en muc lLo
menor gra
do
la feni
lalani.na, absorben la lu z ultravioleta ( Fig. 3-6; Rec uad ro 3-1
Esto expUca la fue r
te
absorbancia de la [uz ca racterí
st
ica de 1
mayoría de l
as
proteínas a una longitud
de onda de 280 Jun
propi edad aprovechada por los investigadores en la C .:"lracte ri
zación e Ia..
-
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H
I
HO- C CH,
I I
H,C, + / CH- COO -
/ N,
H H
4-Hidroxip roli na
+
H, N- CH, -
CH
- CH CH, - CH- COO -
I I
OH
+NH,
5-
Hidroxit isina
CH
,,
- NH- CH
CH
CH, - CH ?H- CO
-
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82
Capítulo 3 Am inoácidos , péptidos
y
proteínas
RECUADRO
3-1
BIOQuíMICA PRÁCTICA
Absorción
de
la
luz por
las
moléculas :
ley
de
Lambert-Beer
Una gran variedad de biomoléculas absorben luz a longitu
des
de
onda caracleríslicas,
de
la misma forma que el Lripló
fano absorbe luz a 280 IUn (FiS. 3-6). La medida
de
la
absorción
el
e
la
luz mediante un espectrofolómelro se ut iliza
para deleclar e identificar moléculas y para medir su con
centración en solución.
La
fracción de la luz incidenle absor
biela por una solución
a
lma longitud de onda determinada
está relacionada con el espesor
de
la capa absorbente (paso
óptico) y con la concent ración de la especie absorben te
(Fig. 1) . Estas dos relaciones se cornbinan en la ley de L.,1m-
bert-Beer,
lo
log T
ecl
en donde
lo
es la intensidad de la luz incidente,
J
es
la
inten
sidad de la l
uz
transmitida, e es el coe
fi
ciente de absorción
(o extinción) molar en unidades de litros p
or
mol-centúne-
tro), e es la concentración de la es pecie absorbente en mo
les p
or
litro) y l el paso óptico de la muestra que absorbe
la
luz en centímet ros). La ley
de
La mbe r t -Beer supone que
la luz incidente es paralela
y
monocromática
de
una so
la
longitud de onda)
y
que las moléculas de disolvente
y
de so
luto esláll orientadas al azar.
La
expresión log(h/J) se deno
mina
absorbancia
y se designa como
A
Es import.ante resaltar que cada rnillmetro sucesi
vo
de
paso óptico de
la
solución absorbeme en
lila
cubeta de 1,0 cm
no absorbe
wm
cantidad const,.;mte sino una fracción cons
lante
de
la luz que incide en é
l.
No obstante, con una
ca
pa
absorbenle de paso óptico fijo , l absorbancia A s
dire
c
tamente 1J mporcion l a
l
concentr ción del solUlO ab
sorbente
El
coeficiente de absorción molar varia con la natura
leza del compuesto absorbente, el disolvente y la longitud de
onda,
y
t.ambién con e l p i[ si la especie
absorbente de
luz
está en equilibrio con W1 estado de ionización
Que
tiene dife
remes propiedades de absorbancia.
Intensidad
de
la luz
incident
e
FlGUR Componentes principales de un
cspeclrofolómetro. Una fuente de luz emite
luz en un amplio espectro. A continuación,
el monocromador selecciona
y
transmite
luz
de una longitud de onda determinada.
l luz
del monocromador
pa
sa a través de
la
muestra situada en una cubeta de paso
óp tico
I y
es absorbida po r la muestr
-
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+ +
NH
3
NH
3
NH
,
I
pK,
I
I
CH, CH, CH,
I
600- 600
OOH
13
Glicina
pl
9,60
------
-
7
pH
pi 5,97
pK, 2,34
0
0
- - ------ ---
------
0,5 1 1,5 2
OH
- (eq uiva len
te s
)
FIGURA
3-10
Titulación de un amin
oác
ido. Se muestra aqu í la curva
de
titulación de glicina 0,1
M
a 25 oc. la s especies ¡únicas predomi
nantes en puntos clave de la titulación se muestran encima de la gr
á-
fica. l os recuadros sombreados. centrados alrededor
de p
¡ = 2,34 Y
pK
2
= 9,60, indican las regiones de máximo poder tamponanle.
2
4
3.
1 Aminoácidos 83
A
partir
de la curva de Liwlación de la glicina se puede
deducir diversas ilúormaciones interesantes. En
pr
im
er
luga
da
una
medida cuantiwtiva del pK
a
de cada UlIO de los do
gru pos ionizables: 2,34 para el -C
OO
H y
9 GO
para el grup
- NH ; . Obsérvese que
el
grupo ca l boxilo de la glicina es má
de
10
0 veces más ác ido (se ioniza más fácilmente) que el gru
po carboxilo d
el
ácido acé
[Íco
que , como
hemos
visto en el Ca
pítulo
2, t iene
un
pK
a
de 4,76,
cerc
an
o al pr
ome
dio
pa
ra
un
grupo
carboxi lo unido a un hidroca rburo alifáti
co
sin más sus
tituyentes. La
modificación del pK .
de
la glicina está c
au sad
por la repulsión en tre el protón
sa
lien
t.e
y e l grupo amino ca r
gaclo positivamem e ce r
cano
s
ituado
en el
átomo
e c
arbono
a
tal como se clescribe en la Figw'a 3-11 . Las cargas opuestas e
el zwitterion
resu
lt.ante rienen un efecto estabi.l.izaHle, despla
zando e l eqtúlibrio
aún
más hacia la derecha . De
modo
si.mila
el pK
a
del
gru
po amino de la glici.na es menor que el pK
n
medi
de un
grupo
amino. E
ste
efecto
es
debido en
parte
a los
átomo
de o)...igeno e leetronegmivos del grupo car box ilo, que t ien
de
a
atra
er
electrones ha
cia e
ll
os, aumente'melo
así
la te n
de
ncia
de
g
ru po amino a ceder
un
protón.
Po
r ta nto,
pi gr
upo a-a min
t i
ene
un
a
men
or
qu
e e l
el
e
una
am
i
na
alifática
tal
como
l
metilamina (Pig. 3-11 ).
En
res wnen, el pKa. de cualquier grup
fL
mcional
se
ve f
ll
ertemente afec
tado
po r
su
enlomo q\límico
un fen ó
meno
que a veces es uLiliz..1.do
en
los
ce
ntros ac t ivos de
los enzimas
para
promover m ecanismos de reacción exquisita
mente adapte1dos que depe
nden de
los va l
ores
modificados de
los pK
a
de grupos dadores/aceptar
es
de prolon
es
de residuo
específicos.
6
B
10 12
w
w
rupos carboxilo
y amino metil
susrituidú :i
CH
3
- COOH
+
H
3
-C OO
W
+
H
3
- NH, CH
O
- NH
2
w
Grupos carbo
Kilo
y amino
de la glicina
Ác id o acéti
co
El normal de un
grupo
carboxi lo es a proximadamente
4,8.
,
NH,
I
+
NH
3
I
H- C - COO -I
I
H- C- COO
I
H
a-Ami
no
ác
id
o
(g lic
in a
)
pK
a
= 2,34
La repulsión en tre el grupo amino
y el protón salie
nt
e disminuye el pK
a
del grupo c8l'boxi lo y los
grupos
co n cargas
opuestas disminuyen el pK
n
al estabilizar el zwitLeriun.
H
l\,fetiJamina
El
pK
a
normal de un grupo
ami no es aproximadamente 10 ,6.
NH
,
I
H- C- COO-
I
H
a-Aminoácido
(
glicina)
pK, 9,60
Lo
s átomos de oxígeno
elect.ronegativos del
grupo
car
boxi
lo atraen electrones
del grupo amino, di smin uyendo
su pKa
AGURA 3-11 Efedo del entorno qu ími co en el pK
Lo
s valores de
p para los gr upos ionizables de la gli ci na son menores que los
de los grupos amino y car box ilo susti tuidos simplemente po r un mc
tilo. Estas modificaciones que disminu yen el pKd son debidas a ¡nter-
acciones intrarnolcculart. S.
Efe
-
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10/41
84 Capítulo 3 Aminoácidos, péptldos y proteínas
La sC'gtmda itúormación qllf" propo rciona
la
CllrV3 de
titu
lación de
la
glicina es que e::; le aminoácido Li
ene dos
regiones
d "' capackhu..lt;;tmponant;r.
ena
de
és
ta s
es
In po rción relati va
me
nt
e plana de la cu rva qu e a bnrca alrededo r de \lna unid
ad
dr pH a ca
da
lado del primer pK
a
de 2,34, lo que imtic'l que la
g licina
es
un
bu r
n t.ampón
cerca
de
es
l r pH.
La
otra zon a
de
w mpona miento está cemrada alrededor ele pH 9,GO. (Ob::;ér
vese
que
la
glicina no
es
un
buen
wrnpón
al
pH
del
flu
ido
int
ra
ce lular o
de
la
sangre, que
es
dr alrededor de 7, 4.) Dentro de
los márge ll
es
de t.ampon amleltto de la glicina, se puede utiliz.:'u·
la
ec uHción
de
Hf'nder::;oll- I-Iasse lbalch (véa::;e Recuadro
2-3)
para calcular la
proporcionE's de
esvec
i
es
dndo
ra y acepto
ra
de
protOI1f's
de
la g
li
ci
nél
que
se
requ ie ren para prepar
ar
un
Iampón a
W'I 1'
11dctC'nninado.
La curva
de
titulación predice la carga eléctrica
de
los aminoácidos
Ot
ra in formación importantE'
de
duci
da
ele la
Cll
rva de t itula
ción de un am
inoácido
e::; la relación enl re su cCtrga
eléct
rica
neta
y
el pH
de
la disolución.
A
pH
5,97,
punto
df' in
fl
ex
i
ón
C' 111 re
las dos etapas de su curva de titulación, la glit:ina
está
presente
ele
manera predominantC' f'n Sil
fo
rma di polar, to ta
l-
mente ionizada pero si n
carga
eléc tr ica neta (
Pi
g. 3- 10). El pll
caracte rístico
en que la
ca rga
eléct
rica
neta es cero
Sf>
de
no
mina punto
isoel
éc
trico
o pO is oe léc tri co, desigllado pI.
ElI e l caso
de la
g
li
cina, que
11
0 Uene
grupo
ionizable en su ca
dena la teral, e l punto isoC'léct rico e::; simplC'mente la med
ia
aritrnéti
ca de
los
dos
valores de
pK:¡:
1 l
pI
=
"2 pK + pK
2
=
"2 (2 ,34 + 9.60) 5,97
Como res
ulta
evide
nt
e de
la
Figura 3-10,
la
g liciníl tiene tilia
ca r
ga
ll
eta negativa a
cu
alquier pll
por
rl1ci ma
de::;u
pI.
por lo
qUf'
se desp
la
zará hacia el r lC'ct rodo posit i
vo
(ánodo) cuando
se coloquC' C'n un ca mpo eléct rico. A
cualquier
pll por df'hajo
de
su pI,
la
glic
iH
a tiene una car
ga
lI et
-
8/18/2019 Aa Leninger
11/41
grupos R ionizables presentes. Por ejemplo, el
gl
utamato li ene
WI pI de 3,22, considerahlemente inferior al de la glicina. Esto
es el resultado
de
la
prese
nda
de
dos g
rup
os
ca
rboxilo que, f'n
el promedio de sus va lores dp pK
l
(3,22), contribuyen con una
ca rga negati
va
neta de 1 que eq uilibra la de
+1
deb ida
a\
grupo arnino. De modo semejant(', ( \ p i de la histiclina, con dos
grupos cargados positivamente cuando es tán protona elos, es el e
7
59
(e
l promedio
de
los valo r
es de
pf(a
de
los g
rupos
anu
uo e
unidazol) , lItu t:ho mayor que el de la glicina.
Finalm
C nte, y
como
se
ha indicado
ante
rio
rment
e, en l
as
t:omticiolles
genemles
de
ex
posición libre y abier ta al e ntorno
acuoso, só lo la histidina tiene
WI
grupo R pK;:¡ = 6,0) que pro
porciona
poder
tamponante significativo al pI
ce
rcano a la
neut
ralidad presellte normalmente en los fluidos int ra- y ex
tra (:( lulares de la mayoría de
an
imales y bacte rias (Tabla
3-1).
RESUMEN
3.1
Aminoácidos
• Los
20
aminoácidos Que se encuentran nOlll1ahneme
como residuos en las prote
úu
tS cO IlLienen UII grupo
a -carboxilo,
IIn
grupo a -amino y un grupo H.
c
-
8/18/2019 Aa Leninger
12/41
86 Capítulo 3 Aminoácidos, péptidos y proteín as
(,JH
r
CH . I
( ' H
CI l,OH H H H
~
H CH H CH ,
• I I I I I I ¿ I I -
~
~ N
~ ? C O O
H
°
H O H O H O H
Extremo
amino-termin
aJ
Ex
tr
emo
c3l'boxi lo-lerminal
FIGURA 3-14 E pentapéptido
se
rilgl icilt irosinilalJnil-leucinfl,
o
Ser
Gly -Tyr-Ala- l eu. Los péptidos
se
nombran empezando por el residuo
amino-term inal que, po r convención, se si túa a la izquierd a. l os en
I ¡ces pcp tídicos están sombreados en a
mari
llo y 105 grupos R en rojo.
noácido del ex tremo de un pép lido que tiene un gl11po u-amino
libre es el residuo amino-terminal
o
N-
tprrn
inal); d residuo
del otro ex trerno, quC' tiene un grupo carboxilo librC' ,
PS
pi re
siduo carboxilo-terminal (e-terminal).
AWlque la h.idrólisis
de
un ( nlace peplídico es
Wla
reacción
exergónica, tiene lugar lentamente debido a su alt; . pnergía de
activación. En consecuencia, los ('nlaces peplidicos de las pro
teínas son bastante eS lables, con una
vicia
m( dia tI . )
de
alre
dedor de 7 años en la mayotía de
c o n c t i c i o l l e ~
intracelularC s.
Los
péptidos pueden distinguirse
por su comportamiento de ionización
Los péptidos contieHe n Wl único grupo a -amino y UIl único
grupo
a-
carboxi lo libres, lino en cada ex tremo de
Ir ('
-
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13/41
Algo
mayores son
lo >
polipéptidos pequclios y oligopépti
dos ta les como la ho rm ona pancreática insulina, que contiene
dos cadenas p
oli
pept
íd
icas, una de cUas con 30 residu
os
a
mi
noácidos y la otra COII 2 1. El glucagón, otra hormona pancreá
tica que se opone a la acción de la insulina, tiene 29 residuos.
La corticotropina es
Wla
hormona de 39 residuos de
la hipófi
sis anterior y estimula la cOl1eza adrenal.
¿Qué longitud tienen las cadenas po
li
peptfdicas de las
proteínas? Como muestra la T db la 3-2, la lo ngitlld
va
na consi
derablemenlC'.
F I
citocromoc
hu
mano
t.iene 1
04 residu
os
ami
noácidos unidos
eH
una ú
ni
ca cadena; el
qll
imotr ipsinógeno
bovino tiene 245 rf s idlloS. En el extr emo se ellcuenlra la li
tina, que tiene cerca de 27.000 residuos aminoácidos y una
masa mo lecula r de alrededor de 3.000.000.
La
inmensa mayo
ría de los polipép tidos naturales son mucho menores y conUe
nen menos de 2000 residuos aminoácidos.
Algunas prote
ín
as p >l.án constituidas por Wa sola cadena
peptfdica, pe ro otras, denominadas proteínas con subullida
des múlt iples, tienen dos o más po li péptidos asociados de
rorma no covalente (Tdbla 3-2). Las cadenas poli peptídicas in
dividuales de una proteína
eO
Il diversas subunidades pueden
ser idélllicas o diferemes.
Si
como mínimo dos son idént icas,
la proteína se denomina oligomérica y las subunidades idén
licas (constituidas por una o más cadenas polipeptIdicas) se
denominan p
ro
tómeros . La hemoglobi na, por ejemplO, tiene
cuatro subunidades p
oli
peptfe
li
cas: dos cadenas O idénticas y
dos cadenas f idénticas, unidas todas ellas entre sí por inte r
acciones
no
covalentes. Cada s
ub
wudad O está unida de forma
idéntica con wm subunidad f3 dentro de la estructura de esta
proteína con sub unidades múltiples, de forma que la hemoglo
bina puede considerarsC
co
mo un tetrámero de cuatro subwu
dades polipeptidicas o como W dúnero de protómeros
crf3
.
Unas pocas proteínas contienen una o más cadenas poli
peptídicas unidas covalememente. Por ejemp
lo,
las dos cade
nas po lipeptíd icas de la insulina están unidas entre sí a t ravés
de puentes dis ulfur
o.
En estos casos, los po li péptidos indivi-
3.2 Pépti
do
s
y
proteínas
8
dual
rs no
se
co
nsidera
ll
subwlidades, si
no
que se s uelen de
no rninar simplemenl,e cadr-nas.
Se puede calc
ul
ar el
nú
mero aproximado de res
idu
os ami
noácidos de una proteína sencilla, que no contenga ningún
otro grupo qulmico, di vidielldo su masa
mo
lecular por
1
10.
Aunque la masa
mo
lecular media de los 20 amllloúcidos están
dar es
de
alrededor
de
1
38, en
la mayoría de pro
ernas
predo-
minan los aminoácidos más pequei los; cuando se t¡pnf
1l
en
cuenta las proporciones pn qU E se presentan los distintos ami
n
oAci
dos en las proteúlas (T ..tbla 3-1),
la
masa molecu
la
r me
d
ia
está próxima a 128. Darlo que se e l.imina lll la lIIolécula de
agua 18 para crear cada enlace peptídico, la masa mole
cular media de un residuo aminoácido de una proteína es de
alrededor
de
1
28
- 18 = 1 O.
los pollpéptldos tienen una composición
de aminoácidos característica
La hidrólisis de pé
pt
idos o proteínas con ácido produce un a
mezc la de a -aminoácidos li bres. Cuando se ha hidrolizado
completamente , cada tipo de proteína da \Ina proporción o
mezcla característica de los diferentes aminoácidos. Los 20
aminoácidos estándar casi nunca se presentan ( n cantidades
iguales en una proteína. Algunos aminoácidos pueden apar€
cer
solamente una vez. o ninguna, por mo lécula en un tipo de
I;er
mi
nado
de
proteína; otros pueden prese
nt.
arse
€ n
números
elevados. La Tabla 3-3 muest ra la composición de las mezclas
de aminoácidos que
se
obtienen en la hidró lisis completa del
citocromo e y del quimotri
ps
inógeno
bovi
n
os,
este último el pre
cursor inactivo del enzima digestivo quimolripsina . 8stas dos
proteínas, con funciones
muy
diferentes, también difieren de
ma
nera significat iva en el número relativo dC rada clase de anu
noácido que contienen.
Sin embargo, lUl a hidrólisis comple ta no es sllnc
ie
nte para
obt.ene r un anál isis exacto de la co mposición de aminoácidos,
a Causa de ciertas reacciones laterales que se clan dura
ll
te el
T BL 3- 2 Datos moleculares de algunas prote ínas
a
sa
Número
de
Núm
e
ro de
cadenas
molecular residuos
polipeptldiea
s
Ci
to
e
romo
e humano) 13 .000
104 1
R
bonu
cl
easa
A pá
ncrea
s bo
vi
no ) 13
.700
124
1
Li
so
zi
ma
clara
de
huevo de pollo
)
13.930 129 1
Mioglob ina
c
orazón de ca
ballo
)
16.890 153
1
Qu
i
motripsina pán
creas
bo
v
ino
)
21.600
241
3
Quimotripsi
nógeno
bovino) 22.000 245 1
Hemoglobina
humana)
64.500 574 4
Albúmina sériea humana) 68.500 609 1
He
x
oqu
i
nasa le
vadura)
102.000 972 2
RNA po li
me
ra
sa E eoli)
450.000 4158
5
Apolipoproteína 8
humana
)
513.000 4536 1
Glut
ami
na si
nteta
sa
E
eoli)
619.000
5628 12
Titina
humana )
2.993.000
26.926 1
-
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14/41
88
Capí
tu lo 3 Aminoácidos, péptldos y proteínas
TABLA
3-3 Composición de
aminoácidos
de dos
proteínas
Número
de resi
duo
s
por mol
éc
ula de
proteína
tocromo C
Qui
mot
ripsinóge
no
Am
i
no
áci
do
bo
vino
b
ovi
no
Ala
6
22
Arg 2 4
Asn 5
15
Asp 3 8
Cys 2
10
Gln 3 10
Glu
9 5
Gly
14
23
His 3 2
lI
e
6
10
Leu
6
19
L
ys
18 14
Met
2
2
Phe 4
6
Pro
4 9
Ser 1 28
Thr
8
23
Trp
1 8
Tyr 4 4
Val 3 23
Tota l 104
245
• En al¡Un tipo de análisis, como sucede en
la
hidróliSiS ácida , Asp yAsn no
se
distlnguen y se designan Asx o B)
.
De
maflera
SllTUlar no es posible diStmguir
Glu y Gln, QIJe se designan
GIx
o Z). Además. el Trp es destru ido. Deben
emp
lealSe
procedimientos adiciona les para determ
Inar
COfrectamente el contenido
total
en ammoácidos.
proceso. P
or
ej
em
plo, los C' nl¡)('Ps anuda de las cadr nas latera
les de la asparagina y la gluli.llniu
-
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15/41
3 3 Trabajar
con
proteínas 9
Estruc tura
primaria
Estructura
se c
undaria
Estructura
te rciaria
Estructura
cuaternaria
----- -----------
Residuos ami noácidos Hélice a Cadena polipeplfdica
Subunidudcs unjdas
FIGUR 3 16 Niv eles de es lructura de las proteínas . la estructura
primaria consiste en una secuencia de aminoácidos unidos (mIre sí
el
través de enlaces
pt.>ptídicos e
inclu)'e los puentes disulfuro que exis
Idn (1 polipeptido resultante puede estar enrol lado en unidades
de
• Las proteúlas pueden ser cadenas polipeptfdic.:1s muy
largas
de
100 a varios mUes
de
residuos aminoácidos.
Sin embar
go,
algunos péptidos naturales tieuen sólo
unos pocos aminoácidos. Algunas proteúlas están
compuestas por varias cadel
la
s polipeptídicas
asoc iadas de forllla no covalCl1le que reciben el
nombre de subunidades.
La
s proteínas simples
generan tan s610 aminoácidos después de
la
hidrólisis;
las prot eínas conjugadas contienen algún Olro
componente adicional, como por ejemplo un grupo
prosté tico metálico u orgánico.
• La secuencia de aminoácidos de W1a
protC fna
es una
caraclerística propia de esa proteína que se denomina
es tru
c lma
primar
ia.
Éste es uno de los cuatro
ni
veles
con qlle generalmente se describe la
cstmc
tUTa de las
proleúlas.
3 3 Trabajar con proteínas
Nuestro conocimiento de la estructura y
fWlción
de las proleí
nas provielle' del estudio de muchas proteínas individuales.
Para estudiar
lUla
protefna
c.:on
cierto deta
lle
es neccsario se
pararla del reS10 de proteínas y disponer
de
téc
nÍf a
s que per
mi ta
n dCI,f rmillar sus propiedades. Los mé odos necesarios
provienen de la química de proteínas, disciplina mn anligua
co
mo
la bioquímica
qUf
mantiene una posició
lI
central cn la
inves tigación bioquúnica.
Las
proteínas se pueden separar
y
purificar
Una preparación pura de una proteúla es esenrial para poder
de ('rminar sus propicctades y su actividad. Pues to que las cé
lulas contirne f\ miles
ele
tipos diferentes
de
proteínas, ¿cómo
pue
de
purificarse una proteína?
Lo
s métodos de separación de
prol eíllas aprovcchan propiedades que va rían de una proteIna
a otra,
e
nl
re las que se inrluyen el kUnaño,
la
carga y
la
s pro
pj e dad es de unión.
estructura secundaria. tales como unil hélicc
a.
la hélice
es
una parte
de
la
es tructura lerci.1
i
del polipép tido plegado. el cual cs en s
mismo una
de
las subunidades que constituye n la es tructura cuater
naria
de
una proteína multisubun id
dd.
en
es
te
C
JSO la hemoglobina.
La
fuente
de W1a
proteína son generalnlf'nle las células de
un tejido o célu
la
s microbianas. El primer paso en cualquie
purificación de protemas es la rotura de estas células, para
li
berar sus proteúlas en una solución denominada extracto
c
rudo
.
En
caso n
eces
ario puede utilizarse la
cent
rifugación
diferencial para preparar fracciones subce lulares o
ai
slar de
terminaclos orgánulos (véasc I· ig . 1-8).
Una vez está a punto el ext racto o la preparación de orgá
nulo, se dispone
ele
diversos métodos para pW'ificar un:l o más
de las proteínas que contienen. Normalmente, el extracto se
s
om
ete a tratamientos
Qu
e separan 1M proLeÚla5 en dilerf'ntes
fracciones en virtud de a lguna propiedad tal co
rno
el tamaño o
la carga , Wl proceso que se denomina fracciona.miento. Los
pasos iniciales de
frd
ccionamic
nl
o de
WIa
purü'icación utilizan
diferencias en
la
solubil idad de
la
s prole fna s, que es Wla fWl
ción compleja df 1 pH , temperatura, concelllración de sal y
o
tr
os faclores.
La
so lubilidad
de
las protefnas disminuye gen€
rahnente a concentraciones elevadas
de
sal , un ( [f C tO deno
minado salting out (salado).
La
adición de- algunas sales en
cantidades apropiadas puede precipitar selectivamente algu
nas proteúlas, permancci
e
ndo
la
s restante'S en solución. E
sulfato amónico
I
NH4)2S0,
al
es particularmente efect
ivo
y se
utiUza a menudo para "salar" proteínas.
La solución que conti ene la proteína
de
int
erés
debe a
menudo sufrir otros cambios :ln
t.es
de que sean posibles pa
SO ; de purificación post.eriores. La diáli
sis
por ejemplO , es
un procedimie nto
Que
separa las prole
ú¡a
s de los disolventes
aprov
ec
handO el mayor tamailo
de
las
prot
eínas . El extra cto
parcialmente purificado se coloca en un saco o tubo de mem
brana semi permeable. Cuando ésLe se suspende
f
n un volwnen
mayor
de
solución tampollada de
fu
erza iónica apropiada
la membrana permite el int erca mbi o
de
sal y tampón, pero
no de proteÚlas. De esta forma,
la
diális is re tiene las proteínas
grandes
dentr
o del saco o tub o de memhrana, mientras que
permite que
la
concentración de los df'más solutos en la
pr
e
paración de
pr
ot.eí
na
cambir hasta llegar al equilibrio con la
solución del exterior de
la
membrana. La diálisis puede utili
\
-
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16/41
90 Cap í
tulo
3 Aminoácidos, péptidos
y
proteín
as
zarse,
por ejemplo,
para
elimi
nar
el suUato
amónico dI
una
preparación de proteína.
Lo s mélOdos más potentes para el fraccionamiC'nto de
prote ínas utiUzan
la
cromatografía
en
c
ohullna
,
que
aprove
cha las diferencias
de
carga, ta.lllaflo, afinidad
d('
unión y otras
propiedad es de las proteínas (Fig. 3-17). Se
intl'Och
l(,C'
C 11
\lna
col umna un material sólido poroso
de
propi
edades
quími cas
adecuadas
(la fase
es
tacionaria )
y
se
ha
ce
pasar
a trav(>s
0('1
mismo una sohlción
tamponada
(la fase móvil). La sol ución
q1le contiene las proteínas se introduce en la cabeza de la co
IW IUla
y a continuación
se
úJtra a
lr
avés de
la
matriz sólida, en
forma de una banda que va expandiénd ose cont,ill1lamente
de
nt
ro de> la f
ase
móvil (Fig. 3-17). Las proteínas individuales
migran más rápido o más
lentamente
a trav0S de la columna
en
función de sus propiedades. Por
ejemp
l
u,
en la cromato
grafía
de inte rcambio catióIlÍco (Fig. 3- 18a), la matriz só
lida tiene grupos cargados negativamente.
En
la fasC' móvil , las
prot eínas rO I1 ca rga positiva net.a migran más le lllamente a
través de la matriz Que aqué llas con c cada una de la s bandas de prot.eína.
La f igu ra
3-
18 mllesl
ra
otras
dos
va ri
antes
de
cro
mato
gra fía en co
lu
mna
además
de la de intercambio iónico. La cro
matografía de exclusión mol
ec
ular
separa prot.eínas según
Sil tamaño. I:;n este m
ét
odo , las prolcinas
de
mayor tamaño
emergen de la columna antes
que
las pequefías - lIna o bserva
ción
que cont
radice la inLUición en cie rto modo-o La fase só
lida co nsiste en pcqueilas perla s, pa rUculas
que
contienen
unos poros o cavidades
d
tamai to calibrado. Las proteinas de
mayor tamaiío no
pueden
ent rar e n las cavidades, por lo
que
loman el camino más co rto Cy más rápido) a lravés
de
la co
IlIm
na , rodeando las pa rtículas por
('
1exterior. Las pruteínas
más pequeflas penetran C'n las cavidades y, por tanto, migran
más lentamente a
través
tle la collUnna (Pig. 3- 18b).
La
c
ro
matografía
de afinidad se basa e
Jl
la afinidad
de
unión de
[a
s proteúlas. Las partículas de la columna t ie nen en este caso
un grupo químiCO un i
do
covalenteme
nt
e. Una
proteína
afín a
es te grupo quúruco particular se unirá a las partículas
de
la co
lumna, lo que retardará su nLi gración (Fig. 3-18c).
Un refmumiento moderno de los métodos eromatográlicos
es la
UPL C, o cromatografía
líquida
d e
alta
resoluc,ión,
La HPLC ul Hiza bombas de alta presión
que
aceleran el movi
miC'nt.o
de las moléculas de
prot
eína cn la colurtma, así como
materiales cromatográ licos de calidad superior
que
pueden so
port ,1r la
fu
ert.a de compresión del flujo presurizado. l redu
cir el tiempo de tránsito
en
la columna, la
HPL
C puede liItutar
FIGURA 3-17 Cromatografía en columna. Elementos estándar de una
columna cromatográ(ica.
Un
material sólido poroso se deposita en el
interior
de
una co lumna hecha generalmente de plástico o vidrio. El
ma te
rial só
li do (matriz) co nstituye la (ase estacionaria, a través de
la
cual flu ye una solución, la fase móvil. la solución que sale de
la
-
lumna por la parte inferior (el efl uente) es reemplazada constante
mente por solución suministrada por
un
depósito en la parte superior.
la solució n de proteína ql le debe separarse se depositJ sobre la ca
beza de la
co
lumna
y
se deja pcrcolar hacia el in terior de IJ ma
tri
z só
lidJ. Se arade
má
s solución sobre e lla.
la
solución de proteína forma
una banda
de
ntro
de
la fase móvil que tiene inicialmente
la
anchura
de
1
-
8/18/2019 Aa Leninger
17/41
• Carga posit iva neta
gr
and e
• Ca rga
po
s
it.iva
neta
O Carga negati
va
neta
• Ca rga negativa neta
Partíc
ul as
poliméricas con
gru pos fu ncional
es
cargados
negat i
va
mente
Se aña
de la mezcla
de proteínas a la
co
lum
na
qu
e cont.
ie
ne
in t
ercambiadores.
•
i
t
:
U[
1 3456
Las proteínas
se
desplazan por In columna a
veloc idades
de
tenninadas por su carga neta al
pH u sado. Con los in tercambiadores ca
t.
i6nicos,
las
pro
te í
nas
con
más carga
n
eta negat iva se
(a)
despl
azan más
rápido y cluyen
a ntes.
FlGURA 3-18 Tres métodos cromatográficos para la purificac ión de
proteínas. (a) l a cromatugrafía de intercambio iónico aprovcchJ I J ~
diferenc..:ids en el
signo
la magn
it
ud
de
l
as
cargas eléctricas netas
dc
las proteínas a un pH determ inado. l a
ma
triz de la columna es un
polímero sinlélico que tiene unidos grupos cargados; los que tiencn
uni dos grupos aniónicos son intercambiadorcs ca tiónicos
y
los que
ticnen unidos grupos catiónicos,
intercambiadores
aniónicos. Se
muestra
-
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18/41
92 Capítulo 3 Aminoácidos, péptidos y proteínas
TABLA
3-5
Tab
la
de purificación para
un
enzima hipotético
Volumen de la
fracción Proteí
na total Actividad
Actividad
específica
Procedimiento o
pa
so m i) mg) un idades) unidadesj mg)
1. xtr
acto ce
lular
crudo 1400 10 000
100 .
000
10
2. Precipitación
con
sulfato amónico 280
3000
96 000
32
3.
Cromatogr
a
fía
de
intercambio
iónico
90 400 80
.
000 200
4 Cromatograf
ía de exc
lu
sión por tamaño
80 100
60
.
000
600
5. Cromatografía de
afinidad
6 3 45 000
15
.000
Nota: lodos los datos represenlan el estado
de
la muestra después
de
haber efectuado el procedimiento indicado . la actMd
ad
y a actiVidad
espec
ífica se de fi
nen en
la página 94
la expansión de las bandas
de
protpÍlla por di
fu
sión
y
por tanto
mejorar notableme
nt
e la reso
lu
ción.
La
es trategia
de
purificación
de
una
prot
eína quP no ha
sido pre\o;amente aislada
se
gufa tanto por los prf'ccdelltes es
tablecidos como por el sentido común . En la ma
yo
ría (if f'asos
deben utilizarse varios métodos iliferenl('s de mo
clo
secupnf'ia l
pa
ra pu
ri
fi
ca r
co
mpleLam(,nle una proteína. La ~ m o A menudo los m
ét
odos tTomatogn'ificos no ~ O l l prá(' li f'os
en las primeras fases debido a
Que
la ca
llL
idad
dr
me
di
o cro
matogl'áfico npc
f'
s
fl
rio amue
ll
la con el lamailo
tl
e
la mU f's
tra .
A
I11pdida
que se
com plp
t.a
cada p
aso
dp pu
ri
fi
cación, e l
la
ma l
lO
de
la
mues tra es generalmcnte me
ll
or (Tahla
3-0), lo
que
ha
ce posible ulili
7..a
r pl'ocedimip
nt.
os c romatográficos más
so
fi
s ticados y
ca
ros) en
la
s
N
-
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e
Pocillo
Dirección
O
0
del
desplazamiento
0 O
O
O
O
0
O
O
(a)
GUR 3-19
Electrofores i
s.
a) Se cargan diferentes mues lras en los
pocil
los o depres iones en la parte superior de un gel de
poliacrila
mida. la s
pro leínas
se tras ladan J través del
gel
c
uando se
aplica un
campo eléctr ico. El gel manl ienc al mínimo las corrien tes de convec
ci ón producid
as
por pequeños gradient
es
de tcmpe
ratuf
-
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~ · l
I
=:1
Prime ra
-.
dimens ión
~
pI
decrecien
te
Enfoque
1 . '
1
soelé
drico
~
.
'
-.-
1
))
)
) )
El
gel
de e nfoque
isoeléctrico se coloca
sobn;
un
ge
l de
po
liacrilamida con
SDS.
Segunda
dim
ensión
Ele
ctrofor
es
is en gel
de
pol iacrilamida
con
SDS
(a)
1
•
- pi
---+
decreciente
miligr
amo de
p
roteí
na ( F
ig.
3-23).
La
actividad específica
cons tituye una m
ed
ida de la
pur
eza enzimática: a
wnenta
du
ran te la puri
fi
cación de
un
enzima y llega a se r máxima y cons
tante
cuando el enzi.ma es puro
(
f
abla
3-
5)
.
Des
pués
de cada paso de purificación,
se
determina
la
ac
tivid
ad
de la prep
aración
(e
n wli
dades de
esp
ec
ifidad enz
i
.má
Lica),
se
determina
i
ndependientemente la cant
idad
total de
proteína y
su
cocie
nt
e da la
actividad
específica.
La
actividad
y
la proteína
tot
al generalmente dismin uyen en cada
paso.
La
actividad disminuye p
or
que siempre
se
produce algwla pé r
dida debido a i.nactivaci6n O
a
in teracc
i
ones
no
óptin13S con l
os
ma leriales cromatog
ráficos
o eOIl
ot
ras
molé
culas de
la sol u
ción.
La
proteína total disminuye p
orque e l
objetivo
es
e lirninar
ta
nt
a proteína no
deseada
o no
es
p
ecífi
ca como sea pos
ible.
En L
Ul
paso de
pur
iflcaciólI exitoso, la pérdida de prote
ílL
a no
específica es
m
uc
ho mayor
que
la
pé rdida de
ac tivi
dad;
por
tanto,
aun
cuando
la act.ividad
total disminuye,
la
actividad es
pecífica a
um
enLa. Los datos
se recoge
n fmalm enle en lUla
1:.: -
bIa de puri
fi
cación similar
a la
Tab
la 3-5.
Generalrnem e se
3.3 Trabajar
con proteínas
95
r-r , -
. -
(b )
AGURA 3-22 Electroforesis bidimensional. (a) L
as
proteínas se se
paran primero mediante enfoque isodéctrico en
un gel
cilíndrico.
A
continuación se extiende el gel horizontalmente sobre un segundo
gel, en forma de plancha , y las protcínas se separan mediante electro
foresis en ge l de po liacrilamida con sos.
l
separación horizon
ta
l re-
fleja l
as
d
ife
rencias de p
i;
la ve rt icJI
re
fleja l
as
d
ife
rencias en masa
molecular. (b) Utilizando esta técnica se pueden separar más de 1000
proteínas diferentes de E
coli
cons
idera
que lUla prote ína es pura cuando pasos adicionales
de
puri
ficac ión
no con
siguen
au
m
enta
r 5
11
act ivi
da
d
especí
fica y cuando só
lo se pu
ede detectar W \a especie prote
i
ca (me
(li
ante
electroforesis, por ejemplo).
En
el
caso de proteínas que no sean enzimas, se requieren
ot ros métodos de cuantiricacióu. Las protemas de transporte
p
uede
n
dete
rminarse p
or su
un
ió
n a
la molécula
que
t r
ans
p
or
ta
n ,
y las
hormo
na
s
y
l
as toxinas por los
ef
ectos bi
ológicos
que
producen; por
ejemplo, l
as
hormonas
de crecun
.i
ellto estimulan
el
crec imiento de ciertas células cultivadas . AJgunas proteínas
es t
ru
ctura
les
rep
r
esent
an u
na
fracción
r.a
n
gr
ande
de
la
masa
tisula r que pueden ex t
r
ae
r
sf
y
pUlIDcarse
fác.:ilmente s in
nece
sidad de un ensayo fW
1ciona l.
Los métodos son tan
v
aria
dos
como las propias proteínas.
AGURA 3-23 Actividad frente a actividad
esp
ecífica.
Se
puede ilus·
trar la d
if
erencia entre es tos dos términos considerando dos recipien·
tes con canicas. Ambos cont ienen el mismo
nú
mcro de canicas ro j
as,
pero can tid< ldes d iíerentes de l.:tlllicas de otros colores. Si se consi
dera que l
-
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22/41
96 Capítulo 3 Aminoácidos, pept ldos y proteínas
R SUM N
3.3 Trabajar con proteínas
• Las
proteínas
se
separan
y
purifican e
l1
fWlcióll
de
difere
lld
as sus prop iedades. Las prot e
ín;1
s se
pueden
prec
ipit
ar
selectivamente mediante la adidón
de cie rtas sal('s. 8xistc una amplia ~ l I l 1 a de métodos
cromatogr{ificos que
exp
lotan las difereJlcias de
tantano, afinidad
de
unión, carga y o
tr
as
propiedaelC's.
~ n t r estos métodos se il1cluyen las cromalOgrafias
de int.e rcamhio iónico, de exclusión molecular, de
afini
dad
y liquida de alLa rpsolurión.
• La electroforesis se para proteínas sf'gün S1I masa .r Sil
('arga. La e lec troforesis e n gel con SDS y el enfoque
h:ioelécl
rko
se pueden u\
iUzar
por spparado o
combinados para oblene r
lUla
Illejor
resoludól
l.
• Todos los procedimienlüs de purificación reQuierfn
un m(>todo para cuanlilica r o d isti nguir la proteína
de interés e
l1
presen
da
de ol ras proteínas . La
purificación puede segu.i rse mediante la
determinadón de
la ael ividad psp('('ífira.
3.4
Estructura covalente de las proteínas
La
pm if¡('ación
de
una proteína
es
ge neralmen te tall sólu el
pr
elud io
de una
dis('('dón rlf'lallad
-
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proteínas eslaucul relacionadas de algÚl\ modo.
Ap
-
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24/41
98 Capítulo 3 Aminoácidos, peptidos y proteínas
Polipéptido
NO
F'DNB
(a )
lI el6 t.I
NH
R
- ¿H
I
NO ,
Se identifica el resi duo amino-
tenninal
del polipéptido.
COO-
Amino·
ácidos
libres
Derivado de
2,4·di ni t rofenilo
del polipóptido
Derivado
de
2,4·
dinitrofenilo
del residuo
amino·lermi
na l
J
renili80tiocmnnto
r\
H
H
C
N S (
\ / w
I I
Se
ide ntifica el r
es
i
duo
amino-terminal; purificación
y
reciclaje del fraf:,. IDento
peptídico
resultante
a
través
del proc
es
o de Edman.
(b )
C- CH - HN CH
J R }¡.
Derivado ani linotia
zolinona del
re
siduo
aminoácido
Derivado feniltiohi
dantoína
del
re
siduo
aminoácido
R
2
R
3
+ Póptido
HaN- C- C- N- C- C 'V'\...
recortado
H H H
ducto
e PTC
O O
FIGURA 3-25
Pasos en la secuencia
ció
n d e un polipépti
do
. (a) la
ide
nti
ficación del residuo amino-tc
rm
i
lMI
puede ser el primer paso
de
la
secuenciación
de
un polipéptido. Aquí se
mUlo'$
trd el método de San
ger para iden tificar el residuo amino-Ienninal.
(b) El
procedimiento
de la degradación
de
Edman permite obtener la
~ e c u e n c i c.:om
pleta
una prorrfna, siempre que cada uno tenga Ull residuo amino
termimll diferente. Por ejemplo, si
la
insulina se somete a es le
procrdimicnto se marcarían dos residuos, Phe' y
Gly
(
F i
g. 3-24).
Para
src
ucnciar un polip pUdo cor
npl
elo se uliliza nor
maLmeme un método químiro
cl
isí'i'lado por Pehr I
;d
mall . El
procedimiento de la de
grad
ac
ión de
Edman
marca y rlimina
sólo
el
residuo amulo-terminal de un péptido, dejando el resto
de enlaces pcptíclicos intactos (Fig. 3-25b). Se hace reaccionar
el
péptido con fenilisoliocianato en condiciones alcalinas sua
ves, lo que convierte el
aminoáddo
amino-I.f'rminal en un
aducto de fenilliocarbamilo
(lYI'C ).
I ~ I enla
ce
peptídico conti
guo al ad u
cto
de P'l'C se rompe a conLinuación f l Ilna reac
ción llevada a cabo por
el
{¡cido
tr
illuoroacético anhidro, cotila
consiguiente eli..IlIi
.nad
ón del aminoácido amino-tc rminal en
forma oe anilinotiazolu tona .
El
aminoácido modificaoo sr
rx
trae con cisolventes orgánicos, se convie rte en
tUl
derivado fe·
nilLiohidamoína m:i.s estable, mediante tral:.tlllienlo con árido
de un pép tido.
En
el caso de péptidos
co
rtos este método por sí solo
da
la
secuencia
co
mpleta, por
lo
que
fr
ecuentemente se omite el paso
(a). El
paso
(a) resuILa
útil en el caso de
po
lip
ép
tidos
de
gran tamaño
que a menudo se fragmen tan en péptidos más
pe
-
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25/41
La long itud
de
polipéplido que
puede sec
u
enciarse
co
rrectamen
te mediante la degradación de Edman depende de la
e
fi
ciencia
de
los pasos q1límicos individuales. Consideremos un
péptido
que empi
ece
con la secuencia Gly-Pro-Lys- en
su
ex
tr
emo
amino.
Si
la glicina
se
elimin
ara
con ulla efici
enc
ia del
97 ,
el
3 de
las moléculas del polipéptido en la so lución
malltendrían
un
r
es
iduo
de
Gly en su
ex t
remo arnmo.
En
el se
gundo ciclo de
~ d m a
el 97
de los runinoácidos liberados se
ría protina y el 3 glicina, mientras que un 3 de moléculas
del polipéptido
mante
ndrían r
es
idu
os de
Gly (0, 1
)
o
Pr
o
(2,9 ) en
su
ex trerno am
in
o. 8n cada ciclo, los
péptidos
que
no han rcaccion
ado en
los ciclos a
nt
erior
es aporta
rán amino
ácidos a un fo
ndo
que cr
ece
continuamente, hacie
nd
o fina
l-
mente i
mp
osible
dete
nn
inar
cuál
es
el si
guiente
aminoácido en
la secucncia pep
tíd
ica o
ri
ginal. Los secuenciadores modernos
alcanza
ll
eficiencias superiores
al 99
por cic
lo
, pe
nni
tiendo
sec
u
enc
iar más
de 50
residuos aminoácidos co
nt
iguos
de
un
polipéptido .
La
es tructura primalia de la insu lina, resuelta por
Sanger
y col
aborado
r
es
a lo largo
de un pe
ríodo
de 10
ailos,
podria ser ahora
det
e
nn
iuada por completo en un día o dos.
las proteínas
grandes deben
secuenciarse
a partir
de
fragmentos
más pequeños
La precisión global en
la
determinación de
una sec
u
encia
de
aminoácidos disminuye generalmente a medida que aumenta
la lon
gitud
del p
ol
i
pépt
ido.
Lo
s polipépt.idos
eno
n
ne
m
ente
grandes
que se encu
en t
ran en las
prot
eú tas han
de
r
ompe
rse
en
tro zos más pequeños
para
poder secue
nciarlos
de
man era
eficiente. Este proceso consta de vanos pasos. En
pr
i
mer
lugar
3.4 Estructu ra cov
alent
e de las proteínas 99
se rompe la proteína en un conjunlO de fragmentos e c í f
mediante métodos quúnicos o enzimáticos.
Si ex
isten puentes
disulfuro ) es
necesa
rio romperlos.
A
cont illuación se
purif
ka
cada fragmento y se secuencia mediante el procedimiento de
Edman. f'inalme
nte
se determina el
orden
en
que
los fragmen
t
os
aparecen en la pr
oteú
ta original y se de te rmina dónde es
tán
localizados, si es que los ha
y lo
s enlaces disulfuro.
otura
de
los
enlaces dlsulfuro Los
puentes
disulfuro interfierrn
en e l
procedimiento
de secuenciación. Un residuo de cistina
(Fig. 3-7) al qu
e se
cor
ara uno
de
sus enlaces peptídicos m
diante el pro
ce
dimiento de
Edman
podr ía perlllanecer mudo
a
otra cadena
po lipeptfdica a trav
és
de su
puente
disulfuro.
Lo
s
puentes disulfuro también interfieren
('
n la rotura enzimática
O química del polipépticlo. En la Figura 3 ~ 6 se esquematizan
dos rn
étodos
ut
ili
zados para romp
er
e
nl
ar:es disulfuro de ma
nera irreversible.
otura de la cadena polipeptidica Pueden utilizarse va rios méto
dos
para frag.menta r la
cade
na polipeptfd ica. Lo s enzimas
de
nominados
pr
ot
easas
catalizan la r
otura
hidrolitica
de
los
enlaces peptídicos.
A gw'\as
proteasas
COltan
solamente los en
la
ces
peptfcJicos adyacen
tes
a residuos aminoácidos específicos
(Tabla 3-7) y por tanto fragm
enta
n una
cadena
polipeptfclica
de
forma predecible
y
reproducible. Vatios reactivos químicos
cortan también los en laces
peptídi
cos adyacentes a residuos
específicos.
En
tre
las proteasas, el enzima digestivo tripsina cataliza la
hidrólisis de
tan
s6lo aquellos enlaces peplídicos en los que el
grupo carbonilo es tá
propo
rcionado por un res iduo de Lys o
~
Pue
nt
e disul
fur
o
(cistina)
f
CH
,S
H
I
CHOH
I
C
HOH
I
CH,SH
Ditiot reitol (D1'T)
~
NH
O
I
O
NH
I
HC- CH, - S
I
C= O
O= C
I
HC- CH
S- O-
I
- O- S- CH
2
- CH
I
O
Residuos de
ácido cisteico
O HN
~
FlGURA 3-26 Rotura de pu entes disul furo en proteínas. Se ilustran
los dos métodos
más
comunes.
lJ
oxidación de un residuo de cistinf¡
con ác ido pcrfórmico produce dos residuos de ác ido cisl
ei
co.
La reducci
ón
con ditiotreitol que da lugar a residuos de
Cys
se
ha de completJr co n una modificación adicional de
los
grup
os
H reactivos para impedir
la
reformación
del
puente disulfuro.
la acetilación con yodoacetato es
útil en este
últ imo caso.
O= C
I
S- CH CH
I
HN
~
~ N
~
NH
I
HC- CH
2
-
SH
I
C= O
,s
I
H
C -C
H
.
S- CH,- COO-
I -
C= O
f
O= C
I
HS- CH
C
H
I
HN
j
' ~
... uuXllllet.1 aClón
me
d ian le
yodoacetalO
- OOC- CH
2
- S- CH
2
C
H
I
HN
,s
Residuos
~
de cistcína
carboximct.ilados
-
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26/41
1 Caprtulo 3 Aminoácidos, péptidos y proteínas
TABLA 3- 7 Especificidad
de
algunos métodos
usuales de fragmentación de
cadena
s pOlípeptídicas
Tratamient
o (o
rigen
biológico; Puntos de corte
t
Tri
ps
in
a
Ly
s,
Arg (C)
(p
án
creas bovino)
Pr
oteasa
de Submaxillarus Arg
(C)
(glándula submaxilar de ratón)
Quimotr
ipsi
na Ph e,T
p
,Tyr
e)
(páncreas bovino)
Proteasa V8
de Staphy/ococcus
aureus
Asp,
Glu
e)
b
ac
ter
ia S. aureus
Proteasa As
p-N
Asp
,Glu
(N)
(bacteria Pseudomonas
tragi
Peps
ina Ph
e
Trp Tyr (N)
est
ómag
o
porcino)
Endoproteinasa Lys e Lys e)
(bac
teria
L
ysobacte
r
enzymogenes
B
ro
m
ur
o de
cia
nógeno Met
e)
•A
excepción del bfOmufo de cianógeno
,
todos
l
os
reactJvos
pfoteasas
,T
odos pueden
obtenerse comerc
i
almente
.
tReslduos
Que apo rtan
el pu
n
to de
reco
Jl
OClm i
CJlto pflm8JlO para la
pfoleasa °l
reacLvo
:
la rotura
del eJl l
ace
peptfdiCO llene
lugar
eJl
el
lado carbontlo (e) o am l
no
(N)
de
l t CSlduo
aminoácido indic
ado
,
Arg, independientemente de la longiwd o Sf'C'lIf'nria Of' amino*
ácidos
de la cadena . De este ItlOUO predecirse el n
(¡*
mero
de
p
ép
liuos
de
lnenQr tarnaiio producidos por rOllira
('on
t ripsina a partir
de
l n¡'¡mero rotal
Of'
resiollos
oe
Lys o Arg del
polipéptiuo origina l, determina
do
a partir de la hidrólisis de
una ITIUestn1 intact:J. (F'ig. 3-27). Un polipéptido CO II dllco res i
d
uos
de
Ly
s y/o Arg darú lugar
I\
o
rma lmente a
seis péptirlos
más pequeii.os al se r cOl1ado po r In lripsina. df'más, todos ex*
r('pro lino l('nnrán IIna Lys o
Arg
carb oxilo*le rmiltaL
Lo::;
frag
mentos producidos por acción de la tripsin:'l (11 01 r r llzi mO
r
el Vrocedlntiento
de
8dman.
Ordenaci6n de los fragmentos pep tídlcos Ahora debe' c rtrrmi*
narse el
orden
de estos "fragment
os
dp tr ipsina" PIl la
cade
na
polipe ptídica original. Se corla otra mue::;trct del polipéplido in
tacto en fragmentos milizando un rnzima o rp3('tivo oifereme,
q1le co
rt
e e nlaces peptídi cos en puntos diferentes a los corta
dos
pOI'
la tri psi na. Por ejemplo. ('1bromllro op ó ~ p n o sólo
rompe aqll('lIos pnl a('ps pppt.íd icos P Il los que el grupo
ca
rbo
nilo es aportado por
.\1
c l. Lo s fragmcntos r('slllt a l11('s d(' f'slr
s('gundo pro('('dim
ip nt
o SP spparan y sec
ll
pndan igual que lo::;
allteriOJ'es.
Se pxaminan las secuencia::; de aminoácidos de cada frag*
I11rnt.o
obtenido con lo::; dos procedimientos
el
e rotura con e
ll ü
1
d e ncontra r pé pt idos prodllrto del segun do pro
ced
imien*
la cuyas
sec
uencias establezcan una co nt inuidad, deb ido al
solapami('n lo, ('lllrC' los fragmentos obtenidos pO
I'
el primer
proce
dünielllo de ro lura (Fig. 3-27).
p ( p t i d o ~
solapanrps
obten
idos a pa rtir de
In
segunoa fragmpnl.ación dan el orden
rorrecto de
los fragme
nt
os pe
pt
í(
li
cos obte rud os e n la
pr
imera.
Si se ha identificado ('1 aminoárido amino-lerminal previa
m('nt,p a la rotura original de la proleú la
,
se
puede utilizar sta
iJlformación para estclblecer cuá l es e l fragmento que proviene
del
ex tr
emo amino. S(' pllf"df'n ('omparar los dos conjwltos de
fn1g mpnt.os para delectar posibles e rrores al determinar la
::;t'c
uencia
el
e aminoácidos
de cada
fragment.o. Si el
segundo
procedimiento
de
rotura
no eOllsigue es tablec er cont inuidad
elllre texlos
lo
s péptidos d(' la pl;mera rotura, deberá utilizarse
un 'rrcero o incluso un cuarto, méto
do
ele rotura para obtener
UII conjun to de pépti dos que pueda proporcio
nar
los so lapa*
mientas n('r('&11;OS.
L
oca
za
c
ió
n de
lo
s
pu
ent
es
dlsu/fu
ro
Si
1: 1
estl1lcLul'a pr
imada
in*
rhly(, pll('n l('s disulruro, su localización se determina en tu1
pitSO adidollal una vez completada la s('cuenciaciÓIl. De nu('vo
se
corta
una ll1ueS
Ll'n
d(' la protf'í
na
con un rea c tivo como la
1ripsina, pero e::; la vez S
iH
romper los puentes c1 islllfllro. Los
pép tidos
]'C's
lllta
ntes
s('
separ
an por el
ect
roforesis
y
se comp
a*
'fln con el conj unto original de pép[idos generados por la u;P*
silla.
Por ca
da
pue
nt e disulfuro raltarán
dos
O
f'
los pépl idos
originales, al
I
iempo Cjue aparf'cerá un lluevo péptido lH ás
gramle. Lus dus pép titl os que ha n o
rsa
parC'ddo rrpreseman
Ins ( ' ~ del polipéplido intucto
que
estáll unidas por e l
puente disulfuro.
Las
secuencias de aminoácidos
se
pueden deducir
también mediante otros métodos
1:1mrtodo ('sCju('l11a l zado anter
io
nnellle 110 es la (mica forma
de det erw iJ\a r secuencias de aminoár idos. N 11('VOS mptodos
basados e n la es pec ll'
OI11N
ría dC' masas pe rmiten la secuencia*
rión d(' poliptspl dos cortos
(20 a 30
res iduos a rninoáciclos) e n
::;ólo unos pocos minutos ( J{c('undro 2 ) . Además, el desarro*
110
dC' m{-todos rápidos para la secueuciación de
DNA
(Ca pí
tu
lo 8),
el
de,c
ifrado
de
l có
di
go gen
ét
ico (Cap ítul o 27) y pi
c esélrrollo ctC' tt rnkns pa ra eJ aislanuento de ge nes (Capít
uJ
o
9) permit.en
deducir la secue
nc ia
de
un polip
ép t
ido m('diantC'
léI
dcte l'minnrión df' la spc uencia de l1ucleótido::; deJ gen que lo
codi
fi
ca
(Fig. 3-28) . Las t
éc
n
icas
ut
ili
zadas
pnrél
of'term
illar
s c (
c i n ~
d(' prol.f'ínas y
DNA
son complementarias, Cuando
sr di
spone
del gen , la
::it cue
nciación del DNA puede ser más
rápida
y
más precisa que la secuenciación de la proteína. La
mayorín nf' protpínas SE secuencian actualmente por esta vía
imli recLa.
Si
no se ha ais lado el s( 'n es nf'('esm;a
In
sec uenr ia*
rión
dirf' r la
-
8/18/2019 Aa Leninger
27/41
s- s
/
\
Procedimiento
hldróliAiAj
separación
de
los aminoácidos
Polipéptido
HS
/
se hoce rcncdonar
con 1· DNBj hidrólis is:
separación
de IOfi
a minoácidos
se reducen
los
enlaces disulfuro
(s i loe
ha
y)
SH
\
A
C
D
E
G
3.4 Estructura covalente
de
las proteínas 101
Resultado
5 H
2 R
1
2
1
3
S
2
4 K 2 l 1
2
L 2
V
1
I
M 2
Y
2
3
P
3
Se detecta 2-4-
d.initrorenil
glutamato
Co
nclusión
El polipéptido
Li
ene
38 resi
duo
s am inoácidos.
La tr ip
sina
co rtará
tr e
s
veces [en una R (
Arg
) Y
dos
K
(Lys»
dando
cuatro
fragmento
H.
El
bromuro
de cianógeno corta rá en
dos 1\1 (M et) dando t.res
rr
ag
mentos.
E (Glu) es el res iduo
amino
-
terminal
.
T 1
GASMALlK T 2 co locado en el extremo
se
co
rl
a con
p
11
:
se
se
p
aron
amino
porque
em
pieza
los fragmentos; 8e secuencia
T
EGAAYHDFEPLDPR
por E
G lu ),
d,
adaci6n de Edman
'1'-;1)
DC
VHSD
} colocado en el e
xt r
emo
ca
rboxilo porque
'1' I YLIACGPM1'K
no acaba en R (Arg )
o K (Lys),
se
corta
con bro
mu
ro ele c iLlIll¡gc no; se
@
EGAAYHDFEPlDPRGASM
@
se
solapa con
separa n los fra gment os; se secuencia
por
dc
gradllción Edm
an
@
1'KDCVHSD
T f y T f , pe rmitien do
ordenarlos .
@
AL IKYLIACGPM
se clltablece
la secuenc ia
'1 1
T
1
~
Extremo
amino
EGAAYHDFEPLDPRGASMALlKYLIACGPMTKD C
VHSD
Ex t remo
ca rboxilo
11 ' ,1
I
I
FIGURA 3-27
Fragmentación de las proteínas,
sec
uenciación yo rd
e-
namiento de l
os
fragmentos peptídicos. Se determina en primer lugar la
composición de aminoácid
os
y el residuo N- terminal de una muestra
intacta. A continuación se rompen los puen tes disulfuro prese ntes an tes
de la fragmentación de forma que la secuenciación pueda transcurrir
El cOlljWlto de métodos disponible actualmente para ana
liwr
tan to
l
as
proleú¡as como los ácidos nucleicos
cst.: I
dando
o
ri
grn a una nueva disciplina: la bioquímica de la célula com
pI PLa . La secuencia completa del ONA de un urganismo, Sil
genoma,
está
actualmente disponible para orga
ni
smos que
aharca ll desde virus o ba
cter
ias a eucariotas mullicelularcs
(véase Tabla 1-4) .
Se
estáIl descubriendo
mill
olles de genes, in-
c1uy('ndo muchos que codifican prot.eÚlas sin ningwm [wlCión
conocida. Para dC'scribir el com
pl
emento proteico ente ro co
dificado p
or
el DNA de un organismo, los investigadores han
acuflado el té rmino proteoma.
Tal
como se comenta en el Ca
pftulo 9, las nuevas disciplinas de
la
genómica y la proteóm..ica
complementan las invesligaciones realizadas sobre el met.1bo-
con eficiencia. En este ejempl o, só lo hay dos residuos de Cys «() por lo
que sólo
ha
y una posibilidad de loca lización del puente d
is
ulfuro.
En
los polipéptidos con tres o má s residuos de Cys, la posición de los puen-
te
s di sul furo puede determinarse tal como se describe en el t
ex
to. (Los
símbolos de una letra para los aminoácidos aparecen en la Tab la 3-1.)
lismo celular intennediario y
el
metabolismo
de
ácidos nuc1eicos,
generando
una
visión nueva
y
más completa de
la
bioquímica,
a
nivel celular e incluso a nivel de organismos cnt,f'ros.
Secuencia
de amino
ácidos (
prot
eí
na
)
Secuencia
de DNA
(gen)
Gln -Tyr-
Pro
-
fh r
- Il
Trp
---'.-----.'---'r----lr---J ---'
CAG'I'ATCCTACGAT'ITGG
FIGURA
3-28 Correspondencia enlre las secuencias de DNA y de
aminoácidos. Cada aminoác ido está codificado por una secuencia
es
-
pedf ica de tres nuc eótidos en el DNA. El cú
digo
genélico
se
des-
cri be con detalle en el Ca pítulo 27.
-
8/18/2019 Aa Leninger
28/41
102 Ca pítu
lo
3 Aminoácidos, péptidos y proteinas
RECUADRO 3 2 BIOQuíMICA PRÁCTICA
Investigación de
las
proteínas
mediante
la espectrometria de masas
El
espectró
m
etl O
de masas
ha
sido
desde
hace tiempo una
herram.ienta indispensable en qufmica .
Las
moléculas
qUE
se
deben analizar,
a
las que se
hace
referf'ncia como
Rn
a
litos
,
se
ionizan
en
primer lugar en el vacío. Cuando las nllcvas
mo
lécu las cargadas se introducen en un campo eléctricu y/o
magnético, sus trayectorias
a
través del campo son fllnción
de su relación lIIasa
-c
arga, n¡/z L
}
medición de es ta propie
dad
de
las especies ionizadas
puede
utilizarse para deducir
la masa
CM)
del analito con una precisión muy elevada.
Aunque
la
espectrometría
df'
masas
CMS
se ha u
tili:t.auo
durante muchos años, no podía aplicarse a macromoléculas
tales como las proteúms y los áridos nucleicos. Las medidas
de
m z se realizan sobre mol
éc
ulas en fase gaseosa
y la C<
Ie
facción u o
lr
os tratamientos necesarios p
ara
ll
ev
ar
Wla
ma
cromolécula a
la
fa
se
gaseosa
ca
usab
an
normalmente
su
rápida descomposición.
En 1988
se desarrollaron dos técni
cas diferentes para superar
este
problrma.
En
una de ellas)
las proteínas se colocan dcntro de W
1a
matr
iz
que puede ab
so
rber
luz. Con W1 pulso corlo
de
luz
de
láser, las proteinas
ionizan
y
a conti
nua
ción se desorben de la
mar
r
iz
hac
ia el
sistema
de
vacío.
Este
proccso, conocido como
es
p
ecuo
me tría de masas de desorci
ónlioniza
ción po r láse r
as i
ida por matriz o
MALD' MS, se
ha utilizado con
éxito para medir
la
masa
de una
gran variedad
de
maeromo
léculas. En 1m segundo proceso, que da los mismos bu('nos
resultados, las macromolécuJas en diso
lu
ción son forladas a
pasar
de
la
fa
se liquida a
la
fase gas directamente. Una so
lu
ción
de
ana
li
tos se hace pasar
a
t rav
és de
una aguja cargada
que se
mantiene
a
un elevado potencial eléctrico, disper
sando la solución en una fina niebla de m
icrogol.; lS
cargadas .
El
disolvf'nte
que
rodea las macromoléculas se ('vapora rápi
damente y los iones con múltiples cargas resultantes se
int roduccn
de esta
fonna en la fase gas
de
manC ra no des
tructiva. Esta técnica
sr
denomina eSllectr
om
e tr Ía de
ma sas de ionización
por el
ec
tros
pra y, OES J MS .
Los
protones añadidos
durante
el paso a través
de
la aguja
pro-
porciollan carga adicional a la macromolécula. l..a l1VZ de
la
molécula pucde analizarse en
la
cámara
de
vacío.
L ::} MS
proporciona una
gran
cantidad
de in fo
rm
ación
para
la investigación en prote�