วภาพ ัยศิลปากร...

วัสดุเจลเปปไทดปดแผลจากธรรมชาติสําหรับการสมานแผล

โดย นางสาววิมล เผาดี

วิทยานิพนธนี้เปนสวนหนึ่งของการศึกษาตามหลักสูตรปริญญาวิทยาศาสตรมหาบัณฑิต สาขาวิชาเทคโนโลยีชีวภาพ ภาควิชาเทคโนโลยีชีวภาพ

บัณฑิตวิทยาลัย มหาวิทยาลัยศิลปากร ปการศึกษา 2554

ลิขสิทธ์ิของบัณฑิตวิทยาลัย มหาวิทยาลัยศิลปากร

สำนกัหอ

สมุดกลาง

วัสดุเจลเปปไทดปดแผลจากธรรมชาติสําหรับการสมานแผล

โดย นางสาววิมล เผาดี

วิทยานิพนธนี้เปนสวนหนึ่งของการศึกษาตามหลักสูตรปริญญาวิทยาศาสตรมหาบัณฑิต สาขาวิชาเทคโนโลยีชีวภาพ ภาควิชาเทคโนโลยีชีวภาพ

บัณฑิตวิทยาลัย มหาวิทยาลัยศิลปากร ปการศึกษา 2554

ลิขสิทธิ์ของบัณฑิตวิทยาลัย มหาวิทยาลัยศิลปากร



NATURAL PEPTIDE HYDROGEL DRESSING FOR WOUND HEALING

By

Miss Wimol Phoudee

A Thesis Submitted in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree

Master of Science Program in BIOTECHNOLOGY

Department of Biotechnology

Graduate School, Silpakorn University

Academic Year 2011

Copyright of Graduate School, Silpakorn University



บัณฑิตวิทยาลัย มหาวิทยาลัยศิลปากร อนุมัติใหวิทยานิพนธเร่ือง “ วัสดุเจลเปปไทดปดแผลจากธรรมชาติสําหรับการสมานแผล ” เสนอโดย นางสาววิมล เผาดี เปนสวนหน่ึ งของการศึกษาตามหลักสูตรปริญญาวิทยาศาสตรมหาบัณฑิต สาขาวิชาเทคโนโลยีชีวภาพ

……........................................................... (ผูชวยศาสตราจารย ดร.ปานใจ ธารทัศนวงศ)

คณบดีบัณฑิตวิทยาลัย วันที.่.........เดือน.................... พ.ศ...........

อาจารยที่ปรึกษาวิทยานิพนธ 1. อาจารย ดร.วนิดา วัฒนการุณ 2. รองศาสตราจารย ดร.กัลยาณี จิรศรีพงศพันธ 3. อาจารย ดร.นวลอนงค จิระกาญจนากิจ คณะกรรมการตรวจสอบวิทยานิพนธ .................................................... ประธานกรรมการ (อาจารย ดร. สินธุวัฒน ฤทธิธรรม) ............/......................../.............. .................................................... กรรมการ .................................................... กรรมการ (อาจารย ดร. สมพร มูลมั่งมี) (อาจารย ดร. วนิดา วัฒนการุณ) ............/......................../............. ............./......................../.............. .................................................... กรรมการ .................................................... กรรมการ (รองศาสตราจารย ดร.กัลยาณี จิรศรีพงศพันธ) (อาจารย ดร.นวลอนงค จิระกาญจนากิจ) ............/......................../.............. ............/......................../..............



ง

52401203: สาขาวิชาเทคโนโลยีชีวภาพ คําสําคัญ: วัสดุปดแผล/ไฮโดรเจล/เปปไทด/แอสตาแซนทิน กกกกกกก วิมล เผาดี : วัสดุเจลเปปไทดปดแผลจากธรรมชาติสําหรับการสมานแผล . อาจารยที่ปรึกษ าวิทยานิพนธ : อ. ดร.วนิดา วัฒนการุณ , รศ. ดร.กัลยาณี จิรศรีพงศพันธ และ อ. ดร.นวลอนงค จิระกาญจนากิจ . 140 หนา. กกกกกก วัสดุปดหรือตกแตงแผล ใชเพื่อปองกันการติดเช้ือ รักษาความชุมช้ืน สงเ สริมการแพรผานของออกซิเจน และดูดซับของเหลวที่ไหลออกจากแผล ในปจจุบัน นิยมนํา วัสดุ ชีวภาพมา พัฒนา เปนวัสดุปดแผลเนื่องจากไมมีความเปนพิษ ระคายเคือง ยึดติด และลอกออกไดงาย งานวิจัยนี้มุงเนนสังเคราะหวัสดุปดแผลที่ออกฤทธิ์ฆาเชื้อและฟนฟูเซลลได โดยเตรียมสารละลาย BSA และเปปไทดแปรผันความเขมขน 3-15% โดยน้ําหนักตอปริมาตร ใน phosphate buffer pH 7.4 ใหความรอนอุณหภูมิ 100 องศาเซลเซียส แปรผันระยะเวลาในการใหความรอน 5-120 นาที ทําใหเย็นลงอยางรวดเร็ว เติมสารละลายโซเดียมคลอไรดความเขมขน 0.25% โดยน้ําหนักตอปริมาตร เพื่อเชื่อมประสานโครงราง ทิ้งใหคงตัวนาน 2 ช่ัวโมง ที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส พบวา BSA และเปปไทดความเขมขน 6 และ 8% โดยน้ําหนักตอป ริมาตร ตามลําดับ ใหความรอนนาน 30 นาที เปนวัสดุ ปดแผลชนิดไฮโดรเจล สวน BSA ความเขมขน 8% โดยน้ําหนักตอปริมาตร ใหความรอนนาน 20 นาที เปนวัสดุปดแผลชนิดแผนเจล ผลการทดสอบฤทธ์ิการตานเชื้อ Pseudomonas aeruginosa ของวัสดุปดแผล บรรจุ ยาปฏิชีวนะ ciprofloxacin และแอสตาแซนทิน พบวา วัสดุปดแผล ไฮโดรเจลเปปไทด บรรจุ ยาปฏิชีวนะ ciprofloxacin ความเขมขน 10 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร และแอสตาแซนทินความเขมขน 10 ไมโครโมลาร มีคา log reduction มากท่ีสุดเทากับ 7.68 การทดสอบการปลดปลอยยาปฏิชีวนะ ciprofloxacin จากแผนเจล BSA แปรผันระยะเวลา 1-5 วัน พบวายาปฏิชีวนะถูกปลดปลอยในวันที่ 1 และ 2 เทากับ 4.24 และ 1.31 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร ตามลําดับ มีการพองตัวสูงสุดของแผนเจล ในวันที่ 1 แลวเสียสภาพ ไมคงรูปรางในวันที่ 2 และ 3 ตามลําดับ สวนการทดสอบความ เปนพิษของวัสดุปดแผลพบวา ไมมีความเปนพิษ และพบการฟนฟูเซลลจ ากไฮโดรเจลเปปไทด บรรจุแอสตาแซนทินความเขมขน 10 ไมโครโมลาร ในวันที่ 1 และ 2 ของการบมกับ เซลลไลนชนิด Vero จากขอมูลการศึกษาขางต นสามารถนําไฮโดรเจลเปปไทด บรรจุยาปฏิชีวนะ ciprofloxacin ความเขมขน 10 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร และแอสตาแซนทินความเขมขน 10 ไมโครโมลาร ไปพัฒนาเปนวัสดุ ปดแผลใชในการฆาเช้ือและฟนฟูเซลลได ภาควิชาเทคโนโลยีชีวภาพกกกกกกกก บัณฑิตวิทยาลัย มหาวิทยาลัยศิลปากรกกกกกกก ก ปการศึกษา 2554 ลายมือชื่อนักศึกษา........................................ ลายมือชื่ออาจารยที่ปรึกษาวิทยานิพนธ 1. ................................. 2. ............................. 3. ...................................



จ

52401203: MAJOR: BIOTECHNOLOGY KEY WORDS: WOUND DRESSING/HYDROGEL/PEPTIDE/ASTAXANTHIN WIMOL PHOUDEE: NATURAL PEPTIDE HYDROGEL DRESSING FOR WOUND HEALING. THESIS ADVISORS: WANIDA WATTANAKAROON, Ph.D., ASSOC. PROF. KALYANEE JIRASRIPONGPUN, Ph.D. AND NUANANONG JIRAKANJANAKIT, Ph.D. 140 pp. Application of dressing material is generally aimed to maintain a moist environment at the wound interface, allow gaseous exchange, prevent the wound directly contact to microorganisms and remove excess exudates. Recently, the wound dressing synthesized from biocompatible materials are of interest due to the desired properties such as nontoxic, non-allergenic, non adherent, and easily removed without trauma. The objective of this research is to synthesize a multifunctional wound dressing which could provide an antimicrobial activity and help tissue regeneration. Sample suspensions, containing either BSA or peptide, 3-15% (w/v) were prepared in phosphate buffer pH 7.4 as the hydrogel and solid pad. The suspension was heated at 100˚C for 5-120 minutes followed by rapid cooling in cold water. To crosslink the structure, 0.25% (w/v) NaCl solution was added. The suspensions were later cooled down at 4 ˚C for 2 hours. The 6% (w/v) BSA and 8% (w/v) peptide extract heated for 30 minutes were a suitable condition for hydrogel dressing preparation. For gel pad casting, 8% (w/v) BSA also heated to 100˚C for 20 minutes. The antimicrobial test indicated that the peptide hydrogel containing 10 μg/ml ciprofloxacin and 10 μM astaxanthin had the activity against Pseudomonas aeruginosa with the log reduction value of 7.68. The release of ciprofloxacin from BSA pad experiment showed that 4.24 and 1.31 μg/ml of ciprofloxacin were released at day 1 and 2, respectively. The most swelling of gel pad was in the first day and began to deform and could not keep the shape in the second and the third day causing rapidly decrease efficiency of absorption. Dressing materials were proven to be non-toxic in Vero cell. The hydrogel peptide containing 10 μM astaxanthin enabled proliferation at day 1 and 2. These results suggested that peptide hydrogel, adding 10 μg/ml ciprofloxacin and 10 μM astaxanthin, has a potential to use as a wound dressing due to its antimicrobial and proliferation action.

Department of Biotechnology Graduate School, Silpakorn University Academic Year 2011 Student's Signature ........................................ Thesis Advisors' Signature 1. ............................ 2. ............................. 3. ..........................



ฉ

กิตติกรรมประกาศ ผูวิ จัยขอกราบขอบพระคุณ อาจารย ดร . วนิดา วัฒนการุณ อาจารยที่ปรึกษา หลักวิทยานิพนธ ที่ใหคําแนะนําในการวางแผนงานวิจัย การแกไขปญหาตางๆ ที่เกิดขึ้นในระหวางการทํางานวิจัย และการศึกษา ตลอดจนตรวจแกไขวิทยานิพนธฉบับนี้ นอกจากน้ียังเปนกําลังใจแ ละเขาใจในตัวผูวิจัยเสมอมา ขอกราบขอบพระคุณ รองศาสตราจารย ดร. กัลยาณี จิรศรี พงศพันธ และอาจารย ดร. นวลอนงค จิระกาญจนากิจ อาจารยที่ปรึกษา รวมวิทยานิพนธ ที่ ใหคําแนะนําในการทํางานวิจัย และการตรวจแกไขวิทยานิพนธจนเสร็จสมบูรณ และอาจารย ดร . สมพร มูลมั่ง มี ที่ใหคําแนะนําการตรวจแกไขวิทยานิพนธจนเสร็จสมบูรณ ขอกราบขอบพระคุณ อาจารย ดร. สินธุวัฒน ฤทธิธรรม ที่เปนกําลังใจและใหคําปรึกษาในการทํางานวิจัย ตลอดจนใหคําแนะนําในการตรวจแกไขวิทยานิพนธ และขอ กราบขอบพระคุณ ผูชวยศาสตราจารย ดร . บุษราภรณ งามปญญา และผูชวยศาสตราจารย ดร. พิมพชนก จตุรพิรีย ที่เปนกําลังใจ ใหคําปรึกษา และคําแนะนําในเร่ืองการใชชีวิตและทํางานวิจัย ขอ กราบ ขอบพระคุ ณรองศาสตราจารย ดร . ปาริฉัตร หงศประภ าส มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร วิทยาเขตบางเขน ที่ใหความอนุเคราะหเปปไทดสกัดจาก ถั่วเขียว อาจารย ดร. นวลอนงค จิระกาญจนากิจ ที่ใหความอนุเคราะหเซลลไลน Vero และขอขอบคุณ คุณอํานาจ ชะนะมา สถาบันชีววิทยาศาสตรโมเลกุล มหาวิทยาลัยมหิดล ศาลายา ที่ใหความอนุเคราะหในการใชเคร่ืองระเหิดแหง ขอขอบคุณ สํานักงาน กองทุนสนับสนุนการวิจัย โครง การ ทุนวิจัย มหาบัณฑิต สกว . สาขาวิทยาศ าสตรและเทคโนโลยี -มหาวิทยาลัยศิลปากร วิทยาเขตพระราชวังสนามจันทร ที่สนับสนุนทุนวิจัยมหาบัณฑิต ส กว. สาขาวิทยาศาสตรและเทคโนโลยีป 2553 (Window II) ชื่อโครงการ “วัสดุปดแผลเปปไทดในการสมานแผล ” สัญญา เลขที่ MRG-WII535E027 และทุนอุดหนุนการ วิจัย ของบัณฑิตวิทยาลัย มหาวิทยาลัยศิลปากร ปการศึกษา 2553 และภาควิชาเทคโนโลยีชี วภาพ คณะวิศวกรรมศาสตรและเทคโนโ ลยี อุตสาหกรรม มหาวิทยาลัยศิลปากร ที่เอ้ือเฟอสถานท่ี ตลอดจนอุปกรณ เคร่ืองมือในการทํางานวิจัย ขอขอบคุณพี่ฑิพาภรณ ทรัพยสมบูรณ และพี่ประไพ บางเชย ที่อํานวยความสะดวกในการใช การจัดซื้ออุปกรณ เคร่ืองมือ และสารเคมีที่ใชในการทําวิจัย ตลอดจนใหคาํแนะนํา ความชวยเหลือ และเปนกําลัง ใจตลอดการศึกษาและการทําวิจัย ขอขอบคุณ พี่วัลพิไล พาหา ที่ชวยดําเนินเร่ืองเอกสารในการทําวิทยานิพนธ การศึกษา และยังเปนกําลังใจ ใหคําแนะนํา ตลอดจนให



ช

ความชวยเหลือในทุกดานอยางเต็มใจเสมอมา และขอบคุณศิลา ศรียา ที่ชวยอํานวยความสะดวกในการใชอินเทอรเน็ต รวมท้ังกําลังใจและมิตรภาพที่ดียิ่ง ขอกราบขอบพระคุณ คุณพอ คุณแม ขอบคุณพี่สาวและนองสาวที่ใหโอกาสท่ีดีและใหกําลังใจอันอบอุน ขอขอบคุณ พี่นบชุลี ชีวีวัฒนากูล ที่ใหมิตรภาพที่ อบอุน สวยงาม กําลังใจ คําแนะนํา ตลอดจนความชวยเหลือในเร่ืองการเรียนและการทําวิจัย ขอบคุณพี่อนิรุทธ เอกคุณธรรม และพ่ีวิษณุ ศรีลา ที่ใหมิตรภาพและกําลังใจที่ดีระหวางการศึกษ า ขอบคุณพ่ีศรีสุดา เคยอาษา และ วิกานดา โสขุมา ที่เปนทั้งพี่และเพ่ือน เปนกําลังใจ ท่ีสําคัญ ใหคําปรึกษา มิตรภาพอันอบอุน และรวมสุขรวม ทุกขกัน ตลอดระยะเวลาท่ีศึกษาและทํางานวิจัย นอกจากน้ียังขอบคุณ ทอป นองแตกตาง นองเคก นองแบงค นองพีท นองเหมียว นอง เปล นองแอม นองนุย และนองกากา ที่ใหความชวยเหลือ เปนกําลังใจ ท่ีอบอุน ตลอดจนมิตรภาพที่ดียิ่งในระหวาง การศึกษาและการทํางานวิจัย



ซ

สารบัญ หนา บทคัดยอภาษาไทย .................................................................................................................... ง บทคัดยอภาษาอังกฤษ ............................................................................................................... จ กิตติกรรมประกาศ ..................................................................................................................... ฉ สารบัญตาราง ............................................................................................................................ ฎ สารบัญภาพ ............................................................................................................................... ถ บทที่ 1 บทนํา กกกกที่มาและความสําคัญของงานวิจัย ......................................................................... 1 กกกกวัตถุประสงคของงานวิจัย ..................................................................................... 2 กกกกขอบเขตของงานวิจัย ............................................................................................ 2 กกกกประโยชนที่คาดวาจะไดรับ .................................................................................. 2 2 ตรวจเอกสารและงานวิจัยที่เกี่ยวของ กกกกสรีรวิทยาการหายของบาดแผล ............................................................................ 3 กกกกวัสดุปดแผล .......................................................................................................... 12 กกกกแอสตาแซนทินกับการตานอนุมูลอิสระ ............................................................... 15 กกกกสารออกฤทธิ์ฆาเชื้อ ............................................................................................. 18 3 วัสดุอุปกรณและวิธีวิจัย กกกกสารเคมีสําคัญ ....................................................................................................... 23 กกกกเคร่ืองมือ วัสดุและเครื่องแกว กกกกกกกกเคร่ืองมือ ..................................................................................................... 23 กกกกกกกกวัสดุและเครื่องแกว ..................................................................................... 24 กกกกวิธีวิจัย กกกกกกกกการเตรียมวัสดุปดแผล กกกกกกกก การศึกษาขนาดโมเลกุลของเปปไทดจากถั่วเขียว ........................... 25 กกกกกกกก การเตรียมไฮโดรเจลและแผนเจล BSA .......................................... 25 กกกกกกกก การเตรียมวัสดุปดแผล BSA บรรจุสารออกฤทธิ์ฆาเชื้อ และแอสตาแซนทิน ........................................................................ 25



ฌ

บทที่ ..................................................................................................................... หนา กก การเตรียมไฮโดรเจลเปปไทดจากถั่วเขียว ........................................ 26 การเตรียมวัสดุปดแผลเปปไทดบรรจุสารออกฤทธิ์ฆาเชื้อ และแอสตาแซนทิน ......................................................................... 26 การสังเคราะหอนุภาคซิลเวอร ......................................................... 26 การทดสอบความสามารถในการละลายของอนุภาคซิลเวอร ........... 27 กกกกกกกกกกกก การศึกษาลักษณะทางกายภาพและคุณสมบัติของแผนเจล ......................... 27 กกกกกกกกการศึกษาฤทธิ์การตานเช้ือของวัสดุปดแผล กกกกกกกกกกกกการเพาะเลี้ยงเชื้อ ............................................................................... 28 กกกกกกกกกกกกการทดสอบการตานเชื้อของยาปฏิชีวนะและแอสตาแซนทิน ที่บรรจุในไฮโดรเจล .......................................................................... 28 กกกกกกก ก การทดสอบการตานเช้ือของอนุภาคซิลเวอร ..................................... 29 การทดสอบการปลดปลอยยาปฏิชีวนะในแผนเจล BSA และฤทธิ์การตานเช้ือ ................................................................................... 29 การทดสอบความเปนพิษของวัสดุปดแผลตอเซลลสัตว การเพาะเลี้ยงเซลลสัตว...................................................................... 30 การเตรียมวัสดุปดแผลไฮโดรเจลและแผนเจล .................................. 30 การทดสอบความเปนพิษของวัสดุปดแผล ........................................ 31 การศึกษาปริมาณแอสตาแซนทินที่บรรจุในวัสดุปดแผล ............................ 31 การทดสอบความสามารถในการตานอนุมูลอิสระของแอสตาแซนทิน ที่บรรจุในแผนเจล BSA การสกัดแอสตาแซนทินในแผนเจล .................................................. 32 การทดสอบความสามารถในการตานอนุมูลอิสระ ............................ 32 การทดสอบความสามารถในการฟนฟูเซลลของวัสดุปดแผล ...................... 33 4 ผลการทดลองและวิจารณผลการทดลอง กกกก การเตรียมวัสดุปดแผล กกกก การศึกษาขนาดโมเลกุลของเปปไทดจากถั่วเขียว ............................... 34 กกกก การเตรียมไฮโดรเจลและแผนเจล BSA .............................................. 35 กก การเตรียมไฮโดรเจลเปปไทดจากถั่วเขียว .......................................... 37



ญ

บทที่ หนา กกกกกกกก การสังเคราะหอนุภาคซิลเวอร ........................................................... 38 การทดสอบความสามารถในการละลายของอนุภาคซิลเวอร ............. 40 การศึกษาลักษณะทางกายภาพและคุณสมบัติของแผนเจล .......................... 42 การศึกษาฤทธิ์การตานเช้ือของวัสดุปดแผล การทดสอบการตานเชื้อของยาปฏิชีวนะและแอสตาแซนทิน ที่บรรจุในไฮโดรเจล .......................................................................... 44 การทดสอบการตานเชื้อของอนุภาคซิลเวอร ..................................... 49 การทดสอบการปลดปลอยยาปฏิชีวนะในแผนเจล BSA และฤทธิก์ารตานเช้ือ ................................................................................... 51 การทดสอบความเปนพิษของวัสดุปดแผลตอเซลลสัตว .............................. 53 การศึกษาปริมาณแอสตาแซนทินที่บรรจุในวัสดุปดแผล ............................ 58 การทดสอบความสามารถในการตานอนุมูลอิสระของแอสตาแซนทินท่ี บรรจุในแผนเจล BSA .................................................................................. 58 การทดสอบความสามารถในการฟนฟูเซลลของวัสดุปดแผล ...................... 60 5 สรุปผลการทดลอง ........................................................................................................ 68 บรรณานุกรม ........................................................................................................................... 69 ภาคผนวก ................................................................................................................................ 78 กกกกกกกกภาคผนวก ก การหาขนาดโมเลกุลของโปรตีนเปปไทดโดยวิธี SDS-PAGE ....... 80 กกกกกกกกภาคผนวก ข อาหารเล้ียงเซลลและสารเคมีที่ใชในการเลี้ยงเซลล ........................ 84 กกกกกกกกภาคผนวก ค การนับจํานวนเซลลดวย Hemocytometer ...................................... 87 กกกกกกกกภาคผนวก ง ขอมูลดิบ ......................................................................................... 89 ประวัติผูวิจัย ........................................................................................................................... 140



ฎ

สารบัญตาราง ตารางที่ หนา 1 ผลกระทบจากสารอาหารตอกระบวนการหายของแผล ...................................... 8 2 การเลือกใชวัสดุปดแผลกับลักษณะของแผล ....................................................... 13 3 ปริมาณของแอสตาแซนทินจากแหลงทางชีวภาพ ................................................ 16 4 ชนิดและความเขมขนของยาปฏิชีวนะตอเช้ือกอโรค ........................................... 22 5 ลักษณะทางกายภาพของไฮโดรเจล BSA ตามความเขมขน ของ BSA และระยะเวลาในการใหความรอน ............................................ 36 6 ลักษณะทางกายภาพของไฮโดรเจลเปปไทดตามความเขมขน ของเปปไทด และระยะเวลาในการใหความรอน ....................................... 38 7 ลักษณะทางกายภาพในการละลายอนุภาคซิลเวอร ............................................... 41 8 ลักษณะทางกายภาพในการละลายอนุภาคซิลเวอรทางการคา .............................. 42 9 ปริมาณแอสตาแซนทินบรรจุในวัสดุปดแผล ....................................................... 58 10 การเตรียม stacking gel ......................................................................................... 80 11 การเตรียม resolving gel ....................................................................................... 80 12 การเตรียม sample buffer ...................................................................................... 81 13 การเตรียม protein staining ................................................................................... 81 14 การเตรียม destaining ........................................................................................... 81 15 คาสัดสวนการพองตัวหรือการดูดซับของแผนเจล ............................................... 89 16 Log reduction ของไฮโดรเจล BSA ตอเช้ือ P. aeruginosa................................... 90 17 Log reduction ของไฮโดรเจลเปปไทดตอเชื้อ P. aeruginosa ............................... 91 18 Log reduction ของแผนเจล BSA ตอเชื้อ P. aeruginosa ...................................... 91 19 ปริมาณยาปฏิชีวนะ ciprofloxacin ที่ปลดปลอยจากแผนเจล ................................ 92 20 ฤทธิ์การตานเช้ือ P.aeruginosa ของยาปฏิชีวนะที่ปลดปลอย .............................. 93 21 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยงกับสวนประกอบของวัสดุปดแผล เปนเวลา 24 ชั่วโมง ................................................................................... 94 22 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยงกับสวนประกอบของวัสดุปดแผล เปนเวลา 48 ชั่วโมง ................................................................................... 96



ฏ

ตารางที่ หนา 23 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยงกับไฮโดรเจล BSA ที่เจือจาง ในอาหารเล้ียงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% อัตราสวน เทากับ 1:9 โดยปริมาตรของไฮโดรเจลตออาหารเล้ียงเซลล เปนเวลา 24 ชั่วโมง ................................................................................... 98 24 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยงกับไฮโดรเจล BSA ที่เจือจาง ในอาหารเล้ียงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% อัตราสวน เทากับ 1:4 โดยปริมาตรของไฮโดรเจลตออาหารเล้ียงเซลล เปนเวลา 24 ชั่วโมง ................................................................................... 98 25 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยงกับไฮโดรเจล BSA ที่เจือจาง ในอาหารเล้ียงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% อัตราสวน เทากับ 1:1 โดยปริมาตรของไฮโดรเจลตออาหารเล้ียงเซลล เปนเวลา 24 ชั่วโมง ................................................................................... 99 26 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยงกับไฮโดรเจล BSA ที่เจือจาง ในอาหารเล้ียงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% อัตราสวน เทากับ 1:9 โดยปริมาตรของไฮโดรเจลตออาหารเล้ียงเซลล เปนเวลา 24 ชั่วโมง ................................................................................... 99 27 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยงกับไฮโดรเจล BSA ที่เจือจาง ในอาหารเล้ียงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% อัตราสวน เทากับ 1:4 โดยปริมาตรของไฮโดรเจลตออาหารเล้ียงเซลล เปนเวลา 24 ชั่วโมง ................................................................................... 100 28 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยงกับไฮโดรเจล BSA ที่เจือจาง ในอาหารเล้ียงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% อัตราสวน เทากับ 1:1 โดยปริมาตรของไฮโดรเจลตออาหารเลี้ยงเซลล เปนเวลา 24 ชั่วโมง ................................................................................... 100 29 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยงกับไฮโดรเจลเปปไทดที่เจือจาง ในอาหารเล้ียงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% อัตราสวน เทากับ 1:9 โดยปริมาตรของไฮโดรเจลตออาหารเล้ียงเซลล เปนเวลา 24 ชั่วโมง ................................................................................... 101



ฐ

ตารางที่ หนา 30 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยงกับไฮโดรเจลเปปไทดที่เจือจาง ในอาหารเล้ียงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% อัตราสวน เทากับ 1:4 โดยปริมาตรของไฮโดรเจลตออาหารเล้ียงเซลล เปนเวลา 24 ชั่วโมง ................................................................................... 101 31 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยงกับไฮโดรเจลเปปไทดที่เจือจาง ในอาหารเล้ียงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% อัตราสวน เทากับ 1:1 โดยปริมาตรของไฮโดรเจลตออาหารเล้ียงเซลล เปนเวลา 24 ชั่วโมง ................................................................................... 102 32 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยงกับไฮโดรเจลเปปไทดที่เจือจาง ในอาหารเล้ียงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% อัตราสวน เทากับ 1:9 โดยปริมาตรของไฮโดรเจลตออาหารเล้ียงเซลล เปนเวลา 48 ชั่วโมง ................................................................................... 102 33 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยงกับไฮโดรเจลเปปไทดที่เจือจาง ในอาหารเล้ียงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% อัตราสวน เทากับ 1:4 โดยปริมาตรของไฮโดรเจลตออาหารเล้ียงเซลล เปนเวลา 48 ชั่วโมง ................................................................................... 103 34 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยงกับไฮโดรเจลเปปไทดที่เจือจาง ในอาหารเล้ียงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% อัตราสวน เทากับ 1:1 โดยปริมาตรของไฮโดรเจลตออาหารเล้ียงเซลล เปนเวลา 48 ชั่วโมง ................................................................................... 103 35 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยงกับแผนเจล BSA ที่แชในอาหาร เลี้ยงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% นาน 1 วัน เปนเวลา 24 ชั่วโมง ................................................................................... 104 36 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยงกับแผนเจล BSA ที่แชในอาหาร เลี้ยงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% นาน 2 วัน เปนเวลา 24 ชั่วโมง ................................................................................... 105



ฑ

ตารางที่ หนา 37 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยงกับแผนเจล BSA ที่แชในอาหาร เลี้ยงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% นาน 3 วัน เปนเวลา 24 ชั่วโมง .................................................................................. 106 38 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยงกับแผนเจล BSA ที่แชในอาหาร เลี้ยงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% นาน 4 วัน เปนเวลา 24 ชั่วโมง .................................................................................. 107 39 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยงกับแผนเจล BSA ที่แชในอาหาร เลี้ยงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% นาน 5 วัน เปนเวลา 24 ชั่วโมง ................................................................................... 108 40 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยงกับแผนเจล BSA ที่แชในอาหาร เลี้ยงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% นาน 1 วัน เปนเวลา 48 ชั่วโมง ................................................................................... 109 41 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยงกับแผนเจล BSA ที่แชในอาหาร เลี้ยงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% นาน 2 วัน เปนเวลา 48 ชั่วโมง ................................................................................... 110 42 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยงกับแผนเจล BSA ที่แชในอาหาร เลี้ยงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% นาน 3 วัน เปนเวลา 48 ชั่วโมง ................................................................................... 111 43 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยงกับแผนเจล BSA ที่แชในอาหาร เลี้ยงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% นาน 4 วัน เปนเวลา 48 ชั่วโมง ................................................................................... 112 44 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยงกับแผนเจล BSA ที่แชในอาหาร เลี้ยงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% นาน 5 วัน เปนเวลา 48 ชั่วโมง ................................................................................... 113 45 ความเขมขนของแอสตาแซนทินที่สกัดไดจากแผนแจล BSA .............................. 114 46 ความสามารถในการตานอนุมูลอิสระของแอสตาแซนทินที่ปลดปลอยจาก แผนเจล BSA ............................................................................................ 114



ฒ

ตารางที่ หนา 47 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยงกับไฮโดรเจล BSA ที่เจือจางใน อาหารเล้ียงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% อัตราสวนเทากับ 1:9 โดยปริมาตรของไฮโดรเจลตออาหารเล้ียงเซลล เปนเวลา 1 วัน .......... 115 48 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยงกับไฮโดรเจล BSA ที่เจือจางใน อาหารเล้ียงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% อัตราสวนเทากับ 1:9 โดยปริมาตรของไฮโดรเจลตออาหารเล้ียงเซลล เปนเวลา 2 วัน .......... 115 49 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยงกับไฮโดรเจล BSA ที่เจือจาง ในอาหารเล้ียงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% อัตราสวนเทากับ 1:9 โดยปริมาตรของไฮโดรเจลตออาหารเล้ียงเซลล เปนเวลา 3 วัน .......... 116 50 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยงกับไฮโดรเจล BSA ที่เจือจาง ในอาหารเล้ียงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% อัตราสวนเทากับ 1:9 โดยปริมาตรของไฮโดรเจลตออาหารเล้ียงเซลล เปนเวลา 4 วัน .......... 116 51 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยงกับไฮโดรเจล BSA ที่เจือจาง ในอาหารเล้ียงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% อัตราสวนเทากับ 1:9 โดยปริมาตรของไฮโดรเจลตออาหารเลี้ยงเซลล เปนเวลา 5 วัน .......... 117 52 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยงกับไฮโดรเจล BSA ที่เจือจาง ในอาหารเล้ียงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% อัตราสวนเทากับ 1:4 โดยปริมาตรของไฮโดรเจลตออาหารเล้ียงเซลล เปนเวลา 1 วัน .......... 117 53 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยงกับไฮโดรเจล BSA ที่เจือจาง ในอาหารเล้ียงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% อัตราสวนเทากับ 1:4 โดยปริมาตรของไฮโดรเจลตออาหารเล้ียงเซลล เปนเวลา 2 วัน .......... 118 54 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยงกับไฮโดรเจล BSA ที่เจือจาง ในอาหารเล้ียงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% อัตราสวนเทากับ 1:4 โดยปริมาตรของไฮโดรเจลตออาหารเล้ียงเซลล เปนเวลา 3 วัน .......... 118 55 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยงกับไฮโดรเจล BSA ที่เจือจาง ในอาหารเล้ียงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% อัตราสวนเทากับ 1:4 โดยปริมาตรของไฮโดรเจลตออาหารเล้ียงเซลล เปนเวลา 4 วัน .......... 119



ณ

ตารางที่ หนา 56 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยงกับไฮโดรเจล BSA ที่เจือจาง ในอาหารเล้ียงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% อัตราสวนเทากับ 1:4 โดยปริมาตรของไฮโดรเจลตออาหารเล้ียงเซลล เปนเวลา 5 วัน .......... 119 57 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยงกับไฮโดรเจล BSA ที่เจือจาง ในอาหารเล้ียงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% อัตราสวนเทากับ 1:1 โดยปริมาตรของไฮโดรเจลตออาหารเล้ียงเซลล เปนเวลา 1 วัน .......... 120 58 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยงกับไฮโดรเจล BSA ที่เจือจาง ในอาหารเล้ียงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% อัตราสวนเทากับ 1:1 โดยปริมาตรของไฮโดรเจลตออาหารเล้ียงเซลล เปนเวลา 2 วัน .......... 120 59 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยงกับไฮโดรเจล BSA ที่เจือจาง ในอาหารเล้ียงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% อัตราสวนเทากับ 1:1 โดยปริมาตรของไฮโดรเจลตออาหารเล้ียงเซลล เปนเวลา 3 วัน .......... 121 60 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยงกับไฮโดรเจล BSA ที่เจือจาง ในอาหารเล้ียงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% อัตราสวนเทากับ 1:1 โดยปริมาตรของไฮโดรเจลตออาหารเล้ียงเซลล เปนเวลา 4 วัน .......... 121 61 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยงกับไฮโดรเจล BSA ที่เจือจาง ในอาหารเล้ียงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% อัตราสวนเทากับ 1:1 โดยปริมาตรของไฮโดรเจลตออาหารเล้ียงเซลล เปนเวลา 5 วัน .......... 122 62 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยงกับไฮโดรเจลเปปไทดที่เจือจาง ในอาหารเล้ียงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% อัตราสวนเทากับ 1:9 โดยปริมาตรของไฮโดรเจลตออาหารเล้ียงเซลล เปนเวลา 1 วัน .......... 122 63 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยงกับไฮโดรเจลเปปไทดที่เจือจาง ในอาหารเล้ียงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% อัตราสวนเทากับ 1:9 โดยปริมาตรของไฮโดรเจลตออาหารเล้ียงเซลล เปนเวลา 2 วัน .......... 123 64 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยงกับไฮโดรเจลเปปไทดที่เจือจาง ในอาหารเล้ียงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% อัตราสวนเทากับ 1:9 โดยปริมาตรของไฮโดรเจลตออาหารเล้ียงเซลล เปนเวลา 3 วัน .......... 123



ด

ตารางที่ หนา 65 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยงกับไฮโดรเจลเปปไทดที่เจือจาง ในอาหารเล้ียงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% อัตราสวนเทากับ 1:9 โดยปริมาตรของไฮโดรเจลตออาหารเล้ียงเซลล เปนเวลา 4 วัน .......... 124 66 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยงกับไฮโดรเจลเปปไทดที่เจือจาง ในอาหารเล้ียงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% อัตราสวนเทากับ 1:9 โดยปริมาตรของไฮโดรเจลตออาหารเล้ียงเซลล เปนเวลา 5 วัน .......... 124 67 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยงกับไฮโดรเจลเปปไทดที่เจือจาง ในอาหารเล้ียงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% อัตราสวนเทากับ 1:4 โดยปริมาตรของไฮโดรเจลตออาหารเล้ียงเซลล เปนเวลา 1 วัน .......... 125 68 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยงกับไฮโดรเจลเปปไทดที่เจือจาง ในอาหารเล้ียงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% อัตราสวนเทากับ 1:4 โดยปริมาตรของไฮโดรเจลตออาหารเล้ียงเซลล เปนเวลา 2 วัน .......... 125 69 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยงกับไฮโดรเจลเปปไทดที่เจือจาง ในอาหารเล้ียงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% อัตราสวนเทากับ 1:4 โดยปริมาตรของไฮโดรเจลตออาหารเล้ียงเซลล เปนเวลา 3 วัน .......... 126 70 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยงกับไฮโดรเจลเปปไทดที่เจือจาง ในอาหารเล้ียงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% อัตราสวนเทากับ 1:4 โดยปริมาตรของไฮโดรเจลตออาหารเล้ียงเซลล เปนเวลา 4 วัน .......... 126 71 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยงกับไฮโดรเจลเปปไทดที่เจือจาง ในอาหารเล้ียงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% อัตราสวนเทากับ 1:4 โดยปริมาตรของไฮโดรเจลตออาหารเล้ียงเซลล เปนเวลา 5 วัน .......... 127 72 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยงกับไฮโดรเจลเปปไทดที่เจือจาง ในอาหารเล้ียงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% อัตราสวนเทากับ 1:1 โดยปริมาตรของไฮโดรเจลตออาหารเล้ียงเซลล เปนเวลา 1 วัน .......... 127 73 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยงกับไฮโดรเจลเปปไทดที่เจือจาง ในอาหารเล้ียงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% อัตราสวนเทากับ 1:1 โดยปริมาตรของไฮโดรเจลตออาหารเล้ียงเซลล เปนเวลา 2 วัน .......... 128



ต

ตารางที่ หนา 74 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยงกับไฮโดรเจลเปปไทดที่เจือจาง ในอาหารเล้ียงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% อัตราสวนเทากับ 1:1 โดยปริมาตรของไฮโดรเจลตออาหารเล้ียงเซลล เปนเวลา 3 วัน .......... 128 75 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยงกับไฮโดรเจลเปปไทดที่เจือจาง ในอาหารเล้ียงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% อัตราสวนเทากับ 1:1 โดยปริมาตรของไฮโดรเจลตออาหารเล้ียงเซลล เปนเวลา 4 วัน .......... 129 76 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยงกับไฮโดรเจลเปปไทดที่เจือจาง ในอาหารเล้ียงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% อัตราสวนเทากับ 1:1 โดยปริมาตรของไฮโดรเจลตออาหารเล้ียงเซลล เปนเวลา 5 วัน .......... 129 77 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยงกับแผนเจล BSA ที่แชในอาหาร เลี้ยงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% (แชเปนระยะเวลานาน 1-5 วัน) เปนเวลา 1 วัน ............................................................................................ 130 78 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยงกับแผนเจล BSA ที่แชในอาหาร เลี้ยงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% (แชเปนระยะเวลานาน 1-5 วัน) เปนเวลา 2 วัน ............................................................................................ 132 79 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยงกับแผนเจล BSA ที่แชในอาหาร เลี้ยงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% (แชเปนระยะเวลานาน 1-5 วัน) เปนเวลา 3 วัน ............................................................................................ 134 80 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยงกับแผนเจล BSA ที่แชในอาหาร เลี้ยงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% (แชเปนระยะเวลานาน 1-5 วัน) เปนเวลา 4 วัน ............................................................................................ 136 81 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยงกับแผนเจล BSA ที่แชในอาหาร เลี้ยงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% (แชเปนระยะเวลานาน 1-5 วัน) เปนเวลา 5 วัน ............................................................................................ 138



ถ

สารบัญภาพ ภาพที่ หนา 1 ขั้นตอนของการสมานแผล .................................................................................. 6 2 SDS-PAGE เจลของเปปไทด .............................................................................. 35 3 คาการดูดกลืนแสงของการเกิดอนุภาคซิลเวอร ................................................... 39 4 การพองตัวของแผนเจล BSA ที่ระยะเวลาการบม 1-3 วัน ................................... 43 5 Log reduction ของไฮโดรเจล BSA บรรจยุาปฏิชีวนะ ciprofloxacin ความเขมขน 10 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร .................................................. 45 6 Log reduction ของไฮโดรเจล BSA บรรจยุาปฏิชีวนะ tobramycin ความเขมขนเทากับ 1 และ 10 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร ............................. 46 7 Log reduction ของไฮโดรเจล BSA บรรจุแอสตาแซนทิน ความเขมขน 10 ไมโครโมลาร ................................................................. 46 8 Log reduction ของไฮโดรเจลฺ BSA บรรจยุาปฏิชีวนะ ciprofloxacin หรือ tobramycin ความเขมขน 10 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร รวมกับ แอสตาแซนทินความเขมขน 10 ไมโครโมลาร ......................................... 47 9 Log reduction ของไฮโดรเจลเปปไทดบรรจุยาปฏิชีวนะ ciprofloxacin หรือ tobramycin ความเขมขนเทากับ 10 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร รวมกับ แอสตาแซนทินความเขมขนเทากับ 10 ไมโครโมลาร .............................. 48 10 Log reduction ของอนุภาคซิลเวอรที่สังเคราะหความเขมขน 100 และ 125 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร ...................................................... 50 11 Log reduction ของอนุภาคซิลเวอรทางการคาความเขมขน 50 และ 100 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร ........................................................ 51 12 การปลดปลอยยาปฏิชีวนะ ciprofloxacin ที่ความเขมขนเร่ิมตน 125 ไมโครกรัมตอแผนเจล ที่ระยะเวลาการบม 0-5 วัน ........................... 52 13 Log reduction ของยาปฏิชีวนะ ciprofloxacin ที่ปลดปลอยออกจากแผนเจล ใน 1 และ 2 วัน ......................................................................................... 52 14 สัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมกับสวนประกอบของวัสดุ ปดแผล เปนเวลา 24 และ 48 ชั่วโมง ....................................................... 54 15 สัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมกับไฮโดรเจล BSA นาน 24 และ 48 ชั่วโมง ............................................................................ 55



ท

ภาพที่ หนา 16 สัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมกับไฮโดรเจลเปปไทด นาน 24 และ 48 ชั่วโมง ........................................................................... 56 17 สัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมกับแผนเจล BSA นาน 24 และ 48 ชั่วโมง ........................................................................... 57 18 ความสามารถในการตานอนุมูลอิสระของแอสตาแซนทินที่สกัดไดจาก แผนเจล BSA แชใน phosphate buffer pH 7.4 นาน 1-5 วัน ..................... 59 19 สัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมกับไฮโดรเจล BSA นาน 1-5 วัน .............. 60

20 สัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมกับรวมไฮโดรเจลเปปไทด นาน 1-5 วัน .. 63 21 สัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมกับรวมแผนเจล BSA นาน 1-5 วัน ........... 65



1

บทท่ี 1 บทนํา

1.1 ท่ีมาและความสําคัญของงานวิจัย กก ปญหาการรักษาแผลเร้ือรัง ในผูปวย ที่มีสาเหตุมาจากภา วะแทรกซอนท่ีเกิดขึ้น เชน โรคเบาหวาน แผลกดทับ และการติดเช้ือ กอใหเกิดผลกระทบโดยตรงตอคุณภ าพชีวิตและสภาพจิตใจ เปนการเพิ่มคาใชจาย และระยะเว ลาของการอยูในโรงพยาบาล แผลเร้ือรัง มีลักษณะ เปน แผลเปดหรือ เกิด เปนโพรง มีการอักเสบ ติดเช้ือ ยาวนาน จนเกิดการลุกลามของแผล ดังนั้น การรักษาแผลเร้ือรังจําเปนตองมีการจัดการอยางถู กวิธีและรวดเร็วต้ังแตระยะแรก ซึ่งในปจจุบันน้ีการรักษาโดยใชวัสดุ ปดแผลที่ชวยใหความชุมชื้ นแกแผล ปองกันการติดเช้ือ สงผานความช้ืน ทําใหออกซิเจนสามารถแทรกเขา ไปในเนื้อตายเพ่ือใหออนตัวลง และเรงฟนฟูเน้ือเยื่อใหเกิดใหม ถือเปนแนวทางหน่ึงในการชวยเพิ่มประสิทธิภาพของการ รักษาได แตวัสดุปดแผลที่ใชในปจจุบั นยังตองมีการนําเขาจากตางประเทศเปนหลัก จึงทําใหมีราคาคอนขางแพง และสวนใหญยังผลิตจากพอลิเมอรสังเคราะหในกลุมของพอลิ เอธิลีนและไดเมทิลอะซิเตมายด ซึ่งมีรายงานการวิจัย พบวา มีความเปนพิษสูงตอเซลลหรือเน้ือเยื่อของผูปวย ทําใหเปนอุปสรรคตอการรักษ า งานวิจัยนี้จึง เกิดแนวคิดในการพัฒนาวัสดุปดแผลซึ่งทําหนาที่ เสมือน เปน “การผสมผสาน ” (multifunctionality) โดยมีองคประกอบเปน วัตถุดิบชีวภาพในกลุมของเ ปปไทดที่สกัดจากถั่วเขียวซึ่งเปนผลผลิต ทางการเกษตรภายในประเทศ สารออกฤทธิ์ฆาเชื้อที่ใชกันทั่วไปในทาง การแพทย และสารตานอนุมูลอิสระ โดยออกแบบผลิตภัณฑ ในรูปของไฮโดรเจลสําหรับทาและไฮโดรเจลข้ึนรูปที่ ใชเคลือบบนแผนปดแผลในลักษณะที่เปน gauze pad ทั้งนี้ ในวัสดุที่พัฒนาข้ึนเปป ไทดทําหนาที่ เสมือน เปนโครงสรางในการรักษาความชุมชื้นใหแผล ปองกันการติดเ ช้ือจากภายนอก ชวยสงผานออกซิเจนในการเรงสมานแผลใหเร็วขึ้น สารออกฤทธิ์ฆาเชื้อทําหนาที่ฆาเชื้อ อันเปนสาเหตุหลักของการเกิ ดแผลติดเชื้อและแผลเร้ือรัง สวนสารตานอนุมลูอิสระทําหนาที่ ชวยเรงใหเกิดการเจ ริญของเนื้อเยื่อ



2

บริเวณบาดแผล นอกจากนี้ เปปไทดยังมีคุณสมบัติ ในการชวยฟนฟูเนื้อเยื่อบริเวณแผลอีกทางหนึ่งดวย งานวิจัยนี้สามารถตอบสนองแนวคิดในการผลิตวัสดุปดแผลตนทุนตํ่าเพื่อลดการนําเขาจากตางประเทศ มีความปลอดภัยสูง เน่ืองจากผลิตจากสารสกัดธรรมชาติ สามารถนําไปประยุกตใชกับแผลเปดหรือ แผลที่เปนโพร งท้ังขนาดเล็กและใหญ ที่เปนสาเ หตุสําคัญของแผลเร้ือรัง ในปจจุบัน 1.2 วัตถุประสงคของงานวิจัย กกกกกกกกพัฒนาวัสดุปดแผลเพื่อเรง สมานแผลจาก โปรตีนตนแบบและ เปปไทดธรรมชาติและเติมสารออกฤทธิ์ฆาเชื้อรวมกับ สารตานอนุมูลอิสระ ศึกษาลักษณะทางกายภาพ การกระจายตัว การพองตัวของไฮโดรเจล ความเปนพิษ ฤทธิ์การตานเช้ือ ปริมาณสารตานอนุมูลอิสระ ท่ีบรรจุได ตลอดจนความสามารถในการตานอนุมูลอิสระและการเรงฟนฟูเซลลของวัสดุปดแผล 1.3 ขอบเขตของงานวิจัย 1.3.1 เตรียมสวนประกอบไฮโดรเจลท่ี ใชเปนวัสดุปดแผล 2 รูปแบบคือ ไฮโดรเจลและแผนเจลที่เติมสารออกฤทธิ์ฆาเชื้อรวมกับสารตานอนุมูลอิสระ 1.3.2 ศึกษาลักษณะทางกายภาพและคุณสมบัติของแผนเจล 1.3.3 ศึกษาฤทธิ์การตานเช้ือ Staphylococcus aureus และ Pseudomonas aeruginosa และความเปนพิษในเซลลไลน Vero ของวัสดุปดแผล 1.3.4 ศึกษาปริมาณการบรรจุ สารตานอนุมูลอิสระ ความสามารถในการตาน อนุมูลอิสระที่สกัดไดและการเรงฟนฟูเซลลของวัสดุปดแผล 1.4 ประโยชนท่ีคาดวาจะไดรับ กกกกกกกก ผลิตวัสดุปดแผล ตนทุนต่ํา จากเปปไทดที่มี สวนประกอบของสารที่ออกฤทธิ์ ฆาเชื้อรวมกับสารตาน อนุมลูอิสระ เพื่อใชในการสมานแผล ตานการติดเช้ือ เรงการซอมแซมและฟนฟูเซลล ทั้งแบบใชทาสําหรับแผลเปดขนาดเล็ก และการเคลือบบนแผนปดแผลสําหรับแผลโพรงเร้ือรัง ที่ไมเปนพิษและปลอดภัยตอผูปวย



3

บทท่ี 2 ตรวจเอกสารและงานวิจัยท่ีเก่ียวของ

2.1 สรีรวิทยาการหายของบาดแผล

บาดแผลหมายถึง รอยฉีกขาดของผิวหนังหรือเน้ือเยื่อ และสวนที่ลึกกวาผิว หนังถูกทําลาย ผิวหนังแยกจากกันดวย สาเหตุใดก็ตาม และเน้ือเยื่อไดรับอันตราย ทําใหเลือดไหลออกมา (เชน การฉีกขาดของอวัยวะภายใน ทําใหเนื้อเยื่อหรืออวัยวะน้ันไมสามารถทํางานหรือเจริญเติบโตไดตามปก ติ) รวมท้ังการติดเชื้อจาก เช้ือโรค ท่ีเขาสูรางกายทางบาดแผล (อัจฉรา , 2530) บาดแผลแบงออกเปน 2 ประเภท ตามระยะเวลาในการเกิด แผลคือ แผลชนิดเฉียบพลัน (acute wound) คือ แผลทั่วไปที่มีการพัฒนาตามข้ันตอนของการ หายของบาดแผลคือ ระยะการหามเลือด ระยะการอักเสบ ระยะการแบงตัว แล ะระยะการเสริมสรางความแข็งแรง ซึ่งแผลแบบนี้ หายเองตามปกติ สวนแผลชนิดเร้ือรัง (chronic wound) คือ แผลท่ีไมสามารถรักษาหายไดภายใน 3 เดือน ซึ่งอาจมีสาเหตุมาจากการขา ดการทํางานของเซลลเม็ดเลือดขาวและเม็ดเลือดขาวท่ีไมมีแกรนูล การรักษาแผลเร้ือรัง ตองใชระยะเวลานานและ มีขั้นตอนที่ยุงยากในการรักษาใหแผลหายเปนปกติ การดูแลและรักษาแผลของผูปวยที่เปนแผลชนิด น้ี จึง มีความสําคัญตอการหายของแผลเปนอยางมาก เน่ืองจากการดูแลรักษาแผลท่ีไมถูกวิธีอาจทําใหแผลหายชาลง เกิดการติดเชื้อ และทําใหผูปวยเจ็บปวดมากข้ึน (Moseley และคณะ , 2004) ในการรักษาแผลชนิดน้ีตองมีการจัดการกับเนื้อเยื่อที่ตาย เพราะเน้ือเยื่อตาย จะไปขัดขวางก ารหายของแผล ซึ่งทําไดโดยการตัดออก การใชสารเคมีตางๆ ซึ่งเปนวิธีที่สะดวก รวดเร็ว แตเสี่ยงตอการติดเช้ือ การทําลายเน้ือ เย่ือดี และสรางความเจ็บปวดใหกับผูปวย ได ในปจจุบันนี้จึง หันมา ใชวัสดุ ปดแผลที่ ใหความชุมชื้นแกแผล แทน เพื่อปองกันการติดเชื้อและเรงฟนฟูเน้ือเยื่อใหเกิดให ม ชวยใหน้ําและออกซิเจนแทรกเขาไปในเน้ือตายเพื่อใหออนตัวลงแลวเนื้อตายนี้หลุดออกมา ซึ่งวิธีนี้ไมทําใหผูปวยเจ็บปวดเหมือนวิธีขางตน



4

กระบวนการหายของแผล ถือเปนกลไกที่ซับซอนเกิดขึ้นระหวาง เซลลผิวหนังชั้นนอก (epidermal cell) เซลลผิวหนังชั้นใน (dermal cell) สารประกอบท่ีอยูระหวางเซลล (extracellular

matrix, ECM) การสรางหลอดเลือดใหม (angiogenesis) ตลอดจนโปรตีนในน้ําเหลืองซึ่งถูกควบ คุมดวยไซโตไคน (cytokine) รวมท้ังสารท่ีทําใหมีการเจริญเติบโต (growth factor) (Harding และคณะ, 2002) กระบวนการหายของแผล น้ันครอบคลุมตั้งแตเน้ือเยื่อหรืออวัยวะถูกทําลาย เกิดการสมานแผล และเปนรอยแผลเปนเกิดขึ้น สามารถแบงออกไดเปน 4 ขั้นตอน (ภาพท่ี 1) คือ

ขั้นตอน 1. ระยะการหามเลือด (hemostasis) เกิดขึ้นทันทีเม่ือมีการบาดเจ็บหรือถูกทําลายของเนื้อเยื่อ (ภาพที่ 1a) ทําใหเกิดการบาดเจ็บตอหลอดเลือดและเซลลเยื่อบุผนังภายใน (endothelial cell) มีการหลั่งของเลือดออกจากบาดแผล ทําใหมี ECM ที่ชวยในการเคลื่อนที่ ของเซลลเขามาในแผล และมีการหลั่งสารท่ีชวยใหเกิดการสมานแผล เชน สารเรงการเจริญเติบโตของเซลลเม็ดเลือดขาวและเซลลเน้ือเยื่อเกี่ยวพัน เกิดการทํางานของเกล็ดเลือด (fibrin) ทาํใหมีการแข็งตัวของเลือ ดและเกิดการหามเลือด ดังแสดงในภาพที่ 1b ซึ่งการหามเลือดเปนก ารกักเลือดไวเฉพาะตําแหนงที่หลอดเลือดถูกทําลาย ทําใหเปนระบบปดและมีความดันสูงเพ่ือปองกันการเสียเลือดเพ่ิมขึ้น

ขั้นตอน 2. ระยะการอักเสบ (inflammation) เกิดขึ้นในชวง 2-4 วันแรกของการเกิดบาดแผล โดยเม็ดเลือดขาวชนิด neutrophil เขาสูบาดแผล เพื่อทําหนาที่ เก็บกินเชื้อโรคและเศษเน้ือทีต่าย และอยูในแผลนานประมาณ 6 วัน หลังจากน้ันภายใน 4 วันหลังไดรับบาดเจ็บ เม็ดเลือดขาวอีกชนิดคือ macrophage จะเขามาที่แผลและคอยๆ แทนที่ neutrophil การที่เม็ดเลือดขาวมา บริเวณแผลถือเปนกลไกสําคัญของรางกายในการปองกันตัวเองตอเชื้อโรค การกินแบคทีเรียและยอยสลายเน้ือตายถือเปนหนาที่หลักของเซลล macrophage ถาระยะการอักเสบยาวนานข้ึน การหายของแผลจะชาลง (ภาพท่ี 1c-d)

ขั้นตอน 3. ระยะการแบงเซลล (proliferation) เซลล fibroblast (เซลลเน้ือเยื่อเกี่ยวพันทําหนาที่สรางเสนใยตางๆ) จากบริเวณใกลเคียง เร่ิมมีการแบงตัวเพ่ือสรางเน้ือเยื่อใหมในแผลรวมกับ matrix ของเกล็ดเลือด การสรางหลอดเลือดใหม การสรางคอลลาเจน และการหดร้ังของแผล (ภาพที่ 1e) โดยการสรางหลอดเลือด เกิดจากการทํางานของหลอดเลือดฝอย จากหลอดเลือดที่ยังสมบูรณบริเวณขางเคียง ของแผล หลอดเลือดฝอยที่สรางใหมจะเชื่อม ตอกันเปนเนื้อเยื่อใหม จนเต็มแผล ในระยะแรกจะเห็นเปนสีชมพูซีด และเมื่อมีหลอดเลือดใหมเขามาจนเต็มจะเปลี่ยนเปนสีแดงเขม การสรางคอลลาเจนเกิดขึ้นพรอมกับการสรางหลอดเลือดใหม เซลลที่มีบทบาทสําคัญในขั้นตอนน้ีคือ fibroblast โดยมีหนาที่ในการสรางและสะสม ECM โดย fibroblast เคลื่อนเขามาในแผลและเพิ่ม



5

จํานวนขึ้นจากการกระตุนของสารที่ทําใหมีการเจริญเติบโต ไดแก platelet-derived growth factor

(PDGF) และ transforming growth factor beta 1 (TGFB1) รวมกับโมเลกุลของ ECM กระตุนให fibroblast ผลิต proteoglycan (องคประกอบของเนื้อเยื่อเกี่ยวพัน ) ซึ่งมีลักษณะเปนสารคลายกาวที่ชวยเติมพื้นที่ชองวางในแผลใหเต็ม เคลือบ และเชื่อมเซลลเน้ือเยื่อเขาดวยกัน ทําใหมีความยืดหยุนเพิ่มมากข้ึน นอกจากน้ี ยังผลิต fibronectin ที่ชวยในการสรางโคร งรางสําหรับเน้ือเย่ือใหมโดยการยึดคอลลาเจนและเซลลเขาไวดวยกัน และมีการผลิต ECM ตัวใหมที่จําเปนในการกระตุนใหเกิดการเจริญเติบโตของเซลล และ การสรางหลอดเลือดที่จะนําออกซิเจนและสารอาหารท่ีจําเปนมาสูเซลล การหดร้ังของแผลเกิดจาก myofibroblast (ทําหนาที่ชวยในการหดตัวของแผล ) ซึ่งการสรางเซลลผิวใหมจะเปนการคลุมผิวหนาของแผลโดยการสรางเซลลเยื่อบุผิวใหมมาปดคลุมแผล การหดร้ังของแผลเปนการลดขนาดของแผลลงจนกระทั่งแผลปด

ขั้นตอน 4. ระยะการเสริมสรางความแข็งแรง (maturation หรือ remodeling) เกิดขึ้นภายใน 2 สัปดาหหรือมากกวานั้น มีการเปล่ียนแปลงโดยมีการสรางและการทําลายคอลลาเจนอยางสมดุล ถือเปนกระบวนการท่ีชวยเสริมสรางความแข็งแรงของเสนใยคอลลาเจนท่ีอยูในแผลในระยะแบงเซลล คอลลาเจนเดิมถูกแทนที่ดวยคอลลาเจนที่สรางขึ้นใหม ชวยเพิ่มความแข็งแรงของแผล (tensile strength) และเกิดเปนรอยแผลเปนที่หดเล็กลง บาง และมีสีซีด ซึ่งอาจจะกลายเปนแผลเปน (scare) ในที่สุด (ภาพที่ 1f) แผลเปนถือเปนผลผลิตสุดทายของการหายของแผล ชวยใหเน้ือเยื่อเกิดการสมานตอเน่ืองและชวยใหเกิดความแข็งแรง แตความแข็งแรงของแผลเปนจ ะนอยกวาเนื้อเย่ือปกติ (Strodtbeck, 2001; Hardwicke และคณะ , 2008; Menke และคณะ , 2008; Beldon,

2010; Polat และคณะ, 2010)



6

ภาพท่ี 1 ขั้นตอนของการสมานแผล (ที่มา: http://www.expertreviews.org)

ปจจัยที่ทําใหเกิดการหายของแผลแบงออกเปน 2 ปจจัยคือ

1. ปจจัยเฉพาะท่ี (local factor) เปนปจจัยที่มีผลกระทบโดยตรงตอการหายของแผล

ไดแก 1.1 การติดเช้ือ และการกดภูมิคุมกัน เปนสิ่งสําคัญที่ทําใหแผลหายชาในแผลเร้ือรัง ทําใหระยะการอักเสบในกระบวนการห ายของแผลยาวนานขึ้น การสังเคราะหคอลลาเจน ลดลง และยับย้ังการสรางเซลลเน้ือเยื่อผิวใหม การติดเช้ือมีหลายชนิด เชน การติดเช้ือแบคทีเรีย ที่ไมเพิ่มจํานวน (contamination) แบคทีเรียเพิ่มทวีคู ณ แตเน้ือเยื่อแผล ไมถูกทําลาย (colonization) และแบคทีเรียเพิ่มทวีคูณทําใหการหายของแผลหยุดชะงัก และเน้ือเยื่อบริเวณแผลถูกทําลายทําใหติดเชื้อเฉพาะที่ (บางกรณีที่ไมแสดงการอักเสบ ; critical colonization) แบคทีเรียอาจสรางหรือกอใหเกิดความเสียหายกับเซลลขางเคียง และมีการแพรกระจายของเชื้อที่เปนสาเหตุการติดเช้ือในระบบรางกาย แบคทีเรียที่พบสวนใหญในแผลติดเช้ือคือ Pseudomonas aeruginosa และเชื้อในกลุม Staphylococcus

1.2 สภาพของเน้ือเยื่อรอบแผล อาการเปอยยุยของผิวหนังรอบแผลจากสารนํ้าในแผล (ประกอบดวยน้ําเหลือง เนื้อตาย เชื้อแบคทีเรีย และเซลลเม็ดเลือดขาว ) ออกมาชุมบริเวณผิวหนั งปกติรอบๆ แผลมากเกินไป



7

1.3 การแพรผานของออกซิเจนในแผล เปนสาเหตุสําคัญในการกระตุนกระบวนการหายของแผล โดยออกซิเจนกระตุน การทํางานของไซโตไคน (ควบคุมการทํางานของเซลล เกิดการอักเสบ กําจัดสิ่งแปลกปลอม ทําลายเซลลแปลกปลอม และ กระตุนการเพิ่มจํานวนเซลล ) เน้ือเยื่อเก่ียวพัน และเซลลผิวหนัง

1.4 หลอดเลือดดําและแดงผิดปกติ การไหลเวียนของเลือดสามารถนําออกซิเจนไปเล้ียงเซลลและกําจัดของเสียบริเวณแผล

1.5 อนุมูลอิสระ ทําใหเกิดการทําลายเซลลเยื่อบุผิวหนังของหลอดเลือด และการซึมผานของหลอดเลือด การเคล่ือนที่ของเซลล การทํางานของไซไตไคนและการสรางหลอดเลือดใหม และยังกระตุนใหสรางอนุมูลอิสระชนิด superoxide เพิ่มมากข้ึน นอกจากน้ี ยังทําลายสารประกอบที่อยูระหวางเซลลและเซลลในเน้ือเยื่อ โดยระดับอนุมูลอิสระที่เพิ่มขึ้นหรือไมสมดุ ลในแผล เปนสาเหตุสําคัญในการทําลายเซลลและเน้ือเยื่อของแผลหรือบริเวณรอบๆ แผล

2. ปจจัยทางระบบของรางกาย (systemic factor) เปนปจจัยที่มาจากสุขภาพของผูปวย

ไดแก 2.1 อายุ เปนปจจัยเสี่ยงท่ีทํา ใหกระบวนการหายของแผลเกิดชาลง รวมถึงการทํางานของระบบภูมิคุมกันที่ตอบสนองตอการอักเสบ เชน การทํางานของ T-cell chemokine เซลลเม็ดเลือดขาวชนิด macrophage ใหทํางานชาลงหรือไมเต็มประสิทธิภาพ

2.2 ฮอรโมนเพศ โดยเพศชาย มีการหายของแผลชากวาเพศหญิง เนื่องจากเพศหญิงมีฮอรโมน estrogen ซึ่งเปนสารต้ังตนในกระบวนการหายของแผล

2.3 โรคเบาหวาน โดยเฉพาะผูปวยโรคเบาหวานท่ีมีแผล บริ เวณเทา เนื่องจากโรคเบาหวานมีการทํางานของเซลลเม็ดเลือดขาวและการสรางหลอดเลือดใหมลดลง 2.4 การสูบบุหรี่ เปนปจจัยเสี่ยงตอการเกิดโรคหัวใจและหลอดเลือดหัวใจ โรคปอดเร้ือรัง และผูปวยที่เปน แผลบริเวณปลายมือ ปลายเทา ทําใหมีการรวมตัวของเกล็ดเลือด มีผลใหเลือดแข็งตัวมากกวาปกติ ทําใหแผลไดรับสารอาหาร และออกซิเจนลดลง นอกจากน้ี ยังพบผูปวยหลังการผาตัดหรือมีแผลเร้ือรัง มีการร่ัวของแขนงหรือสวนปลายของหลอดเลือด การฉีกขาดของแผลและผิวหนังชั้นนอก สงผลใหความแข็งแรงของเนื้อเยื่อบริเวณแผลลดลง

2.5 เคร่ืองด่ืมมีแอล กฮอล ขึ้นอยูกับปริมาณและระยะเวลาในการด่ืม พบวาการด่ืมที่ระยะเวลาสั้น สงผลในการกดการทํางานของระยะการอักเสบ สวนการด่ืมที่มีระยะเวลานาน สงผลตอการทํางานของเซลลเม็ดเลือดขาวชนิด neutrophil และ phagocyte ใหลดลง (Harding และคณะ , 2002; Holloran และ Slavin, 2002; Rodriguez และคณะ, 2008; Guo และ Dipietro, 2010)



8

2.6 ภาวะการขาดสารอาหาร ไดแก โปรตีน องคประกอบสําคัญของเน้ือเย่ือตางๆ ชวยกระตุนและซอมแซมการสรางเน้ือเย่ือที่เสียหาย เปนสวนประกอบของเม็ดเลือดแดงท่ีนําออกซิเจนไปยังเน้ือเยื่อบริเวณแผล ดังนั้น ถาขาดโปรตีนจะทํา ใหกระบวนการหายของแผลเกิดชาลง คารโบไฮเ ดรตเปนสารท่ีสรางพลังงานในรางกาย เมื่อขาดคารโบไฮเดรตรางกายจะดึงโปรตีนที่สะสมไวมาใชงาน และสงผลใหการหายของแผลเกิดชาลง วิตามินและเกลือแร เชน วิตามินเอและซี สังกะสี ธ าตุเหล็ก มีสวนสําคัญในการ สรางคอลลาเจน เซลลเยื่อบุผิว และการทํางานของเซลล เม็ดเลือดแดง ดังนั้น ถาขาดวิตามินและเกลือแรจะทําใหแผลหายชาหรือเน้ือเยื่อที่สรางขึ้นใหม ไมแข็งแรงและเกิดเปนแผลแยกได (MacKay และ Miller, 2003; Guo และ Dipietro, 2010; Megan

และคณะ, 2010) ผลกระทบจากสารอาหารตอการหายของแผลสรุปไวในตารางท่ี 1

ตารางท่ี 1 ผลกระทบจากสารอาหารตอกระบวนการหายของแผล (MacKay และ Miller, 2003)

ระยะการหายของแผล สารอาหาร ผลกระทบตอการหายของแผล การเกิดแผล ยาปฏิชีวนะ -

การหามเลือด

ยาปฏิชีวนะ สมุนไพร วิตามิน กรดอะมิโน หรือเกลือแร

มีการแข็งตัวของเลือดเร็วขึ้น

การอักเสบ

วิตามินเอ การอักเสบเกิดเร็วขึ้น

โบรมิเลนและโปรตีน ปองกันไมใหเกิดการอักเสบยาวนานขึ้น

วิตามินซี เพิ่มการเคลื่อนที่ของเซลลเม็ดเลือดขาวชนิด neutrophil ใหเขามาในแผล

การแบงเซลล

วิตามินซี สรางคอลลาเจน

กลูโคซามีน เพิ่มการผลิต กรดไฮยาลูรอนิก (ใชซอมแซมแผลและเพ่ิมความยืดหยุนใหกับผิวหนัง)

วิตามินเอ กระตุนการเจริญของเซลลเยื่อบุผิว

สังกะสี เปน cofactor ที่จําเปนตอการสังเคราะห ดีเอ็น เอ การแบงตัวของเซลล และการสังเคราะหโปรตีน

การเสริมสรางความแข็งแรง

ภาวะขาดโปรตีน ยับย้ังการเสริมสรางความแข็งแรงของแผล



9

กระบวนการซอมแซมและการเจริญของเนื้อเยื่อใหมบริเวณแผลคือ ทําใหเซลล เน้ือเยื่อหรืออวัยวะสามารถทําหนาที่ ไดตามปกติหรือใกลเคียงกับภาวะปกติ ในกรณีที่เนื้อเยื่อ ไมสามารถกลับคืนสูสภาพเ ดิมไดจะเกิด รอยแผลเปนขึ้นแทนที่ แบงออกเปน 3 ระยะไดแก ระยะปฐมภูมิ (primary intention) เกิดกับแผลท่ีมีการสูญเสียเนื้อเยื่อเล็กนอย เชน แผลที่บาดเจ็บจากของมีคม แผลผาตัด แผลเย็บ ซึ่งการหายของแผลเกิดขึ้นจากการสรางเซลลผิวใหมจากเซลลเยื่อบุผิว และการหดร้ังของแผลจากการทํางานของเซลล myofibroblast ที่ชวยลดขนาดของแผลจนกระทั่งแผลปด ระยะทุติยภูมิ (secondary intention) เกิดกับแผลผาตัดท่ีเกิดการติดเช้ือ แผลที่เกิดจากโรคเร้ือรัง แผลกดทับ แผลมีลักษณะใหญ ขอบแผลกวาง เนื่องจากสูญเสียเน้ือเยื่อจํานวนมาก ซึ่ งเน้ือเยื่อเกี่ยวพันจะถูกสรางเขามาเติมเต็มบริเวณเน้ือเยื่อที่ขาดหาย มีระยะเวลาในการซอมแซมนาน เพราะตองการเนื้อเยื่อจํานวนมาก จึงทําใหแผลมีโอกาสเสี่ยงตอการติดเช้ือสูง และระยะตติยภูมิ (tertiary

intention) เกิดกับแผลเปดหรือแผลเปนโพรง มักเปนแผลท่ีมีปญหา จากการไหลเวียนของเลือดไมดี มีการติดเช้ือภายในแผล ทําใหการเย็บแผลตองลาชาออกไป ตองรอกระทั่งปญหาถูกแกไข จนสภาพแผลดีขึ้นจึงจะเย็บปดแผลได โดยทั่วไปมักจะปลอยใหรางกายสรางเนื้อเย่ือเกี่ยวพันขึ้นมาทดแทนพอสมควร จนแผลต้ืนขึ้น และไมมีการติดเช้ือ จึงทํากา รเย็บปดแผลหรือปดปากแผลโดยการปลูกถายผิวหนังซึ่งจะชวยใหแผลหายเร็วขึ้น (Broderick, 2009; Holloran และ Slavin, 2002)

ปจจัยหลักที่มีผลตอกระบวนการซอมแซมและ การเจริญของเนื้อเยื่อใหมเกดิขึ้นคือ ปจจัยเกี่ยวกับการเจริญเติบโตคือ สารกระตุนการเจริญเติบโตของเ ซลล การสรางหลอดเลือดใหม การสรางกระดูก คอลลาเจนและโปรตีน เซลลเยื่อบุผิว เซลลเน้ือเยื่อเกี่ยวพัน และเซลลเม็ดเลือดขาวชนิด macrophage ปจจัยจากปฏิกิริยาระหวางเซลลตอเซลล และระหวางเซลลตอสารประกอบของเซลล ในภาวะปกติของรางกายมีการควบคุมการเพิ่มจํานวนของเซลลไมใหเพิ่ม มากจนเกินไป โดยปจจัยเกี่ยวกับภาวะแวดลอมในระดับเซลล หรือจํานวนของตัวรับสําหรับสารท่ีทําใหมีการเจริญเติบโต หรือปริมาณของสารยับยั้งการเจริญเติบโต (growth inhibitor) การเพ่ิมจํานวนของเซลลอยางมากในระหวางการซอมแซมเซลลหรือเน้ือเยื่อจะหยุดลงเม่ือซอมแซมสวนที่เสียหายสําเร็จ ซึ่งควบคุมผานกลไกที่เปนปฏิกิริยาระหวางเซลลกับสารประกอบที่อยูระหวางเซลล และปจจัยการสรางคอลลาเจน ความแข็งแรงของแผลเปนขึ้นอยูกับปริมาณของคอลลาเจน ซึ่งมีการสรางใหมรวมกับการถูกยอยสลาย เพื่อจัดเรียงตัวใหมให มีความแข็งแรงตลอดเวลา ในชวงเดือนแรกๆ ของการสมานแผล

คอลลาเจนเปนสารท่ีทนตอการยอยสลาย แตสามารถยอยไดโดยเอนไซม collagenase ที่พบในเซลลหลายชนิด ไดแก fibroblast และ macrophage มีบทบาทสําคัญในการยอยสลายและกําจัดเน้ือเยื่อที่



10

เสียหาย และยังมี บทบาทสําคั ญในข้ั นตอนการเสริมสรางความแข็งแรง ของ เน้ือเยื่อ อีกดวย (Tettamanti และคณะ, 2005) โดยท่ัวไป การซอมแซมและ การหายของแผล ข้ึนกับ ความสามารถในการเจริญของเน้ือเยื่อบุผิว (epithelium cell) การสรางและทําลายคอลลาเจน อยางสมดุล ซึ่งมักเกิดกับแผลชนิดเฉียบพลัน แตแผลของโรคเบาหวาน แผลกดทับ และแผลจากความผิดปกติของหลอดเลือดดํา ที่เปนแผลเร้ือรัง ความสามารถเหลาน้ีจะไมเกิดขึ้นหรือเกิดชาลง ทําใหแผลไมหายไดตามธรรมชาติ สาเหตุที่สําคัญ อีกอยางหนึ่งคือ การติดเช้ือ การอักเสบ ที่เกิดขึ้นระหวางกระบวนการหายของแผล ทําใหเพิ่มระยะเวลาในการหายนานขึ้น เน่ืองจากกระบวนการหายของแผล หยุดชะงักในระยะการแบงเซลลและเสริมสรางความแ ข็งแรง ทําใหการสังเคราะหคอลลาเจนทําไดชาลง ยับย้ังการสรางเซลลหรือเน้ือเยื่อผิวใหม และทําใหแผลเกิดการบาดเจ็บเพิ่มข้ึน นอกจากน้ี ภาวะการขาดออกซิเจน (ทําหนาท่ีเรงการเจริญของเซลลหรือเน้ือเยื่อรอบแผลและหลอดเลือดฝอยใหม ) ยังสงผลใหการหายของแผลเกิดชา ลงดวย ซึ่งการรักษาโดยทั่วไปจะใช epidermal growth factor (EGF) เชน การดัดแปลงพันธะเคมีของ growth factor เพื่อใชในระบบนําสงยา การเติมพาหะนําสงที่มีมวลโมเลกุลสูงๆ เพื่อเพิ่มความเสถียรหรือประสิทธิภาพในการรักษาแผล หรือการใชเทคโนโลยีท างดานนาโนมาชวย เชน การใชพอลิเมอรและตัวเชื่อมประสาน (linker) (โมเลกุลที่เชื่อมระหวางตัวพาและยาท่ีบรรจุลงไป ) ซึ่งสามารถออกแบบใหมีความจําเพาะตอการรักษาบาดแผลได ทั้งนี้การใช growth

factor สามารถเพิ่มประสิทธิภาพ ในการรักษาแผลได แตอาจเปนอันตรายตอแผลเร้ือรัง ในกรณีที่เกิดการแพรกระจายของเชื้อโรคและทําใหเกิดเปนเน้ืองอกได (Hardwicke และคณะ , 2008) ซึ่งการรักษาอาจไมสามารถควบคุมไดจาก การกระตุนการทํางาน ของ growth factor, cytokinase และ chemokinase แตสามารถควบคุมไดจากการกระตุนสิ่งแวดลอมที่อยูในบริเวณท่ีเปนแผล แตสําหรับแผลเร้ือรังในขั้นตอน การเกิดการอักเสบ สามารถผลิต proteolytic เปนเอนไซมในการยอยโปรตีน ท่ีเกิดขึ้นระหวางขั้นตอนการทํางานของเซลลที่เกี่ยวกับการอักเสบของบาดแผล นอกจากน้ี ยังมีงานวิจัยในการนําแอนโธไซยานินที่เปนสารตานอนุมูลอิสระ จากถั่วเหลืองดํามาใชในการกระตุนการทํางาน ของบาดแผลและการตอบสนองของการอักเสบของเซลล ดวย โดยทีมผูวิจัยพบวา แอนโธไซยานินสามารถเพิ่มการผลิต vascular endothelial growth factor (VEGF) จากบริเวณท่ีเปนแผล ซึ่งจะพบที่ keratinocyte มากกวาบริเวณ fibroblast และเมื่อเติมแอนโธไซยานิน เพื่อกระตุนการผลิตของ VEGF ใน fibroblast ที่เวลา 72 ชั่วโมง พบวามีการผลิต VEGF ที่เวลา 48

ชั่วโมง หลังจากที่มีการบมสารนี้ แอนโธไซยานินสามารถกระตุนใหเกิดการผลิต VEGF เพื่อชวยในการรักษาแผลชนิดเร้ือรังได (Nizamutdinova และคณะ , 2009) Prakash Naik และคณะ (2009)



11

นําสารควิโนลีน ที่สามารถดักจับโลหะไดมาใชในการสมานแผล เนื่องจากสารน้ีสามารถปองกันการเกิดปฏิกิริยา fenton ซึ่งคือ กระบวนการออกซิเดชันขั้นสูงโดยใชสารไฮโดรเ จนเปอรออกไซดทําปฏิกิริยากับเฟอรรัสไอออน เกิดเปน ไฮดรอกซิลเรดดิคัล (•OH) ที่เปนอนุมูลอิสระ ชนิดหน่ึง และยังปองกันการทําลายดีเอนเอจากภาวะเครียด (oxidative stress) จึงมีการนําส ารดังกลาวมาประยุกตใชในการรักษาแผล และปองกันการทําลายของเน้ือเยื่อจากภาวะเครียดตางๆ การหายของแผลน้ันสามารถวัดไดจากคา tensile strength เน่ืองจากเกิดการซอมแซมใหมของเน้ือเย่ือตางๆ โดยวัดปริมาณของคอลลาเจนท่ีเกิดขึ้นและสี ของแผลที่ซีดลง ซึ่ง การเพ่ิมปริมาณของ tensile strength สามารถใช thrombin (activated factor II หรือ factor IIa) ที่มีการตอบสนอง ในข้ันตอนการ หายของแผลในระยะการหามเลือดที่ สามารถเปลี่ยน fibrinogen เปน fibrin ซึ่งเปนเกล็ดเลือดที่ปองกันการไหลของเลือดจากบาดแผลได โดยมีรายงานวา thrombin

สามารถเพิ่มการไหล เวียน โลหิตในหัวใจ สะสมการทํางานของเซลลเกี่ยวกับการอักเสบในบาดแผล (ไดแก neutrophil และ macrophage) แต thrombin เมื่ออยูใน plasma ของรางกาย พบวามีการยอยสลายงาย จึงมีแนวคิด นํา thrombin ผสมกับอนุภาคนาโน -Fe2O3 แลวนําไปทดสอบกับแผลผาตัด พบวาปริมาณของ tensile strength เพิ่มขึ้น ภายในระยะเวลา 28 วัน และเมื่อสัง เกตลักษณะของเน้ือเยื่อที่เกิดขึ้น พบวามีการอักเสบของเนื้อเยื่อบริเวณน้ัน เกิดขึ้น ซึ่งหมายความวาบาดแผลเร่ิมเขาสูกระบวนการรักษาตามปกติ และอนุภาคของเหล็ก ท่ีใชในการผสมจะถูกสลายไปดวยกลไกของ macrophage และ fibroblast ภายใน 28 วัน หลังการบมกับบาดแผล (Polat และคณะ , 2010) นอกจากน้ี ยังมีการนําอนุภาคโลหะเงิน (silver particle) มาใชในฆาเชื้อแบคทีเรียและสมานแผล ทัง้แผลทั่วไปและแผลเร้ือรังในรูปแบบของแผนแปะแผลโดยสังเคราะหจากสารในกลุม พอลิเมอร เชน พอลิยูรีเทน และ พอลิเอทิลีนหรือพอลิเมอรจากธรรมชาติ เชน ไคโตซาน เจลลาติน คอลลาเจน ที่นํามาขึ้นรูปเปนวัสดุโครงราง (scaffold) ที่มีการผสมของอนุภาคโลหะเงินกับไคติน ซึ่งพบวาสามารถรัก ษาแผลเร้ือรังที่มีความลึกไดดี แผนแปะแผลชนิดน้ียังสามารถ ชวย รักษา ความชุมช้ืนของเนื้อเยื่อบริเวณแผล และทําใหเกิดการเคลื่อนที่ของเซลลเยื่อบุผิว ตลอดจนการแพรผานของอากาศเขาสูเน้ือเยื่อบริเวณแผล ชวยยอยเน้ือเยื่อที่ตายแลวใหหลุดออกทําใหแผลหายไดเร็วขึ้น (Sudheesh Kumar และคณะ, 2010)



12

2.2 วัสดุปดแผล วัสดุปดแผลหมายถึง วัสดุที่ใชในการปดหรือตกแตงแผล เพื่อปองกัน การติดเช้ือ รักษาความชุมช้ืน ถายเทอากาศเขาออก สงเสริมการเจริญใหมของเซลลเยื่อบุผิวตามกระบวนการหายของแผลที่ เกิดขึ้น โดยวัสดุปดแผลที่ดีควรมีคุณสมบัติคือ นํ้าหนักเบา ยืดหยุน ดูดซับของเหลวที่ไหลออกจากแผล ไมมีความเปนพิษหรือระคายเคือง ไมยึดเกาะ และสามาร ถลอกออกไดงายเมื่อมีการเปลี่ยนวัสดุปดแผล (มีอายุการใชงานนานประมาณ 3-5 วัน) ไมกอใหเกิดความเจ็บปวดต อผูปวย โดยวัสดุปดแผลแบงเปน 8 ประเภท ตามลักษณะของการสังเคราะหคือ ประเภท 1. transparent adhesive film เปนแผนฟลมบางใสเคลือบดวยกาวที่ใชทางการแพทย มีคุณสมบัติคลายผิวหนังใหออกซิเจนและนํ้าระเหยผานเขาออก ปองกันการติดเช้ือจากภายนอกเขาสูแผล รักษาความชุมชื้ นใหกับบริเวณรอบแผล นอกจากน้ี ยังชวยสงเสริมใหเกดิการเคลื่อนที่ของเซลล ทําใหแผลหายเร็วขึ้น แต มีขอเสียคือ ไมเหมาะกับแผลที่มีของเหลวใ นบาดแผลเปนจํานวนมาก เนื่องจากไมสามารถระบายของเหลวได นิยมใชกับแผลที่มีการเย็บหรือแผลที่ไมมีการติดเช้ือเพราะวัสดุปดแผลชนิดน้ีไมมีการเติมสารออกฤทธิ์ฆาเชื้อ

ประเภท 2. hydrocolloid สังเคราะหจากพอลิเมอรที่มีองคประกอบคือ พอลิแซกคาไรด โซเดียมคารบอกซี เมทิลเซลลูโลส เพคติน เจลาติน และกาวทางการแพทย เมื่อนํามาใชปดแผล สวนของพอลิเมอร ไปจับกับหนอง มีลักษณะเปนกอนซึ่ง ชวยใหเกิดการสลายตัวของเนื้อเยื่อที่ตายและนําออกไปจากแผล นอกจากน้ี ยังชวยรักษาความชุมชื้นไดดี เหมาะกับบาดแผลที่มีของเหลวไหลออกมา แตไมเหมาะกับแผลติดเช้ือ

ประเภท 3. hydrogel สังเคราะหจากพอลิเมอรที่มีน้ําเปนองคประกอบประมาณ 30-90% เชน พอลิเอทิลีน หรือ พอลิไวนิลไพรโรลิโดน ซึ่งสามารถดูดซับนํ้า พองตัว และขยายตัวไดหลายเทา ทําใหเหมาะกับการใชในแผลท่ีมีลักษณะเปนโพรง ลดความเจ็บปวดจากการตึงของแผล ประเภท 4. foam สังเคราะหจากพอลิเมอร เชน พอลิยูรีเทนโฟม บางชนิดมีการเติมสารออกฤทธิ์ฆาเชื้อ เชน ไอออนของโลหะเงิน เพื่อเพิ่มฤทธิ์ในการฆาเชื้อ สามารถดูดซับของเหลวจากแผลไดดี ประเภท 5. alginate สังเคราะหจากสาหรายทะเลที่ประกอบดวยแคลเซียม หรือ เกลือของโซเดียม/แคลเซียม เปนเสนใยสังเคราะหที่มีหลายรูปแบบ ขึ้นอยูกับบริเวณท่ีใชงาน เหมาะกับการรักษาความชุมชื้นใหแกแผลที่มีลักษณะเปนโพรงหรือแผลกดทับ

ประเภท 6. nanocrystalline silver เปนแผนปดแผลที่เคลือบดวยโลหะเงินท่ีผานกระบวนการผลิตให มีอนุภาคขนาดเล็กมากทําใหมีปริมาณแรธาตุเงินสูง จึงมีฤทธิ์ฆาเชื้อแบคทีเรีย



13

และสามารถควบคุมการติดเช้ือแทรกซอนที่รุนแรงหลายประเภทได และยังออกฤทธิ์ตอเน่ืองไดนานอยางสมํ่าเสมอ มีคุณสมบัติชวยใหแผลหายไดเร็วยิ่งข้ึน สามารถใชงานไดนาน 2-7 วัน ขึ้นกับปริมาณของของเหลวจากแผลชวยลดความเจ็บปวดของผูปวยในการเปลี่ยนวัสดุปดแผล

ประเภท 7. collagen ลักษณะเปนแผน ผง หรือเจล จึงผสมอยูในวัสดุปดแผลชนิดอ่ืน เชน อัลจิเนต หรือ ไฮโดรเจล ใหความชุมชื้นแกแผล เรงการเจริญของเนื้อเยื่อ และลดความเจ็บปวดจากการเปลี่ยนวัสดุปดแผล มีอายุการใชงานมากกวา 7 วัน ประเภท 8. gauze ลักษณะเปนเสนใยหรือสําลีกอน นิยมใชอยางแพรหลายในปจจุบัน เหมาะกับแผลที่มีของเหลวมาก ราคาถูก สะดวกตอผูดูแล แตผูปวยจะเ จ็บปวดเมื่อเปลี่ยนวัสดุปดแผล และอาจมีเซลลหรือเน้ือเยื่อใหมหลุดออกไป ดวย นอกจากน้ี สําลีที่ติดคางอยูบริเวณแผลอาจสงผลใหเกิดการอักเสบ ของแผลได (กรรณิกา , 2543; พรพรหมและอรรถ, 2553; Seaman, 2002;

Jones และคณะ , 2006; Jayakumar และคณะ , 2011) ดังนั้น การเลือกใชวัสดุปดแผลท่ีเหมาะสมควรคํานึงถึงลักษณะของแผลและประเภทของวัสดุปดแผล เพื่อใหการรักษามีประสิทธิภาพ สูงสุดและไมสรางความเจ็บปวดใหกับผูปวยอีกดวย (ตารางที่ 2)

ตารางท่ี 2 การเลือกใชวัสดุปดแผลกับลักษณะของแผล (Seaman, 2002)

ลักษณะแผล เปาหมายในการรักษา ตัวอยางของวัสดุปดแผล แผลที่มีของเหลวมาก

ดูดซับของเหลว foam (มีอัตราการถายเทความช้ืนสูง) collagen, gauze

แผลที่มีของเหลวนอย

รักษาความชุมชื้นใหกับแผล hydrocolloid, foam (มีอัตราการถายเทความช้ืนต่ํา) transparent film

แผลแหง เพิ่มความชุมชื้นใหกับแผล hydrogel, transparent film, hydrocolloid

แผลติดเช้ือ

รักษาตามอาการติดเช้ือ ดูดซับของเหลวและทําความสะอาดแผล

เลือกใชวัสดุปดแผลใหเหมาะสมกับปริมาณของเหลวท่ีไหลออกมา เปลี่ยนวัสดุปดแผลทุกวัน หลีกเลี่ยงวัสดุปดแผลที่ติดแนน ควรใชวัสดุที่มีการเติมสารออกฤทธิ์ฆาเชื้อ

แผลที่เสี่ยงการติดเชื้อสูง (เชน แผลจากโรคเบาหวาน)

ปองกันการติดเช้ือ

เลือกใชวัสดุปดแผลใหเหมาะสมกับปริมาณของเหลวท่ีไหลออกมา เปลี่ยนวัสดุปดแผลทุก 1-3 วัน



14

คุณสมบัติของวัสดุปดแผลที่ดีคือ ชวยปองกันการติดเช้ือแทรกซอน กระตุนการเจริญและปกปองเซลลที่เกิดใหมไมใหถูกทําลายไป การปองกันการติดเช้ือแทรกซอนทําโดยเติมสารออกฤทธิ์ฆาเชื้อหรือใชวัสดุปดแผลท่ีเหมาะสมกับลักษณะแผล สวนการกระตุนการเจริญของเซลลและเน้ือเยื่อมีหลายงานวิจัยที่ศึกษา คุณสมบัติดังกลาว Wiegand และคณะ (2009) ศึกษาคุณสมบัติของวัสดุปดแผลในการชวยเรงการเจริญเติบโตของเซลลเยื่อบุผิว เนื้อเยื่ อ และหลอดเลือดของผูปวย โดยนําวัสดุปดแผล อัลจิเนตที่เติมโลหะ เงิน ทดสอบกับเซลลเพาะเลี้ยงชนิด human HaCaT

keratinocyte เพื่อประเมินการเจริญของเซลล ผลการทดลองพบวา วัสดุปดแผลไมมีความเปนพิษและสามารถชวยเรงการเจริญของเซลลที่ระยะเวลามากกวา 48 ชั่วโมง นอกจากน้ี มีการนําวัสดุปดแผลอัลจิเนตที่มีการเชื่อมตอพันธะโควาเลนตกับเปปไทด เพื่อทดสอบความสาม ารถในการกระตุนการเจริญของเซลลเพาะเลี้ยงชนิด human dermal fibroblast และผิวหนังบริเวณหูของกระตาย โดยเปรียบเทียบกับวัสดุปดแผลที่ ปราศจากการเช่ือมตอกับเปปไทด พบวา วัสดุปดแผลท่ีมีการเชื่อมตอกับเปปไทดสามารถกระตุนการเจริญของเซลล ที่เวลานาน 72 ชั่วโมง และมีการเจริญของเซลลเยื่อบุผิวบริเวณหูของกระตายท่ีเวลานาน 9 วัน ไดมากกวาของวัสดุปดแผลที่ปราศจากการเชื่อมตอพันธะกับเปป ไทด (Hashimoto และคณะ , 2003) และเมื่อไมนานนี้ Chikazua และคณะ (2010)

พัฒนาวัสดุปดแผลชนิดเจลประก อบดวยคอลลาเจนและปจจัยที่ชวย กระตุนการเจริญเติบโตของเซลล เมื่อนําไปใชกับแผลบริเวณหลังของหนูที่เปนโรคเบาหวานนาน 8 สัปดาห พบวาวัสดุปดแผลสามารถเรงการเจริญของเซลลบริเวณแผล มีการหดร้ังของแผลโดยการเคลื่อนที่ของเซลลเยื่อบุผิวบริเวณรอบๆ แผล ในวันที่ 14 ของการทดลอง และมีพื้นที่ของแผลลดลง เทากับ 37% เมื่อเปรียบเทียบกับแผลท่ีไมใชวัสดุปดแผลท่ีมีพื้นที่ลดลงเพียง 22% ซึ่งแสดงใหเห็นวาเจลที่ประกอบดวยคอลลาเจนชวยสงเสริมการหดร้ังของแผลได นอกจากน้ี ยังมีการสรางหลอดเลือดใหมเกิดขึ้นอีกดวย ซึ่งกอใหเกิดแนวคิดในการนําไปประยุกตใชกับแผล เปด แผลแหง แผลไฟไหม หรือแผลจากโรคมะเร็งผิวหนั ง Huang และ Yang (2008) ไดสังเคราะหวัสดุปดแผลชนิดแผนฟลมจากพอลิเมอรผสมระหวาง glucan และ poly(vinyl alcohol) แลวทดสอบความสามารถในกระตุนการทํางานของเกล็ดเลือด ปจจัยควบคุมการแข็งตัวของเลือด และการเกิดการหามเลือด ซึ่งการหามเลือดเปนการกักเลือดไวเฉพาะตําแหนงที่หลอดเลือดถูกทําลายทําใหเปนระบบปดและมีความดันสูงเพ่ือปองกันการเสียเลือดเพ่ิม โดยปดวัสดุป ดแผลที่บริเวณหลังของหนู นาน 17 วัน พบวาหนูที่ปดแผลดวยแผนฟลมมีรอยแผลต้ืนขึ้นและปากแผลปดจนเกือบเปนผิวหนั งปกติ ใชระยะเวลาในการรักษาสั้นกวาหนูที่ปดดวยผากอซสําลีอยู 48% แสดงวาแผนฟลมสามารถกระตุนการหามเลือดระยะที่ 2 ของกระบวนการหายของแผลได



15

2.3 แอสตาแซนทินกับการตานอนุมูลอิสระ

แอสตาแซนทิน (astaxanthin) เปนคาโรทีนอยดสีแดงและเปนสารในกลุมเทอพีน (terpene) ที่มีโครงสรางคลายคาโรทีนอยด มีชื่อเรียกทางวิทยาศาสตรวา 3,3’-dihydroxy- -, -

carotene-4,4’-dione มีขนาดมวลโมเลกุลเทากับ 596.86 เปน tetra-terpene ที่ไฮโดรเจนอะตอมถูกแทนที่ดวย hydroxyl หรือ oxygen group มีรายงานเกี่ยวกับสมบัติตานการเกิดออกซิเ ดชันไดดีกวาคาโรทีนอยดในกลุมอื่นๆ เชน ซีแซนทิน (zeaxanthin) ลูทีน (lutein) และเบตาคาโรทีน

( -carotene) ถึง 10 เทา และสูงกวาวิตามินอีถึง 1,000 เทา แหลงทางชีวภาพของแอสตาแซนทินในธรร มชาติ พบไดทั่วไปในสาหรา ยจุลินทรีย สัตวน้ําที่มีสี แดง ไดแก ปลาแซลมอน (ในน้ําหนัก 200 กรัม มีแอสตาแซนทินเพียง 1 มิลลิกรัม ) กุง ปู ตัวเคย (krill) และสะสมอยูภายในหวงโซอาหารโดยแพลงกตอนสัตว (zooplankton) และสัตวน้ําที่มีเปลือกแข็งตระกูล crustaceans ซึ่งเปนอาหารของปลาแซลมอน ปลาเทราท รวมถึงสัตวน้ําอ่ืนๆ แตโดยสวนใหญไดมาจากจุลินทรีย เชน ยีสต Xanthophyllomyces dendrorhous หรือเรียกอีกชื่อหน่ึงวา Phaffia rhodozyma โดยการเติมเชื้อราบางชนิด สามารถ กระตุน ใหยีสต ผลิตแอสตา - แซนทินได เพิ่มขึ้น หรืออาจผลิตไดจาก microalgae จากการเปรียบเทียบปริมาณแอ สตาแซนทินที่ผลิตไดจากแหลงทางชีวภาพตางกัน พบวาแอสตาแซนทินที่ผลิตไดจากสาหราย Haematococcus pluvialis มีความเขมขนสูงสุดเทากับ 40,000 พีพีเอ็ม (ตารางท่ี 3) สวนใหญแอสตาแซนทินที่ได อยูในรูปของ trans-astaxanthin จากรายงานการศึกษาผลของตัวทําละลายอินทรีย ตอการเปล่ียนแปลงโครงสรางของแอสตาแซนทินจา ก trans-astaxanthin เปน cis-isomers (9-cis-astaxanthin และ

1,3-cis-astaxanthin) ที่อุณหภูมิ 35 องศาเซลเซียส โดยความตางในการเปล่ียนแปลงโครงสรางของ trans-astaxanthin ขึ้นกับตัวทําละลายจากการเปรียบเทียบเปอรเซ็ นตการเปล่ียนแปลงโครงสราง

(%isomerization) เรียงลําดับจากมากไปหานอย มีดังนี้คือ dichloromethane > chloroform > ตัวทําละลายผสมระหวาง dichloromethane และ methanol (อัตราสวน 25:75 โดยปริมาตร) > methanol >

acetonitrile > acetone > dimethyl sulfoxide (นบชุลี, 2553)



16

ตารางท่ี 3 ปริมาณของแอสตาแซนทินจากแหลงทางชีวภาพ (ที่มา: http://algatech.com)

แหลงทางชีวภาพ ความเขมขนของแอสตาแซนทิน (ppm) Salmonid 5

Plankton 60

Krill 120

Arctic shrimp 1,200

Phaffia yeast 8,000

Haematococcus pluvialis 40,000

ปจจุบันมีแนวโนมในการนําแอสตาแซนทิ นมาพัฒนาเปนผลิตภัณฑ ดานสุขภาพและ เวชสําอางมากขึ้น เน่ืองจากแอสตาแซนทิน ไมถูกเปลี่ยนเปนวิตามินเอที่เปนสาร pro-oxidant ซึ่งถาสารน้ีมีมากเกินไปอาจกอใหเกิดโรคได โดยมีรายงานเกี่ยวกับคุณสมบัติของแอสตาแซน ทินที่เปนประโยชนตอสุขภาพ เชน เปนสารท่ีมีสมบัติตานภาวะเ ครียดออกซิเดชัน และสามารถกําจัดอนุมูลอิสระที่นําไปสูการเกิดโรคเส่ือม (anti-degenerative disease) เชน โรคความเสื่อมทางระบบประสาท โรคความดันสูงในหลอดเลือดหัวใจ โรคมะเร็ง และยังสามารถลดอาการลาทางสายตาได (Guerin และคณะ , 2003) หรือใชในการบําบัดเพ่ือลดปญหาของการเกิดพิษจากการใชสารตานมะเร็ง (Tripathi และ Jena, 2009) Shimidzu และคณะ (1996) รายงานวา แอสตาแซนทินชว ยปองกันการทําลายเยื่อหุมเซลล ดีเอ็นเอ และการทําลายเน้ือเยื่อ ชวยปองกันโรคมะเร็ง โรคหัวใจ โรคความดันโลหิต ชวยสงเสริมระบบภูมิคุมกันโดยเพ่ิมปริมาณ T cell และ B cell และยังสามารถเพิ่ม T-dependent immunoglobulin (Ig) ใน human peripheral blood mononuclear cell ได และมีรายงานวิจัยศึกษา ประสิทธิภาพในการยับยั้ง อนุมูลมูลอิสระของ แอสตาแซนทิน Miki (1991) เปรียบเทียบกับวิตามินอี (สารตานอนุมูลอิสระที่มีประสิทธิภาพสูงและใชอย างแพรหลาย ) โดยฉายรังสียูวีเอซึ่งทําใหเกิดอนุมูลอิสระ ที่สามารถทําลายเซลลหรือเน้ือเยื่อตาง ๆ ของรางกายได ที่เซลลไมโตคอนเดรียของตับหนูนาน 4 ชั่วโมง เมื่อครบระยะเวลา จึงเติมสารละลายแอสตาแซ นทินและวิตามินอีที่แปรผันความเขมขนในชวง 10-3–103 ไมโครโมลาร นาน 24 ชั่วโมง คํานวณความมีชีวิตของเซลลเปรียบเทียบระหวาง สารตานอนุมูลอิสระทั้งสองชนิด โดยสังเกตพบวาเซลลที่มีการเติมแอสตาแซนทินความเขมขน 1 ไมโครโมลาร สามารถปองกันอนุมูลอิสระได 100% ในขณะที่เซลลที่มีการเติมวิตามินอี ตองใช ความเขมขนสูงถึง 1,000 ไมโครโมลาร แสดงวาสารละลาย แอสตา - แซนทินสามารถปองกันอนุมูลอิสระที่เปนอันตรายตอรางกายไดมากกวาวิตามินอีถึง 1,000 เทา



17

ตอมาจึงมีการเรียกชื่อของแอสตาแซนทินวาเปนซูเปอรวิตามินอี และเกิดแนวคิดในการนําแอสตา -

แซนทินมา ประยุกตใช ในการสมานแผลเพ่ือชวยปองกันการทําลายเยื่อหุมเซลล และกระตุน การเจริญของเซลล มีรายงานวาแผลเร้ือรังหรือแผลที่หายชานั้น มีสาเหตุหนึ่งมาจากอนุมูลอิสระที่เกิดขึ้นบริเวณแผล (Moseley และคณะ , 2004) การเติมสารตานอนุมูลอิสระในกลุมแคโรทีนอยด จึงอาจชวยฟนฟูการเจริญของเซลลเยื่อบุผิว และอันตรายท่ีเกิดจาก อนุมูลอิสระ ได โดยการดูดซับพลังงานสวนเกินของ singlet oxygen ไปยังสายโซของแคโรทีนอยด ซึ่งชักนําใหเกิดการสลายของโมเลกุลแคโรทีนอยด แตปองกันโมเลกุลอ่ืนหรือเน้ื อเยื่อไมใหถูกทําลาย มีงานวิจัยที่ นําสง คอลลาเจน ที่เปนองคประกอบหนึ่งในสารประกอบที่อยูระหวางเซลลและการหายของแผล จากคอลลาเจนใน ขมิ้นชัน โดยทดสอบในหนูที่มีบาดแผล พบวาหนูที่มีการรักษาโดยใชคอลลาเจนสามารถเรงการเจริญของเซลลและเน้ือเยื่อ มีการหายของแผล และปริมาณ อนุมูลอิสระ ลดลง (Gopinath และคณะ , 2004) นอกจากน้ี ยังมีการนําวิตามินอี มาชวย ในหนูที่เปนแผล จากโรคเบาหวานบริเวณหลัง พบวาวิตามินอีสามารถลดปริมาณ malondialdehyde (อนุมูลอิสระที่สามารถทําลายโปรตีน ไขมัน และดีเอ็นเอ ในรางกายได ) และกระตุนใหสรางเอนไซ ม glutathione

peroxidase (เอนไซมที่ใชในการปองกันการเกิดอนุมูลอิสระและการเสื่อมตางๆ ในรางกาย ) นอกจากน้ี ยังชวยในการปดปากแผล ที่เวลา 10 วัน (Musalmah และคณะ , 2002) Hallberg และคณะ (1996) รายงานวามีการนํา trolox ที่เปนสารตานอนุมูลอิสระม าใชทาบริเวณ แผลของโรคเบาหวานในหนูนาน 3 เดือน พบวาความยาวของแผลลดลง เมื่อเปรียบเทียบกับความยาวแผลเร่ิมตน มี การสรางเซลลเยื่อบุผิว และมีรอยแผลเปนเกิดขึ้นในหนูบางราย ซึ่งรอยแ ผลเปนถือเปนกระบวนการสุดทายใน การหายของ แผล Uchiyama และคณะ (2002) ใชหนูเพศเมียที่เปนโรคเบาหวานจํานวน 8 ตัว แบงออกเปน 3 กลุมการทดลอง ฉีดสารละลายกลูโคสจํานวน 1 กรัมตอกิโลกรัม นาน 18 สัปดาห และกลุมทดลองหนึ่งใหสารละลายแอสตาแซนทินจํานวน 1 มิลลิกรัมตอตัวหนูตอวัน เมื่อครบ ระยะเวลาเจาะเลือดหนูออกมาตรวจ พบวาหนูที่มีการฉีดสาร ละลายกลูโคสรวมกับการใหแอสตาแซนทิน มีปริมาณกลูโคสในกระแสเลือดลดลง เมื่อเทียบ กับหนูที่ไมไดรับแอสตาแซนทิน Naito และคณะ (2004) ฉีดสารละลายกลูโคสในตัวหนูที่เปนโรคเบาหวานจํานวน 1 มิลลิกรัมตอตัวหนูตอวัน จากนั้นเจาะเลือดมาวัดปริมาณกลูโคสที่เวลา 0-120 นาที พบวาหนูที่เปนโรคเบาหวานและมีการฉีดแอสตาแซนทินจํานวน 1 มิลลิกรัมตอตัวหนูตอวัน มีปริมาณกลูโคสในกระแสเลือดนอยกวาหนูที่เปนเบาหวานแตไมไดฉีดแอสตาแซนทิน ซึ่งอาจเน่ืองมาจากหนูที่เปนเบาหวานมีอนุมูลอิสระเกิดขึ้น ในปริมาณมาก แตเมื่อฉีดแอสตาแซนทินสามารถ ดักจับและยับย้ัง



18

การทํางานของอนุมูลอิสระ ทําใหเซลลของรางกายมีปริมาณอนุมูลอิสระลดลงและทํางานไดอยางปกต ิ

2.4 สารออกฤทธ์ิฆาเชื้อ

แผลเร้ือรังหรือแผลที่หายชาคือ แผลที่ไมสามารถหายไดตามธรรมชาติ เน่ืองจากอายุเพิ่มขึ้น หรือโรคประจําตัวของผูปวย แตสาเหตุที่สําคัญ อีกอยางหนึ่งคือ การติดเช้ือ ทําใหระยะการอักเสบของแผลนานขึ้น การสังเคราะหคอลลาเจนทําไดชาลง ยับยั้งการสรางเซลลและเน้ือเยื่อใหม โดยแผลติดเช้ือสวนมากมักพบเชื้อ Pseudomonas aeruginosa และ Staphylococcus aureus ที่มีเชื้อเร่ิมตนประมาณ 105-108 CFU/ml (กรณีที่มีเชื้อเ ร่ิมตนมากกวา 105 CFU/ml แสดงวามีการติดเชื้อ)โดยลักษณะทางสัณฐานของเช้ื อ P. aeruginosa เปนแบคทีเรียแกรมลบ จัดอยูในตระกูล

Pseudomonadaceae ลักษณะรูปทอน เคลื่อนที่ได เจริญไดในที่มีอากาศ ไมตองการสารอาหารซับซอน สามารถมีชีวิตและเพ่ิมจํานวนในชวงอุณหภู มิ 20-42 องศาเซลเซียส ในสภาพแวดลอมตางๆ ได รวมท้ังในสภาพท่ีมีเกลือสูงๆ และในที่ชื้น บางชนิดสรางรงควัตถุที่ละลายนํ้าได บางชนิดเปนเช้ือกอโรคกับพืช แมลง และสัตว มีเพียงไมกี่ชนิดที่กอโรคกับคน มักเปนเชื้อฉวยโอกาสทําใหเกิดโรคในคนไขที่มีภูมิคุมกัน ผิดปกติ และเกิดอาการรุนแรงกับคนไขที่มีแผลไฟไหม คนไขที่สวนทอปสสาวะ (Poole, 1994) สวนลักษณะสัณฐานของเช้ือ S. aureus เปนแบคทีเรียแกรมบวก จัดอยูในตระกูล Micrococcaceae มีลักษณะทรงกลม ไมเคลื่อนที่ ไมสรางสปอร บางสายพันธุสามารถสรางแคปซูลทําใหโคโลนี เปนเมือก ชวยใหเชื้อมีความทนทานตอการทําลายของยาปฏิชีวนะและภูมิตานทานของรางกาย สามารถเจริญไดดีในสภาพที่มีออกซิเจนหรือมีออกซิเจนเล็กนอย และทนตอสภาพแวดลอมที่ไมเหมาะสมไดดี นอกจากน้ี ยังอาจมีชีวิตรอดไดในหนองหรือเสมหะแหงเปนระยะเวลานาน สามารถเ จริญไดดีที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส (Siriwong และ Chukeatirote, 2009) ยาปฏิชีวนะหมายถึง สารท่ีสรางขึ้นและแยกไดจากจุลชีพชนิดหน่ึง และออกฤทธิ์ยับย้ังหรือทําลายเชื้อจุลชีพ (จุลชีพหมายถึง แบคทีเรีย รา และไวรัส) สามารถแบงเปน 2 กลุมตามฤทธิ์การตานเช้ือคื อ ฤทธิ์การฆาหรือทําลาย (bactericidal) ออกฤทธิ์ตอเยื่อหุมเซลลและผนังเซลลของแบคทีเรียทําใหเชื้อแบคทีเรียตาย ตัวอยางของยาในกลุมนี้ไดแก ยาในกลุมอะมิโนไกโคไซด ควินโนน และฤทธิ์ยับย้ังการเจริญเติบโต (bacteriostatic) ออกฤทธิ์ยับย้ังการสรางโปรตีน ทําใหเชื้อหยุดการแบงตัว การใชยาในกลุมนี้ตองอาศัยกลไกการกําจัดเชื้อออกจากรางกายรวมดวย จึงไมเหมาะสมกับการติดเช้ือที่รุนแรงหรือการติดเช้ือในบริเวณท่ีกลไกการกําจัดของรางกายเขาไปไมถึง



19

เชน ส มองหรือเยื่อบุหัวใจ ตัวอยางของยาในกลุมนี้ ไดแก เตตระไซคลิน ค ลอแรมเฟ นิคอล ยาปฏิชีวนะที่ดีควรออกฤทธิ์ตอเชื้อจุลชีพเทานั้น ไมควรมีผลตอเซลลปกตขิองผูปวย จึงควรเลือกใชใหเหมาะสมกับการรักษา พิจารณาจากปจจัยที่เกี่ยวของ ไดแก เชื้อที่เปนสาเหตุของการเกิดโรค เพื่อเลือกใชยาและขนาดท่ีเหมาะสม ฤทธิ์และระยะเวลาในการใชยา ซึ่งการรักษาจะไดผลข้ึนอยูกับชนิดและขนาดของการใหยา โดยความเขมขนของยา ควรอยูในระดับการออกฤทธิ์การทําลายเชื้อ (ระดับสูงกวาระดับยาต่ําสุดที่ยับยั้งการเจริญของเชื้อ ) ระยะเวลาในการใหยาปฏิชีวนะยังขึ้นกับความไวและปริมาณของเช้ือ การดูดซึม การกร ะจายตัว ตลอดจนระบบภูมิคุมกันของผูปวยและปจจัยเกี่ยวกับผูปวย พิจารณาจากอายุ (มีผลตอการดูดซึม การกําจัดหรือเปล่ียนสภาพของยาเพื่อขับออกจากรางกาย โดยท่ีเด็กมีการกําจัดยาที่ตับยังไมสมบูรณหรือผูสูงอายุกลไกการกําจัดยาอาจเสื่อมประสิทธิภาพลง จึงตองมี การพิจารณาปรับขนาดของยา ) การแพยา (เปนปฏิกิริยาที่เกิ ดจากระบบภูมิคุมกันของรางกาย ตอตานยา ปฏิชีวนะ ที่ไดรับเขา ไป ไมขึ้นกับความแรง หรือปริมาณยา ท่ีใช ) โรคของผูปวย (เชน ผูปวยโรคไตตองมีการปรับขนาดหรือระยะเวลาการใหยาที่ยาวนานข้ึน เน่ืองจากไตมีการทํางานลดลง จึงควรใหยาท่ีขับออกทางตับทดแทน ) นอกจากน้ี การรักษาการติดเชื้อที่เกิดจากเชื้อหลายชนิดหรือมีความไวของยาปฏิชีวนะที่ตางกัน นิยมใชยาหลายชนิดรวมกันเพื่อลดอัตราการเกดิเชื้อด้ือยา โดยเฉพาะโรคท่ีตองใชยาเปนเวลานาน และเพื่อทําลายการติดเช้ือที่รุนแรง เชน เชื้ อในกลุม Pseudomonas ตองใชยาปฏิชีวนะในกลุมอะมิโนไกโคไซดรวมกับ เซฟาโลสปอริน แตการใชยาหลายชนิดรวมกัน อาจสงผลใหเกิดการติดเชื้อแทรกซอน การแพยาหลายชนิด และสิ้นเปลืองคาใชจายมากข้ึน (อโนชาและนงลักษณ, 2543; สุวัฒน, 2542; สุวัฒนาและเนติ, 2547) นอกจากน้ี ยาปฏิชีวนะอาจแบงไดเปน 6 กลุม ตามกลไกการออกฤทธิ์ของยา ไดแก กลุมท่ี 1 กลุมที่มีฤทธิ์ยับย้ังการสรางผนังเซลล ยาในกลุมนี้ ออกฤทธิ์เฉพาะกับเช้ือที่มีการแบ งตัวหรือมีการสรางผนังเซลลเทานั้น มีผลในการยับยั้งการสังเคราะห peptidoglycan ของผนังเซลล ทําใหผนังเซลลไมสมบูรณ ไมทนตอความกดดันภายในเซลลที่สูงกวาความกดดันของสภาพแวดลอมภายนอกเซลลมากๆ ได ทําใหเซลลของแบคทีเรียแตกและตาย จึงจัดเปนยากลุมที่มีคุณสมบัติ ฆาเชื้อแบคทีเรียโดยตรง และออกฤทธิ์ไดเฉพาะ กับเชื้อที่กําลัง เจริญเติบโต แบงตัว หรือการสรางผนังเซลล เน่ืองจากเซลลของแบคทีเรียมีผนัง เซลล แตไมพบในคน ดังนั้น จึงมีพิษตอเซลลของคนนอยมาก ยาในกลุมนี้ประกอบดวย เพนนิซิลิน เซฟาโลสปอริน แวนโคมัยซิน เบซิเตรซิน และไซโครเซอรีน กลุมที่ 2 กลุมที่มีผลตอเยื่อหุมเซลล ยาในกลุ มนี้จับกับเยื่อหุมเซลลของแบคทีเรีย ทําใหกลไกการควบคุมการผานเขาออกของสารตางๆ ผ านเยื่อหุมเซลลเสียไป สงผลให ของเหลวภายในเซลลซึมผานออกมานอกเซลล และทําใหเซลลตายในท่ีสุด ยาในกลุมนี้ออกฤทธิ์ไดทุกระยะ



20

ของการเจริญในเช้ือแบคทีเรีย ประกอบดวย โพลิมิ กซิน โคลิสติน และแอมโฟเทอริซิน บี จัดเปนยาท่ีมีพิษตอเซลลของมนุษยมากท่ีสุด เพราะเยื่อหุมเซลลของมนุษยสามารถถูกทําลายไดเชนเดียวกับเยื่อหุมเซลลของแบคทีเรีย กลุมที่ 3 กลุมที่มีผลยับย้ังการสรางโปรตีน ยากลุมนี้มีผลยับย้ังการทํางานของไรโบโซม ซึ่งเปนองคประกอบที่สําคัญในการสังเคราะหโปรตีน มีฤทธิ์ในการยับย้ังการเจริญเติบโตของแบคทีเรีย แตไมมีผลฆาเชื้อโดยตรง จําเปนตองอาศัยการทํางานของภูมิตานทานของรางกายในการทําลายเชื้อท่ีเหลืออยู ยากลุมนี้สามารถแบงยอยออกเปน 2 กลุมคือ กลุมที่มีผลตอไรโบโซมชนิด 50S ไดแก คลอแรมเฟนิคอล คลินดามัยซิน และ อิริโธมัยซิน และกลุมที่มีผลตอไรโบโซมชนิด 30S ไดแก เตตราซัยคลิน กลุมที่ 4 กลุมที่มีผลทําใหการสรางโปรตีนของแบคทีเรียผิดปกติ เกิดจาก ยาจับกับไรโบโซมชนิด 30S และทําใหเกิดการสรางโปรตีนผิดปกติ ทําใหแบคทีเรียถูกทําลาย จึงมีคุณสมบัติในการฆาเชื้อ โดยตรง ยาในกลุมประกอ บดวย สเปตติโนมัยซิน และอะมิโนไกโคไซด เชน สเตรปโตมัยซิน กานามัยซิน นีมัยซิน และโทบรามัยซิน กลุมที่ 5

กลุมที่มีผลยับย้ังการสรางกรดนิวคลีอิก ยากลุมนี้ทําใหเซลลไมสามารถสรางดีเอ็นเอและอารเ อ็นเอ ซึ่งมีความจําเปนตอการเจริญเติบโตและการแบงตัวของแบคทีเรีย จึงมีฤทธิ์ยับย้ังการเจริญเติบโตของแบคทีเรีย ได ยาในกลุมนี้ ไดแก ไรแฟมฟน เมโทนิดาโซล และยาในกลุมควิโนโลน เชน นอรฟลอคซาซิน โดฟลอคซาซิน ไซโปรฟลอคซาซิน และกลุมที่ 6 กลุมที่ยับยั้งกระบวนการเมตาบอลิสมของแบคทีเรีย ไดแก ยาในกลุมซัลโฟนาไมด และเมโทพริม ซึ่งยับยั้งกระบวนการเมตาบอลิสมของกรดโฟลิค ทําใหแบคทีเรียไมสามารถเจริญเติบโตและแบงตัวตอไปได (กิตติมาและกําพล , 2552) งานวิจัยที่ศึกษาชนิด ความเขมขน และระยะออกฤทธิ์ของยาปฏิชีวนะในการ ยับยั้งหรือทําลายเชื้อในบาดแผลมีดังนี้ Chalkley และ Koornhof (1985) ศึกษาฤทธิ์และระยะเวลาในการตานเชื้อของยาปฏิชีวนะ ciprofloxacin ตอเชื้อ P. aeruginosa, E. coli และ S. aureus พบวา ciprofloxacin ความเขมขน 0.05, 0.1 และ 0.5 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร มีฤทธิ์ใ นการทาํลายเชื้อ E. coli, P. aeruginosa และ S. aureus ตามลําดับ ที่ระยะเวลาการออกฤทธิ์นาน 4 ชั่วโมง รวมทั้งศึกษาฤทธิ์การตานเช้ือของ ciprofloxacin เปรียบเทียบกับ tobramycin กับ aztreonam ที่ระยะเวลาการออกฤทธิ์นาน 5 ชั่วโมง กับเชื้อ P. aeruginosa แลวพบวา ciprofloxacin ความเขมขน 0.05

ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร ออกฤทธิ์การตานเช้ือเทียบเทากับ tobramycin กับ aztreonam ที่ความเขมขน 1.0 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร Trafny (1998) ศึกษาฤทธิ์การตานเช้ือของยาปฏิชีวนะ ciprofloxacin, netilmicin และ polymycin B ตอเชื้อ P. aeruginosa และ S. aureus ใน แผลไฟไหมที่ระยะเวลาการออกฤทธิ์นาน 24 ชั่วโมง ผลการทดลองพบ วาความเขมขนของ netilmicin และ



21

polymycin B เทากับ 8 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร ยับยั้งการเจริญของเชื้อทั้งสองชนิด สวน ciprofloxacin ความเขมขนมากกวา 2 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร ยับย้ังการเจริญของ P. aeruginosa แต S. aureus ตองใช ciprofloxacin ความเขมขนมากกวา 8 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร Grzybowski

และคณะ (1996) ศึกษาฤทธิ์การตานเช้ือของยาปฏิชีวนะ amikacin, doxycyclin และ silver

sulfadiazine ตอเชื้อ P. aeruginosa และ S. aureus ที่ปลดปลอยจากวัสดุปดแผลคอลลาเจนนาน

3 วัน พบวายาปฏิชีวนะมีการปลดปลอยมากท่ีสุดในวันที่ 1 และมีฤทธิ์การตานเช้ือ S. aureus ของ doxycyclin และ silver sulfadiazine ที่ความเขมขนเทากับ 0.01 และ 62.5 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร ตามลําดับ ส วน amikacin ความเขมขนเทากับ 0.4 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร มีฤทธิ์ยับย้ังเช้ือ P. aeruginosa Nishizawa และคณะ (1998) ศึกษาการใชยา carbapenem และ cephem ตอเชื้อ P. aeruginosa ที่คัดแยกไดจากผูปวยติดเชื้อในโรงพยาบาลของประเทศญ่ีปุ นจํานวน 40 คน พบวาเชื้อจากผูปวยตองใชยา meropenem, imipenem, panipenem, cefozopran, cefpirome, ceftazidime

และ cefepime ความเขมขน 8, 32, 32, 8, 32, 64 และ 64 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร ตามลําดับ ในการออกฤทธิ์ยับย้ั งการเจริญของเชื้อ ไดเทากับ 90% Manju และคณะ (2010) สังเคราะหวัสดุปดแผลไฮโดรเจลที่มีสวนประกอบของ poly(phenyl boronic acid) และ polyaminophenyl boronic acid

บรรจุยาปฏิชีวนะ ciprofloxacin ความเขมขน 1 มิลลิกรัมตอมิลลิลิตร และสารละลายกลูโคสเพื่อชวยเพิ่มการพองตัวใหกับไฮโดรเจล ศึกษาการพองตั ว การปลดปลอยยา และฤทธิ์การตานเช้ือ ผลการทดลองพบวา วัสดุปดแผลมีการพองตัวสูงสุดเทากับ 420% เมื่อเติมกลูโคสความเขมขน 0.3 มิลลิกรัมตอมิลลิลิตร (การพองตัวขึ้นกับความเขมขนของกลูโคสที่จับกับโมเลกุลของ กรดโบโรนิก ) มีการปลดปลอยยาคิดเปน 95% ของปริมาณยาท้ังหมด ที่ระยะเวลา 5 ชั่วโมง และเมื่อทดสอบฤทธิ์การตานเช้ือ K. pneumoniae และ S. aureus พบวา เมื่อวางไฮโดรเจลขนาด 1 x 1

เซนติเมตร บนอาหารแข็งที่มีเชื้อและบมเลี้ยงท่ีอุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส นาน 24 ชั่วโมง ไฮโดรเจลสามารถยับยั้งการเจริญของเช้ือทั้งสองชนิดได ดังนั้น การเลือกใชยาจึงมีความสําคัญเปนอยางมากใน การรักษาแผลติดเช้ือ ซึ่งขึ้นกับความรุนแรงของเชื้อ ชนิด และความไวของเชื้อตอยานั้นๆ (ยาปฏิชีวนะตองมีระดับสูงพอในการออกฤทธิ์ทําลายเชื้อ) ในการทํางานอยางมีประสิทธิภาพ ไมกอใหเกิดโรคติดเช้ื อแทรกซอน หรือเกิดการด้ือยา รายงานชนิดและความเข มขนต่ําสุดของยาปฏิชีวนะที่ยับย้ังการเจริญของ เช้ือกอโรค (minimum inhibitory concentration, MIC) รวบรวมไวในตารางท่ี 4



22

ตาราง

ที่ 4 ชน

ิดและความเขม

ขนของยา

ปฏิชีวนะ

ตอเชื้อ

กอโรค

ยาปฏิช

ีวนะ (

MIC;

μg/ml

) เชือ้

แบคท

ีเรียกอโรค

ผูวิจัย

Ci

prof

loxa

cin (0

.016

)

P. aer

uginos

a

Chalk

ley แล

ะ Koo

rnho

f,

1985

Azlo

cillin

(8)

Aztre

onam

(0.0

6)

Tobr

amyc

in (0

.5)

Cipr

oflo

xaci

n (0

.016

)

E. col

i Ce

fotax

ime (

0.06

)

Aztre

onam

(0.1

25)

Tobr

amyc

in (1

)

Cipr

oflo

xaci

n (0

.25)

S. a

ureus

Cefa

zolin

(16)

S. a

ureus และ E

. Coli

Ro

sin แล

ะคณะ

, 198

9 G

entam

icin

(6)

Am

ikac

in (0

.4)

P. aer

uginos

a Gr

zybo

wski

และคณะ

, 199

6 Do

xycy

clin

(0.0

1)

S. aure

us M

erop

enem

(8)

P. aer

uginos

a N

ishiza

wa แ

ละคณ

ะ, 19

98

Imip

enem

(32)

Pani

pene

m (3

2)

Cefo

zopr

an (6

4)

Tobr

amyc

in (0

.468

) P.

aerugi

nosa

Ecke

rt และคณะ

, 200

6

ยาปฏิช

ีวนะ (

MIC;

μg/ml

) เชื้อ

แบคท

ีเรียกอโรค

ผูวิจัย

Pi

pera

cilli

n (1

28)

P. aer

uginos

a

Teno

ver,

2006

Cipr

oflo

xaci

n (4

)

Gent

amici

n (1

6)

Tobr

amyc

in (1

6)

Vanc

omyc

in (1

)

S. aure

us Ge

ntam

icin

(4)

Levo

floxa

cin (0

.1)

Peni

cillin

(0.1

9)

C. teta

ni Ca

mpb

ell และคณ

ะ, 20

09

Chlo

ram

phen

icol (

2)

Eryt

hrom

ycin

(0.5

)

Oflo

xacin

(2)

Cefa

zolin

(800

-900

) S. a

ureus

Sing

h และคณะ

, 200

9 Ce

fazo

lin (3

00)

E. col

i Ge

ntam

icin

(6.3

) S. a

ureus

Elsn

er แล

ะคณะ

, 201

1 Ce

ftazi

dim

e (12

.5)

Gent

amici

n (3

) S. a

lbus

Cefta

zidi

me (

12.5

)



23

บทท่ี 3

วัสดุอุปกรณและวิธีวิจัย

3.1 สารเคมีสําคัญ

3.1.1 Astaxanthin (3, 3’-dihydroxy- , -carotene-4, 4’-dione) บริษัท Sigma, St. Louis,

MO, USA

3.1.2 Bovine serum albumin (BSA) บริษัท Sigma, St. Louis, MO, USA

3.1.3 Ciprofloxacin บริษัท Fluka, Switzerland

3.1.4 Tobramycin บริษัท Sigma, St Louis, MO, USA 3.1.5 Silver nanoparticle บริษัท Sigma, St Louis, MO, USA

3.1.6 MTT (3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazoliumbromide) บริษัท Invitrogen, Eugene, OR, USA

3.1.7 DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl) บริษัท Sigma, St Louis, MO, USA

3.1.8 เปปไทดสกัดจากถั่วเขียว (Protein-lactose, PL; Protein-trypsin-lactose, PTL) 3.1.9 โปรตีนมาตรฐานขนาดโมเลกุล 5-200 กิโลดาลตัน บริษัท Vivantis Technologies,

USA 3.1.10 Silver nitrate บริษัท BDH, England

3.1.11 Ammonium solution บริษัท Merck, Germany

3.1.12 Glucose บริษัท Fluka, Switzerland

3.1.13 Maltose บริษัท Fluka, Switzerland

3.2 เคร่ืองมือ วัสดุและเครื่องแกว 3.2.1 เคร่ืองมือ

3.2.1.1 กลองจุลทรรศน (Light microscope, Olympus)

3.2.1.2 เคร่ืองชั่งทศนิยม 2 ตําแหนง (Balance, Sartorius)

3.2.1.3 เคร่ืองชั่งทศนิยม 4 ตําแหนง (Balance, Sartorius)

3.2.1.4 เคร่ืองนึ่งความดันไอ (Autoclave, Tommy รุน SS-325 และ SX-700)กกกกกกก



24

3.2.1.5 เคร่ืองปนเหว่ียง (Centrifuge, Hettich รุน Universal 32 R และ Beckman รุน Avanti J-25)

3.2.1.6 เคร่ืองผสมสาร (Vortex mixer, Scientific Industries)

3.2.1.7 เคร่ืองวัดความเปนกรดดาง (pH meter, Denver)

3.2.1.8 เคร่ืองอบความรอนแหง (Hot air oven, Memmert) 3.2.1.9 ตูบมควบคุมอุณหภูมิและคารบอนไดออกไซด (CO2 incubator, NuAire) 3.2.1.10 ตูปลอดเชื้อ (Laminar air flow class II, NuAire) 3.2.1.11 ตูบมเชื้อ (Incubator, Memmert)

3.2.1.12 ตูแชแข็งอุณหภูมิ -85 C (Deep freezer, NuAire)

3.2.1.13 อางน้ําควบคุมอุณหภูมิ (Water bath, Memmert)

3.2.1.14 เคร่ืองอานคาการดูดกลืนแสงในไมโครเพลท (Microplate reader, Tecan)

3.2.1.15 เคร่ืองวัดคาการดูดกลืนแสง (Spectrophotometer, Biochrom)

3.2.1.16 ชุดเคร่ืองมือ Electrophoresis (SDS polyacrylamide gel electrophoresis,

Bio-rad)

3.2.1.17 เคร่ืองกําเนิดคลื่นเสียงความถี่สูง (Ultrasonic, Branson)

3.2.2 วัสดุและเครื่องแกว

3.2.2.1 T-flask ขนาด 25 และ 75 cm2

3.2.2.2 96-well plate

3.2.2.3 ตัวกรองขนาด 0.22 m

3.2.2.4 ตัวกรองอาหารปริมาตร 500 ml

3.2.2.5 บีกเกอรขนาด 100, 250, 500 และ 1000 ml

3.2.2.6 ปเปตขนาด 1, 5 และ 10 ml

3.2.2.7 Hemocytometer

3.2.2.8 Autopipette ขนาด 10-100 μl

3.2.2.9 Autopipette ขนาด 100-1000 μl

3.2.2.10 หลอดปนเหว่ียงขนาด 15 ml และ 50 ml

3.2.2.11 จานเพาะเล้ียงเชื้อขนาด 90 x 15 mm และ 60 x 15 mm

3.2.2.12 หลอดทดลองขนาด 16 x150 mm



25

3.2.2.13 Cryovial

3.2.2.14 หลอดปนเหว่ียงขนาดเล็ก 1.5 ml และ 2 ml 3.3 วิธีวิจัย 3.3.1 การเตรียมวัสดุปดแผล

3.3.1.1 การศึกษาขนาดโมเลกุลของเปปไทดจากถั่วเขียว

ประเมินขนาดโมเลกุลของสารสกัดเปปไทดจากถั่วเขียวดวยเทคนิค SDS-PAGE

ดัดแปลงตามวิธีการของ Walker (2002) (แสดงในภาคผนวก ก) สารสกัดมี 2 รูปแบบคือ เปปไทดแลคโตส (PL) และเปปไทดทริปซินแลคโตส (PTL) ในการวิเคราะหใช stacking gel ที่ ความเขมขนของ acrylamide เทากับ 4% โดยปริมาตร และ resolving gel ที่ความเขมขนของ acrylamide

เทากับ 15% โดยปริมาตร (ใชแยกขนาดโมเลกุลไดในชวง 10-100 กิโลดาลตัน) และใชสารละลายเปปไทด PL และ PTL ที่แปรผันความเขมขนเทากับ 0.05, 0.1, 0.5 และ 1.0 มิลลิกรัมตอมิลลิลิตร

3.3.1.2 การเตรียมไฮโดรเจลและแผนเจล BSA เตรียมไฮโดรเจล และแผนเจล โปรตีนตนแบบ BSA ที่แปรผันความเขมขน ของ BSA

เทากับ 3-8% โดยนํ้าหนักตอปริมาตร ละลายใน phosphate buffer pH 7.4 ปริมาตร 5 มิลลิลิตร จากนั้นทําไรเชื้อดวยตัวกรองข นาด 0.2 ไมครอน ใหความรอนที่อุณหภูมิ 100 องศาเซลเซียส แปรผันระยะเวลาในการใหความรอนเทากับ 5-120 นาที เมื่อครบตามระยะเวลาท่ีกําหนดไว นํา ไฮโดรเจลไปทําใหเย็นลงอยางรวดเร็วโดยแชในอางน้ําแข็ง จากนั้นเติมสารละลายโซเดียมคลอไรดใหไดความเขมขนสุดทายเทากั บ 0.25% โดยนํ้าหนักตอปริมาตร (เพื่อเชื่อมประสานไฮโดรเจลใหแข็งแรง ) แลวนําไปกวนใหเขากัน (Akintayo และคณะ , 1999) นําไฮโดรเจลท่ีไดใสในหลอด ปนเหว่ียงขนาด 50 มิลลิลิตร ปริมาตร 3.5 มิลลิลิตร ทิ้งไวใหคงตวัที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส นาน

2 ชั่วโมง 3.3.1.3 การเตรียมวัสดุปดแผล BSA บรรจุสารออกฤทธิ์ฆาเชื้อและแอสตาแซนทิน

เตรียมไฮโดรเจล BSA ตามวิธีการ ขอ 3.3.1.2 และใชความเขมขนของ BSA เทากับ 6% โดยนํ้าหนักตอ ปริมาตร ปริมาตร 5 มิลลิลิตร เวลาในการใหความรอนที่อุณหภูมิ 100 องศาเซลเซี ยส เทากับ 30 นาที เติมสารออกฤทธิ์ฆาเชื้อที่แตกตางกัน ไดแก ยาปฏิชีวนะ ciprofloxacin ที่ละลายในกรดซัลฟูริกความเขมขน 0.05 โมลาร ใหไดความเขมขนเทากับ 100

ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร หรือ tobramycin ที่ละลายใน phosphate buffer pH 7.4 ใหไดความเขมขนเทากับ 10 และ 100 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร รวมกับแอสตาแซนทินที่ ละลายใน dimethylsulfoxide

(DMSO) ความเขมขนเทากับ 100 ไมโครโมลาร โดยเติมในชวงหลังจากการทําใหไฮโดรเจลเ ย็นลง



26

อยางรวดเร็วในอางน้ําแข็ง สวนแผนเจล BSA เตรียมโดยใชความเขมขนของ BSA เทากับ 8% โดยน้ําหนักตอปริมาตร เวลาในการใหความรอนท่ีอุณหภูมิ 100 องศาเซลเซียส เทากับ 20 นาที จากนั้นทําการข้ึนรูปโดยเทเจลลงในจานเพาะเล้ียงเชื้อท่ีมีขนาดเสนผานศูนยกลางเทากับ 10 เซนติเมตร และควบคุมใหมีความหนาประมาณ 1 มิลลิเมตร นําแผนเจลท่ีเตรียมไดไปผ่ึงใ นตูปลอดเชื้อนานประมาณ 6 ชั่วโมง กอนนําไปตัดเปนแผนใหมีขนาดกวาง x ยาว เทากับ 2.5 x 2.5 เซนติเมตร

3.3.1.4 การเตรียมไฮโดรเจลเปปไทดจากถั่วเขียว

เตรียมไฮโดรเจลเปปไทด PL ตามวิธีการเดียวกับของไฮโดรเจล BSA โดยแปรผัน ความเขมขนเทากับ 6-15% โดยน้ําหนักตอปริมาตร ละลายใน phosphate buffer pH 7.4 ปริมาตร 1 มิลลิลิตร จากนั้นทําไรเชื้อดวยตัวกรองขนาด 0.2 ไมครอน หรือฉายดวยรังสีอัลตราไวโอเลต ในตูปลอดเชื้อนาน 24 ชั่วโมง ใหความรอนที่อุณหภูมิ 100 องศาเซลเซียส แปรผันระยะเวลาในการใหความรอน เทากับ 20-180 นาที เมื่อครบตามระยะเวลาท่ีกําหนดไว นําไฮโดรเจลไปทําใหเย็นลงอยางรวดเร็วโดยแชในอางน้ําแข็ง จากนั้นเติมสารละลายโซเดียมคลอไรดใหไดความเขมขนสุดทายเทากับ 0.25% โดยปริมาตร แลวนําไปกวนใหเขากัน นําไฮโดรเจลท่ีได ใสในหลอดปนเหว่ียงขนาด 50 มิลลิลิตร ปริมาตร 0.5 มิลลิลิตร ทิ้งไวใหคงตัวที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส นาน 2 ชั่วโมง

3.3.1.5 การเตรียมวัสดุปดแผลเปปไทดบรรจุสารออกฤทธิ์ฆาเชื้อและแอสตาแซนทิน

เตรียมไฮโดรเจลเปปไทดตามวิธีการขอ 3.3.1.4 และใชความเขมขนของเปปไทดเทากับ 8% โดยน้ําหนักตอปริมาตร ปริมาตร 5 มิลลิลิตร เวลาในการใหคว ามรอนท่ีอุณหภูมิ 100 องศาเซลเซียส เทากับ 30 นาที เติมสารออกฤทธิ์ฆาเชื้อที่แตกตางกัน ไดแก ยาปฏิชีวนะ ciprofloxacin ที่ละลายในกรดซัลฟูริกความเขมขน 0.05 โมลาร ใหไดความเขมขนเทากับ 100 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร หรือท่ี tobramycin ละลายใน phosphate buffer pH 7.4 ใหไดความเขมขนเทากับ 10 และ 100 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร รวมกับแอสตาแซนทินที่ ละลายใน DMSO ความเขมขนเทากับ 100 ไมโครโมลาร โดยเติมในชวงหลังจากการทําใหไฮโดรเจลเย็นลงอยางรวดเร็วในอางนํ้าแข็ง

3.3.1.6 การสังเคราะหอนุภาคซิลเวอร การสังเคราะหอนุภาคซิลเวอรตามวิธี Green synthesis (Tollens process) ดัดแปลงตามงานวิจัยของ Panacek และคณะ (2006) โดยใชสารละลายซิลเวอรไนเตรทความเขมขนเทากับ 1 มิลลิโมลาร ปริมาตร 100 มิลลิลิตร (เตรียมโดยช่ังซิลเวอรไนเตรท 0.017 กรัม ละลายในน้ําปราศจากไอออนปริมาตร 100 มิลลิลิตร) จากนั้นเติมสารละลายแอมโมเนียความเขมขน 10 โมลาร ปริมาตร 0.05 มิลลิลิตร (ใหไดความเขมขนเทากับ 5 มิลลิโมลาร) กวนใหเขากัน ปรับ pH เปน 11.5

จากนั้นเติมกลูโคสหรือมอลโตสท่ีใชเปน reducing agent ปริมาณ 0.198 และ 0.360 กรัม ตามลําดับ (ความเขมขนเทากับ 10 มิลลิโมลาร ) กวนตอใหเขากัน แปรผันระยะเวลาในการเกิดอนุภาคนาน



27

0-5 ชั่วโมง วัดคาการดูดกลืนแสงในชวงความยาวคลื่น 300-700 นาโนเมตร เพื่ อติดตามการสังเคราะหอนุภาค จากนั้นหยุดปฏิกิริยาของการเกิดอนุภาคโดยการปนเหวี่ยงท่ีความเร็วรอบ

2,100 x g นาน 10 นาที ลางอนุภาคดวยน้ําปราศจากไอออน ทําซ้ํา 2 คร้ัง แลวนําอนุภาคที่เตรียมไดไปทําใหเปนผงแหงดวยเทคนิค freeze-drying (Freeze-dry บริษัท Labconco รุน Freezone 18, USA

ที่สถาบันชีววิทยาศาสตรโมเลกุล มหาวิทยาลัย มหิดล ศาลายา) (ดัดแปลงตามวิธีการของ Pal และคณะ, 2007) 3.3.1.7 การทดสอบความสามารถในการละลายของอนุภาคซิลเวอร ประเมินความสามารถในการละลายของอนุภาคซิลเวอรกอนนําไปทดสอบฤทธิ์การตานเชื้อ โดยนําอนุภาคซิลเวอรที่ใชน้ําตาลมอลโตสเปน reducing agent มาทดสอบความสามารถในการละลายในอาหารเหลว nutrient broth (NB) และใน citrate buffer pH 6.8 โดยแปรผันความเขมขนของอนุภาคเทากับ 10, 18.25, 36.5, 75, 125, 250, 500 และ 1,000 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร ปริมาตร 1 มิลลิลิตร บมที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส นาน 24 ชั่วโมง ตรวจสอบการกระจายตัวและ การตกตะกอนของอนุภาค ประเมินความสามารถในการละลายของอนุภ าคซิลเวอรทางการคาที่มีขนาดเล็ก กวา 100

นาโนเมตร ของบริษัท Sigma (St. Louis, MO, USA) กอนทดสอบฤทธิ์ การตานเช้ือ นําอนุภาคซิลเวอรทางการคาละลายใน citrate buffer pH 6.8 แปรผันความเขมขนของอนุภาคเทากับ 50, 100,

200 และ 250 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร ปริมาตร 1 มิลลิลิตร บมที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส นาน 24

ชั่วโมง ตรวจสอบการการกระจายตัวและการตกตะกอน

3.3.2 การศึกษาลักษณะทางกายภาพและคุณสมบัติของแผนเจล

ทดสอบการพองตัว (หรือการดูดซับ ) ของแผนเจล BSA โดยใชแผนเจลขนาด กวาง x ยาว x หนา ประมาณ 1.8 x 1.0 x 0.1 เซนติเมตร ที่ทราบน้ําหนักเร่ิมตน แชใน phosphate

buffer pH 7.4 (บรรจุในจานเพาะเลี้ยงเชื้อขนาด 60 x15 มิลลิลิตร) ปริมาตร 5 มิลลิลิตร นําไปบมที่ตูบมควบคุมความช้ืนอุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส และแปรผันระยะเวลาในการบมนาน 1, 2 และ 3 วัน เมื่อบมครบ 1 วัน ดูด phosphate buffer pH 7.4 ในจานเพาะเล้ียงเชื้อทิ้ง นําแผนเจลออกมาวางบนแผน parafilm ที่ทราบน้าํหนัก เร่ิมตน แลวใชกระดาษ kimwipes ดูดซับ phosphate buffer pH 7.4 บนแผนเจล ออก ชั่งน้ําหนักของแผนเจล จากนั้นนําแผ นเจลใสกลับในจานเพาะเลี้ยงเดิม เติม

phosphate buffer pH 7.4 ปริมาตร 5 มิลลิลิตร แลวนําไปบมตอ ทําเชนนี้จนครบ 3 วัน แลวนําน้ําหนักที่บันทึกไ ด ในแตละวันไปคํานวณหาสัดสวนการพองตั วหรือการดูดซับ (swelling/absorption ratio) ของแผนเจล ดังแสดงในสมการท่ี 1



28

Swelling/Absorption Ratio

= )(มตนแผนเจลเรน้ําหนักของ

มตนแผนเจลเรน้ําหนักของ-การบมตละวันของแผนเจลในแน้ําหนักของ ิ่

ิ่ (1)

3.3.3 การศึกษาฤทธิ์การตานเช้ือของวัสดุปดแผล

3.3.3.1 การเพาะเลี้ยงเชื้อ เพาะเลี้ยงเชื้อแบคทีเรีย Pseudomonas aeruginosa TISTR 1467 และ Staphylococcus aureus TISTR 517 ในอาหารเหลว NB (ประกอบดวย beef extract 3 กรัมตอลิตร และ meat

peptone 5 กรัมตอลิตร) บมเลี้ยงท่ีอุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสในตูบมเชื้อ นานประมาณ 16 ชั่วโมง

3.3.3.2 การทดสอบการตาน เชื้อของยาปฏิชี วนะและแอสต าแซนทินที่บรรจุ ใน ไฮโดรเจล

ประเมินการตานเช้ือของไฮโดรเจล ที่ประกอบดวยยาปฏิชีวนะและแอสตาแซนทินกับเชื้อ P. aeruginosa และ S. aureus โดยนําเชื้อที่บมเล้ียงตามวิธีการ ขอ 3.3.3.1 ไปปนเหว่ียงที่ความเร็วรอบ 8,000 rpm อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส นาน 10 นาที จากนั้นเทสวนใสท้ิง แลวเติมอาหารเหลว NB ปริมาตร 10 มิลลิลิตร ลงไปในหลอดปนเหว่ียงขนาด 15 มิลลิลิตร ผสมใหเขากันดวยเคร่ืองผสมสาร (บริษัท Scientific Industries, UK) วัดปริมาณเช้ือใหมีคาการดูดกลืนแสงอยูในชวง 0.05-0.1 ที่ความยาวคลื่น 600 นาโนเมตร ดวยเคร่ืองอานคาการดูดกลืนแสงในไมโครเพลท (บริษัท Tecan, Switzerland)โดยเช้ือท่ีมีคาการดูดกลืนแสงในชวง 0.05-0.1 มีความเขมขนของเชื้อประมาณ 108 CFU/ml ประเมินการตานเชื้อโดยใชเชื้อเร่ิมตนเทากับ 108 CFU/ml ปริมาตร 9 มิลลิลิตร เติมไฮโดรเจล BSA ปริมาตร 1 มิลลิลิตร (ไฮโดรเจลบรรจุ (1) ยาปฏิชีวนะ ciprofloxacin ละลายในกรดซัลฟูริกความเขมขน 0.05 โมลาร ความเขมขนเทากับ 100 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร (2) ยาปฏิชีวนะ tobramycin ละลายใน phosphate buffer pH 7.4 ความเขมขนเทากั บ 10 และ 100 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร (3) แอสตาแซนทินละลายในตัวทําละลาย DMSO ความเขมขนเทากับ 100 ไมโครโมลาร หรือ (4) ยาปฏิชีวนะ ciprofloxacin หรือ tobramycin ความเขมขนเทากับ 100 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร รวมกับแอสตาแซนทินความเขมขนเทากับ 100 ไมโครโมลาร) นําไปบมเลี้ยงท่ีอุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส นาน 24 ชั่วโมง เมื่อครบระยะเวลา ทดสอบความมีชีวิตของแบคทีเรียโดยใชเทคนิค drop plate บมเลี้ยงท่ี อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส นาน 24 ชั่วโมง นับจํานวนโคโลนีที่เกิดขึ้นและคํานวณหา colony forming unit (CFU) ดังแสดงในสมการท่ี 2



29

) ทดสอบเชื้อทีใ่ชปรมิาตรของ

factordilution x ีทีน่ับไดจํานวนโคโลน( CFU/ml (2)

จากนั้นคํานวณหาอัตราสวนของการลดลงของเชื้อในรูปของ log reduction โดยใช CFU/ml ของตัวอยางเทียบกับของ phosphate buffer pH 7.4 ที่ใชเปนตัวควบคุม แสดงดังสมการที่ 3

)CFU/ml

CFU/ml(log = Reduction Log

bufferphosphate

sample10 (3)

3.3.3.3 การทดสอบการตานเชื้อของอนุภาคซิลเวอร ประเมินการตานเชื้อข องอนุภาคซิลเวอรที่ สังเคราะหไดตามวิธีการ ขอ 3.3.1.6 แปรผันความเขมขนเทากับ 100 และ 125 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร และอนุภาคซิลเวอรทางการคาท่ีมีขนาดเล็กกวา 100 นาโนเมตร ความเขมขน 50 และ100 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร (อนุภาคซิลเวอรละลายใน citrate buffer pH 6.8) กับ P. aeruginosa โดยใชเชื้อเร่ิมตนเทากับ 108 CFU/ml บมที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส นาน 24 ชั่วโมง เมื่อครบระยะเวลา ทดสอบความมี ชีวิตของแบคทีเรียตามวิธีการขอ 3.3.3.2

3.3.4 การทดสอบการปลดปลอยยาปฏิชีวนะในแผนเจล BSA และฤทธิ์การตานเช้ือ

เตรียมยาปฏิชีวนะ ciprofloxacin ความเขมขนเร่ิมตนเทากับ 125 ไมโครกรัมตอแผนเจล (เจลขนาดกวาง x ยาว x หนา เทากับ 2.5 x 2.5 x 0.1 เซนติเมตร) แชใน phosphate buffer pH 7.4

ปริมาตร 5 มิลลิลิตร นําไปบมที่ตูบมควบคุมความช้ืน อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส แปรผันเวลาในการบมนาน 1, 2, 3, 4 และ 5 วัน เมื่อครบตามระยะเวลา ดูด phosphate buffer pH 7.4 ออกใหมากที่สุด จากนั้นเติม phosphate buffer pH 7.4 ลงไปใหเทากับปริมาตรที่ดูดออก นํา phosphate buffer

pH 7.4 ที่ดูดออกไปปนเหว่ียงท่ีความเร็วรอบ 8,000 rpm อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส นาน 10 นาที เก็บสวนใสเพ่ือนําไปวิเคราะหปริมาณและ การตานเช้ือในแตละวันของการบม วิเคราะหปริมาณยา ciprofloxacin โดยวัดคาการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่นสูงสุด 278 นาโนเมตร ดวย เคร่ืองวัดคาการดูดกลืนแสง (บริษัท Biochrom รุน Libra S 22, UK)

ประเมินการตานเชื้อของยาปฏิชีวนะที่ปลดปลอยจากแผนเจลกับ P. aeruginosa โดยใชเชื้อเร่ิมตน 108 CFU/ml ปริมาตร 9 มิลลิลิตร และสวนใสที่เก็บไวปริมาตร 1 มิลลิลิตร นําไปบมที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส นาน 24 ชั่วโมง ทดสอบความมีชีวิตของแบคทีเรีย ตามวิธีการขอ 3.3.3.2



30

3.3.5 การทดสอบความเปนพิษของวัสดุปดแผลตอเซลลสัตว 3.3.5.1 การเพาะเลี้ยงเซลลสัตว เพาะเลี้ยงเซลล ไลน African green monkey kidney (Vero, ATCC CCL-81) เปนเซลลชนิดเกาะผิวจากไตลิง ในอาหาร minimum essential medium (MEM) ที่ประกอบดวย fetal bovine

serum (FBS) 10% บมที่อุณหภูมิ 37 องศาเซ ลเซียสในตูบมที่ควบคุมความชื้น และกาซคารบอนไดออกไซด 5% ใหเขาสูระยะ log phase โดยดูการเกาะแผ (confluence) ที่ 60-80%

3.3.5.2 การเตรียมสวนประกอบของวัสดุปดแผล

เตรียมสวนประกอบของวัสดุปดแผลคือ 6% และ 8% BSA 8% เปปไทด โดยนํ้าหนักตอปริมาตร ยาปฏิชีวนะ ciprofloxacin ความเขมขน 10 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร ยาปฏิชีวนะ tobramycin ความเขมขน 1 และ 10 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร แอสตาแซนทินความเขมขน 10 ไมโครโมลาร กรดซัลฟูริกความเขมขน 1% โดยปริมาตร และตัวทําละลาย DMSO ความเขมขน 1% โดยปริมาตร ที่ละลายในอาหารเลี้ยงเซลล ที่ประกอบดวย FBS 10% จากนั้นผสมใหเขากัน ดวยเคร่ืองผสมสาร (บริษัท Scientific Industries, UK) กอนนําไปใชทดสอบกับเซลลเพาะเลี้ยง

3.3.5.3 การเตรียมวัสดุปดแผลไฮโดรเจลและแผนเจล

เตรียมวัสดุปดแผล ไฮโดรเจล BSA และเปปไทด PL ตามวิธีการ ขอ 3.3.1.3 และ

ขอ 3.3.1.5 ตามลําดับ โดยเจือจางไฮโดรเจลในอาหารเลี้ยง เซลลที่ประกอบดวย FBS 10% ในอัตราสวนเทากับ 1:1, 1:4 และ 1:9 โดยปริมาตรของไฮโดรเจลตออาหารเล้ียงเซลล (Wiegand และคณะ, 2009) จากนั้นผสมใหเขากัน ดวยเคร่ืองผสมสาร (บริษัท Scientific Industries, UK) กอนนําไปใชทดสอบกับเซลลเพาะเลี้ยง

เตรียมวัสดุปดแผ ลแผนเจล (แผนเจลบรรจุ (1) ยาปฏิชีวนะ ciprofloxacin ละลายในกรดซัลฟูริกความเขมขน 0.05 โมลาร ความเขมขนเทากับ 100 ไมโคร กรัมตอมิลลิลิตร (2) ยาปฏิชีวนะ tobramycin ละลายใน phosphate buffer pH 7.4 ความเขมขนเทากับ

100 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร (3) แอสตาแซนทินละลายในตัวทําละลาย DMSO ความเขมขนเทากับ 100 ไมโครโมลาร หรือ (4) ยาปฏิชีวนะ ciprofloxacin หรือ tobramycin ความเขมขนเทากับ 100

ไมโครกรมัตอมิลลิลิตร รวมกับแอสตาแซนทินความเขมขนเทากับ 100 ไมโครโมลาร ) จํานวน 4 แผน ตามวิธีการ ขอ 3.3.1.3 โดยแชใน อาหารเล้ียงเซลล ที่ประกอบดวย FBS 10% ปริมาตร

5 มิลลิลิตร นําไปบมที่ตูบมควบคุมความชื้นอุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส แปรผันระยะเวลาในการบมนาน 1, 2, 3, 4 และ 5 วัน (Wiegand และคณะ, 2011) เมื่อครบระยะเวลา ดูดอาหารเลี้ยงเซลลออกให



31

มากท่ีสุด จากนั้นนําอาหารเล้ียงเซลลที่ดูดออกไป ปนเหว่ียงท่ีความเร็วรอบ 8,000 rpm อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส นาน 10 นาที เก็บสวนใสเพื่อนําไปทดสอบกับเซลลเพาะเลี้ยง

3.3.5.4 การทดสอบความเปนพิษของวัสดุปดแผล ทดสอบความเปนพิษของวัสดุปดแผลตอเซลลเพาะเลี้ย งโดยการวัดคาความมีชีวิตของ

เซลล วิเคราะหดวยวิธี MTT reduction (Zhang และคณะ , 2008) เพาะเลี้ ยงเซลลใหมีความหนาแนนเร่ิมตนเทากับ 2.5×104 เซลลตอหลุม ปริมาตร 100 ไมโครลิตร บมเลี้ยงท่ีอุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสในตูบมท่ีควบคุมความชื้นและกาซคารบอนไดออกไซด 5% นาน 1 วัน จากนั้นดูดอาหารเลี้ยงเซลลทิ้ง แลว จึงเติมวัสดุปดแผล ที่เตรียม ไว ปริมาตร 200 ไมโครลิตร และทํา ชุดควบคุม (positive control) คือ เซลลที่เพาะเลี้ยงกับอาหารเลี้ยงเซลล ที่ประกอบดวย FBS 10% ควบคูกัน บมทิ้งไว ตอเปน ระยะ เวลา 24 และ 48 ชั่วโมง แลวจึงดูดอาหารเล้ียงเซลล และสารทดสอบ ท้ิง ลางเซลลดวย phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 จํานวน 2 คร้ัง จากนั้น เติมสารละลาย MTT

ปริมาตร 100 ไมโครลิตร (ชั่ง MTT 0.025 กรัม ละลายใน PBS pH 7.4 ปริมาตร 50 มิลลิลิตร ใหไดความเขมขนสุดทายเทากับ 0.5 มิลลิกรัมตอมิลลิลิตร ) บมตอเปนเวลา 4 ชั่วโมง ในตูบมและใน ท่ีมืด แลวเติม DMSO ปริมาตร 100 ไมโครลิตร เพื่อละลายผลึกฟอรมาซานท่ีเกิดขึ้นจากปฏิกิริยารีดักชันของ tetrazolium วัดคาการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 560 นาโนเมตร ดวยเคร่ืองอานคาการดูดกลืนแสงในไมโครเพลท (บริษัท Tecan, Switzerland) โดยปริมาณผลึกฟอรมาซานท่ีเกิดขึ้นแปรผันตรงกับคาความมีชีวิตของเซลล รายงาน สัดสวนความมีชีวิตของเซลลที่บม วัสดุปดแผลเทียบกับเซลลชุดควบคุม และวิเคราะหสถิติที่คานัยสําคัญเทากับ 0.05 (ระดับความเช่ือมั่น 95%) 3.3.6 การศึกษาปริมาณแอสตาแซนทินที่บรรจุในวัสดุปดแผล

เตรียมวัสดุปดแผลไฮโดรเจลและแผนเจล BSA ตามวิธีการขอ 3.3.1.3 สวนไฮโดรเจลเปปไทดเตรียมตามวิธีการขอ 3.3.1.5 (เติมแอสตาแซนทินความเขมขนเร่ิมตนเทากับ 10 ไมโคร โมลาร ) สกัดแอสตาแซนทิน ที่บรรจุในไฮโดรเจล โดยใส ไฮโดรเจลในหลอดปนเหว่ียงขนาด 15 มิลลิลิตร ปริมาตร 2 มิลลิลิตร เติมตัวทําละลายผสมระหวาง hexane, ethanol และ acetone

(HEA, อัตราสวน 50:25:25 โดยปริมาตร) ปริมาตร 1 มิลลิลิตร จํานวน 2 คร้ัง สวนการสกัด

แอสตาแซนทินที่บรรจุในแผนเจล ทําโดยใสแผนเจลใน หลอดปนเหว่ียงขนาด 15

มิลลิลิตร เติม phosphate buffer pH 7.4 ปริมาตร 2 มิลลิลิตร และตัวทําละลาย HEA ปริมาตร 1

มิลลิลิตร จํานวน 2 คร้ัง จากนั้นผสมใหเขากัน ดวยเคร่ืองผสมสาร (บริษัท Scientific Industries,

UK) กอนนําไปปนเหว่ียงท่ีความเร็วรอบ 8,000 rpm เปนเวลา 10 นาที ที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส แยกตัวทําละลายผสมสวนใสช้ันบนที่มีแอสตาแซนทิน ที่สกัดไดไปทําใหแหงดวยกาซไนโตรเจน



32

ในหองเย็นท่ีมืด จากนั้นละลายกลับดวยตัวทําละลาย DMSO ปริมาตร 1 มิลลิลิตร วิเคราะหปริมาณแอสตาแซนทินดวย เคร่ืองอานคาการดูดกลืนแสงในไมโครเพลท (บริษัท Tecan, Switzerland) ที่ความยาวคลื่น 480 นาโนเมตร รายงานปริมาณแอสตาแซนทิน ในหนวยไมโครโมลาร ที่คํานวณเทียบจากกราฟมาตรฐาน แสดงความสัมพันธระหวางค าการดูดกลืนแสงกั บแอสตาแซนทินที่แปรผันความเขมขนในชวง 10- 60 ไมโครโมลาร

3.3.7 การทดสอบความสามารถในการตานอนุมูลอิสระ ของแอสตาแซนทินที่บรรจุในแผนเจล BSA

3.3.7.1 การสกัดแอสตาแซนทินในแผนเจล

เตรียมแผนเจลที่บรรจแุอสตาแซนทิน ความเขมขนเร่ิมตน เทากับ 100 ไมโครโมลาร ตามวิธีการขอ 3.3.1.3 แชใน phosphate buffer pH 7.4 ปริมาตร 5 มิลลิลิตร นําไปบมที่ตูบมควบคุมความช้ืนอุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส แปรผันระยะเวลาในการบมนาน 1, 2, 3, 4 และ 5 วัน เมื่อครบระยะเวลา ดูด phosphate buffer pH 7.4 ใสในหลอดปนเหว่ียง สกัดแอสตาแซนทินออกจาก

phosphate buffer pH 7.4 ตามวิธีการขอ 3.3.6

3.3.7.2 การทดสอบความสามารถในการตานอนุมูลอิสระ

ทดสอบความสามารถในการตานอนุมูลอิสระของแอสตาแซนทิน ดวยวิธี DPPH

radical scavenging ดัดแปลงจากงานวิจัยของพัชรินทรและเพชรรัตน (2551) โดยผสมสารละลาย DPPH ในตัวทําละลาย methanol ความเขมขน 50 ไมโครโมลาร ปริมาตร 250 ไมโครลิตร (ชั่ง DPPH 0.0016 กรัม ละลายใน methanol 20 มิลลิลิตร) กับสารละลายตัวอยางท่ีเตรียมไวขางตน (ขอ 3.3.7.1) ปริมาตร 750 ไมโครลิตร ใหมีปริมาตรรวมเทากับ 1,000 ไมโครลิตร จากนัน้ผสมใหเขากันดวยเคร่ืองผสมสาร (บริษัท Scientific Industries, UK) ทิ้งใหสารผสมทําปฎิกิ ริยานาน 30 นาที ในที่มืด โดยชุดควบคุม (control) คือ สารละลาย DPPH ในตัวทําละลาย methanol ความเขมขน 50 ไมโครโมลาร ปริมาตร 250 ไมโครลิตร และตัวทําละลาย DMSO ปริมาตร 750 ไมโครลิตร และชุดอางอิง (reference) คือ สารละลายแอสตาแซนทินในตัวทําละลาย DMSO ปริมาตร 750 ไมโครลิตร และตัวทําละลาย methanol ปรมิาตร 250 ไมโครลิตร เมื่อครบระยะเวลา วัดคาการดูดกลืนแสง สูงสุด ท่ีความยาวคลื่ น 517 นาโนเมตร ดวย เคร่ืองวัด คาการดูดกลืนแสง

(บริษัท Biochrom รุน Libra S 22, UK) และคํานวณหาความสามารถในการตานอนุมูลอิสร ะของ แอสตาแซนทินในรูปของเปอรเซ็นตการตานอนุมูลอิสระ (% inhibition) ดังแสดงในสมการท่ี 4



33

% Inhibition = 100x )OD

OD -(OD- OD(

control

sample)referencecontrol (4)

รายงานความสามารถในการตานอนุมูลอิสระของแอสตาแซนทิน ท่ีสกัดไดจาก phosphate buffer

pH 7.4 ที่คํานวณเทียบจากกราฟมาตรฐานแสดงความสัมพันธระหวางคา ความสามารถในการตานอนุมูลอิสระกับแอสตาแซนทินที่แปรผันความเขมขนในชวง 5-100 ไมโครโมลาร

3.3.8 การทดสอบความสามารถในการฟนฟูเซลลของวัสดุปดแผล

ทดสอบความสามารถในการฟนฟูเซลลของวัสดุปดแผล ดัดแปลงจาก งานวิจัย ของ Wiegand และคณะ (2009) โดยเพาะเลี้ยงเซลล ใหมีความหนาแนน เร่ิมตนเทากับ 4.0×103 เซลลตอหลุม ปริมาตร 100 ไมโครลิตร บมท่ีอุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสในตูบม ที่ควบคุมความช้ืนและกาซคารบอนไดออกไซด 5% นาน 1 วัน จากนั้นดูดอาหารเล้ียงเซลลทิ้ง แลวเติมวัสดุปดแผลที่เตรียมไดตามวิธีการขอ 3.3.5.2 ปริมาตร 200 ไมโครลิตร และทําชุดควบคุมคือ เซลลที่เพาะเลี้ยงกับอาหารเลี้ยงเซลลที่ประกอบดวย FBS 10% ควบคูกัน บมทิ้งไวตอเปนเวลา 1, 2, 3, 4 และ 5 วัน เมื่อครบระยะเวลา ดูดอาหารเล้ียงเซลล และสารทดสอบ ทิ้ง ลางเซลลดวย PBS pH 7.4 จํานวน 2 คร้ัง วัดความมีชีวิตของเซลลโดยวิธี MTT reduction ตามวิธีการเดียวกับขอ 3.3.5.3



34

บทท่ี 4 ผลการทดลองและวิจารณผลการทดลอง

4.1 การเตรียมวัสดุปดแผล

4.1.1 การศึกษาขนาดโมเลกุลของเปปไทดจากถั่วเขียว

งานวิจัยนี้ประเมินขนาดโมเลกุลของสารสกัดเปปไทดจากถั่วเขียวที่นํามาใชเปนโครงสรางของวัสดุปดแผล เน่ืองจากขนาดโมเลกุลมีผลตอการขึ้นรูปของโปรตีน สารสกัดที่ไดรับความอนุเคราะห มี 2 รูปแบบคือ เปปไทดแลคโตส (PL) และเปปไทดทริปซินแลคโตส (PTL) วิเคราะหโดยใช stacking gel และ resolving gel ที่ความเขมขนของ acrylamide เทากับ 4% และ

15% โดยปริมาตร ตามลําดับ (ใชแยกสารขนาดโมเลกุล ในชวง 10-100 กิโลดาลตัน ) และใชสารละลายเปปไทด PL และ PTL ความเขมขน 0.05-1.0 มิลลิกรัมตอมิลลิลิตร ผลการทดลองพบวา เปปไทด PL ที่ความเขมขน 0.5 และ 1.0 มิลลิกรัมตอมิลลิลิตร ปรากฏแถบโปรตีนหลายแถบคือ 70,

50, 40, 33 และ 24 กิโลดาลตัน เมื่อเปรียบเทียบกับแถบโปรตีนมาตรฐาน (ขนาดโมเลกุล 5-200

กิโลดาลตัน) ซึ่งแถบโปรตีนท่ีพบชัด เจนมากท่ีสุด มีขนาดโมเลกุลประมาณ 50 และ70 กิโลดาลตัน แสดงวาเปปไทด PL มีขนาดโมเลกุลของโปรตีนในชวง 50-70 กิโลดาลตัน เปนองคประกอบมากที่สุด สวนเปปไทด PTL ไมปรากฏ แถบที่ชัดเจน บนแผนเจลในทุกความเขมขน ท่ีใช ของการทดสอบเดียวกัน (ภาพที่ 2) ทั้งนี้อาจเน่ืองมาจากสายโซของเปปไทด PTL ถูกยอยโดยเอนไซม ทริปซินใหมีขนาดเล็กลงเกินกวาชวงความเขมขนของ acrylamide ที่ใชสามารถแยกได ดังน้ัน ในงานวิจัยนี้จึงนําเปปไทด PL มาใชเปนองคประกอบของวัสดุปดแผล เน่ืองจากโปรตีนที่มีน้ําหนักโมเลกุลสูง เมื่อเกิดการเสียสภาพจากการไดรับความรอน สามารถเกิดเปนโครงรางหลวมๆ ไดดีกวาโปรตีนน้ําหนักโมเลกุลต่ํา และเน่ืองจากขนาดของเปปไทด PL ใกลเคียงกับของโปรตีนมาตรฐานอัลบูมิน (BSA, น้ําหนักโม เลกุล 76 กิโลดาลตัน ) จึงนําอัลบูมิน มาทดสอบเพ่ือ ใชเปนโปรตีนตนแบบสําหรับการพัฒนาวัสดุปดแผลที่มีองคประกอบของโปรตีนหรือเปปไทดรวมดวย



35

ภาพที่ 2 SDS-PAGE เจลของเปปไทด Lane 1 และ Lane 10 คือโปรตีนมาตรฐาน (Vivantis

Technologies, ขนาดโมเลกุล 5-200 กิโลดาลตัน) Lane 2-5 คือ PTL ความเขมขน 0.05-1.0 มิลลิกรัมตอมิลลิลิตร และ Lane 6-9 คือ PL ความเขมขน 0.05-1.0 มิลลิกรัมตอมิลลิลิตร

4.1.2 การเตรียมไฮโดรเจลและแผนเจล BSA

คุณสมบัติในการเกิด เปนไฮโดรเจลของโปรตีนขึ้นอยูกับชนิด ขนาดโมเลกุล ความเขมขน pH อุณหภูมิ และระยะเวลาในการใหความรอน (Barbut, 1995; Ako และคณะ , 2010) งานวิจัยนี้แปรผันความเขมขน ของ BSA (3-8% โดยนํ้าหนักตอปริมาตร ) และระยะเวลาในการใหความรอน (นาน 5-120 นาที) แลวสังเกตการเกิดไฮโดรเจลจากการพลิกภาชนะที่ใสเจลควํ่าลง เพื่อตรวจสอบความเขมขนตํ่าสุดในการเกิดเจล (least concentration endpoint; LCE) โดยสังเกตจากการพลิกภาชนะคว่ําลง แลวไมพบการไหลของเจลเกิดขึ้น รวมกับการประเมินความหนืดโดยการสัมผัส ผลการทดลองพบวา เจล BSA ที่ความเขมขนเพิ่มขึ้นเปน 3, 4, 5 และ 6% โดยนํ้าหนักตอปริมาตร

เมื่อใหความรอน 100 องศาเซลเซียส นาน 30 นาที มีความหนืดเพ่ิม มากข้ึน เมื่อเปรียบเทียบกับสารละลาย BSA กอนใหความรอน แตไมเกิดการแข็งตัวของเจล เมื่อทดสอบการขึ้นรูปพบวา BSA แข็งตัวทํา เปนแผนเจล (ที่สามารถตัดใหมีขนาดตามตองการได ) ที่ความเขมขนเทากับ 7 และ 8%

โดยนํ้าหนักตอปริมาตร ในเวลาของการใหความรอนนาน 120 และ 20 นาที ตามลําดับ (ตารางท่ี 5)

Barbut (1995) รายงานวา BSA ความเขมขน 10% โดยนํ้าหนักตอปริมาตร pH เทากับ 8 เมื่อใหความรอนที่อุณหภูมิ 90 องศาเซลเซียส นาน 15 นาที และมีการเติมสารละลายแคลเซียมคลอไรดความเขมขน 5 มิลลิโมลาร และ whey protein ความเขมขน 10% โดยนํ้าหนัก ตอปริมาตร pH

เทากับ 7 เมื่อใหความรอนที่อุณหภูมิ 80 องศาเซลเซียส นาน 30 นาที และมีการเติมสารละลายแคลเซียมคลอไรดหรือโซเดียมคลอไรดความเขมขน 25 และ 500 มิลลิโมลาร ตามลําดับ คือสภาวะที่เหมาะสมในการเกิด เปนไฮโดรเจล ซึ่งสอดคลอง กับงานวิจัย ตอมาของ Hongsprabhas และ

70 kDa 50 kDa

24 kDa 33 kDa

40 kDa

14 kDa

31 kDa

36 kDa

45 kDa 50 kDa 70 kDa

130 kDa 150 kDa

Lane 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Marker 0.5 mg 1 mg 0.1 mg 0.05 mg 1 mg 0.5 mg 0.1 mg 0.05 mg Marker PTL PTL PTL PTL PL PL PL PL



36

Barbut (1996) ที่ใช whey protein ความเขมขน เวลา และอุณหภูมิในการใหความรอน เดียวกัน แตเติมสารละลายแคลเซียมคลอไรด ความเขมขน 120 มิลลิโมลาร พบวา เกิดเปนไฮโดรเจลท่ีมีโครงสรางแข็งแรง สีใส และมีรูพรุนเกิดขึ้น โดยเวลาและอุณหภูมิในการใหความรอนที่นานและสูงขึ้น ในชวงทิ้งให คงตัวที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส นาน 2 ชั่วโมง สามารถเพิ่มความแข็งแรงใหกับไฮโดรเจลได นอกจากน้ี การเติมสารละลายโซเดียมคลอไรด หรือแคลเซียมคลอไรด ใหกับโปรตีนที่มีการเสียสภาพจากการใหความรอน ยังเปนการกระชับหรือเชื่อมประสาน โครงสรางของเจลใหแข็งแรงมากขึ้น Akintayo และคณะ (1999) รายงานวาโปรตีนจากถั่วแระที่ความเขมขน 6%

โดยนํ้าหนักตอปริมาตร เมื่อใหความรอนที่ อุณหภูมิ 100 องศาเซลเซียส นาน 1 ชั่วโมง และมีการเติมสาร ละลายโซเดียมคลอไรดความเขมขน 0.25% โดยนํ้าหนักตอปริมาตร สามารถเกิดเปน ไฮโดรเจลที่มีความแข็งแรงได

ตารางที่ 5 ลักษณะทางกายภาพของไฮโดรเจล BSA ตามความเขมขนของ BSA และระยะเวลาในการใหความรอน

หมายเหตุ: + หมายถึง ความหนืดของเจล และ – หมายถึง เจลไมมีความหนืด

BSA

(%w/v)

สภาวะการเตรียมเจล NaCl

(%w/v)

ลักษณะความหนืดของเจลที่สังเกตได(หลังเก็บที่อุณหภูมิ 4 ๐C นาน 2 ชั่วโมง) อุณหภูมิ (๐C) เวลา (นาที)

3 100 30 0.25 +

4 100 30 0.25 +

5 100 30 0.25 ++

6 100 30 0.25 +++

7

100 30 0.25 ++++

100 60 0.25 ++++

100 90 0.25 ++++

100 120 0.25 +++++ LCE

8

100 5 0.25 – 100 10 0.25 – 100 20 0.25 +++++ LCE

100 30 - เจลแข็งตัวกอนเติม NaCl



100 60 - เจลแข็งตัวขณะใหความรอน



37

4.1.3 การเตรียมไฮโดรเจลเปปไทดจากถั่วเขียว เมื่อประเมิน การเกิดไฮโดรเจลของเปปไทด PL โดยแปรผันความเขมขน (6-15% โดยนํ้าหนักตอปริมาตร ) และระยะ เวลาในการใหความรอน (นาน 20-180 นาที) ผลการทดลองพบวา เจลเปปไทดที่ความเขมขนเทากับ 8, 10 และ 15% โดยนํ้าหนักตอปริมาตร ที่เวลาการใหความรอนนาน 20-180 นาที มีความหนืดใกลเคียงกัน แตเมื่อใหความรอนนานขึ้น เปปไทดเป ลี่ยนจากขาวขุนเปนสีน้ําตาล ซึ่งเกิดจากน้ําตาลแลคโตส ท่ีเปนองคประกอบทําปฏิกิริยากับกรดอะมิโน และโปรตีน โดยมีความรอนเปนตัวเรงปฏิกิริยา ทําใหเกิด browning reaction (Labuza และคณะ , 1977) (ตารางที่ 6) เปนที่นาสังเกต วาเปปไทด ไม เกิดการ แข็งตัว ซึ่งอาจ เน่ืองมาจากสารสกัด เปปไทดมีองคประกอบเปนโปรตีนหลายชนิด ที่มีโครงสราง ไมเหมาะสม ในการข้ึนรูป อยางไรก็ตาม มีงานวิจัยที่ศึกษาโปรตีนซึ่ง ไมเกิดเปนไฮโดรเจลแตเปนโปรตีนธรรมชาติหรือเปนผลพลอยไดจากโรงงานอตุสาหกรรม มาผสมกับพอลิเมอร บางชนิด เพื่อ ให เกิดเปน ไฮโดรเจล ได เชน ในงานวิจัยของ Turgeon และ Beaulieu (2001) นํา whey protein ผสมกับพอลิแซกคาไรค เชน κ-carrageenan, alginate และ agar-agar โดย whey protein ความเขมขน 9.1% โดยนํ้าหนัก เมื่อผสมกับ κ-carrageenan ความเขมขน 1% โดยนํ้าหนัก ละลายในสารละลายโซเดียมคลอไรด ความเขมขน 50 มิลลิโมลาร ปรับ pH เทากับ 7 นําไปใหความรอนที่อุณหภูมิ 85 องศาเซลเซียส นาน 15 นาที แลวทิ้งใหคงตัวที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส นานขามคืน พบวา κ-carrageenan สามารถเพิ่มการเชื่อมประสานและความแข็งแรงใหกับ ไฮโดรเจลได นอกจากน้ี Mor และคณะ (1999) พบวา whey protein ความเขมขน 13% โดยนํ้าหนัก เมื่อนําไปผสมกับไขมันเนยความเขมขน 30% โดยนํ้าหนัก ใหความรอนที่อุณหภูมิ 90 องศาเซลเซียส นาน 20 นาที และทิ้งใหคงตัวที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส นาน 12 ชั่วโมง สามารถชวยใหไฮโดรเจลมีความคงตัวและแข็งขึ้น



38

ตารางที่ 6 ลักษณะทางกายภาพของไฮโดรเจลเปปไทดตามความเขมขนของเปปไทด และระยะเวลาในการใหความรอน

หมายเหตุ: + หมายถึง ความหนืดของเจล และ * ขาวขุนเปล่ียนเปนสีน้ําตาล 4.1.4 การสังเคราะหอนุภาคซิลเวอร การสังเคราะห อนุภาคซิลเวอร ทําไดหลายวิธี เชน วิธี chemical reduction โดยใช borohydride, citrate หรือ ascorbate เปนตัวรีดิวซประจุบวกของซิลเวอร ใหเปนประจุศูนย เกิดเปนอนุภาคซิลเวอร งานวิจัยสวนใหญใชการสังเคราะห วิธีนี้ เนื่องจากอนุภาคที่ไดมีความคงตัว และกระจายตัวไดทั้งในตัวทําละลายอินทรียและในน้ํา ไมเกาะกลุมกัน แตวิธีนี้ไมสามารถควบคุมขนาดของอนุภาคที่เกิดขึ้น ได ตลอดจนมีความเปนพิษตอสิ่งแวดลอม วิธี green synthesis เปนการสังเคราะหอนุภาคซิลเวอรโดยใชสารเคมีที่ไมเปนพิษเปนตัวรีดิวซ ไดแก พอลิแซกคาไรด เอนไซม กรดอะมิโน หรือวิตามิน วิธีนี้สามารถควบคุมขนาดของอนุภาคและไมมีความเปนพิษตอสิ่งแวดลอม ดังนั้น ในงานวิจัยนี้จึงเลือกวิธี green synthesis (Tollens process) โดยใชน้ําตาลกลูโคสหรือมอลโตส เปนตัวรีดิวซ แปรผันระยะเวลาในการเกิดอนุภาคนาน 0-5 ชั่วโมง วิเคราะห คาการดูดกลืนแสงในชวงควา มยาวคลื่น 300-700 นาโนเมตร เพื่อติดตามการสังเคราะหอนุภาค ซิลเวอร ผลการทดลองพบวา การเกิดอนุภาคซิลเวอรที่มีกลูโคสและมอลโตส เปนตัวรีดิวซ มีคาการดูดกลืนแสงสูงสุดเทากับ 415 (ภาพที่ 3A) และ 403 นาโนเมตร (ภาพที่ 3B) ตามลําดับ ซึ่งใกลเคียงกับงานวิจัยของ Panacek และคณะ (2006) ที่รายงานวาคาการดูดกลืนแสงสูงสุดของอนุภาคที่มีกลูโคสเปนตัวรีดิวซ เทากับ 420 นาโนเมตร รวมท้ังงานวิจัยของ Pal และคณะ (2007) ที่สังเกตการเกิดอนุภาค ซิลเวอร จาก การ อานคา การ ดูดกลืนแสงที่ลดลงใน ชวง ความยาวคลื่นประมาณ

Peptide

(%w/v)

สภาวะการเตรียมเจล NaCl

(%w/v)

ลักษณะความหนืดของเจลที่สังเกตได(หลังเก็บที่อุณหภูมิ 4 ๐C นาน 2 ชั่วโมง) อุณหภูมิ (๐C) เวลา (นาที)

6 100 30 0.25 +

8

100 30 0.25 ++

100 60 0.25 +++ *

100 90 0.25 +++ *

100 120 0.25 +++ *

100 180 0.25 +++ *

10 100 20 0.25 +++

15 100 20 0.25 +++



39

320 นาโนเมตร ซึ่งแสดงถึงการหายไปขอ งประจุบวกของซิลเวอร และ การดูดกลืนแสงที่เพิ่มขึ้นในชวงความยาวคลื่นประมาณ 420 นาโนเมตร ที่แสดงถึงการเกิดอนุภาคซิลเวอร

A. B.

ภาพที่ 3 คาการดูดกลืนแสงของการเกิดอ นุภาคซิลเวอรในชวงความยาวคลื่น 300-700 นาโนเมตร การเกิดอนุภาคซิลเวอรที่มี (A) กลูโคส (B) มอลโตส เปน reducing agent ที่ระยะเวลา 30-300 นาที และ (C) จลนพลศาสตรของการเปลี่ยนแปลงของคาการดูดกลืนแสงที่เวลา 30-300 นาที ของ (-•-) กลูโคส และ (- -) มอลโตส

30 min 180 min

60 min

90 min

120 min

300 min

240 min

180 min

60 min

300 min 90 min

120 min

240 min

30 min



40

Time (minutes)

0 50 100 150 200 250 300

Abso

rban

ce U

nit

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0glucosemaltose

C. .

ภาพที่ 3 (ตอ)

ภาพที่ 3C แสดงระยะเวลาในการเกิดอนุภาคซิลเวอรที่มีกลูโคสและมอล โตสมีคาสูงสุดและเขาสูสมดุลท่ีเวลาประมาณ 90 นาที Sharma และคณะ (2009) ประเมินขนาดของอนุภาคนาโนของ ซิลเวอรที่มีมอลโตสและกลูโคสเปน ตัวรีดิวซ พบวามีคาเฉลี่ยเทากับ 25 และ 44-57 นาโนเมตร ตามลําดับ ซึ่งขนาดท่ีเล็กลงของอนุภาคนั้น ขึ้นอยู กับการ ปรับ pH ของสารละลายซิลเวอร โดยสารละลายแอมโมเนียความเขมขน 0.005 โมลาร พบวาสามารถควบคุมใหอนุภาคมีขนาดเล็กมากท่ีสุด เมื่อเปรียบเทียบกับสารละลายแอมโมเนียที่ควา มเขมขน 0.2 โมลาร และการเติม ตัวรีดิวซที่เปนนํ้าตาลโมเลกุลเด่ียวและคู โดยนํ้าตาลโม เลกุลคู ทําใหเกิดอนุภาคที่มีขนาดเล็ก กวาน้ําตาลโมเลกุลเด่ียวที่ ความเขมขนเดียวกัน นอกจากน้ี pH ของสารละลายซิลเวอร ยังสงผลตอขนาดของอนุภาคดวย โดยพบวาที่ pH เทากับ 11.5 สามารถเกิดอนุภาคที่เล็ก กวาของ pH เทากับ 12.5 ทั้งนี้ขนาดอนุภาคที่เล็กลงสงผลตอประสิทธิภาพในการฆาเชื้อ เน่ืองจากมีพื้นท่ีผิวสัมผัสกับเซลลไดมากขึ้น

4.1.5 การทดสอบความสามารถในการละลายของอนุภาคซิลเวอร อนุภาคนาโนมีลักษณะเปนคอลลอยดที่กระจายตัว ไดทั้งในตัวทําละลายอินทรียและ ในน้ํา จึงประเมินความสามารถในการละลายของอนุภาคซิลเวอรกอนนํา ไปทดสอบฤทธิ์การตานเช้ือ มีรายงานของบริษัททางการคา วา อนุภาคซิลเวอรสามารถกระจายตัวได ดี เมื่ออยูใน citrate buffer และกอนนําไปทดสอบฤทธิ์การตานเช้ือจึง ทดสอบในอาหารเล้ียงเชื้อ NB (มีคา pH ประมาณ 6.8)

รวมดวย โดยใชอนุภาคซิลเวอรที่มีน้ําตาล มอลโตสเปนตัวรีดิวซแปรผันความเขมขน ของอนุภาค ในชวง 10-1,000 ไมโครกรัมตอมิลลิลิต ร บมที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส นาน 24 ชั่วโมง



41

ผลการทดลองพบวา อนุภาคซิลเวอรที่ละลายในอาหารเหลว NB และใน citrate buffer pH 6.8 เร่ิมตกตะกอนที่ความเขมขนเทากับ 75 และ 250 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร ตามลําดับ (ตารางที่ 7) ซึ่งการตกตะกอนของอนุภาคในอาหารเหลว NB ที่ความเขมขนของอนุภาคตํ่า อาจเกิดจากการรวมตัวกันระหวางโปรตีนที่อยูในอาหารเหลว NB กับไอออนของซิลเวอรที่เกิดจากปฏิกิริยาผันกลับของอนุภาคซิลเวอร (Babu และคณะ , 2008) สวน citrate buffer pH 6.8 นอกจากเพ่ิมความสามารถในการละลายของอนุภาคที่ดีกวา ยังชวย stabilized surface ของอนุภาคดวย ตารางที่ 7 ลักษณะทางกายภาพ ในการละลายอนุภาคซิลเวอร ความเขมขน 10-1,000 ไมโครกรัมตอ

มิลลิลิตร ในอาหารเหลว NB และ citrate buffer pH 6.8 บมที่อุณหภูมิ 37 °C นาน 24 ชั่วโมง

ในการทดสอบความสามารถในการละลายของอนุภ าคซิลเวอรทางการคาที่มีขนาดเล็กกวา 100 นาโนเมตร โดยละลาย อนุภาคซิลเวอร ใน citrate buffer pH 6.8 แปรผันความเขมขน 50-250 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร บมที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส นาน 24 ชั่วโมง ผลการทดลองพบวา อนุภาคซิลเวอรไมละล ายในทุกความเขมขนที่ใชทดสอบ ดังนั้น จึงนําไป sonicate นาน 20 นาที เพื่อชวยเพิ่มความสามารถในการกระจายตัวของอนุภาคกอนนําไป ทดสอบความสามา รถในการละลาย ใหม ซึ่งพบวา อนุภาค ละลาย เปนเนื้อเดียวกัน ไดที่ความเขมขน 50 และ 100

ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร แตที่ความเขมขน 200-250 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร เกิด การตกตะกอนเม่ือเวลาผานไป 5 ชั่วโมง (ตารางที่ 8) มีรายงานวิจัยที่พบวาอนุภาคซิลเวอรที่มีขนาด เสนผานศูนยกลาง 2 นาโนเมตร มีความคงตัวและเกิดเปนลักษณะคอลลอยดดี กวาอนุภาคที่มีเสนผานศูนยกลางอยูในชวง 10-1,000 นาโนเมตร (Babu และคณะ, 2008)

ความเขมขนของ

อนุภาคซิลเวอร (μg/ml)

ความสามารถในการละลาย หมายเหตุ อาหารเหลว NB Citrate buffer pH 6.8

10 ละลายเปนเน้ือเดียวกัน ละลายเปนเน้ือเดียวกัน

18.25 ละลายเปนเน้ือเดียวกัน ละลายเปนเน้ือเดียวกัน

36.5 ละลายเปนเน้ือเดียวกัน ละลายเปนเน้ือเดียวกัน

75 มีตะกอนเกิดขึ้น ละลายเปนเน้ือเดียวกัน

125 มีตะกอนเกิดขึ้น ละลายเปนเน้ือเดียวกัน

250 มีตะกอนเกิดขึ้น มีตะกอนเกิดขึ้น เม่ือเวลาผานไป 5ชั่วโมง 500 มีตะกอนเกิดขึ้น มีตะกอนเกิดขึ้น เม่ือเวลาผานไป 2 ชั่วโมง

1000 มีตะกอนเกิดขึ้น มีตะกอนเกิดขึ้น เม่ือเวลาผานไป 2 ชั่วโมง



42

ตารางที่ 8 ลักษณะทางกายภาพ ในการละลายอนุภาค ซิลเวอรทางการคา ความเขมขน 50-250 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร ใน citrate buffer pH 6.8 บมที่อุณหภูมิ 37 °C นาน 24 ชั่วโมง

4.2 การศึกษาลักษณะทางกายภาพและคุณสมบัติของแผนเจล

คุณสมบัติที่ดีของ วัสดุปดแผล คือ การดูดซับของเหลว เลือด จากบาดแผล ไวภายในโครงสรางที่มีลักษณะเปนรางตาขายไดในปริมาณมาก งานวิจัยนี้จึงทดสอบการดูดซับหรือ การพองตัวของแผนเจล BSA โดยใชแผนเจลที่ทร าบน้ําหนักเร่ิมตน แชใน phosphate buffer pH 7.4

ปริมาตร 5 มิลลิลิตร นาน 1-3 วัน ผลการทดลองพบวา แผนเจลมีลักษณะบวมและเปลี่ ยนเปนสีขาวขุนในวันที่ 1 สวนวันที่ 2 และ 3 บริเวณขอบของแผนเจลมีการยุย ฉีกขาด เกิดการแตกของแผนเจลลอยอยูในสารละลาย จนไมสามารถรักษารู ปรางของแผนเจลไวได และเมื่อคํานวณหาสัดสวนการพองตัวหรือการดูดซับน้ําของแผนเจล พบวา แผนเจลมีการพองตัวหรือการดูดซับ ไดมากท่ีสุดในวนัที่ 1 และเร่ิมมีการ แตกเสียสภาพ ไมสามารถรักษารูปรางของแผนเจลไดในวั นที่ 2 และ 3

สงผลให ประสิทธิภาพในการ ดูดซับลดลงอยางรวดเร็ว (ภาพที่ 4) Sudheesh Kumar และคณะ (2010) สังเคราะหโครงสรางแมแบบของ -chitin/nanosilver และ -chitin และทดสอบการพองตัวของวัสดุ ในน้ํากลั่นและ ใน PBS แลวพบวา -chitin/nanosilver พองตัวมากกวา -chitin เมื่ออยูในตัวกลางทั้งสองชนิด และมีคาการพองตัวมากที่สุดเมื่ออยู ใน PBS เน่ืองจาก -chitin/nanosilver มีรูพรุนที่มากกวา -chitin จึงสามารถดูดซับของเหลวไดดี โดย คาการพองตัวของ -chitin/nanosilver คิดเปน 1,000 และ 1,200 เปอรเซ็นต เมื่ออยูในนํ้ากลั่นและใน PBS ตามลําดับ ที่เวลานาน 7 วัน Tiana และคณะ (2010) นํา waterborne polyurethane มาผสมกับ soy protein isolate หรือเรียกอีกอยางวาพอลิเมอรผสม SW เพื่อชวยในการขึ้นรูป เพิ่มความแข็งแรง และการดูดซับน้ํา โดยตัดพอลิเมอร SW เปนทรงกลมขนาด 10 x 10 x 0.2 มิลลิเมตร แชในน้ํากลั่นนาน 120 ชั่วโมง วิเคราะหเปอรเซ็นตการดูดซับน้ําพบวา พอลิเมอร SW มีการดูดซับน้ําอยางรวดเร็ว และเปอรเซ็นต

ความเขมขนของอนุภาค

ซิลเวอรทางการคา (μg/ml) ลักษณะทางกายภาพ หมายเหตุ

50 ละลายเปนเนื้อเดียวกัน -

100 ละลายเปนเนื้อเดียวกัน -

200 มีตะกอนเกิดขึ้น เมื่อเวลาผานไป 5 ชั่วโมง 250 มีตะกอนเกิดขึ้น เมื่อเวลาผานไป 5 ชั่วโมง



43

การดูดซับน้ําสูงสุดเทากับ 60 เมื่อเวลาผานไป 30 ชั่วโมง จากนั้นเร่ิมเขาสูสมดุล โดยท่ีพอลิเมอรยังคงรูปรางของโครงสราง อยูไดจนครบเวลา 120 ชั่วโมง Varshney (2007) เตรียมไฮโดรเจลของพอลิแซกคาไรด agar และ carragenan ผสมกับ poly(vinyl alcohol) เพื่อเพิ่มความคงตัว ความแข็งแรง และการดูดซับน้ํา โดยนําไฮโดรเจลแชในน้ํากลั่น นาน 72 ชั่วโมง คํานวณเปอรเซ็นตการดูดซับน้ํา ที่เกิดขึ้น พบวาไฮโดรเจลท่ี เติม agar และ carragenan มีการดูดซับนํ้าสูง ที่สุดเทากับ

58 และ 157 ตามลําดับ เมื่อเวลาผานไป 24 ชั่วโมง และเร่ิมเขา สูสมดุลจนครบระยะเวลา 72 ชั่วโมง โดยไฮโดรเจลที่เติม carragenan มีการพองตัวไดมากกวาไฮโดรเจลท่ีเติม agar เน่ืองจาก carragenan ละลายนํ้าไดดีกวา นอกจากน้ี Kim และคณะ (2008) นําไฮโดรเจลของ poly(vinyl alcohol) ผสมกับ sodium alginate และบรรจยุาปฏิชีวนะ nitrofurazone ไปทดสอบการพองตัว ความแข็งแรง การยืดตัว การยืดหยุน และความคงตัว เมื่อแปรผันอุณหภูมิ โดยนําไฮโดรเจล แชในน้ํา นาน 30 นาที พบวาความเขมขนของ sodium alginate ที่เพิ่มขึ้น สามารถชวยเพิ่มการพองตัวใหกับไฮโดรเจล โดย sodium alginate ที่ความเขมขน 20% โดยนํ้าหนัก พองตัว ไดมากท่ีสุดเทากับ 170% ที่เวลานาน 30

นาที แตเมื่อเพิ่มความเขมขนของ sodium alginate มากข้ึน (มากกวา 30% โดยนํ้าหนัก) การพองตัว ความแข็งแรง และการยืดตัวลดลงกลับมีคาลดลง เน่ืองจากความสามารถในการเช่ือมประสานและการละลายน้ําของ sodium alginate ลดลง

ภาพที่ 4 การพองตัวของแผนเจล BSA ที่ระยะเวลาการบม 1-3 วัน ขอมูลที่แสดงเปนคาเฉลี่ยและ

คาเบี่ยงเบนมาตรฐานท่ีไดจากการทดลองซ้ํา 6 คร้ัง

0.0

1.0

2.0

3.0

0 1 2 3

Cum

ulat

ive

Swell

ing

Rat

io

Time (days)



44

4.3 การศึกษาฤทธิ์การตานเชื้อของวัสดุปดแผล

4.3.1 การทดสอบการตานเชื้อของยาปฏิชีวนะและแอสตาแซนทินที่บรรจุในไฮโดรเจล

งานวิจัยนี้เลือกใชยาปฏิชีวนะไดแก ยาในกลุมควิโนโลน (quinolone) คือ ciprofloxacin

เน่ืองจากเปนยาท่ี ออกฤทธิ์ตานเช้ือครอบคลุมทั้งแกรมบวกและแกรมลบ และยาในกลุม อะมิโนไกโคไซด (aminoglycoside) คือ tobramycin ซึ่งเปนยาที่ ออกฤทธิ์ไดดีกับเชื้อแบ คทีเรีย แกรมลบ โดยเฉพาะรูปแทง (กิตติมาและ กําพล , 2552) โดยประเมินฤทธิ์การตานเช้ือของยาปฏิชีวนะที่บรรจุในไฮโดรเจลตอ เช้ือ P. aeruginosa และ S. aureus ใชเชื้อเร่ิมตนเทากับ

108 CFU/ml ปริมาตร 9 มิลลิลิตร และเติมไฮโดรเจลปริมาตร 1 มิลลิลิตร นําไปบมเลี้ยงท่ีอุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส นาน 24 ชั่วโมง เมื่อครบระยะเวลา ทดสอบความมีชีวิตของแบคทีเรีย และคํานวณหาอัตราสวนของการลดลงของเชื้อในรูปของ log reduction ผลการทดลอง พบวา ไฮโดรเจล BSA บรรจุยาปฏิชีวนะ ciprofloxacin ความเขมขน 10 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร ยับย้ังการเจริญของเชื้อ P. aeruginosa ได log reduction เทากับ 6.49 ทั้งนี้ยาปฏิชีวนะ ciprofloxacin มีกลไกในการออกฤทธิ์ฆาเชื้อโดยการยับยั้ง DNA gyrase ในแบคทีเรีย DNA gyrase มีหนาที่ในกระบวนการสรางสายดีเอ็นเอในชวงการคลายเกลียวของสาย supercoil และตัดตอสายดีเอ็นเอ โดยยาปฏิชีวนะจับกับสายดีเอ็นเอ และ DNA gyrase ของแบคทีเรียดวยพันธะโควาเลนต ทําใหหยุดการสรางสายดีเอ็นเอ สงผลใหเชื้อตายในท่ีสุด (ดวงมณี, 2547) ในขณะท่ีไฮโดรเจล BSA และไฮโดรเจลที่มีกรดซัลฟูริกความเขมขนเทากับ 0.133 มิลลิโมลาร มีคา log reduction เทากับ -0.04

และ 0.12 ตามลําดับ แสดงวาไฮโดรเจลและกรดซัลฟูริกที่ใชละลาย ciprofloxacin ไมมีผลตอการยับย้ังการเจริญของเชื้อ (ภาพท่ี 5)



45

-2

0

2

4

6

8

10

Log

Red

uctio

n

Treatment

BSA gel gel + gel + 0.133 mM H2SO4 10 μg/ml ciprofloxacin

ภาพที่ 5 Log reduction ของไฮโดรเจล BSA บรรจุยาปฏิชีวนะ ciprofloxacin ความเขมขน

10 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร เปรียบเทียบกับไฮโดรเจล BSA และไฮโดรเจลท่ีมีกรดซัลฟูริกความเขมขน 0.133 มิลลิโมลาร ขอมูลที่แสดงเปนคาเฉลี่ยและคาเบี่ยงเบนมาตรฐานท่ีไดจากการทดลองซ้ํา 6-10 คร้ัง

การทดสอบฤทธิ์การตานเช้ือ P. aeruginosa ของไฮโดรเจล BSA บรรจุยาปฏิชีวนะ tobramycin ความเขมขน 1 และ 10 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร พบวามีคา log reduction เทากับ 0.84

และ 6.32 ตามลําดับ ยา tobramycin ความเขมขน 10 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร มีผลในการยับยั้งการเจริญของเชื้อแบคทีเรีย เน่ืองจาก มีกลไกการออกฤทธิ์ฆาเชื้อ ยับย้ังการสรางโปรตีนโดยจับกับ ไรโบโซม (เปนอวัยวะยอยขนาดเล็กภายในเซลล ที่ไมมีเยื่อหุม ทําหนาที่ในการสังเคราะหโปรตีน ) ชนิด 30S และทํา ใหเกิดการสรางโปรตีนท่ีผิดปกติ เปนผลใหแบคทีเรียถูกทําลาย (กิตติมาและ กําพล, 2552) สวนไฮโดรเจล BSA ที่ปราศจากยาปฏิชีวนะ มีคา log reduction เทากับ -0.04 ซึ่งไมมีผลในการยับยั้งการเจริญของเชื้อ (ภาพที่ 6)



46

ภาพท่ี 6 Log reduction ของไฮโดรเจล BSA บรรจยุาปฏิชีวนะ tobramycin ความเขมขนเทากับ 1

และ 10 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร เปรียบเทียบกับไฮโดรเจล BSA ขอมูลที่แสดงเปนคาเฉลี่ยและคาเบี่ยงเบนมาตรฐานท่ีไดจากการทดลองซ้ําจํานวน 3–10 คร้ัง

การทดสอบฤทธิ์การตานเช้ือ P. aeruginosa ของไฮโดรเจล BSA บรรจุแอสตาแซนทินความเขมขนเทากับ 10 ไมโครโมลาร และ 0.3% DMSO ที่ใชเปนตัวทําละลายแอสตาแซนทิน พบวามีคา log reduction เทากับ 0.34 และ 0.20 ตามลําดับ ดังนั้น แอสตาแซนทินและตัวทําละลาย DMSO ไมมีผลในการยับยั้งการเจริญของเชื้อ (ภาพท่ี 7)

ภาพที่ 7 Log reduction ของไฮโดรเจล BSA บรรจุแอสตาแซนทินความเขมขน 10 ไมโครโมลาร

เปรียบเทียบกับไฮโดรเจล BSA และไฮโดรเจลฺที่มีตัวทําละลาย DMSO ความเขมขน 0.3% โดยปริมาตร ขอมูลท่ีแสดงเปนคาเฉลี่ยและคาเบี่ยงเบนมาตรฐานท่ีไดจากการทดลองซ้ํา 3-10 คร้ัง

BSA gel gel + gel + 1 μg/ml tobramycin 10 μg/ml tobramycin

-2

0

2

4

6

8

10

Log

Red

uctio

n

Treatment

BSA gel gel + gel + 0.3% DMSO 10 μM astaxanthin

-2

0

2

4

6

8

10

Log

Red

uctio

n

Treatment



47

การทดสอบฤทธิ์การตานเช้ือ P. aeruginosa ของไฮโดรเจล BSA บรรจุยาปฏิชีวนะ ciprofloxacin หรือ tobramycin ความเขมขน 10 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร รวมกับแอสตาแซนทินความเขมขน 10 ไมโครโมลาร พบวามีคา log reduction เทากับ 6.19 และ 6.50 ตามลําดับ สวนไฮโดรเจลที่มีกรดซัลฟูริกความเขมขน 0.133 มิลลิโมลาร รวมกับตัวทําละลาย DMSO ความเขมขน 0.3% โดยปริมาตร และไฮโดรเจลท่ีปราศจากกา รเติมยาปฏิชีวนะและ แอสตาแซนทินมีคา log

reduction เทากับ 0.08 และ -0.04 ตามลําดับ แสดงวาฤทธิ์ของยาปฏิชีวนะในการยับยั้งเชื้อเม่ือรวมกับแอสตาแซนทินยังคงมีประสิทธิภาพ โดยไมมีผลของแอสตาแซนทิน ทําใหประสิทธิภาพลดลง (ภาพท่ี 8)

ภาพที่ 8 Log reduction ของไฮโดรเจลฺ BSA บรรจุยาปฏิชีวนะ ciprofloxacin หรือ tobramycin

ความเขมขน 10 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร รวมกับ แอสตาแซนทิน ความเขมขน 10 ไมโครโมลาร เปรียบเทียบกับไฮโดรเจล BSA และไฮโดรเจลท่ีมีกรดซัลฟูริกความเขมขน 0.133 มิลลิโมลาร และตัวทําละลาย DMSO ความเขมขน 0.3% โดยปริมาตร (CIF คือ ciprofloxacin, TOB คือ tobramycin และ AST คือ แอสตาแซนทิน ) ขอมูลที่แสดงเปนคาเฉลี่ยและคาเบี่ยงเบนมาตรฐานท่ีไดจากการทดลองซ้ํา 6-10 คร้ัง

การทดสอบฤทธิ์การตานเช้ือ P. aeruginosa ของไฮโดรเจล เปปไทดบรรจุยาปฏิชีวนะciprofloxacin หรือ tobramycin ความเขมขน 10 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร รวมกับแอสตาแซนทินความเขมขน 10 ไมโครโมลาร พบวามีคา log reduction เทากับ 7.68 และ 6.13 ตามลําดับ สวนไฮโดรเจลเปปไทดและ ไฮโดรเจลท่ีมีกรดซัลฟูริกความเขมขน 0.133 มิลลิโมลาร รวมกับ ตัวทําละลาย DMSO ความเขมขน 0.3% โดยปริมาตร มีคา log reduction เทากับ 0.15 และ 0.12

ตามลําดับ (ภาพที่ 9) คา log reduction ที่ไดจากการทดลองสอดคลองกับงานวิจัยของ Walters และคณะ (2003) ที่ศึกษากิจกรรมการเผาผลาญอาหารและความทนทานของ เช้ือ P. aeruginosa ตอยา

-2

0

2

4

6

8

10

Log

Red

uctio

n

Treatment

BSA gel gel + gel + gel + H2SO4+DMSO CIF+AST TOB+AST



48

-2

0

2

4

6

8

10

Log

Red

uctio

n

Treatment

ciprofloxacin และ tobramycin โดยใชยาปฏิชีวนะ ciprofloxacin ความเขมขน 1 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร หรือ tobramycin 10 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร บมกับเชื้อ P. aeruginosa ที่เชื้อเร่ิมตน 108

CFU/ml นาน 4 ชั่วโมง พบวายาปฏิชีวนะ ciprofloxacin และ tobramycin มีคา log reduction

เทากับ 5.9 และ 5.2 สวน Spoering และ Lewis (2001) ศึกษาฤทธิ์ตานเช้ือ P. aeruginosa ตอยาปฏิชีวนะ carbenicillin, ofloxacin และ tobramycin เมื่อบมกับเชื้อเร่ิมตน 105 CFU/ml นาน 6 ชั่วโมง พบวายาปฏิชีวนะ carbenicillin ความเขมขน 600 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร มีจํานวนเช้ือที่มีชีวิตรอด 0.1% และยาปฏิชีวนะ ofloxacin ความเขมขน 5 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร มีจํานวนเช้ือที่มีชีวิตรอด เพียง 0.001% ในขณะท่ี ยาปฏิชีวนะ tobramycin ความเขมขน 800 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร มีจํานวนเชื้อที่มีชีวิตรอด 1% และเมื่อไมนานนี้ Kim และคณะ (2008) เปรียบเทียบฤทธิ์การตานเช้ือของคลอรีน ไอออนของซิลเวอร และ tobramycin ตอเชื้อ P. aeruginosa ที่เชื้อเร่ิมตน 106 CFU/ml บมเลี้ยงนาน 5 ชั่วโมง โดยใชคลอรีนความเขมขน 0.05 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร พบวา log reduction เทากับ 4 สวนไอออนของซิลเวอร และ tobramycin ความเขมขน 20 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร มีคา log reduction เทากับ 3.75 และ 3.20 ตามลําดับ Adegbolagun และคณะ (2008)

ทดสอบฤทธิ์การตานเช้ือ P. aeruginosa และ K. pneumoniae ที่คัดแยกไดจากผูปวยในโรงพยาบาลของประเทศไนจีเรีย พบวายาปฏิชีวนะ ciprofloxacin ที่ความเขมขน 0.5 และ 1 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร ออกฤทธิ์ตอเชื้อ K. pneumoniae และ P. aeruginosa ตามลําดับ ได

ภาพที่ 9 Log reduction ของไฮโดรเจล เปปไทดบรรจุยาปฏิชีวนะ ciprofloxacin หรือ tobramycin

ความเขมขน 10 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร รวมกับแอสตาแซนทินความเขมขน10 ไมโครโมลาร เปรียบเทียบกับไฮโดรเจล BSA และไฮโดรเจลท่ีมีกรดซัลฟูริก ความเขมขน 0.133 มิลลิโมลาร และตัวทําละลาย DMSO ความเขมขน 0.3% โดยปริมาตร (CIF คือ ciprofloxacin, TOB คือ tobramycin และ AST คือ แอสตาแซนทิน ) ขอมูลที่แสดงเป นคาเฉลี่ยและคาเบี่ยงเบนมาตรฐานท่ีไดจากการทดลองซ้ํา 3-4 คร้ัง

peptide gel gel + gel + gel + H2SO4+DMSO CIF+AST TOB+AST



49

สวนการทดสอบฤทธิ์การตานเช้ือ S. aureus ของไฮโดรเจลเปปไทดที่บรรจุยาปฏิชีวนะ ciprofloxacin และ tobramycin ความเขมขน 10 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร รวมกับแอสตาแซนทินความเขมขน 10 ไมโครโมลาร พบวา มีคา log reduction เพียง 1.00 และ 1.93 ตามลําดับ ซึ่งแตกตางจากงานวิจัยของ Cirz และคณะ (2007) ที่พบวายาปฏิชีวนะ ciprofloxacin ที่ความเขมขนเทากับ 0.8

ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร ออกฤทธิ์ยับย้ังเช้ือ S. aureus เมื่อบมเลี้ยงนาน 120 นาที Oo และคณะ (2010) ศึกษาความเขมขนของยาปฏิชีวนะในการออกฤทธิ์ฆาเช้ือ P. aeruginosa และ S. aureus ที่คัดแยกจากผูปวยพบวา ciprofloxacin และ gentamicin ความเขมขน 16 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร มีฤทธิ์ตานเช้ือ P. aeruginosa สวน ciprofloxacin และ gentamicin ความเขมขน 4 และ 16 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร ตามลําดับ ออกฤทธิ์ตานเช้ือ S. aureus ได Singh และคณะ (2009) ศึกษาความเขมขนของยาปฏิชีวนะที่ออกฤทธิ์ฆาเชื้อ S. aureus พบวา ยาปฏิชีวนะ oxacillin, cefotaxime, amikacin,

ciprofloxacin และ vacomycin ความเขมขน 0.25, 1, 2, 0.5 และ 1 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร ตามลําดับ ออกฤทธิ์ฆาเชื้อได

4.3.2 การทดสอบการตานเชื้อของอนุภาคซิลเวอร ประเมินฤทธิ์การตานเช้ือของอนุภาคซิลเวอร โดยใชอนุภาคซิลเวอรที่มีมอลโตสเปน reducing agent ที่ความเขมขน 100 และ 125 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร และอนุภาคซิลเวอรทางการคาที่มีขนาดเล็กกวา 100 นาโนเมตร ที่ความเขมขน 50 และ 100 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร กับเช้ือ P. aeruginosa บมเลี้ยงท่ีอุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส นาน 24 ชั่วโมง พบวาอนุภาคซิลเวอรที่สังเคราะห มีคา log reduction เทากับ 0.21 และ 0.30 ที่ความเขมขน 100 และ 125 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร ตามลําดับ (ภาพที่ 10) สวนอนุภาคซิลเวอรทางการคาพบวา มีคา log reduction เทากับ 0.34 และ 0.64 ที่ความเขมขน 50 และ 100 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร ตามลําดับ (ภาพที่ 11) ซึ่งตํ่ากวาของยาปฏิชีวนะ และแตกตางจากงานวิจัยของ Shrivastava และคณะ (2007) ที่พบวาอนุภาคซิลเวอรสังเคราะหโดยใชกลูโคสเปน reducting agent มีฤทธิ์ในการตานเชื้อ S. aureus และ E. coli โดยอนุภาคซิลเวอรที่ความเขมขน 25 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร สามารถยับยั้งการเจริญของเชื้อได 100%

ที่เวลาการบมนาน 8 ชั่วโมง Panacek และคณะ (2006) สังเคราะหอนุภาคซิลเ วอรที่มีกลูโคส กาแลคโตส มอลโตส และแลคโตสเปน reducting agent แลวทดสอบความสามารถในการตานเชื้อแบคทีเรียแกรมบวกและแกรมลบพบวา อนุภาคซิลเวอรที่มีมอลโตส และแลคโตสเปน reducting

agent มีฤทธิ์ในการตานเชื้อมากกว าอนุภาคซิลเวอรที่มีกลูโคส และ กาแลคโตสเปน reducting

agent โดยความเขมขนในชวง 0.84-54 ไมโครกรัมตอ มิลลิลิตร มีฤทธิ์ในการตานเชื้อแบคทีเรีย แกรมบวกและแกรมลบได Lara และคณะ (2010) นําอนุภาคซิลเวอรในทางการคาท่ีมีขนาดเทากับ



50

100 นาโนเมตร มาทดสอบฤทธิ์การตานเช้ือ P. aeruginosa, S. aureus และ E. coli แลวพบวา อนุภาคซิลเวอรที่ความเขมขนเทากับ 83.3 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร มีฤทธิ์ในการยับยั้งการเจริญของเชื้อ P. aeruginosa และ E. coli และอนุภาคซิลเวอรที่ความเขมขน 29.2 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร มีฤทธิ์ในการยับยั้งการเจริญของเชื้อ S. aureus เมื่อเวลาผานไป 24 ชั่วโมง นอกจากนี้ ยังมีรายงานวิจัยของ Lok และคณะ (2007) ที่คนพบวาการออกซิไดซอนุภาคซิลเวอรใหกลายเปนไอออน ซิลเวอรสามารถชวยเพิ่มความสามารถในการตานเชื้อ และการตกตะกอนของอนุภาค ทําใหประสิทธิภาพการตานเชื้อลดลง จึงใชกาซออกซิเจนเปนตัวออกซิไ ดซนาน 30 นาที เพื่อชวยเพิ่มประจใุหกับอนุภาคซิลเวอร จากนั้นนําไปทดสอบฤทธิ์การตานเช้ือ E. coli พบวาอนุภาคซิลเวอรที่มีขนาด 9.2 และ 62 นาโนเมตร มี ฤทธิ์การตานเช้ือท่ีความเขมขน 12 และ 108 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร ตามลําดับ ซึ่งกลไกในการออกฤทธิ์ของอนุภาคซิลเวอรคือ เมื่ออนุภาคซิลเวอรไป เกาะท่ีผนังเซลลของแบคทีเรีย และแทรกเขาไปภายใน จะไปเกาะกับหมู -SH ของเอนไซม ซึ่งมีผลตอระบบเมทาโบลิซึม ทําใหเกิดการยับยั้ง การเจริญเติบโตของเซลลและ ทําลายระบบหายใ จ

ระบบขนยายอิเล็กตรอนในกระบวนการเมทาโบลิ ซึม และระบบขนยายซับสเตรทในเยื่ อหุมเซลล ทําใหแบคทีเรียตายในท่ีสุด (Rai และคณะ, 2009; Hermans, 2007)

ภาพที่ 10 Log reduction ของอนุภาคซิลเวอรที่สังเคราะหความเขมขน 100 และ 125 ไมโครกรัมตอ

มิลลิลิตร ขอมูลที่แสดงเปนคาเฉลี่ยและคาเบี่ยงเบนมาตรฐานท่ีไดจากการทดลองซ้ํา 3 คร้ัง

0

2

4

6

8

10

100 125

Log

Red

uctio

n

[Silver Nanoparticle] (μg/ml)



51

ภาพที่ 11 Log reduction ของอนุภาคซิลเวอรทางการคาความเขมขน 50 และ 100 ไมโครกรัมตอ

มิลลิลิตร ขอมูลที่แสดงเปนคาเฉลี่ยและคาเบี่ยงเบนมาตรฐานท่ีไดจากการทดลองซ้ํา 3 คร้ัง

4.4 การทดสอบการปลดปลอยยาปฏิชีวนะในแผนเจล BSA และฤทธ์ิการตานเชื้อ

ในการทดสอบการปลด ปลอยยาปฏิชีวนะ ciprofloxacin โดยนําไปแชใน phosphate

buffer pH 7.4 นาน 5 วัน ผลการทดลองพบวา ในวันที่ 1 ของการทดสอบ phosphate buffer pH 7.4

มีความขุนเกิดขึ้น และในวันที่ 2-5 แผนเจลมีการแตก ฉีกขาด ไมสามารถรักษารูปราง ของแผนเจลไวได และความขุนลดลงเมื่อเทียบกับวันที่ 1 เมื่อวัดปริมาณและคํานวณ การปลดปลอยยาปฏิชีวนะที่คาการดูดกลืนแสงสูงสุดที่ความยา วคลื่น 278 นาโนเมตร พบวามีการปลดปลอย ในวันที่ 1 และ 2

ปริมาณเทากับ 4.24 และ 1.31 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร ตามลําดับ (ภาพที่ 12) งานวิจัยของ Rahman

Mofizur และคณะ (2011) รายงานวา ciprofloxacin ถูกปลดปลอยสูงสุด เมื่อเวลาผานไป 8 ชั่วโมง สวน Kumar และ Jain (2007) พบวาปลดปลอยสูงสุดเมื่อเวลาผานไป 10 ชั่วโมง นอกจากน้ี ยังพบวามีความเสถียรที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส นาน 8-12 ชั่วโมง

0

2

4

6

8

10

50 100

Log

Red

uctio

n

[Silver Nanoparticle] (μg/ml)



52

0

2

4

6

8

10

0 1 2 3 4 5

Cip

roflo

xacin

Con

cent

ratio

n

Relea

sed (μ

g/ml)

Time (days)

ภาพที่ 12 การปลดปลอยยาปฏิชีวนะ ciprofloxacin ที่ความเขมขนเร่ิมตน 125 ไมโครกรัมตอ

แผนเจล ที่ระยะเวลาการบม 0-5 วัน ขอมูลที่แสดงเปนค าเฉลี่ยและคาเบี่ยงเบนมาตรฐานที่ไดจากการทดลองซ้ํา 3 คร้ัง

สวนการประเมิน ฤทธิ์การตานเช้ือของยา ที่ปลดปลอยจากแผนเจลกับ P. aeruginosa

พบวายาปฏิชีวนะปลดปลอยในวันที่ 1 และ 2 มีคา log reduction เทากับ 6.46 และ 5.04 ตามลําดับ (ภาพที่ 13) ซึ่งสอดคลองกับรายงานวิจัยของ Walters และคณะ (2003) และของ Chalkley และ Koornhof (1985) ที่พบวายาปฏิชีวนะ ciprofloxacin ความเขมขน 0.016-1 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร สามารถตานเช้ือ P. aeruginosa ได

ภาพที่ 13 Log reduction ของยาปฏิชีวนะ ciprofloxacin ที่ปลดปลอยออกจากแผนเจล ใน

1 และ 2 วัน ขอมูลท่ีแสดงเปนคาเฉลี่ยและคาเบี่ยงเบนมาตรฐานท่ีไดจากการทดลองซ้ํา 3 คร้ัง

0

2

4

6

8

10

1 2

Log

Red

uctio

n

Time (days)



53

4.5 การทดสอบความเปนพิษของวัสดุปดแผลตอเซลลสัตว การประเมิน ความเปนพิษของวัสดุปดแผล ตอ เซลลหรือเน้ือเยื่อของผูปวยถือ เปน

สิ่งจําเปนกอนนําไปประยุกตใชจริงในงานวิจัยนี้เลือกใชเซลลไลนชนิด Vero (เซลลเน้ือเยื่อเกี่ยวพันทําหนาที่สรางเสนใยชนิดตางๆ ) เพื่อเปนตัวแทนของเซลลผูปวย ทดสอบผลขององคประกอบตอความมีชีวิตของเซลล ภาพที่ 14 แสดงสัดสวนความมีชีวิตของเซลล หลังบมองคประกอบของวัสดุปดแผล ผลการทดลองพบวา องคประกอบไมมีความเปนพิษตอเซลลเมื่อ บมเปนเวลานาน 24 และ 48 ชั่วโมง โดยสัดสวนความมีชีวิตมีคาความแตกตางอยางมีนัยสําคัญ เมื่อทดสอบกับแอสตาแซนทิน กรดซัลฟูริก และตัวทําละลาย DMSO เปรียบเทียบกับเซลลทดสอบท่ีปราศจาก องคประกอบที่เวลา 24 ชั่วโมง นอกจากน้ี มีขอสังเกตวา เปปไทดและ BSA ที่ความเขมขน 8% โดยนํ้าหนักตอปริมาตร ระยะเวลาการบ มนาน 24 ชั่วโมง มีคาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลมากกวา 1 แสดงวาเปปไทดและ BSA อาจชวยใหเซลลมีการเจริญ เพิ่มขึ้น เน่ืองจากโปรตีนถือเปนโครงสรางพื้นฐานที่สําคัญของเซลล มีหนาที่หลักในการสรางและซอมแซมเซลล สรางคอลลาเจนในช้ันใตผิวหนัง เชื่อมประสานแตละเซลลใหยึดติดกัน สวนยาปฏิชีวนะ ciprofloxacin ความเขมขน 10 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร และ tobramycin ความเขมขน 1 และ 10 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร และกรดซัลฟูริ กความเขมขน 1% โดยปริมาตร ที่เวลา 24 และ 48 ชั่วโมง พบวาไมมีความเปนพิ ษตอเซลล ในงานวิจัยของ Seitz และคณะ (1996) พบวายาปฏิชีวนะ ciprofloxacin และ tobramycin ความเขมขน 3 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร ไมมีความเปนพิษตอเซลล keratocyte ที่เวลา 24 และ 48 ชั่วโมง นอกจากน้ี สัดสวนความมี ชีวิตของเซลลที่ทดสอบกับ แอสตาแซนทินความเขมขน 10 ไมโครโมลาร และตัวทําละลาย DMSO ความเขมขน 1% โดยปริมาตร ที่เวลา 48 ชั่วโมง มีสัดสวนความมีชีวิตมากกวาที่เวลา 24 ชั่วโมง ซึ่งสอดคลองกับงานวิจัยของนบชุลี (2553) ที่รายงานวาตัวทําละลาย DMSO ความเขมขน 1% โดยปริมาตร และแอสตาแซนทินความเขมขน 10 ไมโครโมลาร ไมมีความเปนพิษตอเซลลไลน HepG2 ที่เวลา 24 และ 48 ชั่วโมง



54

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Frac

tion

of V

iabi

lity

24 hours48 hours

ภาพที่ 14 สัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบม กับสวนประกอบของวัสดุปดแผล เปนเวลา 24 และ

48 ชั่วโมง รายงานผลการทดลองเปนคาเฉลี่ย ± คาเบี่ยงเบนมาตรฐานท่ีได จากการทดสอบจํานวน 4-20 ซ้ํา *แสดงถึงคาความแตกตางอยางมีนัยสําคัญท่ี p <0.05

การทดสอบความเปนพิษของไฮโดรเจล BSA และเปปไทด โดยเจือจางไฮโดรเจล ในอาหารเล้ียงเซลลประกอบดวย FBS 10% ในอัตราสวนเทากับ 1:1, 1:4 และ 1:9 โดยปริมาตรของไฮโดรเจลตออาหารเล้ียงเซลล เน่ืองจากไฮโดร เจลละลายอยูใน phosphate buffer pH 7.4 ถาทดสอบโดย เติมไฮโดรเจลลงไปโดย ตรง อาจทําใหเซลลขาดแหลงอาหาร สงผลใหเซลล ตาย จากการขาดอาหารมากกวาการตายท่ีมาจากความเปนพิษของไฮโดรเจล การประเมินความเปนพิษตอเซลลไลนจึงเจือจางไฮโดรเจลในอาหารเล้ียงเซลลตาม มาตรฐาน DIN norm EN ISO 10993-12 ผลการทดลองพบวา ไฮโดรเจล BSA ที่อัตราสวนการเจือจางเทากับ 1:1, 1:4 และ 1:9 โดยปริมาตร ไมมีความเปนพิษตอเซลลที่เวลา 24 และ 48 ชั่วโมง (ภาพที่ 15A และ 15B) โดยสัดสวนความมีชีวิตมีคาความแตกตางอยางมีนัยสําคัญ ในไฮโดรเจล BSA ที่บรรจุยาปฏิชีวนะ ciprofloxacin อัตราสวนการเจือจางเทากับ 1:4 โดยปริมาตร ไฮโดรเจลที่บรรจุยาปฏิชีวนะ tobramycin และไฮโดรเจลท่ีบรรจุยาปฏิชีวนะ ciprofloxacin รวมกับแอสตาแซนทิน อัตราสวนการเจือจางเทากับ 1:1 โดยปริมาตร ที่ระยะการบมนาน 48 ชั่วโมง (ภาพที่ 15B)

* * *

6% BSA 8%BSA 8% peptide 10 μg/ml 10 μM 1 μg/ml 10 μg/ml 1% DMSO 1% H2SO4

ciprofloxacin astaxanthin tobramycin tobramycin

Treatment



55

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Frac

tion

of V

iabi

lity

Treatment

1:91:41:1

A. B. .

ภาพที่ 15 สัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมไฮโดรเจล BSA ที่เจือจางไฮโดรเจลใน อาหารเลี้ยง

เซลลประกอบดวย FBS 10% ในอัตราสวนเทากับ (- -) 1:9, (- -) 1:4 และ (- -) 1:1 โดยปริมาตรของไฮโดรเจลตออาหารเล้ียงเซลล เปนเวลา นาน (A) 24 ชั่วโมง และ (B) 48 ชั่วโมง (H คือ กรดซัลฟูริก , D คือ DMSO, CIF คือ ciprofloxacin, TOB คือ tobramycin และ AST คือ แอสตาแซนทิน ) รายงานผลการทดลองเปน คาเฉลี่ย ± คาเบี่ยงเบนมาตรฐานท่ีไดจากการ ทดสอบจํานวน 3-5 ซ้ํา *แสดงถึงคาความแตกตางอยางมีนัยสําคัญท่ี p <0.05

สวนไฮโดรเจลเปปไทดที่อัตราสวนการเจือจางเทากับ 1:1, 1:4 และ 1:9 โดยปริมาตร ไมมีความเปนพิษตอเซลลที่เวลา 24 และ 48 ชั่วโมง (ภาพที่ 16A และ 16B) ไฮโดรเจลเปปไทด บรรจุ ciprofloxacin แอสตาแซนทิน และ ciprofloxacin รวมกับแอสตาแซนทิน ที่อัตราสวนการเจือจางเทากับ 1:1 โดยปริมาตร เมื่อเทียบกับเซลลทดสอบท่ีปราศจาก ไฮโดรเจลที่เวลา 48 ชั่วโมง มีคาความแตกตางอยางมีนัยสําคัญ (ภาพที่ 16B) มีขอที่นาสังเกตวาทั้ง ไฮโดรเจล BSA และเปปไทด ที่บรรจุยาปฏิชีวนะ ciprofloxacin รวมกับ แอสตาแซนทิน ที่บมกับเซลลนาน 48 ชั่วโมง มี คาสัดสวนความมีชีวิตเพ่ิมขึ้น แสดงใหเห็นวาสารละลายแอสตาแซนทินที่บรรจุในไฮโดรเจลอาจ ชวยกระตุนการเจริญของเซลลได มีรายงานการวิจัยผลของ แอสตาแซนทินที่ชวยกระตุนการเจริญ ของเซลล (Shimidzu และคณะ, 1996) นอกจากน้ี Ohgami และคณะ (2003) นําแอสตาแซนทินมาชวยลดการอักเสบ โดยใชเซลล macrophage ของหนู พบวาเซลลไลนที่ บมดวยแอสตาแซนทิน มีการอักเสบลดลง เมื่อเทียบกับเซลลไลนที่ ปราศจากการบมดวย แอสตาแซนทิน และยังชวยใหความมีชีวิตของเซลลเพิ่มขึ้นอีกดวย

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Frac

tion

of V

iabi

lity

Treatment

1:91:41:1

* *

*

BSA gel gel+ gel+ gel+ gel+ gel+ gel+ gel+ gel+ H D H+D CIF TOB AST CIF+ TOB+ AST AST




56

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Frac

tion

of V

iabi

lity

Treatment

1:91:41:1

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Frac

tion

of V

iabi

lity

Treatment

1:91:41:1

A. B.

ภาพที่ 16 สัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมกับไฮโดรเจลเปปไทดที่เจือจางในอาหารเล้ียงเซลล

ประกอบดวย FBS 10% ในอัตราสวนเทากับ (- -) 1:9, (- -) 1:4 และ (-�-) 1:1 โดยปริมาตรของไฮโดรเจลตออาหารเล้ียงเซลล เปนเวลานาน (A) 24 ชั่วโมง และ (B) 48 ชั่วโมง (H คือ กรดซัลฟูริก , D คือ DMSO, CIF คือ ciprofloxacin, TOB คือ tobramycin และ AST คือ แอสตาแซนทิน) รายงานผลการทดลองเปนคาเฉลี่ย ± คาเบี่ยงเบนมาตรฐานท่ีไดจากการทดสอบจํานวน 3-5 ซ้ํา *แสดงถึงคาความแตกตางอยางมีนัยสําคัญท่ี p <0.05

การทดสอบความเปนพิษของแผนเจลที่แชในอาหารเล้ียงเซลลประกอบดวย FBS 10% นาน 1-5 วัน โดยเติมอาหารเลี้ยงเซลลที่เก็บไวกับเซลล เปนเวลานาน 24 และ 48 ชั่วโมง พบวาเซลลที่บมในอาหารเล้ียงเซลล มีสัดสวนความมีชีวิตใกลเคียงกับของเซลลที่ปราศจากการเติมอาหารเล้ียงเซลลที่เวลา 24 และ 48 ชั่วโมง (ภาพที่ 17A-17E) แสดงวาสารท่ีปลดปลอยออกจากแผนเจลไมกอใหเกิดความเปนพิษหรือเปนอันตรายตอเซลล มีขอนาสังเกตวาในแผน เจลบรรจุ ciprofloxacin และ ciprofloxacin รวมกับแอสตาแซนทิน (1-5 วัน) มีคาความแตกตางอยางมีนัยสําคัญ (ภาพที่ 17A-

17E)

peptide gel+ gel+ gel+ gel+ gel+ gel+ gel+ gel+ gel H D H+D CIF TOB AST CIF+ TOB+ AST AST

* *

*




57

A. B.

C. D.

ภาพที่ 17 สัดสวน ความมีชีวิตของเซลลหลังบม กับแผนเจล BSA ที่แชในอาหารเล้ีย งเซลล

ประกอบดวย FBS 10% เปนเวลานาน (A) 1 วัน (B) 2 วัน (C) 3 วัน (D) 4 วัน และ (E) 5 วัน และบมกับเซลลเปนเวลา 24 และ 48 ชั่วโมง (H คือ กรดซัลฟูริก , D คือ DMSO, CIF คือ ciprofloxacin, TOB คือ tobramycin และ AST คือ แอสตาแซนทิน ) รายงานผลทดลองเปนคาเฉลี่ย ± คาเบี่ยงเบนมาตรฐานท่ีไดจากการทดสอบจํานวน 3-5 ซ้ํา * แสดงถึงคาความแตกตางอยางมีนัยสําคัญท่ี p <0.05

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0Fr

actio

n of

Via

bilit

y

Treatment

24 hours

48 hours

BSA pad pad+ pad+ pad+ pad+ pad+ pad+ pad+ pad+ H D H+D CIF TOB AST CIF+ TOB+ AST AST

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Frac

tion

of V

iabi

lity

Treatment

24 hours

48 hours

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Frac

tion

of V

iabi

lity

Treatment

24 hours

48 hours

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Frac

tion

of V

iabi

lity

Treatment

24 hours

48 hours

* *

* * * * *

* * * * *






58

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0Fr

actio

n of

Via

bilit

y

Treatment

24 hours

48 hours

E.


4.6 การศึกษาปริมาณแอสตาแซนทินท่ีบรรจุในวัสดุปดแผล

งานวิจัยนี้ ตรวจสอบปริมาณแอสตาแซนทินที่ถูกกักเก็บไวในโครงสราง โดย วิธีการทําลายโครงสรางของวัสดุปดแผลดวยตัวทํา ละลายผสม ระหวาง hexane, ethanol และ acetone สกัดและวัดปริมาณ แอสตาแซนทินที่คาการดูดกลืนแสงสูงสุดที่ความยาวคลื่น 480 นาโนเมตร เปรียบเทียบกับปริมาณแอสต าแซนทินเร่ิมตน ผลการทดลอง พบวา ไฮโดรเจล เปปไทดบรรจุแอสตาแซนทิน ไดมากท่ีสุดเทากับ 9.08 ไมโครโมลาร สวนไฮโดรเจลและแผนเจล BSA บรรจุแอสตาแซนทินไดเทากับ 7.61 และ 7.44 ไมโครโมลาร ตามลําดับ (ตารางที่ 9)

ตารางที่ 9 ปริมาณแอสตาแซนทินบรรจุในวัสดุปดแผล

ชนิดของวัสดุปดแผล ปริมาณแอสตาแซนทิน (μM)

ไฮโดรเจล BSA 7.61

ไฮโดรเจลเปปไทด 9.08

แผนเจล BSA 7.44

4.7 การทดสอบความสามารถในการตานอนุมูลอิสระของแอสตาแซนทินท่ีบรรจุในแผนเจล BSA

อนุมูลอิสระ จัดเปนรูปแบบหนึ่งของออกซิเจนท่ีมีโครงสรางไมเสถียร ทําใหสามารถสรางพันธะกับสารอ่ืนไดอยางรวดเร็ว โดยอนุมูลอิสระเหลาน้ีอาจมาจากแสง แดด รังสี ภาวะเครียดในรางกาย มีรายงานวิจัยคนพบวา อนุมูลอิสระเปนสาเหตุหนึ่ง ท่ีทําใหการหายของแผลชาลง จึงเกิดแนวคิดในการใช สารตานอนุมูลอิสระ ในวัสดุปดแผล เพื่อชวยใหแผลหายได เร็วขึ้น งานวิจัยนี้

* * * * *




59

0

1

2

3

4

5

0 1 2 3 4 5

% In

hibi

tion

Time (days)

เลือกใชแอสตาแซนทินส ารตานอนุมูลอิสระที่มี การตานอนุมูลอิสระ ไดสูงที่สุด เทียบกับสารตานอนุมูลอิสระในกลุมเดียวกัน ซึ่งการตรวจสอบความสามารถในการเปนสารตานอนุมูลอิสระเลือกใชวิธี DPPH (DPPH เปนอนุมูลอิสระที่เสถียร มีสีมวง เมื่อ DPPH ไดรับอิเล็กตรอนหรืออนุมูลอิสระไฮโดรเจน จะเปลี่ยนเปน DPPH:H สีเหลือง) วิเคราะหการตานอนุมูลอิสระของแอสตาแซนทินที่บรรจุในแผนเจล BSA โดยแชใน phosphate buffer pH 7.4 นาน 1-5 วัน (เพื่อตรวจสอบความเขมขนของแอสตาแซนทินเร่ิมตนที่บรรจุในแผนเจล ในการศึกษาความสามารถในการฟนฟูเซลล ) วัดความสามารถในการตานอนุมูลอิสระเร่ิมตนในแต ละวันของการแชแผนเจลใน บัฟเฟอร ผลการทดลองพบวา ความเขมขนของแอสตาแซนทินที่บรรจุในแผน เจลเทากับ 6.48 ไมโครโมลาร มีการตานอนุมูลอิสระ ได 1.47% (แอสตาแซนทินความเขมขน 10 ไมโครโมลาร ตานอนุมู ลอิสระคิดเปน 1.80%) เกิดขึ้นในวันท่ี 1 ของการแชแผนเจลในบัฟเฟอร และ ที่ความเขมขนของ แอสตาแซนทินเร่ิม ลดลงในวันที่ 2-5 ซึ่งอาจเน่ืองมา จากแอสตาแ ซนทินเปนสารท่ีสลายตัวไดงายจากปจจัยทางกายภาพ เชน แสง อุณหภูมิ และออกซิเจนในอากาศ จึงทําใหสูญเสียคุ ณสมบัติของสารตานอนุมูลอิสระไป (ภาพที่ 18) Chen และคณะ (2007) ศึกษาผลของอุณหภูมิตอความเสถียรของแอสต าแซนทิน พบวาที่อุณหภูมิสูงทํา ใหแอสตาแซนทินสลายตัวได งายกวา ท่ีอุณหภูมิต่ํา สอดคลองกับงานวิจัย ของนบชุลี (2553) ที่ประเมินความเสถียรของ แอสตาแซนทินในอาหารเล้ียงเซลลที่มี FBS 10% แตปราศจาก phenol red ในสภาวะที่ปราศจากเซลลทดสอบและพาหะนําสงสารที่อุณหภูมิ 37º C พบวาแอสตาแซนทินในสภาวะ ดังกลาวมีความเสถียรลดลง เทากับ 75% ที่เวลา 24 ชั่วโมง

ภาพที่ 18 ความสามาร ถในการตานอนุมูลอิสระของ แอสตาแซนทิน ที่สกัดไดจากแผน

เจล BSA แชใน phosphate buffer pH 7.4 นาน 1-5 วัน รายงานผลการ ทดลองเปนคาเฉลี่ย ± คาเบี่ยงเบนมาตรฐานท่ีไดจากการทดสอบจํานวน 4 ซ้ํา



60

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Frac

tion

of V

iabi

lity

Treatment

1:91:41:1

4.8 การทดสอบความสามารถในการฟนฟูเซลลของวัสดุปดแผล

ในวัสดุปดแผลมีการบรรจุ แอสตาแซนทินเพ่ือดักจับอนุมูลอิสระที่ เปนอุปสรรคตอการหายของแผล และชวยกระตุนการซอมแซมและการเจริญของเซลล การตรวจสอบความสามารถในการฟนฟูเซลล (การฟนฟูเซลลตรวจสอบโดยวัดปริมาณเซลลที่เพิ่มขึ้น ) ใชเซลลที่มีความหนาแนนเร่ิมตน 4x104 เซลลตอมิลลิลิตร บมนาน 24 ชั่วโมง เพื่อใหเซลลมีการเกาะผิวและเจริญเติบโ ตขึ้น จากนั้นเติมวัสดุปดแผล แตละชนิด บมเลี้ยงกับเซล ลนาน 1-5 วัน เมื่อครบระยะเวลาที่กําหนด วัดและคํานวณความมีชีวิตของเซลล ที่เติมวัสดุปดแผลเทียบกับเซลลที่ไมมีการเติมวัสดุปดแผล ผลการทดลองพบวา วัสดุปดแผลไฮโดรเจล BSA ที่อัตราสวนการเจือจางเทากับ 1:1 โดยปริมาตร ระยะเวลาการบมนาน 1-3 วัน (ภาพที่ 19A-19C) มีสัดสวนความมีชีวิตมากกวาในวันที่ 4-5 (ภาพที่ 19D และ 19E)

A. B.

ภาพที่ 19 สัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบม กับไฮโดรเจล BSA ที่เจือจางในอาหารเล้ียงเซลล

ประกอบดวย FBS 10% ในอัตราสวนเทากับ (- -) 1:9, (- -) 1:4 และ (- -) 1:1 โดยปริมาตรของไฮโดรเจลตออาหารเล้ียงเซลล เปนเวลานาน (A) 1 วัน (B) 2 วัน (C) 3 วัน (D) 4 วัน (E) 5 วัน และ (F) ไฮโดรเจล BSA ที่เจือจางในอัตราสวนเทากับ 1:1 โดยปริมาตรของไฮโดรเจลตออาหารเล้ียงเซลล บมเลี้ยงกับเซลลนาน 1-5 วัน (H คือ กรดซัลฟูริก , D คือ DMSO, CIF คือ ciprofloxacin, TOB คือ tobramycin และ AST คือ แอสตาแซนทิน ) รายงานผลการทดลองเปน คาเฉลี่ย ± คาเบี่ยงเบนมาตรฐานท่ีไดจากการ ทดสอบจํานวน 3-5 ซ้ํา *แสดงถึงคาความแตกตางอยางมีนัยสําคัญท่ี p <0.05

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Frac

tion

of V

iabi

lity

Treatment

1:91:41:1

*

*

*

* *



-



61

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0Fr

actio

n of

Via

bilit

y

Treatment

1:91:41:1

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Frac

tion

of V

iabi

lity

Treatment

1:91:41:1

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Frac

tion

of V

iabi

lity

Treatment

1:91:41:1

C. D.

D.

E. F.


ไฮโดรเจล BSA บรรจุแอสตาแซนทินที่อัตราสวนการเจือจางเทากับ 1:4 และ 1:1 โดยปริมาตร ที่ระยะการบมเลี้ยงนาน 1 และ 2 วัน (ภาพที่19A และ19B) ไฮโดรเจลที่เติมตัวทําละลาย DMSO ที่อัตราสวนการเจือจางเทากับ 1:4 โดยปริมาตร บรรจุแอสตาแซนทินและยาปฏิชีวนะ tobramycin ที่อัตราสวนการเจือจางเทากับ 1:1 โดยปริมาตร ที่ระยะการบมเลี้ยงนาน 3 วัน (ภาพที่ 19C) ไฮโดรเจลที่เติมตัวทําละลาย DMSO และบรรจุยาปฏิชีวนะ tobramycin ที่อัตราสวนการเจือจางเทากับ 1:4 โดยปริมาตร และบรรจุบรรจุยาปฏิชีวนะ tobramycin รวมกับแอสตาแซนทิน ที่อัตราสวนการเจือจางเทากับ 1:1 โดยปริมาตร ที่ระยะการบมเลี้ยงนาน 4 วัน (ภาพที่ 19D) ไฮโดรเจลที่บรรจุแอสตาแซนทิน ท่ีระยะการบมเลี้ยงนาน 1-3 วัน และบรรจุยาปฏิชีวนะ tobramycin รวมกับแอสตาแซนทินที่ระยะการบมเลี้ยงนาน 4 วัน (ภาพที่ 19F) มีคาความแตกตาง

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0Fr

actio

n of

Via

bilty

Treatment

1 วัน 2 วัน 3 วัน 4 วัน 5 วัน

*

*

* * * *

* *

*

*







62

อยางมีนัยสําคัญ สวน การฟนฟูเซ ลลที่มี ไฮโดรเ จลเปปไทดพบวาไฮโดรเจลเปปไทดบรรจุ แอสตาแซนทินที่อัตราสวน 1:1 โดยปริมาตร มีสัดสวนความมีชีวิตของเซลลเพิ่มขึ้นที่เวลา บมเลี้ยงนาน 1-3 วัน (ภาพที่ 20A-20C) เมื่อเปรียบเทียบกับ เซลลที่เติมไฮโดรเจลเปปไทดที่มีองคประกอบอ่ืนๆ และเซลลที่มีการบมเลี้ยงนาน 4-5 วัน ทีเ่ติมไฮโดรเจลเปปไทด ชนิดตางๆ พบวาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลใกลเคียงกับของเซลลที่ปราศจากการเติมไฮโดรเจลเปปไทดที่มีการบมเลี้ยงนาน 4-5

วัน (ภาพที่ 20D-20E) สัดสวนความมีชีวิตมี คาความแตกตางอยางมีนัยสําคัญ ในไฮโดรเจลเปปไทดบรรจุ แอสตาแซนทิน ยาปฏิชีวนะ ciprofloxacin รวมกับ แอสตาแซนทิน และยาปฏิชีวนะ

tobramycin รวมกับแอสตาแซนทิน ที่อัตราสวนการเจือจางเทากับ 1:1 โดยปริมาตร ที่ระยะการบมนาน 1 วัน (ภาพที่ 20A) ไฮโดรเจลที่บรร จุแอสตาแซนทิน และบรรจุยาปฏิชีวนะ tobramycin

รวมกับแอสตาแซนทินท่ีอตัราสวนการเจือจางเทากับ 1:1 โดยปริมาตร ที่ระยะการบมเลี้ยงนาน 2

วัน (ภาพที่ 20B) ไฮโดรเจลที่ เติมตัวทําละลาย DMSO รวมกับกรดซัลฟูริก บรรจุ แอสตาแซนทิน และยาปฏิชีวนะ tobramycin รวมกับแอสตาแซน ทิน ในอัตราสวนการเจือจางเทากับ 1:1 โดยปริมาตร ระยะการบมนาน 3 วัน (ภาพที่ 20C) สวนการฟนฟูเซลล จากแผนเจล BSA แชในอาหารเลี้ยงเซลลประกอบดวย FBS 10% นาน 1-5 วัน แลวนํามาบมเล้ียงกับเซลลนาน 1-5 วัน (ภาพที่ 21A-21E) พบวาแผนเจล BSA บรรจุแอสตาแซนทินที่แชในอ าหารเล้ียงเซลลนาน 1 และ 2 วัน จากนั้นนําไปบมกับเซลลอีก 1 และ 2 วัน มีสัดสวนความมีชีวิต เพ่ิมมากข้ึน (ภาพที่ 21A และ 21B) เมื่อเปรียบเทียบกับแผนเจลที่มีการแชในอาหารเล้ียงเซลล และบมเลี้ยงกับเซลล นานขึ้น สัดสวนความมีชีวิตมี คาความแตกตางอยางมีนัยสําคัญ ในแผนเจลบรรจุแอสตาแซนทินและแชในอาหารเลี้ยงเซลลนาน 1 วัน จากนั้นบมกับเซลลอีก 1 (ภาพที่ 21A) และ 2 วัน (ภาพที่ 21B) แผนเจลที่ เติมตัวทําละลาย DMSO รวมกับกรดซัลฟูริก บรรจุแอสตาแซนทิน และ ยาปฏิชีวนะ ciprofloxacin

รวมกับแอสตาแซนทินที่แชในอาหาร เซลลนาน 2 วัน จากน้ันบมกับเซลลอีก 2 วัน (ภาพที่ 21B)

ทั้งนี้ไฮโดรเจลเปปไทดมีสัดสวนความมีชีวิตของเซลลสูงสุดในวันที่ 1-3 ของการบมเลี้ยงกับเซลล เมื่อเทียบกับในสภาวะเดียวกัน เน่ืองจากไฮโดรเจลเปปไทด บรรจุแอสตาแซนทิน อาจชวยกระตุนการเจริญเติบโตของเซลล หรืออาจเปนผลรวมของเ ปปไทดที่ชวยในการเจริญ เน่ืองจากเปป ไทดเปนโปรตีนสายสั้น ชวยซอมแซมเซลลที่เสียหายและเรงการเจริญของเนื้อเยื่อใหม นอกจากน้ี ในเปปไทด ยังมีน้ําตาลแลคโตสอีกดวย การฟนฟูเซลล จากวัสดุปดแผลที่สังเคราะห นี้เกิดขึ้นในวันที่ 1-3 ของการทดสอบ โดยท่ัวไป วัสดุปดแผลมีอายุการใชงานนาน 5-7 วัน ทําหนาที่ในการปองกันการติดเชื้อ และเรงการเจริญของเซลลใหม การทําหนาที่ของวัสดุปดแผลตองเกิดขึ้นอยางรวดเร็ว เพื่อใหเกิดการหายของแผลอยางปกติ Dong และคณะ (2004) ศึกษาชนิดของวัสดุชีวภาพที่เหมาะสมตอการเจริญขอ งเซลล โดยใชโปรตีนจากขาวโพด ขึ้นรูปเปนแผ นฟลมเปรียบเทียบกับ



63

polylactic acid (PLA) ตรวจสอบการเกาะแผของเซลล HL-7702 และ NIH3T3 เปนเวลา 56 ชั่วโมง สังเกตการยึดเกาะ การกระจายตัว และวัดความมีชีวิตของเซลลบนวัสดุ ทั้งสองชนิด พบวาฟลมของโปรตีนขาวโพดเหมาะสมตอการเพ่ิมจํานวนของ เซลลที่ระยะเวลา 3 วันของการบม และมีการยึดเกาะเกิดขึ้นภายใน 3 ชั่วโมงแรก สวน PLA ไมเหมาะสมตอการเปนพื้นผิวใหเซลลยึดเกาะ อีกทั้งยังมีความเปนพิษตอเซลล

A. B.

C. D.

ภาพที่ 20 สัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมกับไฮโดรเจลเปปไทดที่เจือจางในอาหารเล้ียงเซลล

ประกอบดวย FBS 10% ในอัตราสวนเทากับ (- -) 1:9, (- -) 1:4 และ (- -) 1:1 โดยปริมาตรของไฮโดรเจลตออาหารเล้ียงเซลลเปนเวลานาน (A) 1 วัน (B) 2 วัน (C) 3 วัน (D) 4 วัน (E) 5 วัน และ (F) ไฮโดรเจลเปปไทด ที่เจือจางในอัตราสวนเทากับ 1:1 โดยปริมาตรของไฮโดรเจลตออาหารเล้ียงเซลล นาน1-5 วัน (H คือ กรดซัลฟูริก , D คือ DMSO, CIF คือ ciprofloxacin, TOB คือ tobramycin และ AST คือ แอสตาแซนทิน) รายงานผลการทดลองเปนคาเฉลี่ย ± คาเบี่ยงเบนมาตรฐานท่ีไดจากการทดสอบจํานวน 3-5 ซ้ํา *แสดงถึงคาความแตกตางอยางมีนัยสําคัญที่ p <0.05

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Frac

tion

of V

iabi

lity

Treatment

1:91:41:1

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Frac

tion

of V

iabi

lity

Treatment

1:91:41:1

*

* * *

*





64

C. D.

E. F.


0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Frac

tion

of V

iabi

lity

Treatment

1:91:41:1

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Frac

tion

of V

iabi

lity

Treatment

1:91:41:1

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Frac

tion

of V

iabi

lity

Treatment

1:91:41:1

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0Fr

actio

n of

Via

bilty

Treatment


* * * *

*

* *

* * *







65

A. B.

C. D.

ภาพที่ 21 สัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมกับแผนเจล BSA ที่แชในอาหารเล้ียงเซลล

ประกอบดวย FBS 10% นาน 1-5 วันโดยบมกับเซลลเปนเวลานาน (A) 1 วัน (B) 2 วัน (C) 3 วัน (D) 4 วัน และ (E) 5 วัน (H คือ กรดซัลฟูริก , D คือ DMSO, CIF คือ

ciprofloxacin, TOB คือ tobramycin และ AST คือ แอสตาแซนทิน ) รายงานผลการทดลองเปนคาเฉลี่ย ± คาเบี่ยงเบนมาตรฐานท่ีไดจากการทดสอบ จํานวน 3-5 ซ้ํา *แสดงถึงคาความแตกตางอยางมีนัยสําคัญที่ p <0.05

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Frac

tion

of V

iabi

lity

Treatment


0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Frac

tion

of V

iabi

lity

Treatment


0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Frac

tion

of V

iabi

lity

Treatment


0.0

0.5

1.0

1.5

2.0Fr

actio

n of

Via

bilit

y

Treatment


* *

* * *



BSA pad pad+ pad+ pad+ pad+ pad+ pad+ pad+ pad+ H D H+D CIF TOB AST CIF+TOB+ AST AST




66

E.


Madhumathi และคณะ (2010) สังเคราะหวัสดุโครงรางจากไคตินและเติมสารออกฤทธิ์ ฆาเชื้อคืออนุภาคซิลเวอร เพื่อประยุกตใช เปนวัสดุปดแผล พบวาวัสดุโค รงรางไคตินมีความเขากันไดทางชีวภาพ ออกฤทธิ์ การตานเช้ือ S. aureus และ E. coli แตมีความเปนพิ ษตอเซลลเน้ือเยื่อเกี่ยวพันของหนู ซึ่งอาจมีสาเหตุ มาจากอนุภาคซิลเวอร และไมพบการฟนฟู หรือกระตุนการเจริญของเซลล Wiegand และคณะ (2009) สังเคราะหวสัดุปดแผล อัลจิเนตที่เชื่อมตอกับซิลเวอรไอออนและอนุภาคซิลเวอร ศึกษาลักษณะทางกายภาพ และความเปนพิษ ตอเซลล HaCaT kerationcytes

โดยแชวัสดุในอาหารเล้ียงเซลลนาน 48 ชั่วโมง แลวเจือจางในอาหารเล้ียงเซลลที่แปรผันอัตราสวน 1-100% โดยปริมาตรของอาหารที่มีการแชวัสดุตออาหารท่ีใชเจือจาง พบวาวัสดุปดแผลที่มีอนุภาคซิลเวอรและแชในอาหารเล้ียงเซลลนาน 48 ชั่วโมง มีเปอรเซ็นตความมีชีวิตเทากับ 82% ที่เวลาการบมกับเซลลนาน 1 ชั่วโมง แตที่เวลาการบม นาน 48 ชั่วโมง พบวาเปอรเซ็นต ความมีชีวิตของเซลลลดลงมาก นอกจากน้ียังพบอีกวา วัสดุปดแผล ที่เติมซิลเวอรไอออน มีความสามารถในการฟนฟูเซลลหรือเพิ่มจํานวนของเซลลที่อัตราสวนการเจือจางเทากับ 10% ที่เวลา 48 ชั่วโมง สวนวัสดุที่เติมอนุภาคซิลเวอร เซลลไมเพิ่มจํานวน ในทุกอัตราสวน ของการเจือจาง Kim และคณะ (2000)

สังเคราะหวัสดุปดแผล ที่มีรูพรุนแ ละเติมซิลเวอรซัลฟาเดียซีน ศึกษาลักษณะทางกายภาพ การปลดปลอย และความเปนพิษ พบวาวัสดุ มีการปลดปลอยสาร ขึ้นกับรูพรุนของ วัสดุ และ ออกฤทธิ์ตานเช้ือ P. aeruginosa และ S. aureus ได นอกจากน้ี เมื่อทดสอบความเปนพิษตอเซลลเน้ือเยื่อเกี่ยวพันของหนู พบวายังชวยในการกระตุน การยึดเกาะ และการเพิ่มจํานวนของเซลล เมื่อเวลาผานไป 3 วัน Poon Vincent และ Burd (2003) ศึกษาการปลดปลอยและความเปนพิษของวัสดุปดแผลทางการคาที่เติมไอออนของซิลเวอรตอเซลล keratinocyte และ fibroblast พบวาไอออน

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0Fr

actio

n of

Via

bilit

y

Treatment





67

ซิลเวอรความเขมขน 0.000625% โดยนํ้าหนักตอปริมาตร ที่ระยะเวลาการบมนาน 3 ชั่วโมง ยับยั้ งการเจริญของเซลลเทากับ 10% แตที่ระยะเวลา 21 ชั่วโมง พบวาไอออนของซิลเวอร ชวยซอมแซมและกระตุนการเจริญ นอกจากน้ีไอออนซิลเวอรความเขมขน 0.00125% ทําใหเปอรเซ็นตความมีชีวิตลดลงเทากับ 50% ที่เวลาการบม นาน 3 ชั่วโมง แตเพิ่มจํานวนเซลลไดเมื่อเวลาผานไป 48

ชั่วโมง



68

บทท่ี 5 สรุปผลการทดลอง

จากแนวคิดในการ พัฒนา วัสดุปดแผลตน ทุนต่ํา ท่ีมีสวนประกอบของสารออกฤทธิ์ ฆาเชื้อ และสารตานอนุมูลอิสระ เพื่อใชในการสมานแผล ตานการติดเช้ือ เรงการซอมแซมและ ฟนฟูเซลล ทั้งแบบเจลใชทาและแผนเจลเคลือบปดแผล ที่ไมมีความเป นพิษและปลอดภัยตอผูปวย งานวิจัยนี้เลือกใช โปรตีนตนแบบ BSA และเปปไทดสกัดจาก ถั่วเขียวเปนวัสดุโครงสราง บรรจุ ยาปฏิชีวนะ เพื่อใชในการฆาเชื้อ กับแอสตาแซนทิน ในการเรงฟนฟู เซลล วัสดุปดแผลไฮโดรเจลเตรียมโดยใช BSA และเปปไทดความเขมขน 6 และ 8% โดยนํ้าหนักตอปริมาตร ตามลําดับ ใหความรอนที่อุณหภูมิ 100 องศาเซลเซียส นาน 30 นาที สวนวัสดุปดแผลแผนเจลเตรียมโดยใช BSA ความเขมขน 8% โดยนํ้าหนักตอปริมาตร ใหความรอนที่อุณหภูมิ 100 องศาเซลเซียส นาน 20 นาที แลวทําใหเย็นลงอยางรวดเร็ว เติมยาปฏิชีวนะกับแอสตาแซนทิน และโซเดียมคลอไรดความเขมขน 0.25% โดยนํ้าหนักตอปริมาตร ทิ้งใหคงตัวที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส นาน 2 ชั่วโมง ทดสอบฤทธิ์การตานเช้ือ P. aeruginosa พบวา ไฮโดรเจล BSA และเปปไทดบรรจุยาปฏิชีวนะ ciprofloxacin กับแอสตาแซนทิน มีคา log reduction สูงสุดเทากับ 6.19 และ 7.68 ตามลําดับ เมื่อทดสอบการพองตัวหรือการดูดซับของแผนเจล BSA พบวาแผนเจลพองตัวสูงสุดในวันที่ 1 และเร่ิมแตกเสียสภาพ ไมสามารถรักษารูปรางของแผนเจลไวไดในวันที่ 2 และ 3 สงผลใหประสิทธิภาพในการดูดซับลดลงอยางรวดเร็ว ในศึกษาการปลดปลอยยาปฏิชีวนะ ciprofloxacin จากแผนเจล พบวามีการปลดปลอยยามากท่ีสุดในวันที่ 1 คิดเปน 4.24 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร และมีฤทธิ์การตานเช้ือ P. aeruginosa ได log reduction เทากับ 6.46 นอกจากน้ี ในการทดสอบความเปนพิษและการฟนฟูเซลล Vero พบวาวัสดุปดแผลทุ กชนิดไมมีความเปนพิษตอเซลล และไฮโดรเจลเปปไทด บรรจุยาปฏิชีวนะ ciprofloxacin กับแอสตาแซนทิน ยังชวยกระตุนการเจริญของเซลลอีกดวย ไฮโดรเจลและแผนเจลที่พัฒนาขึ้น จึงอาจนําไปทดสอบในสัตวทดลองและในทางคลินิกเพิ่มเติมกอนนําไปประยุกตใชจริงไดตอไป



69

บรรณานุกรม

กิตติมา ศรีวัฒนกุล และ กําพล ศรีวัฒนกุล . ( 2552) ยาตานจุลชีพ ใน กําพล ศรีวัฒนกุล . (บรรณาธิการ ). คูมือการใชยา ฉบับสมบูรณ . พิมพครั้งที่ 7. ปทุมธานี : สํานักพิมพ สกายบุกส, 121-164.

กรรณิกา โหตกษาปนกุล . (2543) แผลกดทับ : การปองกันและการดูแล , วารสารชมรมพยาบาล ออรโธปดิกสแหงประเทศไทย ปที่ 5 ฉบับที่ 2 เดือนธันวาคม.

ดวงมณี สงแสงทอง. (2547) ขาวสารตานยาและผลิตภัณฑสุขภาพ ปที่ 7 ฉบับที่ 3

นบชุลี ชีวีวัฒนากูล . (2553) การออกแบบพาหะในการนําสง แอสตาแซนทินเพื่อการประยุกตใชใ นเคร่ืองสําอาง. วิทยานิพนธปริญญาโท, มหาวิทยาลัยศิลปากร, นครปฐม.

พัชรินทร วรชื่น และ เพชรรัตน รัศมีธงชัย. (2551) กัมมันตภาพและความเสถียรของสารตานอนุมูลอิสระ. จุลนิพนธปริญญาตรี, มหาวิทยาลัยศิลปากร, นครปฐม.

พรพรหม เมืองแมน และ อรรถ นิติพน . (2553) Advanced surgical wound care technology

dressing. การประขุมวิชาการรวมโรงพยาบาลกรุงเทพประจําป 2553

สุวัฒน วิมลวัฒนาภัณฑ . (2542) ตําราเภสัชวิทยา เลมท่ี 3. ภาควิชาเภสัชวิทยา คณะแพทย ศาสตร ศิริราชพยาบาล มหาวิทยาลัยมหิดล, 1-124.

สุวัฒนา จุฬาวัฒนทล และ เนติ สุขสมบูรณ . (2547) Advances in pharmaceutical care and

pharmacotherapeutics 2. สาขาวิชาเภสัชกรรมคลินิก ภาควิชาเภสัชกรรม คณะเภสัชศาสตร มหาวิทยาลัยมหิดล, 93-120.

อโนชา อุทัยพัฒน และ นงลักษณ สุขวาณิชยศิลป . ( 2543) เภสัชวิทยา เลม 2. พิมพครั้งที่ 2.

กรุงเทพมหานคร: สํานักพิมพนิวไทยมิตรการพิมพ, 1-25.

อัจฉรา วัจนาภิญโญ (2530) คูมือการปฐมพยาบาล . กรุงเทพมหานคร : สํานักพิมพยูไนเต็ดทบุ กส, 147-161.

Adegbolagun OM., Olajuyigbe OO., Kazzim1 OJ and Osho O. (2008) In vitro activity of

chloroquine phosphate on the antibacterial potency of ciprofloxacin hydrochloride on the

clinical isolates of some gram-negative microorganisms. J Biol Environ Sci 2, 29-34.

Akintayo ET., Oshodi AA and Esuoso KO. (1999) Effects of NaCl, ionic strength and pH on the

foaming and gelation of pigeon pea (Cajanus cajan) protein concentration. Food Chem

66, 51-56.



70

Ako K., Nicolai T and Durand D. (2010) Salt-induced gelation of globular protein aggregates:

structure and kinetics. Biomacromolecules 11, 864-871.

Babu K., Deepa MA., Shankar SG and Sadananda R. (2008) Effect of nano-silver on cell division

and mitotic chromosomes: a prefatory siren. Nanotechnology 2, 1-14.

Barbut S. (1995) Effect of sodium level on the microstructure and texture of whey protein isolate

gels. Food Res Int 28, 437-443.

Beldon P. (2010) Basic science of wound healing. Surgery 28, 409-412.

Broderick N. (2009) Understanding chronic wound healing. The Nurse Practitioner 34, 17-22.

Campbell J., Yen Minh LT., Loan HT., Diep TS., Nga Thu TT., Hoang Minh NV., Son LT., Chau

Vinh NV., Parry C., Farrar JJ., Hien TT and Baker S. (2009) Microbiologic

characterization and antimicrobial susceptibility of Clostridium tetani isolated from

wounds of patients with clinically diagnosed tetanus. Am J Trop Med Hyg 80, 827–831.

Chalkley LJ and Koornhof HJ. (1985) Antimicrobial activity of ciprofloxacin against

Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli and Staphylococcus aureus determined by

the killing curve method: antibiotic comparisons and synergistic interactions. Antimicrob

Agents Chemother 28, 331-342.

Chen X., Chen R., Guo Z., Li C and Li P. (2007) The preparation and stability of the inclusion

complex of astaxanthin with -cyclodextrin. Food Chem 101, 1580-1584.

Chikazua D., Taguchib T., Koyamac H., Hikiji H., Fujiharaa H., Suenagaa H., Saijo H., Moria Y.,

Setoa I., Iino M and Takatoa T. (2010) Improvement in wound healing by a novel

synthetic collagen-gel dressing in genetically diabetic mice. J Oral Maxillofac Surg 22,

61–67.

Cirz RT., Jones MB., Gingles NA., Minogue TD., Jarrahi B., Peterson SN and Romesberg FE.

(2007) Complete and SOS-mediated response of Staphylococcus aureus to the antibiotic

ciprofloxacin. J Bacteriol 189, 531-539.

Dong J., Sun Q and Wang JY. (2004) Basic study of corn protein, zein, as a biomaterial in tissue

engineering, surface morphology and biocompatibility. Biomaterials 25, 4691-4697.



71

Eckert R., Brady KM., Greenberg P., Qi F., Daniel K., He YJ., Mchardy I., Anderson MH and

Shi1 W. (2006) Enhancement of antimicrobial activity against Pseudomonas aeruginosa

by coadministration of G10KHc and tobramycin. Antimicrob Agents Chemother 50,

3833–3838.

Elsner JJ., Berdicevsky I and Zilberman M. (2011) In vitro microbial inhibition and cellular

response to novel biodegradable composite wound dressings with controlled release of

antibiotics. Acta Biomater 7, 325–336

Gopinath D., Ahmed MR., Gomathi K., Chitra K., Sehgal PK and Jayakumar R. (2004) Dermal

wound healing processes with curcumin incorporated collagen films. Biomaterials 25,

1911-1917.

Grzybowski J., Autos M and Trafny EA. (1996) A simple in vitro model to test the efficacy of

antimicrobial agents released from dressings. J Pharmacol Toxicol Methods 36, 73-76.

Guerin M., Huntley ME. and Olaizola M. (2003) Haematococcus astaxanthin: applications for

human health and nutrition. Trends Biotechnol 21, 210-216.

Guo S and Dipietro LA. (2010) Factors affecting wound healing. J Dent Res 89, 219-229.

Hallberg CK., Trocme SD and Ansari NH. (1996) Acceleration of corneal wound healing in

diabetic rats by the antioxidant trolox. Res Commun Mol Pathol Pharmacol 93, 3-12.

Harding KG., Morris HL. and Patel GK. (2002) Science, medicine and the future healing chronic

wounds. BMJ 324, 160–163.

Hardwicke J., Schmaljohann D., Boyce D. and Thomas D. (2008) Epidermal growth factor

therapy and wound healing-past, present and future . Surgeon 6, 172-177.

Hashimoto M., Rockenstein E., Crews L and Masliah. (2003) Role of protein aggregation in

mitochondrial dysfunction and neurodegeneration in Alzheimer’s and Parkinson’s diseases. Neuromolecular Med 2, 21-35.

Hermans MH. (2007) Silver-containing dressings and the need for evidence. Adv Skin Wound

Care 20, 166-173.

Holloran CM and Slavin J. (2002) Pathophysiology of wound healing. Surgery. 20, i-v.

Hongsprabhas P and Barbut S. (1996) Ca2+induced gelation of whey protein isolate: effects of

pre-heating. Food Res Int 29, 15-139.



72

Huang MH and Yang MC. (2008) Evaluation of glucan/poly(vinyl alcohol) blend wound dressing

using rat models. Int J Pharm 346, 38–46.

Jayakumar R., Prabaharan M., Sudheesh Kumar PT., Nair SV and Tamura H. (2011) Biomaterials

based on chitin and chitosan in wound dressing applications. Biotechnol Adv 29,

322–337.

Jones V., Grey JE and Harding KG. (2006) Wound dressing. BMJ 332, 777-780.

Kim Jaeeun., Pitts B., Stewart PS., Camper A and Jeyong Y. (2008) Comparison of the

antimicrobial effects of chlorine, silver ion, and tobramycin on biofilm. Antimicrob

Agents Chemother 52, 1446-1453.

Kim JO., Park JK., Kim JH., Jin SG., Yong CS., Li DX., Choi JY., Woo JS., Yoo BK., Lyoo

WS., Kim JA and Choi HG. (2008) Development of polyvinyl alcohol-sodium alginate

gel-matrix-based wound dressing system containing nitrofurazone. Int J Pharm 259, 79-

86.

Kim HJ., Choi EY., Oh JS., Lee HC., Park SS and Cho CS. (2000) Possibility of wound dressing

using poly(L-leucine)/poly(ethylene glycol)/poly(L-leucine) triblock copolymer.

Biomaterials 21, 131-141.

Kumar PV and Jain NK. (2007) Suppression of agglomeration of ciprofloxacin-loaded human

serum albumin nanoparticles. AAPS Pharm Sci Tech. 8, E1-E6.

Labuza TP., Warren RM and Warmbier HC. (1977) The physical aspects with respect to water

and non-enzymatic browning. Adv Exp Med Biol 86B, 379-418.

Lara HH., Nilda V., Nunez A., Turrent Ixtepan LDC and Padilla CR. (2010) Bactericidal effect of

silver nanoparticles against multidrug-resistant bacteria. World J Microbiol Biotechnol

26, 615-621.

Lok CN., HO CM., Chen R., He QY., Yu WY., Sun H., Tam PK., Chiu JF and Che CM. (2007)

Silver nanoparticles: partial oxidation and antibacterial activities. J Biol Inorg Chem 12,

527-534.

MacKay D and Miller AL. (2003) Nutritional support for wound healing Altern Med Rev 8, 359-

377.



73

Madhumathi K., Kumar Sudheesh PT., Abhilash S., Sreeja V., Tamura H., Manzoor K., Nair SV

and Jayakumar R. (2010) Development of novel chitin/nanosilver composite scaffolds for

wound dressing applications. J Mater Sci: Mater Med 21, 807-813.

Manju S., Antony M and Sreenivasan K. (2010) Synthesis and evaluation of a hydrogel that binds

glucose and releases ciprofloxacin. J Mater Sci 45, 4006–4012.

Menke MN., Menke NB., Boardman CH and Diegelmann RF. (2008) Biologic therapeutics and

molecular profiling to optimize wound healing. Gynecol Oncol 111, S87–S91.

Miki W. (1991) Biological functions and activities of animal carotenoids. Pure Appl Chem 63,

141-146.

Mor Y., Shoemaker CF and Rosenberg M. (1999) Compressive properties of whey protein

composite gels containing fractionated milk fat. J Food Sci 64, 1078-1083.

Moseley R., Hilton JR., Waddington RJ., Harding KG., Stephens P., and Thomas DW. (2004) Comparison of oxidative stress biomarker profiles between acute and chronic wound

environments. Wound Repair Regen 12, 419–429.

Musalmah M., Fairuz AH., Gapor MT., Zurinah W and Ngah W. (2002) Effect of vitamin E on

plasma malondialdehyde, antioxidant enzyme levels and rates of wound closures during

wound healing in normal and diabetic rats. Asia Pac J Clin Nutr 11, S448-S451.

Naito Y., Uchiyama K., Aoi W., Hasegawa G., Nakamura N., Yoshida N., Maoka T., Takahashi J

and Yoshikawa T. (2004) Prevention of diabetic nephropathy by treatment with

astaxanthin in diabetic db/db mice. BioFactors 20, 49-59.

Nishizawa K., Hirano M., Kimura A., Mochizuki T., Yamamoto Y., Yamamura S and Momose

Y. (1998) Evaluation of the antimicrobial activity of carbapenem and cephem antibiotics

against Pseudomonas aeruginosa isolated from hospitalized patients. J Infect Chemother

4, 174-176.



74

Nizamutdinova TI., Kim YM., Chung J., Shin SC., Jeong YK., Seo HG., Lee JH., Chang KC and

Kim HJ. (2009) Anthocyanins from black soybean seed coats stimulate wound healing in

fibroblasts and keratinocytes and prevent inflammation in endothelial cells. Food Chem

Toxicol 47, 2806–2812.

Ohgami K., Shiratori K., Kotake S., Nishida T., Mizuki N., Yazawa K and Ohno S. (2003)

Effects of astaxanthin on lipopolysaccharide-induced inflammation in vitro and in vivo.

Invest Ophthalmol Vis Sci 44, 2694-2701.

Oo TZ., Cole N., Garthwaite1 L., Mark Willcox DP and Zhu H. (2010) Evaluation of synergistic

activity of bovine lactoferricin with antibiotics in corneal infection. J Antimicrob

Chemother 10, 1243-1251.

Pal S., Tak YK and Song JM. (2007) Does the antibacterial activity of silver nanoparticles depend

on the shape of the nanoparticle? a study of the gram-negative bacterium Escherichia

coli. Appl Environ Microbiol 73, 1712-1720.

Panacek A., Kvitek L., Prucek R., Kolar M., Vecerova R., Pizurova N., Sharma VK., Nevecna T

and Zboril R. (2006) Silver colloid nanoparticles: synthesis, characterization, and their

antibacterial activity. J Phys Chem B 110, 16248-16253.

Polat OZ., Topaz M., Brosh T and Margel S. (2010) Enhancement of incisional wound healing by

thrombin conjugated iron oxide nanoparticles. Biomaterials 31, 741-747.

Prakash Naik HR., Bhojya Naik HS., Ravikumar Naik TR., Raja Naika H., Gothamchandra K.,

Mahmood R and Khadeer Ahamed BM. (2009) Synthesis of novel benzo[h] quinolines:

wound healing, antibacterial, DNA binding and in vitro antioxidant activity. Eur J Med

Chem 44, 981–989.

Poole K. (1994) Bacterial multidrug resistance emphasis on efflux mechanisms and Pseudomonas

aeruginosa. J Antimicrob Chemother 34, 453-456.



75

Poon Vincent KM and Burd A. (2004) In vitro cytotoxity of silver: implication for clinical wound

care. Burns 30, 140-147.

Rahman Mofizur MD., Roy S., Das SC., Jha MK., Ahsan Qumrul MD., Shahparan MD and Reza

Selim MD. (2011) Formulation and evaluation of hydroxypropropylmethylcellulose

based matrix system as oral sustained release drug delivery systems for ciprofloxacin

hydrochloride. J Inter Pharm Sci 6, 34-41.

Rai M., Yadaw A and Gade A. (2009) Silver nanoparticles as a new generation of antimicrobials.

Biotechnol Adv 27, 76-83.

Rodriguez PG., Felix FN., Woodley DT., Elisabeth K and Shim MD. (2008) The role of oxygen

in wound healing: A review of the literature. Dermatol Surg 34, 1159-1169.

Rosin E., Ebert S., Uphoff TS., Evans MH and Schultz Darken NJ. (1989) Penetration of

antibiotics into the surgical wound in a canine model. Antimicrob Agents Chemother 33,

700-704.

Seaman S. (2002) Dressing selection in chronic wound management. J Am Podiatr Med Assoc 92,

24-33.

Seitz B., Hayashi S., Wee WR., LaBree XL and McDonnell PJ. (1996) In vitro effects of

aminoglycosides and fluoroquinolones on keratocytes. Invest Ophthalmol Vis Sci 37,

656-665.

Sharma VK., Yngard RA and Lin Y. (2009) Silver nanoparticles: green synthesis and their

antimicrobial activities. Adv Colloid Interface 145, 83-96.

Shimidzu N., Goto M and Miki W. (1996) Carotenoids as singlet oxygen quenchers in marine

organisms. Fish Sci 62, 134-137.

Shrivastava S., Bera T., Roy A., Singh G., Ramachandrarao P and Dash D. (2007)

Characterization of enhanced antibacterial effects of novel silver nanoparticles.

Nanotechnology 18, 1-9.

Singh R., Ray P., Das A and Sharma M. (2009) Role of persisters and small-colony variants in

antibiotic resistance of planktonic and biofilm-associated Staphylococcus aureus: an in

vitro study. J Med Microbiol 8, 1067–1073.



76

Siriwong N and Chukeatirote E. (2009) Antibiotic resistance in Staphylococcus aureus and

controlling. Songkla Med J 27, 347-358.

Spoering AM and Lewis K. (2001) Biofilms and planktonic cells of Pseudomonas aeruginosa

have similar resistance to killing by antimicrobials. J Bacteriol 183, 6746-6751.

Strodtbeck F. (2001) Physiology of wound healing. Newborn and Infant Nur Review 1, 43–52.

Sudheesh Kumar PT., Abhilash S., Manzoor K., Nair SV., Tamura H and Jayakumar R. (2010)

Preparation and characterization of novel -chitin/nanosilver composite scaffolds for

wound dressing applications. Carbohydr Polym 80, 761–767.

Tempest M., Siesennop E., Howard K and Hartoin K. (2010) Nutrition, physical assessment, and

wound healing. Support Line 32, 22-27.

Tenover FC. (2006) Mechanisms of antimicrobial resistance in bacteria. Am J Med 119, S3-S10.

Tettamanti G., Grimaldi A., Congiu T., Perletti G., Raspanti M., Valvassori R and Eguileor MD.

(2005) Collagen reorganization in leech wound healing. Biol Cell 97, 557–568.

Tiana H., Wanga Y., Zhanga L., Quanb C and Zhangb X. (2010) Improved flexibility and water

resistance of soy protein thermoplastics containing waterborne polyurethane. Ind Crops

Prod 32, 13–20.

Trafny EA. (1998) Susceptibility of adherent organisms from Pseudomonas aeruginosa and

Staphylococcus aureus strains isolated from burn wounds to antimicrobial agents. Int J

Antimicrob Agents 10, 223–228.

Tripathi DN and Jena GB. (2009) Intervention of astaxanthin against cyclophosphamide-induce

oxidative stress and DNA damage: A study in mice. Chem Biol Interact 180, 398-406.

Turgeon SL and Beaulieu M. (2001) Improvement and modification of whey protein gel texture

using polysaccharides. Food Hydrocolloids 15, 583-591.

Uchiyama K., Naito Y., Hasegawa G., Nakamura N., Takahashi J and Yoshikawa T. (2002)

Astaxanthin protects -cells against glucose toxicity in diabetic db/db mice. Redox Report

7, 290-293.

Varshney L. (2007) Role of natural polysaccharides in radiation formation of PVA-hydrogel

wound dressing. Nucl Instr and Meth in Phys Res B 255, 343-349.



77

Walker JM. (2002). SDS polyacrylamide gel electrophoresis of proteins. In: Walker JM, editor.

The Protein Protocols Handbook. New Jersey: Humana Press, p. 61-67.

Walters III MC., Roe F., Bugnicourt A., Franklin M and Stewart PS. (2003) Contributions of

antibiotic penetration, oxygen limitation, and low metabolic activity to tolerance of

Pseudomonas aeruginosa biofilms to ciprofloxacin and tobramycin. Antimicrob Agents

Chemother 47, 317-323.

Wiegand C., Abel M., Ruth P and Hipler UC. (2011). Superabsorbent polymer-containing wound

dressings have a beneficial effect on wound healing by reducing PMN elastase

concentration and inhibiting microbial growth. J Mater Sci: Mater Med 22, 2583–2590.

Wiegand C., Heinze T and Hipler UC. (2009) Comparative in vitro study on cytotoxicity,

antimicrobial activity, and binding capacity for pathophysiological factors in chronic

wounds of alginate and silver-containing alginate. Wound Rep Reg 17, 511-521.

Zhang X., Yang F., Xu C., Liu W., Wen S and Xu Y. (2008) Cytotoxicity evaluation of three

pairs of hexabromocyclododecane (HBCD) enantiomers on HepG2 cell. Toxicol In Vitro

22, 1520-1527.



ภาคผนวก



78

ภาคผนวก ก



80

ภาคผนวก ก

การหาขนาดโมเลกุลของเปปไทดโดยวิธี SDS-PAGE การเตรียม stacking และ resolving gel และสารเคมี

1. เตรียม stacking gel ความเขมขน acrylamide 4% โดยปริมาตรใน 0.6 M Tris-HCl

pH 6.8 ผสมสาร ตามตารางท่ี 10

ตารางที่ 10 การเตรียม stacking gel

2. เตรียม resolving gel ความเขมขน acrylamide เทากับ 15% โดยนํ้าหนักตอปริมาตรใน 1.875 M Tris-HCl pH 8.8 ผสมสาร ตามตารางท่ี 11 อยางเบามือ ไมใหมีฟองอากาศ แลวเทใสคูแผนแกว ปดทับดวยน้ํากลั่น ทิ้งใหเจลแข็ง 20 นาที

ตารางที่ 11 การเตรียม resolving gel

สารเคมี ปริมาตร 1. Distilled water 5.7 ml

2. 1.875 M Tris-HCl pH 8.8 4.0 ml

3. 10% SDS 0.2 ml

4. 30% Stock acrylamide 10 ml

5. 10% Ammonium persulphate 0.1 ml

6. TEMED 14 l

Total volume 20 ml

สารเคมี ปริมาตร 1. Distilled water 7.5 ml

2. 0.6 M Tris-HCl pH 6.8 1.0 ml

3. 10% SDS 0.1 ml

4. 30% Stock acrylamide 1.35 ml

5. 10% Ammonium persulphate 0.05 ml

6. TEMED 14 μl

Total volume 10 ml



81

3. เตรียม sample buffer ดังตารางท่ี 12

ตารางที่ 12 การเตรียม sample buffer

สารเคมี ปริมาตร 1. 0.6 M Tris-HCl pH 6.8 0.5 ml

2. SDS 0.05 g

3. Sucrose 0.5 g

4. ß-Mercaptoethanol 0.025 ml

5. Bromophenol blue, 0.5% stock solution 0.5 ml

ปรับปริมาตรของ sample buffer ใหไดปริมาตรรวมเทากับ 5 มิลลิลิตร

4. เตรียม protein staining ดังตารางท่ี 13

ตารางที่ 13 การเตรียม protein staining

สารเคมี ปริมาตร 1. Coomassie brilliant blue R-250 1.0 g

2. Methanol 50 ml

3. Acetic acid 10 ml

4. Distilled water 39 ml

Total volume 100 ml

5. เตรียม destaining ดังตารางท่ี 14

ตารางที่ 14 การเตรียม destaining

สารเคมี ปริมาตร 1. Methanol 50 ml

2. Acetic acid 35 ml

3. Distilled water 415 ml

Total volume 500 ml



82

การหาขนาดโมเลกุลของเปปไทดโดยวิธี SDS-PAGE

1. เตรียม stacking gel โดยใช acrylamide ความเขมขนเทากับ 4% โดยนํ้าหนักตอปริมาตร (ตารางที่ 10) และ resolving gel โดยใช acrylamide ความเขมขน เทากับ 15% โดยน้ําหนักตอปริมาตร (ตารางที่ 11)

2. วางแผนกระจกที่บรรจุเจลที่แข็งตัวแลวลงใน chamber เท electrophoresis buffer

(ประกอบดวย Tris 3.0 กรัม, glycine 14.4 กรัม และ SDS 0.5 กรัม) ใหทวมขอบกระจกดานบน เบาๆ เพื่อไมใหเกิดฟอง

3. เตรียมตัวอยางโปรตีนโดยละลาย crude peptide ปริมาณ 0.05-1 มิลลิกรัมตอมิลลิลิตร ใน sample buffer (ตารางที่ 12)

4. ปเปตสารละลายเปปไทดที่ความเขมขน 0.05, 0.1, 0.5 และ 1.0 มิลลิกรัมโปรตีนตอ

มิลลิลิตร ปริมาตร 20 ไมโครลิตร บรรจุลงหลุม และเติม โปรตีนมาตรฐานปริมาตร 20

ไมโครลิตร กอนปดฝา chamber ตอขั้วไฟฟาเขากับเคร่ืองจายไฟกระแสตรง 30 mA ความตางศักยไฟฟาที่ 200 Volt เปนเวลาประมาณ 40 นาที จนกระทั่งแถบน้ําเงินของ bromophenol blue

เคลื่อนที่ลงมาจนเกือบถึงปลายลางของแผนเจลจึงปดเคร่ืองจายไฟ

5. นําแผนเจลออกจากกระจกดวยความระมัดระวัง จากนั้นทําการยอมแผนเจลดวยสารละลาย

staining (ตารางที่ 13) เปนเวลาประมาณ 2-3 ชั่วโมง 6. แชแผนเจลในสารละลาย destaining (ตารางท่ี 14) ทิ้งไว 6 ชั่วโมง เปลี่ยน destaining ใหม

จนเห็นแถบสีน้ําเงินของโปรตีนบนแผนเจล วิเคราะห ขนาดโมเลกุลโดยเทียบกับโปรตีนมาตรฐาน

(perfect protein ladder น้ําหนักโมลเลกุล 5-200 kDa)



ภาคผนวก ข



84

ภาคผนวก ข อาหารเลี้ยงเซลลและสารเคมีที่ใชในการเล้ียงเซลล

การเตรียมอาหารเล้ียงเซลล Minimum Essential Medium (MEM)

1. ละลายอาหารผง 1 ซองในนํ้าบริสุทธิ์ ปริมาตร 800 มิลลิลิตร จนเปนเน้ือเดียวกัน

2. ละลายโซเดียมไบคารบอเน ต (NaHCO3) จํานวน 2.2 กรัม ในน้ําบริสุทธิ์ ปริมาตร 50 มิลลิลิตร จากนั้นคอยๆ เทลงในอาหารที่เตรียมไวในขอ 1) แลวกวนใหเปนเน้ือเดียวกัน

3. เมื่ออาหาร ละลาย เปนเนื้อเดียวกันแลว เติมซีรัมปริมาตร 100 มิลลิลิตร ที่ผานการ inactivate ที่อุณหภูมิ 56 ºC เปนเวลา 30 นาที จากนั้นปรับ pH ของอาหารใหเปนกรดเล็กนอย

(pH เทากับ 6.9) และปรับปริมาตรอาหารใหได 1 ลิตร 4. กรองอาหารผานตัวกรอง ขนาด 0.2 m ในตูปลอดเชื้อ แลวถายอาหารที่ผานการกรอง

แลวลงขวดปลอดเชื้อที่เตรียมไว 5. แบงตัวอยางอาหารไปตรวจสอบการปนเปอนของเช้ือจุลินทรียโดยแบงอาหารเล้ียงเซลล

ปริมาตร 0.5 มิลลิลิตร ใสลงในหลอดบรรจุ tryptose phosphate soy broth ปริมาตร 3 มิลลิลิตร และ thiglycolate broth ปริมาตร 3 มิลลิลิตร นําไปบมที่อุณหภูมิ 37 ºC เปนเวลา 7 วัน

6. ปดฝาและพันพาราฟ ลมตรงรอยตอของฝาขวด กอนเก็บขวดอาหารที่อุณหภูมิ 4 ºC และนํามาใชเมื่อตัวอยางผานการตรวจวาปลอดเชื้อจุลินทรียแลว

การเตรียม Phosphate Buffered Saline (PBS, Ca2+, Mg2+ free)

1. ชั่งโซเดียมคลอไรด (NaCl) จํานวน 8.0 กรัม, โพแทสเซียมคลอไรด (KCl) จํานวน 0.2

กรัม, ไดโซเดียมไฮโดรเจนฟอสเฟต (Na2HPO4) จํานวน 1.25 กรัม และโพแทสเซียมไดไฮโดรเจนฟอสเฟต (KH2PO4) จํานวน 0.2 กรัม

2. นําแตละสวนคอยๆ ละลายในน้ําบริสุทธิ์ 1 ลิตร ตามลําดับ

3. ปรับ pH ใหไดเทากับ 7.4 จากนั้นบรรจุในขวด

4. นําไปทําไรเช้ือดวยหมอนึ่งความดันไอท่ีอุณหภูมิ 121 ºC เปนเวลา 15 นาที



85

การเตรียม Trypsin-EDTA (0.25% ทริปซินท่ีมี EDTA 1 mM)

1. ชั่งทริปซิน (1:250) จํานวน 0.25 กรัม และ EDTA(Na2) จํานวน 3.74 กรัม ละลายใน PBS (Ca2+และ Mg2+ free) ปริมาตร 100 มิลลิลิตร จากนั้นปรับ pH ใหได 7.4-7.6

2. กรองผานตัวกรองขนาด 0.2 m ลงในขวดปลอดเชื้อ 3. แบงตัวอยางทริปซินปริมาตร 0.5 มิลลิลิตร ใสลงในหลอดบรรจุ tryptose phosphate soy

broth ปริมาตร 3 มิลลิลิตร และ thiglycolate broth ปริมาตร 3 มิลลิลิตร เพื่อตรวจสอบความปลอดเชื้อโดยนําไปบมที่อุณหภูมิ 37 ºC เปนเวลา 7 วัน

การเตรียม Phosphate Buffered pH 7.4

1. ชั่งไดโซเดียมไฮโดรเจนฟอสเฟต (Na2HPO4) จํานวน 1.25 กรัม และโพแทสเซียม

ไดไฮโดรเจนฟอสเฟต (KH2PO4) จํานวน 0.2 กรัม 2. นําแตละสวนคอยๆ ละลายในน้ําบริสุทธิ์ 1 ลิตร ตามลําดับ

3. ปรับ pH ใหไดเทากับ 7.4 จากนั้นบรรจุในขวด 4. นําไปทําไรเช้ือดวยหมอนึ่งความดันไอที่ 121 ºC เปนเวลา 15 นาที

การเตรียม Citrate Buffered pH 6.8 1. ชั่งกรดซิตริก (C6H8O7•H2O) จํานวน 21.01 กรัม ละลายในน้ําบริสุทธิ์ 1 ลิตร

(สารละลาย A) 2. ชั่งไดโซเดียมไฮโดรเจนฟอสเฟต (Na2HPO4) จํานวน 28.39 กรัม ละลายในน้ํา

บริสุทธิ์ 1 ลิตร (สารละลาย B) 3. นําสารละลาย A ปริมาตร 9.1 มิลลิลิตร ผสมกับสารละลาย B ปริมาตร 40.9 มิลลิลิตร

จากนั้นปรับปริมาตรใหไดเทากับ 100 มิลลิลิตร แลวบรรจุในขวด 4. นําไปทําไรเช้ือดวยหมอนึ่งความดันไอท่ีอุณหภูมิ 121 ºC เปนเวลา 15 นาที



ภาคผนวก ค



87

ภาคผนวก ค การนับจํานวนเซลลดวย Hemocytometer

Hemocytometer เปนแผนสไลดแกวที่มีตารางเปนชองสี่เหลี่ยมจัตุรัสเล็กๆ 9 ชอง แตละ

ชองมีพื้นที่ 1 mm2 เมื่อปดดวย cover slip เฉพาะของมันในตําแหนงที่ถูกตองจะใหความลึก 0.1 mm ดังนั้น ปรมิาตรใน 1 ชองตารางส่ีเหลี่ยมจัตุรัสเทากับ 0.1 mm3 ซึ่งก็คือจํานวนเซลลในปริมาตร 1 cm3 เทากับ n 104 เมื่อ n คือจํานวนเซลลที่นับไดใน 1 ชอง การนับเซลลควรนับ 5 ชอง เพ่ือใหไดคาที่ถูกตองมากขึ้น โดยมีวิธีคํานวณจํานวนเซลลดังนี้ กกกกกกกกจํานวนเซลลที่นับได (cells/ml) = (จํานวนเซลลทั้งหมด/ 5) 104 ในกรณีที่เซลลถูกเจือจาง กกกกกกกกจํานวนเซลลที่นับได (cells/ml) = (จํานวนเซลลทั้งหมด/ 5) 104 dilution factor กกกกกกกกโดย dilution factor = (ปริมาตรเซลล + ปริมาตรสารละลายท่ีเจือจาง)/ ปริมาตรของ เซลล กกกกกกกกเปอรเซ็นตความมีชีวิต = (จํานวนเซลลมีชีวิต/ จํานวนเซลลทั้งหมด) 100 ตัวอยางการคํานวณจํานวนเซลลที่เลี้ยงใน 96-well plate จํานวนเซลลที่ใชเลี้ยง 2 104

cells/ml ปริมาตร well ละ 0.1 มิลลิลิตร เมื่อนับเซลลที่เลี้ยงในภาชนะเลี้ยงเซลลไดความหนาแนนของเซลล 16.4 104 cells/ml มีเปอรเซ็นตความมีชีวิตเทากับ 85%

ตองการเซลลทั้งหมด 2 104 0.1 90-well = 18 104 cells/ml เซลลมีชีวิตทั้งหมด 18 104 cells/ml มาจากสัดสวนของเซลล = (100 18 104)/ 85

= 21.1 104 cells กกกกกกกกตองใชเซลลจากเซลลตั้งตน = (21.1 104)/ 16.4 104

= 1.3 ml ดังนั้น ตองใชเซลลตั้งตน 1.3 มิลลิลิตร ใสอาหารอีก 7.7 มิลลิลิตร เลี้ยงใน 96-well

plate ปริมาตร well ละ 0.1 มิลลิลิตร



ภาคผนวก ง



89

ภาคผนวก ง

ขอมูลดิบ

ตารางที่ 15 คาสัดสวนการพองตัวหรือการดูดซับของแผนเจล

Time (days) Swelling/Absorption ratio

AVE STD No. 1 No. 2 No. 3

ครั้งที่ 1

1 1.19 1.76 1.55 2 0.79 1.01 0.88 3


1 1.10 1.16 1.15 1.14 0.03 2 0.94 1.01 1.02 0.99 0.04 3 0.13 0.06 0.16 0.12 0.05



90

ตารางที่ 16 Log reduction ของไฮโดรเจล BSA ตอเชื้อ P. aeruginosa

Log reduction

BSA gel gel+H2SO4 gel+DMSO gel+ H2SO4+ DMSO gel+AST gel+CIF gel+CIF+AST gel+TOB gel+TOB+AST

-0.80 0.32 0.18 0.08 0.32 6.74 6.30 5.80 7.07 -0.41 0.06 0.18 0.05 0.30 6.97 6.18 5.70 7.04 0.33 0.06 0.22 0.09 0.40 6.67 6.38 7.32 6.94 0.10 0.08 0.21 0.10 6.17 6.12 6.35 5.97 0.20 0.12 0.09 6.19 6.07 6.36 6.00 0.01 0.10 6.22 6.08 6.36 6.00 0.02 0.04 0.05 0.06

AVE -0.04 0.12 0.20 0.08 0.34 6.49 6.19 6.32 6.50 STD 0.31 0.09 0.02 0.02 0.04 0.13 0.12 0.74 0.51



91

ตารางที่ 17 Log reduction ของไฮโดรเจลเปปไทดตอเชื้อ P. aeruginosa

ตารางที่ 18 Log reduction ของแผนเจล BSA ตอเชื้อ P. aeruginosa

Log reduction

peptide gel gel+ H2SO4+ DMSO gel+CIF+AST gel+TOB+AST

0.06 0.07 7.66 5.94 -0.07 0.22 7.96 5.77 -0.02 0.08 7.96 6.68 0.62 7.14

AVE 0.15 0.12 7.68 6.13 STD 0.28 0.07 0.33 0.40

Log reduction

Period of incubation (days)

0 1 2 3 4 5

0.93 5.72 1.11 0.40 0.41 -0.13 0.98 5.83 1.11 0.30 0.33 -0.17 0.91 5.81 1.09 0.29 0.26 -0.17

AVE 0.94 5.79 1.10 0.33 0.33 -0.16 STD 0.03 0.05 0.01 0.05 0.06 0.02



92

ตารางที่ 19 ปริมาณยาปฏิชีวนะ ciprofloxacin ที่ปลดปลอยจากแผนเจล

Time (days) Ciprofloxacin content (μg/ml)

AVE STD No. 1 No. 2 No. 3


1 3.69 4.53 4.27 4.16 0.43 2 1.11 0.92 1.49 1.17 0.29 3 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 4 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 5 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00


1 5.43 5.19 2.32 4.31 1.73 2 2.16 1.32 0.84 1.44 0.67 3 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 4 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 5 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00



93

ตารางที่ 20 ฤทธิ์การตานเชื้อ P.aeruginosa ของยาปฏิชีวนะที่ปลดปลอยจากแผนเจล

Released period (days) Log reduction AVE STD


1 6.08 6.30 6.18 6.19 0.11 2 5.20 4.81 5.36 5.12 0.28 3 0.77 0.62 0.82 0.74 0.10 4 0.38 0.38 - 5 0.61 0.61 -

ครั้งที่ 2 1 6.43 6.49 6.45 6.46 0.03 2 5.10 5.12 4.90 5.04 0.12



94

ตารางที่ 21 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยงกับสวนประกอบของวัสดุปดแผลเปนเวลา 24 ชั่วโมง

Fraction of viability

6% BSA 8% BSA 8% peptide 10 μg/ml ciprofloxacin 10 μM astaxanthin 1 μg/ml tobramycin 10 μg/ml tobramycin 1% DMSO 1% H2SO4


0.84 1.44 1.04 1.13 1.09 0.93 1.03 0.70 0.70 0.88 1.09 1.18 1.11 0.70 0.99 0.94 0.70 0.71 0.67 1.33 1.20 0.91 0.67 1.00 1.00 0.85 0.67 0.64 1.44 1.48 1.17 0.81 0.87 0.94 0.87 0.72 1.27 1.53 0.89 1.04 0.82 1.00 1.00 0.74 1.35 1.31 1.21 0.73 0.91 0.99 1.28 1.45 1.39 1.27 0.92 0.93 1.20 1.28 1.73 1.03 0.94 0.95 1.10 1.63 1.09 1.24 0.99 1.00 0.97 1.23 1.21 0.98 1.00 0.93 1.02 0.60 1.12 0.66 0.94 0.95 1.00 1.30 1.05 1.06 0.91 1.00 1.20 1.24 1.02 0.73 0.97 1.00

1.40 1.34



95

ตารางที่ 21 (ตอ)




0.57 1.41 1.23 1.34 0.74 0.74 0.81 1.19 1.51 1.54 1.17 0.74 0.98 0.88 0.96 1.57 1.57 0.86 0.90 0.75 0.88 0.94 1.57 1.41 1.11 0.70 0.86 0.91 1.27 1.59 1.28 0.95 0.82 0.86 0.86 1.14 1.30 1.41 0.89 0.88 0.86 0.85 1.43 1.28 1.09 0.88 0.80 0.93

0.88 0.88

AVE 1.01 1.35 1.26 1.05 0.81 0.81 0.80 STD 0.24 0.23 0.22 0.18 0.12 0.09 0.10



96

ตารางที่ 22 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยงกับสวนประกอบของวัสดุปดแผลเปนเวลา 48 ชั่วโมง



ครั้งที ่1

1.00 0.98 0.80 0.99 0.89 0.80 0.96 0.84 1.15 1.56 1.22 0.99 0.87 0.98 0.89 1.05 0.82 1.31 0.97 0.93 0.95 0.92 0.98 1.31 0.86 1.05 0.94 0.92 0.92 0.92 1.06 1.16 0.87 0.88 0.98 0.80 0.96 1.05 1.18 0.81 0.82 0.88 0.76 0.92 0.76 1.06 0.79 1.02 1.04 0.90 1.14 1.15 1.12 1.10 0.94 0.83 0.78 1.07 1.07 1.00 0.84 0.80 0.79 0.89 1.03 1.50 0.98 0.86 1.01 0.91 0.83 1.05 1.21 1.10 1.25 0.99 0.88 0.93 1.17 0.75 1.25 1.15 0.73 0.76 0.87 0.92 1.10 1.03 1.01 0.98 1.22 1.03 0.86 1.40 1.38 0.94



97





0.82 1.00 1.42 1.04 1.03 1.19 1.04 1.18 0.90 1.02 1.08 1.07 1.08 0.85 1.07 1.10 1.04 0.97 1.11 1.13 1.23 0.98 1.06 1.43 1.02 1.00

1.05 1.09 1.04 1.02 0.92 1.08 0.95 1.15 1.10 1.12 0.98 1.05 1.19 0.92 1.16

AVE 0.91 1.05 1.14 1.08 0.96 1.06 1.08 0.89 0.91 STD 0.09 0.12 0.26 0.15 0.15 0.06 0.10 0.09 0.08



98

ตารางที่ 23 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยง กับไฮโดรเจล BSA ที่เจือจางในอาหารเลี้ยงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% อัตราสวนเทากับ 1:9 โดยปริมาตรของไฮโดรเจลตออาหารเลี้ยงเซลล เปนเวลา 24 ชั่วโมง


1.04 1.03 0.99 1.01 1.00 1.01 1.00 0.98 0.99 1.04 0.99 0.98 0.95 0.99 1.00 0.99 1.00 0.95 1.03 1.00 0.97 0.99 1.01 1.01 0.98 1.00 1.05 0.99 0.99 1.02 1.00 1.04 0.99 1.05 1.04

AVE 1.03 1.00 0.99 0.98 1.00 1.01 0.99 1.01 1.01 STD 0.02 0.02 0.02 0.03 0.01 0.00 0.01 0.01 0.05

ตารางที่ 24 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยง กับไฮโดรเจล BSA ที่เจือจางในอาหารเลี้ยงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10%

อัตราสวนเทากับ 1:4 โดยปริมาตรของไฮโดรเจลตออาหารเลี้ยงเซลล เปนเวลา 24 ชั่วโมง


1.03 0.98 1.07 1.04 1.09 1.10 1.10 1.15 1.12 1.03 0.93 1.03 1.08 1.06 1.12 1.10 1.07 1.10 1.00 1.03 1.06 1.03 1.10 1.10 1.14 1.07 1.10 1.10 1.09 1.03 1.10 1.11

AVE 1.02 0.98 1.06 1.05 1.09 1.10 1.09 1.10 1.11 STD 0.02 0.05 0.02 0.03 0.02 0.01 0.05 0.04 0.01



99

ตารางที่ 25 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยง กับไฮโดรเจล BSA ที่เจือจางในอาหารเลี้ยงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% อัตราสวนเทากับ 1:1 โดยปริมาตรของไฮโดรเจลตออาหารเลี้ยงเซลล เปนเวลา 24 ชั่วโมง


1.01 0.99 0.97 1.00 0.96 1.11 1.13 1.03 1.08 0.92 1.01 1.01 0.99 1.06 1.13 1.18 1.18 1.16 0.97 0.99 0.97 1.00 1.01 1.16 1.13 1.14 1.06 0.99 1.13 1.19 1.25 1.11

AVE 0.97 1.00 0.98 1.00 1.00 1.14 1.16 1.15 1.10 STD 0.04 0.01 0.02 0.00 0.04 0.02 0.03 0.10 0.05

ตารางที่ 26 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยง กับไฮโดรเจล BSA ที่เจือจางใน อาหารเลี้ยงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10%



1.06 0.98 1.00 0.92 0.96 0.99 0.98 1.03 0.89 0.98 0.98 0.94 0.98 0.94 1.02 1.02 1.00 1.03 1.03 0.99 0.93 0.87 0.94 0.99 1.05 0.99 0.92

1.03 0.96 1.01 0.99 0.96 AVE 1.02 0.98 0.95 0.92 0.97 0.99 1.02 1.00 0.95 STD 0.04 0.01 0.04 0.06 0.04 0.02 0.03 0.02 0.06



100

ตารางที่ 27 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยง กับไฮโดรเจล BSA ที่เจือจางใน อาหารเลี้ยงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% อัตราสวนเทากับ 1:4 โดยปริมาตรของไฮโดรเจลตออาหารเลี้ยงเซลล เปนเวลา 48 ชั่วโมง


0.98 1.08 0.96 1.00 1.10 0.96 1.05 1.02 1.15 1.02 1.07 0.98 1.03 1.09 0.97 1.04 1.06 1.10 1.02 1.19 1.01 0.98 1.09 1.03 1.20 1.18 0.96

1.09 1.05 1.15 1.06 0.99 AVE 1.01 1.11 0.98 1.00 1.09 1.00 1.11 1.08 1.05 STD 0.02 0.07 0.03 0.02 0.01 0.04 0.08 0.07 0.09




1.03 1.03 1.12 1.05 1.22 1.15 1.27 1.18 1.12 1.20 1.12 1.15 1.05 1.18 1.24 1.36 1.22 1.00 1.00 1.10 1.10 1.10 1.11 1.05 1.28 1.20 1.16

1.07 1.06 1.34 1.24 1.13 AVE 1.07 1.08 1.12 1.06 1.15 1.12 1.31 1.21 1.10 STD 0.11 0.04 0.02 0.03 0.07 0.09 0.04 0.03 0.07



101

ตารางที่ 29 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยง กับไฮโดรเจลเปปไทดที่เจือจางใน อาหารเลี้ยงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% อัตราสวนเทากับ 1:9 โดยปริมาตรของไฮโดรเจลตออาหารเลี้ยงเซลล เปนเวลา 24 ชั่วโมง

peptide gel gel+H2SO4 gel+DMSO gel+ H2SO4+ DMSO gel+AST gel+CIF gel+CIF+AST gel+TOB gel+TOB+AST

1.04 1.08 1.01 1.01 0.95 0.97 1.08 1.03 1.05 1.03 1.04 1.02 1.00 0.95 1.00 1.03 1.03 1.01 0.99 0.99 0.98 0.99 0.92 1.05 1.02 0.92 0.97

0.96 1.00 1.00 1.01 1.02 AVE 1.02 1.03 1.00 1.00 0.95 1.00 1.03 1.00 1.01 STD 0.03 0.04 0.02 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.04

ตารางที่ 30 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยง กับไฮโดรเจลเปปไทดที่เจือจางใน อาหารเลี้ยงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10%



1.00 1.06 1.00 1.05 1.06 1.15 1.00 0.94 0.97 0.96 0.95 1.00 1.05 0.95 0.89 1.05 0.95 0.95 1.05 1.00 0.95 0.90 0.95 1.00 1.10 0.94 0.93

1.10 1.09 1.03 1.10 1.11 AVE 1.00 1.00 0.99 1.00 1.01 1.03 1.04 0.98 0.99 STD 0.04 0.05 0.03 0.09 0.08 0.11 0.04 0.08 0.08



102



0.89 0.96 0.99 0.98 1.03 1.04 1.18 0.97 1.04 1.00 0.98 1.03 0.97 1.11 1.08 1.14 1.12 1.11 1.01 1.01 1.03 1.03 1.08 1.11 1.22 1.12 1.00

1.06 1.07 0.99 1.01 1.04 AVE 0.97 0.98 1.01 0.99 1.07 1.07 1.13 1.06 1.05 STD 0.07 0.03 0.02 0.03 0.03 0.03 0.10 0.07 0.04




0.97 1.03 1.05 0.96 1.01 1.00 1.00 0.95 0.94 1.06 1.00 1.03 0.96 1.00 1.09 0.96 0.96 1.00 0.96 1.06 1.00 1.02 0.96 1.00 1.07 0.96 1.03

0.96 0.96 1.01 1.00 0.94 AVE 1.00 1.03 1.03 0.98 0.98 1.01 1.01 0.97 0.98 STD 0.05 0.03 0.02 0.03 0.03 0.05 0.05 0.02 0.05



103



1.02 0.85 0.97 0.99 0.96 0.93 1.09 0.93 1.06 0.94 1.01 0.94 1.04 0.95 0.98 1.02 1.00 1.04 0.93 0.98 0.90 0.90 1.00 0.94 1.06 0.96 1.03

1.09 1.00 0.99 1.06 0.99 AVE 0.96 0.95 0.94 0.98 1.00 0.96 1.04 0.99 1.03 STD 0.05 0.08 0.04 0.07 0.06 0.03 0.05 0.06 0.03




1.00 1.05 1.03 1.12 1.21 1.10 1.11 1.07 1.11 1.03 1.10 1.15 1.02 1.07 1.23 1.22 1.00 0.95 1.15 1.00 1.12 1.08 1.02 1.15 1.24 1.11 1.08

1.08 1.15 1.16 1.03 1.10 AVE 1.06 1.05 1.10 1.07 1.10 1.15 1.18 1.05 1.06 STD 0.08 0.05 0.06 0.05 0.08 0.06 0.06 0.05 0.08



104

ตารางที่ 35 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยง กับแผนเจล BSA ที่แชในอาหารเลี้ยงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% นาน 1 วัน เปนเวลา 24 ชั่วโมง

Period of release (days) BSA pad pad+H2SO4 pad+DMSO pad+ H2SO4+ DMSO pad+AST pad+CIF pad+CIF+AST pad+TOB pad+TOB+AST

1

0.98 0.99 0.79 0.87 1.02 0.95 0.94 0.92 0.97 0.98 0.81 0.84 0.82 0.84 0.79 1.06 0.96 1.07 0.92 0.9 0.74 0.82 0.74 0.83 0.82 0.92 1.01 0.91 0.76 0.82 0.97 0.82 0.79 0.91 0.99 0.89 0.95 0.78 0.82 0.8 0.79 0.97 0.96 0.93 1.02

AVE 0.95 0.85 0.80 0.86 0.84 0.87 0.94 0.94 0.99 STD 0.03 0.10 0.04 0.07 0.11 0.09 0.09 0.03 0.07



105


Period of release (days) BSA pad pad+H2SO4 pad+DMSO pad+ H2SO4+

DMSO

pad+

AST pad+CIF pad+CIF+AST

pad+TO

B

pad+TOB+AS

T

2

0.81 0.90 0.91 0.92 0.82 0.82 1.14 0.88 0.88 1.05 1.02 0.90 1.00 0.96 0.81 0.97 0.91 1.02 0.99 1.03 0.93 1.03 0.82 0.8 0.98 1.09 0.91 1.07 1.09 0.82 0.97 1.16 0.97 0.99 0.91 1.03 0.94 0.95 0.85 0.82 0.81 1.02 1.05 0.89 0.96

AVE 0.97 1.00 0.88 0.95 0.91 0.88 1.03 0.94 0.96 STD 0.10 0.07 0.05 0.08 0.15 0.10 0.07 0.09 0.07



106



3

0.91 1.01 1.16 0.93 0.86 0.88 0.88 0.93 0.91 0.81 1.02 1.11 1.00 1.01 1.00 1.03 0.82 1.05 0.99 1.09 1.03 0.95 0.82 0.82 0.92 0.92 0.82 0.96 0.82 1.05 1.11 0.83 0.93 0.80 0.95 0.97 1.07 1.03 0.95 0.99 0.97 0.96 0.79 0.93 1.03

AVE 0.95 0.99 1.06 1.00 0.90 0.92 0.88 0.91 0.96 STD 0.10 0.10 0.08 0.07 0.09 0.07 0.10 0.05 0.09



107



4

1.02 1.04 1.01 0.92 0.96 0.8 1.06 0.93 1.07 0.88 0.87 0.88 1.06 1.09 0.84 1.01 0.95 1.03 0.93 0.97 0.88 0.92 0.8 1.12 0.81 0.95 1.01 0.88 0.88 0.82 1.00 0.94 0.76 0.79 1.07 1.07 0.99 0.91 0.82 1.03 0.75 1.07 0.80 1.10 1.06

AVE 0.94 0.93 0.88 0.99 0.91 0.92 0.89 1.00 1.05 STD 0.06 0.07 0.08 0.06 0.14 0.16 0.13 0.08 0.03



108



5

0.96 1.15 1.04 0.74 0.92 0.8 1.07 1.00 0.82 0.77 1.02 0.95 0.95 0.97 0.99 0.97 0.80 0.86 0.83 0.95 1.14 1.04 1.00 0.82 0.89 0.98 1.01 0.80 0.91 1.05 0.99 0.96 0.83 1.14 0.92 0.93 1.04 0.79 0.99 1.01 0.79 0.93 1.00 1.07 0.88

AVE 0.88 0.96 1.03 0.95 0.93 0.87 1.01 0.95 0.90 STD 0.12 0.13 0.07 0.12 0.08 0.08 0.10 0.10 0.07



109



1

0.95 1.00 0.88 0.91 0.99 0.83 1.24 0.8 0.96 0.97 1.02 0.89 0.84 0.77 0.77 1.15 0.79 1.14 0.85 0.76 1.03 1.06 0.9 0.98 1.08 1.12 0.76 1.04 0.86 0.87 1.07 0.82 0.73 0.94 0.79 1.16 0.99 0.84 0.89 0.76 0.92 1.02 0.98 0.75 1.08

AVE 0.96 0.90 0.91 0.93 0.88 0.87 1.08 0.85 1.02 STD 0.07 0.11 0.07 0.14 0.09 0.13 0.12 0.15 0.16



110



2

0.99 1.02 0.77 0.96 0.80 0.88 0.94 0.95 0.95 0.88 0.93 0.89 0.82 0.95 1.02 1.17 0.97 1.00 0.92 0.92 0.76 0.88 1.16 1.20 1.12 0.81 0.78 0.78 0.82 0.80 1.05 0.88 1.12 1.02 0.81 0.86 0.75 1.08 0.90 0.93 1.12 1.15 1.02 0.79 0.95

AVE 0.86 0.95 0.82 0.93 0.98 1.07 1.05 0.87 0.91 STD 0.10 0.10 0.07 0.09 0.15 0.13 0.09 0.09 0.09



111



3

1.10 1.09 0.94 0.96 1.05 0.93 1.02 1.04 1.05 0.93 0.93 0.80 0.81 0.91 0.88 0.91 0.81 0.8 0.80 1.01 1.05 0.88 1.20 1.16 0.97 0.99 0.79 0.78 0.92 0.81 0.96 0.89 1.17 0.90 0.98 1.00 0.90 0.83 0.84 0.88 1.11 0.97 1.11 1.02 0.82

AVE 0.90 0.96 0.89 0.90 1.03 1.02 0.98 0.97 0.89 STD 0.13 0.10 0.11 0.06 0.13 0.13 0.09 0.09 0.12



112



4

1.14 1.16 0.95 0.91 1.04 1.16 0.95 0.95 1.26 1.14 1.08 0.82 0.93 0.98 0.98 0.90 0.90 1.38 1.02 0.79 0.88 0.93 0.87 0.89 1.09 0.98 0.93 0.88 1.10 0.79 0.95 0.95 0.89 1.16 1.10 1.23 0.95 0.94 1.04 1.08 0.91 1.16 0.90 0.81 0.94

AVE 1.03 1.01 0.90 0.96 0.95 1.02 1.00 0.95 1.15 STD 0.12 0.15 0.10 0.07 0.07 0.14 0.12 0.11 0.20



113



5

1.02 0.86 1.10 1.08 0.94 0.89 0.80 0.86 0.91 1.11 1.21 1.14 0.83 1.01 0.88 0.96 0.96 1.12 1.14 0.99 0.79 0.88 0.81 0.92 0.79 0.93 1.17 1.02 0.85 1.22 0.92 0.80 0.85 0.97 0.97 1.17 1.02 1.01 1.21 1.22 0.88 1.00 1.06 0.9 0.95

AVE 1.06 0.98 1.09 0.99 0.89 0.91 0.92 0.92 1.06 STD 0.06 0.15 0.18 0.16 0.09 0.06 0.12 0.05 0.12



114

ตารางที่ 45 ความเขมขนของแอสตาแซนทินที่สกัดไดจากแผนเจล BSA

Period of incubation (days) [Astaxanthin] (μM)

AVE STD No. 1 No. 2 No. 3 No. 4

1 5.81 6.27 6.81 7.04 6.48 0.55 2 2.88 3.81 2.96 3.96 3.4 0.56 3 1.19 1.27 2.96 3.96 2.35 1.35 4 1.27 0.81 0.88 1.04 1 0.20 5 0.73 0.65 0.42 0.73 0.63 0.15

ตารางที่ 46 ความสามารถในการตานอนุมูลอิสระของแอสตาแซนทินที่ปลดปลอยจากแผนเจล BSA

Period of incubation (days) %Inhibition

AVE STD No. 1 No. 2 No. 3 No. 4

1 1.4 1.45 1.5 1.52 1.47 0.05 2 1.11 1.21 1.12 1.22 1.17 0.06 3 0.95 0.96 1.12 1.22 1.06 0.13 4 0.96 0.91 0.92 0.94 0.93 0.02 5 0.91 0.9 0.88 0.91 0.9 0.01



115

ตารางที่ 47 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยง กับไฮโดรเจล BSA ที่เจือจางใน อาหารเลี้ยงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% อัตราสวนเทากับ 1:9 โดยปริมาตรของไฮโดรเจลตออาหารเลี้ยงเซลล เปนเวลา 1 วัน


0.93 0.91 0.94 1.02 0.91 0.94 0.94 0.95 0.98 0.96 0.97 0.96 0.93 0.87 0.92 0.99 0.95 0.95 1.09 0.96 0.99 0.96 0.98 0.93 1.01 0.99 0.96

0.96 0.87 1.04 0.95 AVE 0.99 0.95 0.96 0.97 0.93 0.91 0.99 0.96 0.96 STD 0.08 0.03 0.02 0.05 0.05 0.03 0.04 0.02 0.01


อัตราสวนเทากับ 1:9 โดยปริมาตรของไฮโดรเจลตออาหารเลี้ยงเซลล เปนเวลา 2 วัน


1.03 0.93 0.94 1.03 0.93 0.96 0.96 1.01 1.02 1.07 0.94 0.95 0.87 0.95 0.93 0.94 0.99 0.98 1.05 0.98 0.99 0.98 0.93 0.96 1.02 1.02 1.00

0.91 0.91 1.00 0.93 AVE 1.05 0.95 0.96 0.96 0.93 0.94 0.98 0.99 1.00 STD 0.02 0.02 0.03 0.09 0.01 0.03 0.04 0.04 0.02



116



0.90 0.90 0.85 0.87 0.90 0.90 0.93 0.90 0.90 0.89 0.86 0.82 0.85 0.86 0.90 0.90 0.90 0.88 0.93 0.86 0.84 0.87 0.87 0.91 0.93 0.88 0.87 0.92 0.92 0.85 0.85 0.87 0.90 0.90 0.89 0.85

AVE 0.91 0.89 0.84 0.86 0.88 0.90 0.92 0.89 0.88 STD 0.02 0.03 0.01 0.01 0.02 0.01 0.01 0.01 0.02




1.00 0.91 0.94 0.81 0.81 0.85 0.99 0.88 0.83 0.91 0.88 0.91 0.85 0.82 0.83 0.87 0.83 0.85 0.97 0.84 0.85 0.80 0.82 0.81 0.90 0.85 0.87

0.82 0.85 0.91 0.94 0.90 AVE 0.96 0.87 0.90 0.82 0.82 0.83 0.92 0.88 0.86 STD 0.05 0.03 0.05 0.03 0.00 0.02 0.05 0.05 0.03



117



1.01 0.98 0.99 1.00 0.99 1.01 1.04 1.08 1.00 1.00 1.05 1.02 0.96 1.00 1.01 1.04 1.01 1.06 0.98 0.98 0.98 1.02 1.02 1.01 1.08 1.04 1.07

1.01 0.98 1.01 1.03 1.04 AVE 1.00 1.00 1.00 0.99 1.01 1.00 1.04 1.04 1.04 STD 0.01 0.04 0.02 0.03 0.02 0.01 0.03 0.03 0.03




1.00 0.88 0.86 0.91 1.05 0.85 1.25 1.14 1.12 1.06 0.93 0.97 0.94 0.91 0.95 1.36 1.09 1.11 1.04 0.86 0.91 0.94 0.91 0.87 1.27 1.11 1.10

0.88 0.88 1.23 1.15 AVE 1.03 0.89 0.91 0.93 0.94 0.89 1.28 1.13 1.11 STD 0.03 0.03 0.05 0.02 0.07 0.04 0.06 0.03 0.01



118



1.04 1.09 1.00 0.90 1.06 1.26 1.22 1.14 1.01 1.03 1.07 1.09 0.90 1.03 1.18 1.30 1.01 1.06 0.98 1.03 1.02 0.90 1.02 1.22 1.34 0.98 1.08

1.05 1.21 1.28 1.04 AVE 1.02 1.07 1.04 0.90 1.04 1.22 1.28 1.05 1.05 STD 0.03 0.03 0.05 0.01 0.02 0.03 0.05 0.07 0.04




1.01 1.04 0.98 0.92 1.04 1.01 1.15 1.05 1.00 0.91 0.92 1.00 0.98 0.97 0.99 1.22 1.05 1.00 0.95 0.90 1.14 1.04 0.98 0.96 1.09 1.26 1.12 0.88 0.82 1.05 1.03 1.04 0.97 1.23 1.15 1.05

AVE 0.94 0.92 1.04 0.99 1.01 0.98 1.17 1.13 1.04 STD 0.06 0.09 0.07 0.05 0.04 0.02 0.06 0.10 0.06



119



0.93 0.96 1.06 0.97 1.01 1.03 1.08 1.03 0.97 1.01 1.01 1.02 0.95 1.03 1.11 1.06 0.93 0.91 0.93 1.02 1.11 1.07 0.96 1.06 1.01 0.97 0.93

1.02 1.02 1.06 0.96 0.97 AVE 0.96 1.00 1.06 1.00 1.01 1.06 1.05 0.97 0.95 STD 0.04 0.03 0.04 0.07 0.03 0.04 0.03 0.04 0.03




1.03 1.02 1.00 0.98 0.94 1.12 1.15 1.02 0.92 0.95 1.15 0.98 0.94 0.98 1.09 0.95 1.12 0.92 0.98 0.97 1.09 1.02 0.95 1.05 1.05 0.94 1.03 1.03 1.02 0.89 1.14 0.92 1.02

AVE 1.00 1.05 1.03 0.98 0.97 1.04 1.07 1.00 0.97 STD 0.04 0.10 0.06 0.04 0.03 0.10 0.09 0.09 0.06



120



0.84 0.93 0.85 0.87 0.89 0.90 1.62 1.26 1.17 0.95 0.98 0.95 0.81 0.87 0.87 1.51 1.21 1.18 0.89 0.85 0.82 0.85 0.84 0.93 1.60 1.15 1.20

0.73 0.73 1.43 1.24 AVE 0.89 0.92 0.88 0.84 0.83 0.86 1.54 1.22 1.18 STD 0.05 0.06 0.06 0.03 0.07 0.09 0.09 0.05 0.02




0.96 1.11 0.95 0.95 0.95 1.08 1.35 1.17 1.15 0.93 1.01 0.99 1.11 0.99 1.09 1.49 1.12 1.13 0.85 1.08 1.08 1.09 1.07 1.08 1.37 1.15 1.11

1.08 1.17 1.40 1.12 AVE 0.92 1.07 1.00 1.05 1.02 1.11 1.40 1.14 1.13 STD 0.06 0.05 0.07 0.09 0.06 0.04 0.06 0.03 0.02



121



0.97 0.88 0.96 1.02 0.96 1.11 1.39 1.19 1.13 0.84 0.81 0.94 0.96 1.14 1.25 1.45 1.07 1.10 0.94 0.82 1.02 0.88 1.19 1.16 1.49 1.10 1.16 0.97 0.97 0.99 1.02 1.07 1.07 1.45 0.99 1.25

AVE 0.93 0.87 0.98 0.97 1.09 1.15 1.44 1.09 1.16 STD 0.07 0.08 0.03 0.07 0.10 0.08 0.04 0.08 0.07




1.03 0.94 0.94 0.83 0.99 0.96 1.01 0.96 1.07 0.89 0.96 0.91 0.92 0.98 0.83 1.07 1.10 0.94 1.01 0.98 0.96 0.94 0.91 0.91 0.99 0.91 1.15

0.83 0.94 1.03 0.99 1.03 AVE 0.98 0.96 0.93 0.90 0.93 0.91 1.03 0.99 1.05 STD 0.08 0.02 0.03 0.06 0.07 0.05 0.03 0.08 0.09



122



0.96 1.15 1.08 0.98 1.13 1.03 1.30 0.98 1.08 1.03 1.06 0.98 0.96 1.08 1.06 1.01 1.01 1.06 1.08 1.15 0.96 1.15 1.10 1.01 1.03 0.89 1.08 1.15 1.03 1.06 1.10 1.10 1.03

AVE 1.06 1.12 1.01 1.03 1.09 1.04 1.11 1.00 1.06 STD 0.08 0.06 0.06 0.10 0.04 0.02 0.13 0.09 0.02

ตารางที่ 62 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลั งบมเลี้ยงกับไฮโดรเจลเปปไทดที่เจือจางใน อาหารเลี้ยงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10%



1.06 0.94 0.96 0.97 1.02 1.09 1.11 1.04 0.96 0.99 1.01 0.93 1.05 0.94 1.04 1.07 1.05 0.98 1.04 0.96 0.96 0.96 0.94 1.02 1.10 1.03 1.00

AVE 1.03 0.97 0.95 0.99 0.97 1.05 1.10 1.04 0.98 STD 0.04 0.04 0.02 0.05 0.05 0.04 0.02 0.01 0.02



123

ตารางที่ 63 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยง กับไฮโดรเจลเปปไทดที่เจือจางใน อาหารเลี้ยงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% อัตราสวนเทากับ 1:9 โดยปริมาตรของไฮโดรเจลตออาหารเลี้ยงเซลล เปนเวลา 2 วัน


1.00 1.03 0.99 0.98 0.98 1.00 1.07 0.94 0.96

0.98 1.01 0.96 0.96 1.00 0.98 1.10 0.91 0.99

1.02 0.98 1.03 0.96 1.01 1.03 0.99 0.81 0.84

AVE 1.00 1.01 0.99 0.97 1.00 1.00 1.06 0.89 0.93

STD 0.02 0.03 0.03 0.01 0.01 0.03 0.06 0.07 0.08 ตารางที่ 64 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยง กับไฮโดรเจลเปปไทดที่เจือจางใน อาหารเลี้ยงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10%



0.90 0.97 0.99 0.99 0.97 0.94 0.96 0.96 0.95 0.96 0.94 0.99 0.99 0.97 0.97 0.99 0.98 1.05 0.99 0.99 0.95 0.99 0.94 0.95 0.95 0.97 0.97

AVE 0.95 0.97 0.97 0.99 0.96 0.96 0.97 0.97 0.99 STD 0.04 0.03 0.02 0.00 0.02 0.02 0.02 0.01 0.05



124




0.99 0.97 0.98 1.03 0.96 0.94 0.96 0.94 0.93 0.95 0.95 0.94 0.97 1.06 0.92 1.02 0.93 0.91 0.89 0.91 0.94 0.94 0.98 0.89 0.98 0.94 0.94

AVE 0.94 0.94 0.95 0.98 1.00 0.92 0.99 0.94 0.93 STD 0.05 0.03 0.03 0.04 0.05 0.02 0.03 0.01 0.02




1.01 1.08 1.02 1.05 1.01 1.06 1.00 1.01 1.01 1.02 1.01 0.99 1.04 1.02 1.04 0.98 1.04 1.05 1.04 1.01 1.00 1.00 1.04 1.00 1.04 1.01 1.05

AVE 1.03 1.04 1.00 1.03 1.03 1.03 1.01 1.02 1.04 STD 0.01 0.04 0.02 0.03 0.01 0.03 0.03 0.02 0.02



125

ตารางที่ 67 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยง กับไฮโดรเจลเปปไทดที่เจือจางใน อาหารเลี้ยงเซลล MEM ที่ประกอบด วย FBS 10% อัตราสวนเทากับ 1:4 โดยปริมาตรของไฮโดรเจลตออาหารเลี้ยงเซลล เปนเวลา 1 วัน


1.20 1.20 1.03 1.06 1.12 1.24 1.23 1.27 1.22 1.22 1.23 1.10 1.14 1.14 1.22 1.25 1.25 1.23 1.15 1.22 1.14 1.08 1.13 1.20 1.32 1.19 1.21

AVE 1.19 1.22 1.09 1.09 1.13 1.22 1.27 1.24 1.22 STD 0.03 0.02 0.06 0.04 0.01 0.02 0.04 0.04 0.01

ตารางที่ 68 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยง กับไฮโดรเจลเปปไทดที่เจือ จางในอาหารเลี้ยงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10%



1.04 1.12 1.09 0.95 0.98 1.04 1.22 1.20 1.10 1.06 1.01 1.11 1.03 0.96 0.91 1.24 1.16 1.14 1.09 1.03 1.01 0.95 1.00 0.93 1.19 1.12 1.10

AVE 1.07 1.06 1.07 0.98 0.98 0.96 1.22 1.16 1.11 STD 0.02 0.06 0.05 0.05 0.02 0.07 0.02 0.04 0.02



126

ตารางที่ 69 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลห ลังบมเลี้ยง กับไฮโดรเจลเปปไทดที่เจือจางใน อาหารเลี้ยงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% อัตราสวนเทากับ 1:4 โดยปริมาตรของไฮโดรเจลตออาหารเลี้ยงเซลล เปนเวลา 3 วัน


1.08 1.01 0.96 0.97 1.06 1.02 1.16 1.08 1.04 1.05 0.97 1.01 0.92 1.09 1.03 1.12 1.03 1.15 1.03 1.00 0.97 0.91 1.11 1.11 1.11 1.16 1.00

AVE 1.05 0.99 0.98 0.94 1.09 1.05 1.13 1.09 1.06 STD 0.02 0.02 0.03 0.03 0.02 0.05 0.03 0.07 0.08




1.11 1.02 0.93 1.08 1.01 0.95 1.05 1.02 1.03 1.15 1.00 1.10 1.17 1.03 1.03 1.03 1.06 1.01 1.16 1.03 1.01 1.05 1.07 1.05 1.10 1.10 1.13

AVE 1.14 1.02 1.01 1.10 1.04 1.01 1.06 1.06 1.06 STD 0.03 0.02 0.08 0.06 0.03 0.05 0.03 0.04 0.07



127



0.98 0.95 0.92 1.12 1.09 0.98 1.03 1.15 1.08 1.00 1.03 0.98 1.05 1.11 1.14 1.11 1.03 1.05 1.05 0.92 1.14 0.95 1.15 1.05 0.97 1.05 0.95

AVE 1.01 0.97 1.02 1.04 1.12 1.06 1.04 1.08 1.03 STD 0.03 0.06 0.11 0.08 0.03 0.08 0.07 0.07 0.06




1.21 1.18 1.09 1.09 1.13 1.09 1.83 1.40 1.40 1.18 1.20 1.17 1.12 1.12 1.21 1.71 1.43 1.49 1.09 1.26 1.26 1.10 1.21 1.10 1.73 1.43 1.41

AVE 1.16 1.21 1.17 1.10 1.16 1.13 1.76 1.42 1.44 STD 0.06 0.04 0.09 0.02 0.05 0.07 0.07 0.02 0.05



128



1.07 1.16 1.12 0.96 1.23 1.09 1.41 1.25 1.31 1.13 1.16 1.04 1.01 1.16 1.00 1.49 1.20 1.29 1.08 1.05 1.11 1.00 1.12 1.16 1.51 1.25 1.28

AVE 1.09 1.12 1.09 0.99 1.17 1.08 1.47 1.24 1.29 STD 0.04 0.06 0.04 0.03 0.05 0.08 0.05 0.03 0.01




1.16 1.07 1.07 1.17 1.13 1.19 1.42 1.22 1.25 1.07 1.17 1.17 1.23 1.13 1.11 1.37 1.28 1.31 1.10 1.10 1.04 1.34 1.23 1.13 1.39 1.31 1.26

AVE 1.11 1.11 1.09 1.25 1.16 1.14 1.39 1.27 1.27 STD 0.05 0.05 0.07 0.08 0.06 0.04 0.02 0.05 0.03



129

ตารางที่ 75 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยง กับไฮโดรเจลเปปไทดที่ เจือจางในอาหารเลี้ยงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% อัตราสวนเทากับ 1:1 โดยปริมาตรของไฮโดรเจลตออาหารเลี้ยงเซลล เปนเวลา 4 วัน


1.08 1.08 1.07 1.06 1.08 0.96 1.02 0.98 1.11 1.02 1.10 1.03 1.13 0.96 1.07 1.15 1.05 0.95 1.02 1.08 1.15 1.10 1.01 1.03 1.10 1.07 0.98

AVE 1.04 1.09 1.08 1.10 1.02 1.02 1.09 1.03 1.01 STD 0.04 0.01 0.06 0.04 0.06 0.06 0.06 0.05 0.09

ตารางที่ 76 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซ ลลหลังบมเลี้ยง กับไฮโดรเจลเปปไทดที่เจือจางใน อาหารเลี้ยงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10%



0.96 0.96 0.98 1.08 0.96 0.98 1.13 1.01 1.13 0.94 0.98 0.96 0.94 1.08 1.06 1.08 0.96 0.86 1.03 1.20 1.08 1.03 1.10 1.08 1.10 1.03 1.01

AVE 0.98 1.05 1.01 1.02 1.05 1.04 1.10 1.00 1.00 STD 0.05 0.13 0.06 0.07 0.08 0.05 0.02 0.04 0.13



130

ตารางที่ 77 คาสัดสวนความมีชีวิตของเซลลหลังบมเลี้ยงกับแผนเจล BSA ที่แชในอาหารเลี้ยงเซลล MEM ที่ประกอบดวย FBS 10% (แชเปนระยะเวลานาน 1-5 วัน) เปนเวลา 1 วัน

Period of

immersion (days) BSA pad pad+H2SO4 pad+DMSO pad+ H2SO4+ DMSO pad+AST pad+CIF pad+CIF+AST pad+TOB pad+TOB+AST

1

0.96 1.07 0.98 1.02 1.09 0.95 1.36 1.02 1.20 1.08 1.00 0.95 0.94 0.90 0.95 1.51 1.10 1.14 1.12 1.05 0.96 0.84 0.92 0.95 1.45 1.15 1.08 1.05 1.09 1.07 1.05 1.07 1.00 1.29 1.02 1.15

AVE 1.05 1.05 0.99 0.96 0.99 0.96 1.40 1.07 1.14 STD 0.07 0.04 0.06 0.09 0.10 0.02 0.09 0.06 0.05

2

1.00 1.05 1.10 1.15 0.98 0.99 1.19 1.07 1.05 0.92 1.02 0.84 1.19 1.02 0.98 1.17 1.03 1.12 1.08 0.95 0.94 0.96 0.95 1.00 1.29 1.07 1.17 1.02 0.83 1.10 1.01 0.86 1.13 1.19 1.33 0.92

AVE 1.01 0.96 0.99 1.08 0.95 1.02 1.21 1.13 1.06 STD 0.07 0.10 0.13 0.11 0.07 0.07 0.05 0.14 0.11

3

1.05 0.94 1.08 1.04 1.07 1.07 1.12 0.98 1.01 1.22 0.93 0.89 1.16 1.02 1.00 1.30 1.05 1.15 1.07 1.02 0.86 1.19 0.99 1.29 1.01 0.98 1.05 1.20 1.05 1.00 0.95 1.00 1.42 0.98 1.24 0.91

AVE 1.13 0.99 0.96 1.09 1.02 1.20 1.10 1.06 1.03 STD 0.09 0.06 0.10 0.11 0.04 0.19 0.14 0.13 0.10



131


Period of immersion (days) BSA pad pad+H2SO4 pad+DMSO pad+ H2SO4+ DMSO pad+AST pad+CIF pad+CIF+AST pad+TOB pad+TOB+AST

4

1.06 0.98 1.07 1.02 0.98 1.02 1.02 1.02 1.07 1.30 1.03 1.14 1.13 0.98 1.00 1.09 1.01 0.98 1.40 1.20 1.02 1.07 1.02 1.00 1.13 1.05 0.95 1.40 1.00 1.21 0.99 0.93 1.02 1.07 0.94 1.05

AVE 1.29 1.05 1.11 1.05 0.98 1.01 1.08 1.01 1.01 STD 0.16 0.10 0.08 0.06 0.04 0.01 0.04 0.05 0.06

5

0.92 0.90 0.32 1.02 0.93 0.88 0.89 1.00 1.05 1.00 1.04 0.22 1.00 1.06 0.94 0.91 0.99 1.06 0.93 0.91 0.16 1.05 1.02 0.93 0.94 0.95 1.00 1.03 0.96 0.22 0.98 1.08 0.90 0.98 0.95 1.02

AVE 0.97 0.95 0.23 1.01 1.02 0.91 0.93 0.97 1.03 STD 0.06 0.06 0.06 0.03 0.07 0.02 0.04 0.03 0.02



132



1

1.00 1.06 0.95 0.96 0.94 1.00 1.22 0.93 0.90 1.01 0.98 1.04 1.00 0.98 1.07 1.16 1.02 0.91 0.91 0.93 0.85 0.96 0.96 0.98 1.21 1.00 0.98 0.94 1.00 1.06 1.01 0.92 1.06 1.10 0.96 1.06

AVE 0.97 0.99 0.97 0.98 0.95 1.03 1.17 0.98 0.96 STD 0.05 0.05 0.10 0.03 0.03 0.05 0.06 0.04 0.07

2

1.12 1.02 1.04 0.86 0.90 0.85 1.07 0.99 0.87 1.13 0.97 0.96 0.96 1.05 0.85 1.17 1.04 0.87 0.98 0.87 1.05 0.97 0.94 0.75 1.05 1.07 0.98 0.80 1.18 0.94 0.90 0.79 0.98 0.97 1.01 0.98

AVE 1.01 1.01 1.00 0.92 0.92 0.86 1.06 1.03 0.92 STD 0.15 0.13 0.05 0.05 0.11 0.10 0.08 0.03 0.06

3

1.05 0.97 0.86 1.00 0.82 0.91 0.94 0.93 0.92 0.99 0.93 0.99 0.91 0.85 0.99 0.94 0.98 0.82 1.10 1.11 1.05 0.97 1.10 0.94 1.22 0.91 0.94 1.15 0.87 0.98 0.75 0.95 1.05 0.98 1.16 0.83

AVE 1.07 0.97 0.97 0.91 0.93 0.97 1.02 0.99 0.88 STD 0.07 0.10 0.08 0.11 0.12 0.06 0.14 0.11 0.06



133



4

0.94 1.00 1.01 0.78 1.16 1.00 0.97 0.87 0.89 1.05 1.16 1.20 0.94 1.15 1.03 1.00 0.85 0.76 0.98 1.19 1.21 0.97 1.05 1.17 1.20 0.82 1.13 0.95 1.03 0.80 1.00 1.18 1.19 1.00 0.80 1.13

AVE 0.98 1.10 1.05 0.92 1.13 1.10 1.04 0.83 0.98 STD 0.05 0.09 0.19 0.10 0.06 0.10 0.11 0.03 0.18

5

0.91 0.96 0.96 0.93 0.96 0.86 0.80 0.80 0.85 0.85 0.87 0.96 1.02 0.91 0.79 0.92 0.82 0.95 0.91 0.90 0.96 0.90 0.80 0.80 0.82 0.87 0.86 0.95 0.79 0.96 1.08 0.91 0.79 0.83 0.93 0.86

AVE 0.90 0.88 0.96 0.98 0.89 0.81 0.84 0.86 0.88 STD 0.04 0.07 0.00 0.08 0.07 0.04 0.05 0.06 0.05



134



1

1.12 0.98 0.84 0.84 0.89 1.05 0.80 0.86 1.11 0.90 0.86 1.17 0.87 0.93 0.85 0.92 0.81 0.83 0.82 1.09 0.90 1.09 1.11 0.96 0.94 0.88 0.98 0.92 0.90 1.07 1.01 0.90 0.76 1.04 1.14 1.05

AVE 0.94 0.96 1.00 0.95 0.96 0.91 0.93 0.92 0.99 STD 0.13 0.10 0.15 0.12 0.10 0.13 0.10 0.15 0.12

2

0.89 0.85 0.88 0.89 0.93 0.75 0.87 0.79 0.86 0.91 0.84 0.94 0.86 0.89 0.90 0.97 0.91 0.96 0.87 0.87 0.95 0.87 0.95 0.81 0.94 0.88 0.91 0.73 0.99 0.85 0.96 0.94 1.00 0.99 0.89 0.90

AVE 0.85 0.89 0.91 0.90 0.93 0.86 0.94 0.87 0.91 STD 0.08 0.07 0.05 0.04 0.03 0.11 0.05 0.05 0.04

3

1.02 0.98 1.18 1.18 0.89 0.95 1.07 1.16 1.13 1.15 0.89 0.99 0.88 0.84 0.91 1.12 1.15 1.16 0.90 0.86 1.14 0.90 1.16 0.91 1.02 1.12 1.13 1.01 0.90 1.14 1.01 1.12 0.86 1.16 1.13 1.12

AVE 1.02 0.91 1.11 0.99 1.00 0.91 1.09 1.14 1.13 STD 0.11 0.05 0.08 0.13 0.16 0.04 0.06 0.02 0.02



135



4

1.28 1.13 1.12 0.84 1.01 0.94 1.02 0.88 1.01 1.05 1.16 0.89 1.13 0.93 0.88 0.88 0.79 0.88 0.97 1.00 1.16 0.98 1.19 0.84 0.99 0.88 0.83 1.11 0.95 0.84 0.90 0.84 0.83 1.19 0.84 0.79

AVE 1.10 1.06 1.00 0.96 0.99 0.87 1.02 0.85 0.88 STD 0.13 0.10 0.16 0.13 0.15 0.05 0.13 0.04 0.09

5

1.09 1.09 1.08 0.91 0.97 1.01 0.96 0.97 1.03 1.12 1.12 0.80 0.99 1.16 1.17 0.90 1.17 0.88 1.01 1.00 0.94 1.07 1.10 1.09 1.17 1.14 1.03 1.09 1.17 0.95 0.90 1.05 1.14 0.96 0.80 1.02

AVE 1.08 1.09 0.94 0.97 1.07 1.10 1.00 1.02 0.99 STD 0.05 0.07 0.12 0.08 0.08 0.07 0.12 0.17 0.07



136



1

0.91 0.94 0.88 0.92 0.86 0.92 0.90 1.03 0.98 0.92 0.98 0.90 0.89 0.92 0.98 0.96 0.91 1.07 1.05 0.82 0.89 0.85 0.81 0.84 0.95 0.82 1.01 0.83 0.78 0.93 0.87 0.87 1.00 1.10 0.84 0.87

AVE 0.93 0.88 0.90 0.88 0.87 0.93 0.98 0.90 0.98 STD 0.09 0.09 0.02 0.03 0.04 0.07 0.08 0.09 0.08

2

1.10 0.97 0.91 1.00 0.87 0.85 0.83 0.84 0.93 0.93 0.86 0.95 0.91 0.88 0.89 1.03 0.98 0.89 1.06 0.81 0.84 0.86 0.86 1.00 0.91 0.93 0.91 0.91 0.86 0.93 0.91 0.74 0.92 0.84 0.96 0.97

AVE 1.00 0.88 0.91 0.92 0.84 0.91 0.90 0.93 0.93 STD 0.09 0.07 0.05 0.06 0.06 0.06 0.09 0.06 0.03

3

0.97 0.96 0.89 1.01 0.82 0.98 0.94 0.96 1.08 0.35 0.98 0.79 0.94 0.85 0.87 0.98 0.98 0.97 0.93 0.94 0.94 0.73 0.91 0.84 0.97 0.86 0.98 1.05 0.94 1.06 1.00 0.95 0.88 1.26 0.89 0.90

AVE 0.83 0.95 0.92 0.92 0.88 0.89 1.04 0.92 0.98 STD 0.32 0.02 0.11 0.13 0.06 0.06 0.15 0.06 0.08



137



4

0.93 0.86 0.94 0.87 0.91 0.92 0.99 0.96 0.84 1.00 0.86 0.98 0.82 0.99 1.08 0.86 0.94 0.93 0.86 1.00 0.93 0.87 0.93 0.91 0.95 1.12 0.86 0.93 0.96 0.83 0.98 0.91 0.98 0.98 0.84 0.86

AVE 0.93 0.92 0.92 0.88 0.93 0.97 0.95 0.96 0.87 STD 0.06 0.07 0.06 0.06 0.04 0.08 0.06 0.11 0.04

5

0.86 0.96 0.94 0.81 0.86 0.81 1.03 1.06 0.94 0.92 0.93 0.86 0.92 0.81 1.12 0.96 0.95 1.03 0.83 0.86 0.92 0.91 0.93 1.00 1.00 0.89 0.84 0.96 1.08 0.89 0.83 0.91 0.85 0.89 0.98 0.88

AVE 0.89 0.96 0.90 0.87 0.88 0.94 0.97 0.97 0.92 STD 0.06 0.09 0.04 0.06 0.05 0.14 0.06 0.07 0.08



138



1

0.86 0.95 0.79 0.88 0.95 0.77 0.89 0.88 0.82 0.75 0.82 0.66 0.74 1.00 1.00 0.79 0.70 0.95 1.00 1.04 0.87 0.83 0.87 0.76 0.79 0.79 1.03 0.88 0.81 1.03 0.90 0.88 0.75 0.74 0.94 1.11

AVE 0.87 0.91 0.84 0.84 0.92 0.82 0.80 0.83 0.98 STD 0.10 0.11 0.16 0.07 0.06 0.12 0.06 0.10 0.13

2

1.08 0.91 1.00 0.74 0.83 1.17 0.88 0.83 0.91 0.76 0.93 0.94 0.88 0.76 1.00 0.80 0.76 0.82 0.99 0.79 0.80 0.81 0.75 0.87 0.90 0.81 0.77 0.88 0.88 0.97 0.94 0.91 0.91 0.77 0.94 0.76

AVE 0.93 0.88 0.93 0.84 0.82 0.99 0.84 0.84 0.82 STD 0.14 0.06 0.09 0.09 0.08 0.13 0.06 0.07 0.07

3

1.07 1.04 0.69 0.95 0.77 0.91 0.76 0.75 0.83 0.88 1.18 0.76 0.87 0.81 0.83 0.87 0.82 0.75 0.93 1.09 0.80 0.95 0.94 0.80 0.86 1.14 1.11 1.17 1.03 0.93 0.90 0.81 0.82 1.17 0.81 1.01

AVE 1.01 1.09 0.79 0.92 0.83 0.84 0.91 0.88 0.93 STD 0.13 0.07 0.10 0.04 0.07 0.05 0.18 0.17 0.17



139



4

0.81 0.80 1.06 1.01 1.02 0.99 0.83 1.14 0.63 0.70 1.07 0.83 0.79 0.93 0.87 0.93 1.06 1.02 0.94 0.91 0.76 1.17 0.82 0.74 0.91 1.13 0.81 1.04 1.00 0.88 0.94 0.66 0.80 1.10 1.00 0.91

AVE 0.87 0.94 0.88 0.98 0.86 0.85 0.94 1.08 0.84 STD 0.15 0.12 0.13 0.16 0.16 0.11 0.11 0.07 0.17

5

0.81 0.69 0.91 0.82 0.74 0.82 0.83 0.99 1.14 0.89 0.76 0.89 0.79 0.87 0.89 0.91 0.96 1.10 0.83 0.82 0.77 0.87 0.95 0.81 0.90 0.95 1.01 0.94 0.90 0.93 1.03 0.83 0.82 0.83 0.89 0.87

AVE 0.87 0.79 0.88 0.88 0.85 0.84 0.87 0.95 1.03 STD 0.06 0.09 0.07 0.11 0.09 0.04 0.04 0.04 0.12



140

ประวัติผูวิจัย ชื่อ-สกุล นางสาววิมล เผาดี ที่อยู 140 ม. 7 ต. ศาลาขาว อ. เมือง จ. สุพรรณบุรี 72210 ประวัติการศึกษา

พ.ศ. 2551 สําเร็จการศึกษาวิทยาศาสตรบัณฑิต สาขาวิชาเทคโนโลยีชีวภาพ คณะวิศวกรรมศาสตรและเทคโนโลยีอุตสาหกรรม มหาวิทยาลัยศิลปากร

พ.ศ. 2552 ศึกษาตอระดับปริญญามหาบัณฑิต สาขาวิชาเทคโนโลยีชีวภาพ คณะวิศวกรรมศาสตรและเทคโนโลยีอุตสาหกรรม บัณฑิตวิทยาลัยมหาวิทยาลัยศิลปากร

การนําเสนอผลงานทางวิชาการ - Poster presentation

พ.ศ. 2552 Antioxidant activity of astaxanthin extracted from Phaffia Rhodozyma การประชุมวิชาการวิทยาศาสตรและเทคโนโลยีแหงประเทศไทย (วทท.) คร้ังที่ 35 เดอะ ไทด รีสอรท (หาดบางแสน ) จังหวัดชลบุรี วันที่ 15-17 ตุลาคม 2552

- Oral presentation พ.ศ. 2555 Natural peptide hydrogel dressing for wound healing การประชุมวิชาการโครงการทุนวิจัยมหาบัณฑิต สกว. สาขาวิทยาศาสตร

และเทคโนโลยี คร้ังที่ 6 โรงแรมจอมเทียน ปาลม บีช รีสอรท เมืองพัทยา จังหวัดชลบุร ีวันที่ 4-6 เมษายน 2555



วภาพ ัยศิลปากร...

Documents