เทคโนโลยหองแลบโรงพยาบาล ความทาทายในยคดจทล

ดร.สภาภรณ วชรพฤษาด

ศนยวทยาศาสตรสขภาพโรคอบตใหม คณะแพทยศาสตร โรงพยาบาลจฬาลงกรณ สภากาชาดไทย

การอบรมเขงปฏบตการเครอขายหองปฏบตการโรคตดเชออบตใหม (EID Lab Network) 20 กมภาพนธ 2560 จดโดย กรมวทยาศาสตรการแพทย

Breaches in species barrier: selected emerging infections in humans identified since 1976

Pathogens Reservoirs Year

H7N9 Chickens 2013

MERS coronavirus Bat / Camel? 2012

Influenza H1N1(2009) Swine 2009

SARS coronavirus Palm civets , Bats 2003

Nipah virus Bats 1999

H5N1 influenza A Chickens 1997

Australian lyssavirus Bats 1996

BSE/vCJD Cattle 1996

Hendra virus Bats 1994

HIV-2 Primate 1986

Borrelia burgdorferi Rodents 1982

E. coli O157:H7 Cattle 1982

HIV-1 Primates 1981

Ebola virus Bats 1976 Approximately 75% of emerging infectious diseases are zoonoses

ความทาทาย

• Novel / EID Pathogen(s): MERS-CoV

• Technology: NGS

• Re-emerging: Rabies

• Unknown VS Early detection

• Logistic/Budget

Novel / EID Pathogen

Zaki et al. N Engl J Med. 2012 Nov 8;367(19):1814-20.

Sputum sample tested negative by indirect immunofluorescence assays for influenza A and B viruses, parainfluenza viruses types 1 to 3, respiratory syncytial virus, and adenovirus.

- Virus isolation positive: LLC-MK2 and Vero cells resulted in cytopathic changes suggestive of virus replication: POSITIVE

- Indirect immunofluorescence assays for the detection of influenza A and B viruses, parainfluenza viruses types 1 to 3, respiratory syncytial virus: NEGATIVE

Real-time PCR assays specific for adenovirus,

enterovirus, human metapneumovirus,

and human herpesvirus 1 - 3 yielded NEGATIVE

Family-wide PCR assays Paramyxoviruses: NEGATIVE Coronaviruses: POSITIVE

Zaki et al. N Engl J Med. 2012 Nov 8;367(19):1814-20. 6

HCoV-EMC (MERS) is the first human coronavirus in lineage C of the betacoronavirus genus. Its closest relatives are coronaviruses HKU4 and HKU5, isolated from Tylonycteris pachypus and Pipistrellus abramus bats, respectively.

A

B

C

D

The tree is based on a 408-nucleotide fragment of the open reading frame 1b.

Zaki et al. N Engl J Med. 2012 Nov 8;367(19):1814-20.

พบเชอในคางคาวไผและคางคาวลกหน

ตงแต 2006

Lessons learned : Appropriate technology,

ฐานขอมลเชอโรคในอดตชวยท าใหเขาใจ EID

WHO Collaborating Centre for Research and Training on Viral Zoonoses

MERS-CoV, Saudi Arabia

Wacharapluesadee et al. (2013) EID

Thailand bat CoV

Novel beta CoV from bat guano

8

Similarity: 76% -CoV HKU4 80%-CoV HKU5 77%- MERS-CoV

Technology: NGS

Patients: Taiwan

Meningitis was diagnosed by clinical features of fever (>38°C), headache, nuchal rigidity, abnormal CSF profile (CSF protein >45 mg/dL and leukocyte >5/mL [reference 0–5/mL]), and/or meningeal involvement noted by brain magnetic resonance imaging (MRI).

Encephalitis was diagnosed when there was evidence of brain parenchyma involvement (e.g., paralysis or focal or generalized seizure) and when the finding of brain MRI or electroencephalogram (EEG) was compatible with encephalitis. Excluded: CSF samples from meningitis or encephalitis patients with noninfectious diagnosis, including traumatic, metabolic, malignant, vascular, surgical, hypoxic, and toxic causes,

= 131 CSF sample

Positive = 31 (24%) - 25/94 (27%) of meningitis - 6 /37(16%) encephalitis Enterovirus, HSV1, HSV2 Varicella-zoster virus Epstein-Barr virus Cytomegalovirus Mycobacterium tuberculosis Escherichia coli (16 s rRNA)

= 100 CSF sample NEGATIVE Hsu CC, et al. EID 2013

= 212

= 71 Routine, 33%

21 viruses, 5 bacteria 2 fungi 1 parasite.

31 positive cases

ตดเชอ...คาดไมถง

Wilson MR et al. N Engl J Med 2014;370:2408-2417.

Sample Preparation-Key CSF 1.5 mL

Wilson MR et al. N Engl J Med 2014;370:2408-2417.

3,063,784 Sequence reads

475 reads (0.016%) corresponded to the

Leptospiraceae family

48-hour TAT for the assay

Diagnosis of Leptospira Infection by Means of Unbiased Next-Generation Sequencing (NGS).

ชดตรวจ Multiplex Real-time PCR รผลภายใน 1 ชวโมง

ชดตรวจ Multiplex Real-time PCR 15 เชอ ความไวในการตรวจ 1000 copies / mL

Lessons learned : First line diagnostic assays, ตวอยางตรวจทเหมาะสม-มากพอ

Re-emerging: Rabies

Rabies diagnosis by molecular detection

Nested –PCR Journal of Infectious Diseases 1993

Real-time PCR J Virological Methods 2006

19

4 ชวโมง 8 ชวโมง

20

นายโยซ ลาผะ อาย 33 ป เชอชาตพมา อาศยอยกบพชายท บานน าร หม 6 ต าบลเมองนะ อ าเภอเชยงดาว จงหวดเชยงใหม ท าใบขออนญาตเขาเมอง มอาชพรบจางทวไป (เดนทางเขาออกชายแดนไทย-พมา) เมอสองเดอนทแลวไดกลบไปท านาทบานลงและปาทบานน าคขน (บรเวณใกลกบบานโปงปาแขม เปนชนชาตละวา หางจากชายแดนไทยบานอรโณทย (หางจากดานชองกวผาวอก ประมาณ 1 กม) กวา 30 กม ซงการเดนทางดวยเทาใชเวลาประมาณ 9 ชวโมง แตมรถรบจางสลบกบการเดนเทา การคมนาคมหนาฝนตองใช four wheels 11/7/57 นายโยซ หอขาวไปกน ขณะพกทกระทอมรมนาหลงบาน มสนขเดนเขามาหา นายโยซ ไดหยบเศษไมเพอเขวยงไลสนขครงแรก เพอไลสนข แตสนขไมไดวงหน จงเตรยมหยบไมเพอทจะขวางครงทสอง สนขตวดงกลาวไดวงเขามากดทแขนขวาเปนแผลลกสามรอย เลอดไหล ไดไปคลนก (ฝงพมา) และฉดยา 1 เขมราคา 1,100 บาท นายโยซ อยทบานดงกลาวประมาณสองสปดาหจงกลบมาพกททฝงไทย (แวะบานญาตทบานรนหลวงเพอชวยปลกขาว แลวมาพกบานพชาย 2 – 3 วน กมรถจากโรงงานอบแหงล าไยมารบเดนทางไปท างานทอ าเภอจอมทอง จงหวดเชยงใหม 6/9/57 ไปพบแพทยทโรงพยาบาลจอมทองดวยอาการปวดทอง คลนใส อาเจยน น าลายฟมปากและจมก ปวดและชาตรงบรเวณแผลแขนดานขวา 7/9/57 น าสงโรงพยาบาลเชยงดาว 8/9/57 สงตอไปโรงพยาบาลนครพงค

Rabies import case: เชยงใหม 2557

• รพ นครพงค เกบตวอยาง CBC : wbc 16,920 ^, Neu 12,790, plt 25300, bun 47, cr 4.10 (haemoculture, Throat swab รอผล), ปมรากผม 30 เสน, ผวหนงบรเวณทายทอย, ปายกระจกตา (Cornea) สงผาน รพ ยพราช โดยรถไฟเชา วนท 10 กย 57 ถงจฬาฯ เยนผล undetectable rabies virus โดย Qualitative real time PCR ออกวนท 11 กย 57 โดยมความเหนวาควรสงเนอสมองตรวจ

• แลบ จฬา ตรวจเพมเตมวธท 2 พบผลบวกดวยวธ Conventional PCR และถอดรหสพนธกรรม เปรยบเทยบไดดงรป

• เปนไวรสโรคพษสนขบาสายพนธ ทไมเคยพบในประเทศไทย จากการรวบรวมขอมลระหวางป 2541-2545

21

การสงตรวจทางหองปฏบตการ

22

Thai rabies 1998-2002

China Rabies-China

Rabies-สนขไทย 2013-4

ผปวยพมา (ถกกดฝงพมา) มาปวยทไทย = seq-China

Philippines

Indonesia

Sri Lanka

23

ผลแลบ Rabies PCR 1. Real-time PCR: No signal, product + 2. Nested PCR: Detected

Chiang Mai

Chiang Rai

Rabies detection platform @ Chula

24

Real-time PCR

Specific primers and probe

รวดเรว

• High sensitivity

• High specificity: probe

• Fast

• Limitation: mutation/different strain

Nested PCR

แมนย า • High sensitivity

• Less specificity: product size

Sequencing

ถกตอง • High specificity

• Strain typing

Lessons learned: จบตามอง Mutation, New strain, Imported pathogens

เพอพฒนาวธการตรวจใหเหมาะสม

Unknown VS Early detection

Virulence & Pathogenicity Determination

Known Pathogen

Causing Disease

Uncharacterized Virus Causing Disease

Known Pathogen Unknown or No Disease

Uncharacterized Virus No Disease Evidence

Uncharacterized Virus Disease Unknown

Potential Pathogen Detected

….Making the “Unknown Known”

• There are ~500,000 viruses spanning 23 viral families in wildlife that have the potential to cause human infection

• This means, for every “known” Ebola virus there are likely 10-20,000 distinct “unknown” “Ebola-like” viruses of the same Filo-virus family circulating among an “unknown” pool of wild animals

• The same holds for HIV and retroviruses, SARS and coronaviruses etc.

111 viral families recognized to-date infecting all hosts around the globe

23 of these families likely contain species capable of infecting humans

~1.3 million viral species spanning the 23 viral families are estimated to be circulating in mammals and water fowl

Of these 500,000 - 700,000 viral species are likely to be of human pandemic /epidemic potential

To-date a total of 385 viruses are known to have infected humans

The Global Virome Projects presents a path to the identification all viruses in wildlife that can infect humans - so we can prepare

for them before they jump to us

From Dr.Dennis Carroll, USAID

Human-Livestock-Wildlife Interface

Land Use Change & Human Population

Growth

Increased Contact Between Humans,

Livestock, & Wildlife

Enhanced Flow of Pathogens

Health Risks to Humans, Livestock,

& Wildlife

Livelihood Impacts & Economic Pressures

• Majority of emerging infectious diseases (EIDs) in people are of animal origin (zoonotic)

• 75% of emerging zoonoses have wildlife origins

• Human activities at the interface linked to EIDs (Nipah virus, SARS, Ebola)

• Annual population growth among highest in buffers to protected areas near wildlife

DAY

CA

SES

Current Outbreak Detection and Response

Adapted from J. Davis, Climate Adaptation Workshop, Nov. 2003

First Case

Detection/ Reporting

Lab Confirmation

Response

Opportunity for control

DAY

CA

SES

First Case Detection/ Reporting

Lab Confirmation

Response

Effective Health Early Warning

Surveillance, Observations

and Monitoring Information

Adapted from J. Davis, Climate Adaptation Workshop, Nov. 2003

Opportunity for control

The Challenge

Pre-empt or combat, at their source, the first stage of emergence of zoonotic diseases that pose a significant threat to public health (potentially pandemic infections)

The goal of the PREDICT project in

Thailand is to strengthen surveillance

and diagnostics to protect human

and animal health.

• Chulalongkorn University

• Kasetsart University

• Department of National Parks,

Wildlife and Plant Conservation

(DNP)

• EcoHealth Alliance

- THAILAND

2010

Ran Over 400,000 Diagnostic Tests

Viral Detection Success

Overall 984 known and new viruses:

• 812 novel and 147 known in animals

• 3 novel and 31 known in human pilot studies

PREDICT-1 Thailand Bats, rodents, NHP, from 8 sites in Thailand Samples collected from ~800 animals

Bats, 5350

Non-human

Primates, 1205

Rodents & Shrews,

1048

~8000 Diagnostic Tests For 18 Viral Families/Genera

PREDICT – Thailand Viral Discovery

29

6 2

79

3 0

0

20

40

60

80

100

120

Bats Non-human Primates Rodents & Shrews

Known Novel

119 positive: Astro-, Corona-, Herpes-, Paramyxo-, and Rhabdoviruses

Lessons learned: พฒนาแนวทาง วธการ และศกยภาพใน...

“การคนพบเชอ กอนการระบาด”

Logistic/Budget

• เครองมอตกรนเมอมงบประมาณ • เทคโนโลยใหมๆมความซบซอนมากขน ยากทจะพฒนาโดยหนวยงานใด

หนวยงานหนงโดยล าพง - บรณาการ • เทคโนโลยพฒนาอยางรวดเรวตองเตรยมตองพรอมของบคลากร • บรษทเอกชนพฒนาเทคโนโลยและบรการเพอตอบโจทยของงานตรวจ

วนจฉย หนวยงานรฐตองปรบบทบาท • เทคโนโลย มความหลากหลาย ตองเลอกใหเหมาะสมกบงาน • การเปลยนแปลงของเชอโรคอบตใหม รวดเรว ไมบอกลวงหนา • Technology Lab Network