สัตวแพทย์มหานครสารjo ouurrn naall off mma ahhaanaakkoorrnn...

สตวแพทยมหานครสารสตวแพทยมหานครสาร JJoouurrnnaall ooff MMaahhaannaakkoorrnn VVeetteerriinnaarryy MMeeddiicciinnee

ปทปท 11 ฉฉบบบทบท 1 มกรามกราคมคม – มมถนายนถนายน 22555599

VVoolluummee 1111 NNoo.. 11 JJaannuuaarryy –– JJuunnee 22001166

IISSSSNN:: 11990055--77557711

wwwwww..vveett..mmuutt..aacc..tthh//jjoouurrnnaall__jjmmvvmm

คณะสตวแพทยศาสตร มหาวทยาลยเทคโนโลยมหานคร ไดจดท าวารสารทางวชาการขนดวย วตถประสงคเพอเผยแพรผลงานคนควาวจยทางวชาการ รวมถงกจกรรมตางๆ ทเกยวของกบสาขาสตวแพทย ศาสตร สตวบาล และสาขาทเกยวของ สงเสรมความสมพนธอนดระหวางนกวชาการทเกยวของกบว ชาชพ สตวแพทย สตวบาล และเพอเผยแพรเกยรตคณของคณะสตวแพทยศาสตร มหาวทยาลยเทคโนโลยมหานคร สานกงาน: คณะสตวแพทยศาสตร มหาวทยาลยเทคโนโลยมหานคร 140 ถนนเชอมสมพนธ เขตหนองจอก กรงเทพมหานคร 10530 โทร: 0-2988-3655 โทรสาร: 0-2988-4040

กาหนดตพมพ: ปละ 2 ฉบบ ฉบบท 1 เดอน มกราคม – มถนายน ฉบบท 2 เดอน กรกฎาคม – ธนวาคม คาสมาชก: 1 ป 140 บาท 2 ป 280 บาท 3 ป 420 บาท ตลอดชพ 1,000 บาท ราคาฉบบละ 70 บาท

สตวแพทยมหานครสารสตวแพทยมหานครสาร

JJoouurrnnaall ooff MMaahhaannaakkoorrnn VVeetteerriinnaarryy MMeeddiicciinnee

คณะทปคณะทปรรกษากษา // AAddvviissoorryy CCoommmmiitttteeee อธการบดมหาวทยาลยเทคโนโลยมหานคร President of Mahanakorn University of Technology คณบดคณะสตวแพทยศาสตร Dean of Faculty of Veterinary Medicine รองคณบดคณะสตวแพทยศาสตร Associate Dean of Faculty of Veterinary Medicine

บรรณาบรรณาธธการการ // EEddiittoorr

ผศ.น.สพ.ดร.จ าลอง มตรชาวไทย Assist.Prof.Dr.Jamlong Mitchaothai คณะสตวแพทยศาสตร Faculty of Veterinary Medicine มหาวทยาลยเทคโนโลยมหานคร Mahanakorn University of Technology

ผชวยบรรณาธการ / ผชวยบรรณาธการ / AAssssiissttaanntt EEddiittoorr

ผศ.รชกฤช เลศภทรโกมล Assist.Prof.Rachakris Lertpatarakomol คณะสตวแพทยศาสตร Faculty of Veterinary Medicine มหาวทยาลยเทคโนโลยมหานคร Mahanakorn University of Technology

กองบรรณากองบรรณาธธการการ // EEddiittoorriiaall BBooaarrdd

ผศ.สพ.ญ.ดร.จตรบรรจง เวยงเจรญ Assist.Prof.Dr.Jitbanjong Wiengcharoen คณะสตวแพทยศาสตร Faculty of Veterinary Medicine มหาวทยาลยเทคโนโลยมหานคร Mahanakorn University of Technology

น.สพ.ธนากร พจนประสาท Thanakorn Pojprasath คณะสตวแพทยศาสตร Faculty of Veterinary Medicine มหาวทยาลยเทคโนโลยมหานคร Mahanakorn University of Technology

สพ.ญ.ภควด ค าพลงาม Pakawadee Kumpolngam คณะสตวแพทยศาสตร Faculty of Veterinary Medicine มหาวทยาลยเทคโนโลยมหานคร Mahanakorn University of Technology

น.สพ.อนสรณ จาแสนชน Anusorn Jasancheun คณะสตวแพทยศาสตร Faculty of Veterinary Medicine มหาวทยาลยเทคโนโลยมหานคร Mahanakorn University of Technology

น.สพ.เกยรตชย โรจนมงคล Kiatchai Rojanamongkol คณะสตวแพทยศาสตร Faculty of Veterinary Medicine มหาวทยาลยเทคโนโลยมหานคร Mahanakorn University of Technology

รศ.สพ.ญ.ดร.นนทรกา ชนซอ Assoc.Prof.Dr.Nantarika Chansue

คณะสตวแพทยศาสตร Faculty of Veterinary Medicine จฬาลงกรณมหาวทยาลย Chulalongkorn University

ผศ.น.สพ.อดศร ยะวงศา Assist.Prof.Adisorn Yawongsa คณะสตวแพทยศาสตร Faculty of Veterinary Medicine มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตก าแพงแสน Kasetsart University, Kamphaengsaen campus

ผศ.น.สพ.ดร.สรรเพชญ องกตตระกล Assist.Prof.Dr.Sunpetch Angkittitrakul คณะสตวแพทยศาสตร Faculty of Veterinary Medicine มหาวทยาลยขอนแกน Khon Kaen University

น.สพ.ดร.วรพงศ ตงจตเจรญ Dr.Weerapongse Tangjitjaroen คณะสตวแพทยศาสตร Faculty of Veterinary Medicine มหาวทยาลยเชยงใหม Chiangmai University

ผศ.ดร.เฉลมพล เยองกลาง Assist.Prof.Dr.Chalermpon Yuangklang คณะทรพยากรธรรมชาต Faculty of Natural Resources มหาวทยาลยเทคโนโลยราชมงคลอสาน Rajamangala University of Technology Isan, วทยาเขตสกลนคร Sakon Nakhon Campus

Prof.Dr.Kazuyoshi Taya Prof.Dr.Kazuaki Takehara Faculty of Agriculture, Faculty of Agriculture, Tokyo University of Agriculture and Technology Tokyo University of Agriculture and Technology

Prof.Dr.Kazuyuki Taniguchi Assoc.Prof.Dr.Kazumi Taniguchi Faculty of Agriculture, School of Veterinary Medicine, Iwate University Kitasato University

Prof.Dr.Anton C. Beynen Faculty of Natural Resources, Rajamangala University of Technology-Isan, Sakon Nakhon campus

ฝายทะเบยนวารสารฝายทะเบยนวารสาร // JJMMVVMM MMeemmbbeerr RReeggiissttrraattiioonn

จฬาภา สอนกลน Chulabha Sonklein คณะสตวแพทยศาสตร Faculty of Veterinary Medicine มหาวทยาลยเทคโนโลยมหานคร Mahanakorn University of Technology

สพ.ญ.สวรน ภาวสทธไพศฐ Suvarin Pavasutthipaisit คณะสตวแพทยศาสตร Faculty of Veterinary Medicine มหาวทยาลยเทคโนโลยมหานคร Mahanakorn University of Technology

ฝายฝายจจดการเวบไซตดการเวบไซต // JJMMVVMM WWeebbssiittee AAddmmiinniissttrraattoorr ฟารส ชนภกด Faris Cheunpakdee

คณะสตวแพทยศาสตร Faculty of Veterinary Medicine มหาวทยาลยเทคโนโลยมหานคร Mahanakorn University of Technology

ผทรงคณวฒประจาฉบบผทรงคณวฒประจาฉบบ // IIssssuuee RReevviieewweerrss ผศ.น.สพ.ดร.เฉลมพล เลกเจรญสข ผศ.สพ.ญ.ดร.วลยพร ตนพทกษ ผศ.น.สพ.ดร.ทนงศกด มะมม ผศ.น.สพ.ดร.ส าราญ บรรณจรกล ผศ.รชกฤช เลศภทรโกมล สพ.ญ.ดร.ดานย แสงทอง น.สพ.ดร.เจษฎา รงภประดษฐ น.สพ.ดร.กฤษฎา ข าพล น.สพ.ดร.อรชน หยกจโกศล น.สพ.ดร.สทธชน รตนจนทร ดร.สนษา ศรมงคลวรกลข

บทบรรณาธการบทบรรณาธการ

สวสดผอานทกทานสวสดผอานทกทาน

วารสารสตวแพทยมหานครสารยางเขาสปท 11 แลว โดยฉบบนเปนปท 11 ฉบบท 1 ซงทางกองบรรณาธการวารสารไดพยายามมงมนพฒนาวารสารใหคณภาพสงยงขนตามล าดบ ในโอกาสนทางกองบรรณาธการวารสารขอแจงนกวชาการ นกวจย ผอาน และสมาชกของวารสารทกทาน ใหทราบวาในฉบบถดไปทางวารสารจะจดพมพในรปแบบอเลกทรอนกสเทานน เพอรวมอนรกษพลงงานและสอดคลองกบสถานการณการจดท าวารสารในปจจบน โดยจะมองคประกอบของวารสารครบเหมอนเชนเคย ทงนสามารถเขาถงไดจาก http://www.vet.mut.ac.th/journal_jmvm

วารสารฉบบนมบทความทนาสนใจหลากหลายเรอง ซงทางกระผมและกองบรรณาธการของวารสารหวงเปนอยางยงวา ทานผอานทกทานจะไดรบความรทน าไปใชประโยชนตอไปได

สดทายนกระผมและกองบรรณาธการ ขออาราธนาคณพระศรรตนตรยอ านวยพรใหทานผอานทกทาน จงประสบแตความสข ความเจรญ ความกาวหนาในหนาทการงาน มสขภาพกายและใจแขงแรง และมครอบครวทอบอน

จาลอง จาลอง มตรชาวไทยมตรชาวไทย

บรรณาธการบรรณาธการ

สตวแพทสตวแพทยยมหานครสารมหานครสาร

ปท ปท 1111 ฉบบท ฉบบท 11 มกรามกราคม คม –– มถนายนมถนายน 25525599

IISSSSNN:: 11990055 –– 77557711 wwwwww..vveett..mmuutt..aacc..tthh//jjoouurrnnaall__jjmmvvmm

สารบญสารบญ บทความวจยบทความวจย

ความชกของเชอกอโรคทน าโดยเหบในสนขทดานกกกนสตว จงหวดนครพนม อมรรตน เจอสข ธดารตน บญมาศ ปราณ ศรราช รชฎาวรรณ อรรคนมาตย ธราดล จตจกร ภคญาณ สดสาร อโณทย แพทยกจ ศรนทพย บญจรสภญโญ และวนชย มาลวงศ ........................................................ 1

การตรวจหาความเรวสงสดในการวงเรยบ ทรางกายสามารถรกษาระดบแลคเตทในกระแสเลอดใหคงท ในมาลกผสมพนเมองของไทย

พฒนพร ถาวรพฒนพงศ อารย ไหลกล ขนษฐา เพชรอดมสนสข วชรพล ปฐมสกลวงศ ณฐพล ภาณเสวกล และวรกจ เชดชธรรม .................................................................................................................................................... 11

การศกษาลกษณะและการแสดงออกของรปแบบโปรตนในปทะเล (Scylla serrata) ทมอาการอกทองแดงระยะแรก

ภทราวด ศรมเทยน และสรยน ธญกจจานกจ ............................................................................................................... 23

การตรวจหาเชอ Brucella melitensis โดยวธ Real-time PCR และวธการเพาะแยกเชอจากตวอยางอวยวะของแพะเนอในประเทศไทย

ลขณา รามรน เรขา คณตพนธ มนยา เอกทตร และองอาจ เลาหวนจ ......................................................................... 35

การยอยไดของโภชนะไขมนโครงสรางทมกรดสเตยรกและกรดปาลมมตกเปนองคประกอบในสนข เฉลมพล เยองกลาง ไกรสทธ วสเพญ ศศพนธ วงศสทธาวาส และ Anton C. Beynen .............................................. 47

บทความวชาการบทความวชาการ การสญเสยแคปซลของเชอ Streptococcus suis

ณฐกานต มขนอน ......................................................................................................................................................... 57

JJoouurrnnaall ooff MMaahhaannaakkoorrnn VVeetteerriinnaarryy MMeeddiicciinnee

VVoolluummee 1111 NNoo.. 11 JJaannuuaarryy –– JJuunnee 22001166

IISSSSNN:: 11990055 –– 77557711 wwwwww..vveett..mmuutt..aacc..tthh//jjoouurrnnaall__jjmmvvmm

CCoonntteennttss RReesseeaarrcchh aarrttiiccllee

Prevalence of Tick-borne Pathogens in Quarantined Dogs at Nakornpranom Animal Quarantine Station, Thailand

Amornrat Juasook, Thidarut Boonmars, Pranee Sriraj, Ratchadawan Aukkanimart, Tharadol Jitjuk,

Pukkayanee Sudsarn, Anothai Phaetkit, Sirintip Boonjaraspinyo and Wanchai Maleewong ..................... 1

Determination of the Maximal Lactate Steady State Speed of Trotting in Crossbred Native Thai Ponies

Pattanaporn Thawornpattanapong, Aree Laikul, Kanittha Phetudomsinsuk, Watcharapol Pathomsakulwong,

Nuttapon Phanusaweekul and Worakij Cherdchutham .................................................................................. 11

Characters and Protein Profile in the First Stage of Mud Crab (Scylla serrata) Infected by Red Sternum Syndrome

Pattarawadee Srimeetian and Suriyan Tunkijjanukij ......................................................................................... 23

Detection of Brucella melitensis Using Real-time PCR and Isolation from Organs of Meat Goat in Thailand

Luckana Ramrin, Reka Kanitpun, Monaya Ekgatat and Ongard Lawhavinit................................................. 35

Digestibility of a Structural Fat Consisting of Stearic and Palmitic Acid in Dogs Chalermpon Yuangklang, Kraisit Vasupen, Sasiphan Wongsuthavas and Anton C. Beynen .................... 47

RReevviieeww aarrttiiccllee Loss of Capsule in Streptococcus suis

Nattakan Meekhanon .............................................................................................................................................. 57

ขอแนะนาสาหรบผเขยนขอแนะนาสาหรบผเขยน

วตถประสงคและขอบเขตของเนอหา วตถประสงคและขอบเขตของเนอหา ((AAiimm aanndd SSccooppee))

สตวแพทยมหานครสารเปนวารสารทางวชาการของคณะสตวแพทยศาสตร มหาวทยาลยเทคโนโลยมหานคร จดท าขนเพอเผยแพรผลงานการคนควาวจยทางวชาการทเกยวของกบสตวแพทยศาสตร สตวศาสตร และวทยาศาสตรทเกยวของกบการผลตสตว โดยเนอหาจะครอบคลมตงแตระดบโมเลกลและเซลล วทยาศาสตรพนฐาน ชววทยาของสตว พฤตกรรมสตว พชอาหารสตว วทยาศาสตรการผลตสตว วทยาศาสตรการสตวแพทย (พนฐาน พรคลนก และคลนก) ระบาดวทยาในสตว สตวแพทยสาธารณสข และวทยาศาสตรเนอสตว ตลอดจนวทยาศาสตรและเทคโนโลยแขนงอนๆ ทมโอกาสในการพฒนาและ/หรอประยกตใชในวทยาศาสตรทเกยวของกบสตวได

คาแนะนาสาคาแนะนาสาหรบการเตรยมบทความหรบการเตรยมบทความ กองบรรณาธการวารสาร สตวแพทยมหานคร

สาร ยนดรบเรองจากทกทานทใหความสนใจ และกรณาสงมาเพอเผยแพร ดงนนเพอความสะดวกในการพจารณา กองบรรณาธการมขอเสนอแนะดงน

11.. เรองทจะนาสงลงตพมพเรองทจะนาสงลงตพมพ 1.1 บทความวจย (Research article หรอ

Original article) เปนงานคนควาทดลอง หรองานวจยทางวชาการทเกยวกบสตวหรอพชอาหารสตว ทงทท าในประเทศและ/หรอตางประเทศ

1.2 บทความวจยขนาดสน (Short communication) เปนรายงานผลการวจย หรอผลงานทดลองทางดาน

วทยาศาสตรทเกยวของกบสตว เพอการเผยแพรโดยสงเขป หรอเพอการน าเสนอประเดนทคนพบใหมโดยเผยแพรเฉพาะสวนส าคญอยางกระชบ

1.3 รายงานสตวปวย (Case report) เปนรายงานทไมเคยตพมพมากอนและเกยวของกบโรคหรอปญหาทพบในสตว ซงทางกองบรรณาธการพจารณาเหนประโยชนตอทางวชาการสตวแพทย

1.4 บทความวชาการ (Review article) เปนบทความหรอยอเอกสารท เปนประโยชน และเกยวของกบวชาการทางสตวแพทย สตวบาล และสาขาทเกยวของทกสาขา โดยการรวบรวมและเรยบเรยงจากเอกสารทางวชาการ

1.5 บทความปกณกะ (Miscellany article) เปนบทความทเกยวกบการใหขอมลทางวชาการส าหรบผปฏบตงานทเกยวของกบสตว เชน ปรศนาสตวปวย ปรศนาเซลลวทยาวนจฉย

22.. ตนฉบบตนฉบบ 2.1 ตนฉบบทจะสงมาลงพมพตองไมเปนเรองท

เคยตพมพ หรอก าลงอยระหวางพจารณาเพอลงในหนงสอหรอวารสารอน

2.2 ต น ฉ บ บ พ ม พ เ ป น ภ า ษ า ไ ท ย ห ร อภาษาองกฤษ ดวยอกษร Browallia new 16 บนกระดาษขาวเอ 4 เวนขอบกระดาษดานซาย และดานบน 1.5 นว ดานขวาลาง และดานลาง 1 นว โดยความยาวของเรองพรอมตารางและภาพประกอบรวมแลว ไม เกน 12 หนา และให ใสหมายเลขหนาตามล าดบ โดยพมพดวยโปรแกรม Microsoft Word (Window 98 หรอเวอรชนทสงกวา)

2.3 หากตนฉบบทจะสงมรปภาพประกอบดวย ใหแทรกรปภาพดงกลาวในต าแหนงทเหมาะสมในตนฉบบ และ Save ไฟลตนฉบบของรปภาพทมความละเอยดสงลงในแผนซดขอมลแยกจากไฟลตนฉบบ โดยตงชอไฟลของรปภาพใหสามารถสอบทวนไดวาเปนรปภาพใดในตนฉบบ

2.4 ไมมการสงคนตนฉบบ ในกรณทไมผานการพจารณาแตจะแจงใหทราบ

33.. การลาดบเรองควรเรยงดงนการลาดบเรองควรเรยงดงน 3.1 ชอเรอง (Title) ควรตงชอใหสอดคลอง สอ

ความหมายไดดกบเนอหาในเรอง 3.2 ชอผเขยนและผรวมเขยน (Author and Co-

authors) เขยนช อนามสกลเตมท งภาษาไทยและภาษาองกฤษใตชอเรอง พรอมทงสถานทท างานทตดตอไดสะดวก และกรณาบอกหมายเลขโทรศพทหรอโทรสาร และ E-mail ของผรบผดชอบ (Corresponding author) เพอความรวดเรวในการตดตอ โดยใหระบอยใตค าส าคญ

3.3 บทคดยอ (Abstract) เข ยนส นๆ ให ไดเนอความครอบคลมท งหมด ในกรณทตนฉบบภาษาไทยจะตองมช อ เร องและบทคดยอ เปนภาษาองกฤษ และตนฉบบภาษาองกฤษตองมชอเรองและบทคดยอเปนภาษาไทย บทคดยอใหเขยนไวหนาสดทายของเรองเปนหนาหนงตางหาก

3.4 ค าส าคญ (Keywords) เปนค าหรอขอความสนๆ ทมความหมายแสดงถงความเปนไปของการทดลองนนๆ รวมกนแลวไมเกน 5 ค า ระบอยใตบทคดยอ (ขนบรรทดใหม ) ท งภาษาไทยและภาษาองกฤษ

3.5 บทน า ( Introduction) บ ร ร ย ายคว ามเปนมา และควรมการตรวจเอกสาร (Literature

review) ประกอบดวย รวมทงอธบายถงจดประสงคของการทดลอง

3.6 อปกรณและวธการ (Materials and Methods) ในกรณท เปนการคดคนขนใหมควรอธบายอยางละเอยด ถาเปนวธการททราบกนอยแลวและเคยมผตพมพแลว ไมตองบรรยายซ าควรเขยนในลกษณะอางอง และอธบายเฉพาะสวนทดดแปลงหรอเพมเตม พรอมทงวธวเคราะหผลการทดลองทางสถตดวย

3.7 ผลการทดลอง (Results) การรายงานผลการทดลองเปนค าบรรยายควรใหละเอยดและเขาใจงาย หากเปนไปไดควรเสนอผลในรปตาราง รปภาพ หรอกราฟ ไมควรแสดงถงผลทเหมอนกน ถาเปนตารางควรใหชดเจนและขนาดพอเหมาะกบขนาดของหนาหนงสอ ตารางควรมความหมายในตวเอง และตองมค าอธบายเหนอตารางดวย ในกรณท เปนรปภาพ (Figures) ควรเปนภาพขาวด าหรอสไลด หากตองการใหตพมพภาพส ทางคณะผจดท าจะพจารณาถงความเหมาะสมและคาใชจาย หากมหลายรปตองเรยงล าดบกอนหลงพรอมทงมเครองหมายก าหนดบอกดานบนของรปดวยดนสอ และอธบายรายละเอยดไวใตรป ค าอธบายประกอบรปภาพและตาราง รวมท งองคประกอบในตารางและร ปภาพให ใช เป นภาษาองกฤษทงหมด โดยรวบรวมและเรยงตามล าดบใหสอดคลองกบหมายเลขของรปภาพและตารางทน าเสนอ ควรระบความหมายของสญลกษณทใช ในกรณทก าหนดเครองหมายแสดงความแตกตางอยางมนยส าคญทางสถต ใหก ากบ P-value ทใชในการวเคราะหผลการทดลอง ทงนการกลาวถงคา P-value ในเนอหาของบทความใหใชอกษรภาษาองกฤษตวพ

ตวใหญเอยง เชน P-value, P0.05 และ P>0.05 3.8 วจารณ (Discussion) เปนการวจารณผล

การทดลอง การประเมนผล และการตคาของผลงาน

การวจารณผลควรเปรยบเทยบกบผลงานของผอนทไดกระท ามาแลว และควรเนนถงสงทไดคนพบ

3.9 สรป (Conclusion) อาจมหรอไมกได หากเปนบทความ การตรวจเอกสาร หรอเปนการทดลองทมหลายขอ ควรมบทสรปทเขยนใจความส าคญและคณคาของงานเพอผอานจะไดเขาใจมากขน

3.10 กตตกรรมประกาศ (Acknowledgement) ควรมในกรณทไดรบความชวยเหลอหรอความรวมมอในการสนบสนนงานคนควาวจย

3.11 เอกสารอางอง (References)

44.. การเขยนอางองในเนอเรองควรอางองการเขยนอางองในเนอเรองควรอางอง

ดงน ดงน - การอางองให เขยนเปนภาษาองกฤษ

ทงหมด ทงการอางองในเนอหาบทความ และในสวนของเอกสารอางองดานทายบทความ โดยหากเนอหาของเอกสารทน ามาใชอางองเขยนเปนภาษาอน ทไมใชภาษาองกฤษ ใหเขยนอางองเปนภาษาองกฤษ พรอมระบภาษาทใชเขยนในบทความนนๆ ไวในวงเลบดานทายสดของรายการเอกสารอางองนนๆ ตวอยางเชน Mitchaothai, J., Wiengchareon, J.,

Chaiworaporn, J., Srenanuan, P. and Yuangklang, C. 2005. Balantidiasis in growing pigs: A case report. KKU. Vet. Journal. Vol.15 No.1: 166-174. (in Thai)

{ ซงเปนตวอยางทอางองมาจากบทความภาษาไทย : จ าลอง มตรชาวไทย จตรบรรจง เวยงเจรญ จฑามาศ ชยวร

ภร ไพวลย ศรนานวล และ เฉลมพล เยองกลาง. 2548. ภาวะการตดเชอ Balantidium ในสกรรน: รายงานสตวปวย. วารสารสตวแพทยศาสตร มข. 15 (1): 166-174. }

- กรณอางองจากการตรวจเอกสารโดยผอนใหใช ค าวา อางถงโดย (Cited by) - ผรายงานเอกสารทงทเปนคนไทยและชาว

ตางประเทศ เมอเปนประธานของประโยคใหใช Mitchaothai et al. (2005), Tomato and Danny (2006), Taylor et al. (2006) หรอเมอผรายงานอยกลางและทายประโยคใหใช (Mitchaothai et al., 2005), (Tomato and Danny, 2006), (Taylor et al., 2006) ตามล าดบ โดยหากในประโยคหรอสวนของประโยคทมเอกสารอางองมากกวาหนงเอกสารใหคนระหวาเอกสารดวยเครองหมาย “ ; ”) - อางถงบคคล หรอเรองทไมเคยตพมพมา

กอน (Personal comm.) ใหอางเฉพาะในเนอเรองเทานน ไมตองน าไปลงในรายชอเอกสารอางอง - การเขยนเอกสารอางองทายบทความ ให

เขยนเรยงล าดบพยญชนะภาษาองกฤษของชอสกล ตามดวยชอยอของผแตง (หากมผแตงมากกวาหนงคน ใหคนระหวางผแตงดวยเครองหมาย “ , ”) ดงตวอยาง คอ Mitchaothai, J., Everts, H., Yuangklang, C.,

Wittayakun, S., Vasupen, K., Wongsuthavas, S., Srenanul, P., Hovenier, R. and Beynen, A.C. 2008. Digestion and deposition of individual fatty acids in growing-finishing pigs fed diets containing either beef tallow or sunflower oil. J. Anim. Physiol. Anim. Nutr. 92 (4): 502-510. - หากเอกสารอางองเปนต ารา ใหระบชอผเขยน

ปท พมพ ช อเร อง ช อต ารา คร งท พมพและช อบรรณาธการ (หากม) ส านกพมพ เมองทพมพ และจ านวนหนาทงหมด ดงตวอยาง คอ

Mamom, T. 2008. Basic Veterinary Histopathology and Practice. 1sted. Mahanakorn University of Technology publishing. Bangkok. 227 p.

{ ซงเปนตวอยางทอางองมาจากหนงสอภาษาไทย : ทนงศกด มะมม. 2551. ต าราจลพยาธวทยาขนพนฐานทาง

สตวแพทยและบทปฏบตการ (Basic Veterinary Histopathology and Practice). พมพครงท1. ส าน กพ มพ มหาว ทยาล ย เทคโนโลย มหานคร . กรงเทพมหานคร. 227 หนา. } - หากเอกสารอางองเปนบทความจากการ

ประชมวชาการ (Conference proceedings) ใหระบชอผเขยน ปทพมพ ชอเรอง ชอการประชมวชาการ สถานทจดประชม วน-เดอน-ปทประชม ส านกพมพ และเลขทหนาของบทความ ดงตวอยาง คอ Lertpatarakomol, R., Mitchaothai, J.,

Trairatapiwan, T. and Lukkananukool, A. 2010. Preliminary survey on intestinal parasite infestation in natural Thai indigenous beef cattle from Kanchanaburi province at a slaughterhouse. Proceedings of the 14th Asian-Australasian Association of Animal Production Societies (AAAP), Pingtung, Taiwan, ROC, 23-27 August 2010: 468.

- หากเอกสาร อ าง อ ง เป นบทความจาก

อนเตอรเนท (Internet) ใหระบชอผเขยน ปทเผยแพรทางอนเตอรเนท (สบคนขอมลเมอ วน-เดอน-ป) ชอเรอง ชอการประชมวชาการ สถานทจดประชม วน-

เดอน-ปทประชม ส านกพมพ และเลขทหนาของบทความ ดงตวอยาง คอ Mitchaothai, J., Yuangklang, C., Wittayakun, S.,

Vasupen, K., Wongsuthavas, S., Srenanul, P., and Beynen, A.C. 2005 (cited 21 December 2010). Mathematical modelling between Pork Colour and Pork and Carcass Qualities in commercial finishing pigs. Available from: http:// www.scisoc.or.th/stt/31/ sec_f/paper/stt31_F0043.pdf.

55.. การพจารณาบทความการพจารณาบทความ บทความทกบทความทลงตพมพในวารสารสตว

แพทยมหานครสาร เปนบทความทผานการพจารณาจากผทรงคณวฒทเชยวชาญ (Referees) ส าหรบแตละสาขาอยางนอย 2 ทานตอบทความ ยกเวนบทความปกณกะผานการพจารณาจากผทรงคณวฒทเชยวชาญอยางนอย 1 ทาน

66.. การสงตนฉบบบทความการสงตนฉบบบทความ เอกสารทตองสง คอ บทความตนฉบบจรง ทจดเตรยมตามค าแนะน าส าหรบผเขยน วธการสงบทความ คอ สงผานระบบออนไลน ไดท http://www.vet.mut.ac.th/journal_jmvm

77.. ชอชอ--ทอย สาหรบตดตอวารสารทอย สาหรบตดตอวารสาร บรรณาธการ สตวแพทยมหานครสาร คณะสตวแพทยศาสตร มหาวทยาลยเทคโนโลยมหานคร 140 ถ. เชอมสมพนธ เขตหนองจอก กรงเทพมหานคร 10530 โทร. 0-2988-3655 ตอ 5102-3, โทรสาร 0-2988-4040

หมายเหต 1. ชอทางวทยาศาสตรทงภาษาองกฤษและทบศพทภาษาไทยใหพมพโดยใชตวอกษรเอยง 2. ไมมคาเรองลงพมพและผเขยนตองรบผดชอบคาพมพภาพส หากเปนความตองการของผเขยน และ

ผเขยนผรบผดชอบทกเรองจะไดรบส าเนาพมพ 3. ความคดเหนใดๆ ทลงตพมพในวารสารสตวแพทยมหานครสารในแตละฉบบเปนของผเขยน ไมจ าเปน

ทกองบรรณาธการของวารสารฯ และผทรงคณวฒตองเหนดวยเสมอไป

บทความวจย

สตวแพทยมหานครสาร

JOURNAL OF MAHANAKORN VETERINARY MEDICINE

Available online: www.vet.mut.ac.th/journal_jmvm

ความชกของเชอกอโรคทนาโดยเหบในสนขทดานกกกนสตว จงหวดนครพนม

อมรรตน เจอสข1 ธดารตน บญมาศ2,# ปราณ ศรราช3 รชฎาวรรณ อรรคนมาตย2,3 ธราดล จตจกร5

ภคญาณ สดสาร2 อโณทย แพทยกจ5 ศรนทพย บญจรสภญโญ4 และวนชย มาลวงศ2

1คณะสตวแพทยศาสตร มหาวทยาลยมหาสารคาม มหาสารคาม 44000

2ภาควชาปรสตวทยา คณะแพทยศาสตร มหาวทยาลยขอนแกน ขอนแกน 40002 3มหาวทยาลยเทคโนโลยราชมงคลอสาน วทยาเขตสกลนคร สกลนคร 47160

4ภาควชาเวชศาสตรชมชน คณะแพทยศาสตร มหาวทยาลยขอนแกน ขอนแกน 40002

5คณะเกษตรศาสตร มหาวทยาลยราชภฎสกลนคร สกลนคร 47000

บทคดยอ: เพอเปนการศกษาความชกของเชอกอโรคทนาโดยเหบในสนข ณ ดานกกกนสตว จงหวดนครพนม

ชวงเดอนกนยายน พ.ศ.2556 สนขเรรอนและสนขบานจานวน 5% (43 ตว) ทดานกกกนสตว จงหวดนครพนม ไดถกเกบตวอยางเลอดในสาร EDTA และนามาสกดดเอนเอเพอตรวจหาเชอ Babesia sp., Erlichia sp. และ

Hepatozoon sp. ดวยเทคนคปฏกรยาลกโซโพลเมอรเรส ผลการศกษาพบวา 29 ตวอยางจาก 43 ตวอยาง

ตดเชอกอโรคท เ กดจากเหบเพยงชนดเดยวคอ B. canis (10.35%), E. canis (13.80%) และ H. canis

(65.50%) อกทงพบการตดเชอรวมกนระหวาง E. canis และ B. canis เปน 3.45% และการตดเชอรวมกน

ระหวาง E. canis และ H. canis เปน 3.45% การศกษานแสดงใหเหนวาเชอกอโรคทนาโดยเหบในสนขยงคง

เปนปญหาดานสขภาพของสนขทดานกกกนสตว จงหวดนครพนม ซงเปนสาเหตใหเกดการปวยและเสยชวตได

ดงนนจงมความจาเปนตองทาการรกษาเมอพบสตวปวยอกทงตองมแนวทางการปองกนโรคทเกดจากเหบเปน

พาหะดวย

คาสาคญ: สนข บาบเซย เออรลเคย เฮปาโตซน นครพนม #ผรบผดชอบบทความ สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 1-9. E-mail address: [email protected], [email protected]

อมรรตน เจอสข และคณะ / สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 1-9.

2

Prevalence of Tick-borne Pathogens in Quarantined Dogs at

Nakornpranom Animal Quarantine Station, Thailand

Amornrat Juasook1, Thidarut Boonmars2,#, Pranee Sriraj3, Ratchadawan Aukkanimart2,3, Tharadol Jitjuk1, Pukkayanee Sudsarn 2, Anothai Phaetkit5, Sirintip Boonjaraspinyo4 and

Wanchai Maleewong2

1Faculty of Veterinary Sciences, Mahasarakham University, Mahasarakham 44000, Thailand

2 Department of Parasitology, Faculty of Medicine, Khon Kaen University, Khon Kaen 40002, Thailand 3Rajamangala University of Technology Isan Sakonnakhon Campus, Sakonnakhon, 47160, Thailand

4Department of Community Medicine, Faculty of Medicine, Khon Kaen University, Khon Kaen 40002, Thailand 5Faculty of Agriculture, Sakon Nakhon Rajabhat University, Sakon Nakhon 47000, Thailand

Abstract: To know the prevalence of tick-borne pathogens in quarantined dogs at

Nakhonpranom animal quarantine station, Nakornpranom province, Thailand during

September, 2013. About 5% (43 dogs) of EDTA-blood from stray and domestic dogs in

Nakhonpranom animal quarantine station were collected and extracted DNA for detection of

Babesia sp., Erlichia sp. and Hepatozoon sp. using conventional polymerase chain reaction

(PCR). The result found that 29 out of 43 were infected with tick borne pathogens. There were

single infection with B.canis (10.35%), E.canis (13.80%) and H.canis (65.50%). Co-infection with

B.canis, E.canis and H.canis was 3.45%, co-infection with E.canis and B.canis was 3.45% and co-infection with E.canis and H.canis was 3.45%. This study suggests that tick-borne pathogens

remain the health problem in dog which may cause of sick and death at Nakhonpranom

animal quarantine station, Thailand. Therefore, treatment and prevention of tick-borne disease

are extremely needed.

Keywords: Dogs, Babesia, Hepatozoon, Ehrlichia, Nakhonpranom #Corresponding author J. Mahanakorn Vet. Med. 2016. 11(1): 1-9. E-mail address: [email protected], [email protected]

Introduction

Ticks are the most important

ectoparasites in temperate climates (Bryson et

al., 2000; Gray et al., 2013). These

ectoparasites cause significant damages to the

hosts during the feeding process, such as


3

blood loss and dilacerations of tissues due to

mechanical action of mouthparts of ticks, in

addition to being vectors of several pathogens,

which cause serious harms to animals and

public health. The recognized tick-borne

diseases for dogs that transmitted by the main

vector, Rhipicephalus sangiuneus are

babesiosis, hepatozoonosis and ehrlichiosis (Coutinho et al., 2005; Demma et al., 2005;

Dantas-Torres, 2008). The majority of patients

with these diseases cause a mild sickness or

asymptomatic case but some develop severe

sickness that may result in death. Therefore,

rapid diagnostic technique with more

sensitivity, specificity and reproducibility are

needed for early treatment (Krause et al.,

1996). In general, laboratory method for tick-

borne diseases diagnosis is microscopic

examination of stained blood smears but it has

very limited sensitivity and cannot be

distinguished by visual identification. Thus,

molecular techniques have become the preferred method for detection of tick-borne

blood parasites in vertebrates (Matjila et al.,

2008; Irwin, 2009; Abd Rani et al., 2011;

Laummaunwai et al., 2014). This technique

can use for diagnose and differentiate various

tick-borne parasites and has a sensitivity tool

in asymptomatic case for early treatment

(Moraes et al., 2014).

The aim of this study was to investigate the prevalence of canine tick-borne

pathogens (Babesia canis, Hepatozoon canis

and Ehrlichia canis) in domestic dogs from

Nakhonpranom animal quarantine station,

Nakornpranom province, Thailand by using

microscopic examination and conventional

polymerase chain reaction (PCR).

Materials and Methods

Specimen collection

EDTA-blood of 43 domestic dogs from

Nakornpranom province at latitude 17o

23’7.34”, 104o 45’56.15” were collected and

then processed for Giemsa’s staining and DNA extraction.

Fig. 1 The Nakornpranom quarantine unit (A) domestic and stray dogs in quarantine unit (B)

blood collection (C).


4

Microscopic examination

To perform Giemsa’s straining slides,

fresh bloods were thin smear and fixed with

absolute methanol for 1 minute and

subsequently stained with 2.5% Giemsa in

phosphate buffer, pH 7.2, for 30-60 minutes,

and then rinse with tap water. Tick-borne

pathogens were examined on the thin blood film under a light microscope. The

morphology of the blood parasite was

identified as shown in Fig. 2.

Conventional polymerase chain reaction (PCR)

0.5 ML of EDTA blood of each sample

was used for DNA extraction. In brief,

hemolytic buffer was added to the EDTA

blood and then centrifuged at 12,000 rpm for

10 min. One hundred μl. of 0.5% PK and 0.1%

SDS in TE buffer was added and incubated at

60 0C for 1 hr. After that, 100 μl. of 1:1 of

chloroform and phenol was added and then

precipitated with 10% of 2.5M sodium acetate

and 2.5X ethyl alcohol. The reaction was

incubated at -200C overnight and then

centrifuged at 12,000 rpm for 10 min. and

then washed with 75% ethyl alcohol. Twenty

μl. of distilled water was added and the DNA

concentration was measured with Nano-drop

technology (Nanodrop2000®, USA).

All samples were confirmed the result using conventional PCR for genus and species

diagnosis. The analysis was carried out by the

Department of Parasitology, Faculty of

Medicine, Khon Kaen University using a

modified method previously (Moraes et al.,

2014). The PCR mixture contained 10 μl of

PCR master mix 1 μl of 5mM dNTP, 1 μl

of MgCl2, 0.2 μl of Taq polymerase

(Fermentus® Germany) 1 μl of primer pair

mix consisting of 5 pmol/μl each primer, and

6 μl of distilled water. PCR condition was

95°C for 10 min, 1 cycle at 95 °C for 1 min,

Fig. 2 The morphology of tick-borne pathogens from microscopic observation. The

representative picture of E. canis reside in the membrane-lined cytoplasmic vacuoles of

infected leukocytes in dog. Within the cytoplasmic vacuoles Ehrlichia form morulae (A)

merozoite form of Babesia spp. in red blood cell (B) and ellipsoidal-shaped gamont of H. canis

in the cytoplasm of a leukocyte (C).


5

60°C for 30 sec, and at 72 °C for 1 min, 35

cycles. Primers for B. canis , H. canis and E.

canis were designed as follows: B. canis

(GenBank accession no. JQ613105) 5’-CAGGG

CTAATGTCTTGTAATTGG-3’ and 5’-ATTTCTCT

CAAGCTCCTGAAGG-3’; 557 bp, H. canis

(GenBank accession no. AF176835.1) 5’-TTAA

CGGGGGATTAGGGTTC-3’ and 5’-CGGCCTGCTA GAAACACTCT-3’; 437 bp, E. canis (GenBank

accession no. AY205342.1) 5’-CCATAAGCATAG

CTGATAACCCTGTTACAA-3’ and 5’-TGGATAATA

AAACCGTACTATGTATGCTAG-3’; 380 bp

(Laummaunwai et al., 2014). Specific band of

each primer was observed and photographed

as shown in Fig. 3.

Fig. 3 The representative specific bands of B. canis (lane 1), E. canis (lane 2) and H. canis

(lane 3). (M; marker)

Results

Detection of tick-borne pathogens by

microscopic examination

Out of 43 samples, 19 were detected

positive for blood parasites by microscopic

examination. The highest positive rate was H.

canis (32.56%), E. canis (4.56%), B. canis

(2.33%), B. canis co-infection with E. canis

(2.33%) and E. canis co-infection with H. canis

(2.33%) respectively. There were no found B.

canis co-infection with H. canis and co-

infection with all of three blood protozoon.

Fig. 4 The percentage of tick borne pathogen

DNAs in EDTA blood using PCR technique.

Detection of tick-borne pathogens by PCR

technique

Tick blood parasites were found in 29

samples by PCR technique, the positive

samples were 19 samples of H. canis (67%), 4

samples of E. canis (14%), 3 samples of B.

canis (10%), 1 sample of B. canis co-infection

with E. canis (4%), 1 sample of E. canis co-

infection with H. canis (3%) and 1 sample was

co-infection with all of these parasites (3%) respectively (Fig. 4). The diagnostic of tick-

borne pathogen using PCR technique showed

higher positive rate (67.44%) when compared

with microscopic examination (44.19%) (Table

1 and 2) resulting to PCR method showed


6

negative rate less than blood smear

technique (32.55% and 55.8% respectively).

Table 1. Comparison of tick-borne pathogens

positive samples examined by microscopic

examination and PCR technique (N=43)

Positive

samples

Microscopic

examination

PCR

technique

n 19 29

% 44.19 67.44

Discussion

In present study, microscopic

examination and PCR technique are useful to

diagnostic the epidemiology of canine tick-

borne pathogens. The identification of thin

blood film is often used for detection of

blood parasite morphology in practical

laboratory because of it is a rapid diagnostic

method. However, the accuracy of this

method relies on the training and skill of

technician and parasites are not revealed in

early infection (Krause et al., 1996). PCR

method is a sensitivity tool for blood

diagnosis in current study which showed higher positive rate than traditional

identification. Therefore, molecular assay

could be advantage as an alternative way and

a sensitivity method in asymptomatic case for

early treatment, prevention and control in

prevalence region.

From this result, the highest prevalence

rate of tick-borne pathogens at Nakhon-

pranom animal quarantine station, Thailand

was canine hapatozoonosis, ehrlichiosis and

Table 2. Examination of tick-borne pathogens by microscopic examination and PCR technique

(N=43)

Pathogens Microscopic examination PCR technique

% (n) % (n)

Positive B. canis 2.33 (1) 6.97 (3)

Positive E. canis 4.65 (2) 9.30 (4)

Positive H. canis 32.56 (14) 44.19 (19)

Positive B. canis and E. canis 2.33 (1) 2.33 (1)

Positive B. canis and H. canis 0.00 (0) 0.00 (0)

Positive E. canis and H. canis 2.33 (1) 2.33 (1)

Positive B. canis, E. canis and H. canis 0.00 (0) 2.33 (1)

Negative B. canis, E. canis and H. canis 55.8 (24) 32.55 (14)


7

babesiosis respectively. The highest

prevalence of hepatozoonosis in this area

confirmed that H. canis is innate tick-borne

parasite to Thailand (Jittapalapong et al.,

2006). Hepatozoonosis transmit to dogs by

the ingestion of tick containing Hepatozoon

canis mature oocyst (Baneth, 2011; O'Dwyer,

2011). H. canis infects leukocytes and parenchymal tissues of its host and affects

the haematological system organs such as

spleen, lymph nodes and bone marrow, and

it causes the abnormality such as increased

white blood cell number, stiffness, pain,

weight loss, lethargy, anemia and fever;

although generally chronic or mild disease,

the infection can be life-threatening in severe

clinical manifestations associated with high

parasitemia level (Baneth and Weigler, 1997).

The diagnosis of H. canis infection is usually

performed by cytology of blood but this

method may not be sensitive (Otranto et al.,

2011). Babesiosis, the disease caused by the Babesia parasite, is most common among

vertebrates (dogs, cattle, horses, rodents)

including (though rarely) humans (Homer et

al., 2000). Canine babesiosis is characterized

by fever, anemia, hemoglobinuria, thrombo-

cytopenia, jaundice, and functional disorders

of organs (Solano-Gallego and Baneth, 2011).

Moreover, an obligate intracellular bacterium

of the family Anaplasmataceae and gram-

negative coccobacilli are best known for their

etiological agency in the transmission of a

group of tick-borne illnesses known as

ehrlichiosis. All members of the

genus Ehrlichia are pathogenic, causing mild

to severe symptoms, specifically in humans

and canines. The most commonly clinical

signs in dog are weight loss, anorexia, pale

mucous membranes, high fever, lethargy, lymphadenopathy and splenomegaly

(Skotarczak, 2003; Harrus and Waner, 2011; De

Tommasi et al., 2013; Aktas et al., 2015).

From stained blood smear and PCR

technique results indicated that canine tick-

borne disease is remaining the health

problem in dog which may cause of sick and

death at Nakhonpranom animal quarantine

station, Thailand. Therefore, a sensitivity

diagnostic method for early treatment and

prevention of tick-borne disease are needed.

Moreover, tick population control should be

conducted in dog and environment in this

region also.

Acknowledgments

This work was supported by a grant

from Thailand Research Fund (RTA5580004)

and we also wish to thank the Department of

Research Affairs Faculty of Medicine, Khon

Kaen University for research assistant

(AS56203), Nakhonpranom animal quarantine

station and Department of livestock

development, Thailand for their assistance.


8

References

Abd Rani, P.A., Irwin, P.J., Coleman, G.T.,

Gatne, M. and Traub, R.J. 2011. A survey

of canine tick-borne diseases in India.

Parasit. Vectors. 4: 141.

Aktas, M., Ozubek, S., Altay, K., Ipek, N.D.,

Balkaya, I., Utuk, A.E., Kirbas, A., Simsek,

S. and Dumanli, N. 2015. Molecular detection of tick-borne rickettsial and

protozoan pathogens in domestic dogs

from Turkey. Parasit. Vectors. 8: 157.

Baneth, G. 2011. Perspectives on canine and

feline hepatozoonosis. Vet. Parasitol.

181 (1): 3-11.

Baneth, G. and Weigler, B. 1997. Retrospective

case-control study of hepatozoonosis

in dogs in Israel. J. Vet. Intern. Med. 11

(6): 365-370.

Bryson, N.R., Horak, I.G., Hohn, E.W. and Louw,

J.P. 2000. Ectoparasites of dogs

belonging to people in resource-poor

communities in North West Province, South Africa. J. S. Afr. Vet. Assoc. 71 (3):

175-179.

Coutinho, M.T., Bueno, L.L., Sterzik, A., Fujiwara,

R.T., Botelho, J.R., De Maria, M., Genaro,

O. and Linardi, P.M. 2005. Participation of

Rhipicephalus sanguineus (Acari:

Ixodidae) in the epidemiology of canine

visceral leishmaniasis. Vet. Parasitol. 128:

149-155.

Dantas-Torres, F. 2008. Canine vector-borne

diseases in Brazil. Parasit. Vectors. 1: 25.

De Tommasi, A.S., Otranto, D., Dantas-Torres,

F., Capelli, G., Breitschwerdt, E.B. and de

Caprariis, D. 2013. Are vector-borne

pathogen co-infections complicating

the clinical presentation in dogs?

Parasit. Vectors. 6: 97. Demma, L.J., Traeger, M.S., Nicholson, W.L.,

Paddock, C.D., Blau, D.M., Eremeeva,

M.E., Dasch, G.A., Levin, M.L., Singleton,

J., Jr., Zaki, S.R., Cheek, J.E., Swerdlow,

D.L. and McQuiston, J.H. 2005. Rocky

Mountain spotted fever from an

unexpected tick vector in Arizona. N.

Engl. J. Med. 353: 587-594.

Gray, J., Dantas-Torres, F., Estrada-Pena, A.

and Levin, M. 2013. Systematics and

ecology of the brown dog tick,

Rhipicephalus sanguineus. Ticks Tick

Borne Dis. 4 (3): 171-180.

Harrus, S. and Waner, T. 2011. Diagnosis of canine monocytotropic ehrlichiosis

(Ehrlichia canis): an overview. Vet. J. 187

(3): 292-296.

Homer, M.J., Aguilar-Delfin, I., Telford, S.R., Krause,

P.J. and Persing, D.H. 2000. Babesiosis. Clin.

Microbiol. Rev. 13: 451-469.

Irwin, P.J. 2009. Canine babesiosis: from

molecular taxonomy to control.

Parasit. Vectors. 2 Suppl 1: 54.


9

Jittapalapong, S., Rungphisutthipongse, O.,

Maruyama, S., Schaefer, J.J. and Stich,

R.W. 2006. Detection of Hepatozoon

canis in stray dogs and cats in Bangkok,

Thailand. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1081:

479-488.

Krause, P.J., Telford, S., 3rd, Spielman, A.,

Ryan, R., Magera, J., Rajan, T.V., Christianson, D., Alberghini, T.V., Bow, L.

and Persing, D. 1996. Comparison of

PCR with blood smear and inoculation

of small animals for diagnosis of

Babesia microti parasitemia. J. Clin.

Microbiol. 34: 2791-2794.

Laummaunwai, P., Sriraj, P., Aukkanimart, R.,

Boonmars, T., Boonjaraspinyo, S.,

Sangmaneedet, S., Potchimplee, P.,

Khianman, P. and Maleewong, W. 2014.

Molecular detection and treatment of

tick-borne pathogens in domestic dogs

in Khon Kaen, northeastern Thailand.

Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health. 45: 1157-1166.

Matjila, P.T., Leisewitz, A.L., Jongejan, F. and

Penzhorn, B.L. 2008. Molecular detection

of tick-borne protozoal and ehrlichial

infections in domestic dogs in South

Africa. Vet. Parasitol. 155: 152-157.

Moraes, P.H., Rufino, C.P., Reis, T., Aguiar, D.C.,

Meneses, A.M. and Goncalves, E.C.

2014. Optimization of a molecular

method for the diagnosis of canine

babesiosis. Rev. Bras. Parasitol. Vet. 23:

105-108.

O'Dwyer, L.H. 2011. Brazilian canine

hepatozoonosis. Rev. Bras. Parasitol. V.

20: 181-193.

Otranto, D., Dantas-Torres, F., Weigl, S.,

Latrofa, M.S., Stanneck, D., Decaprariis,

D., Capelli, G. and Baneth, G. 2011. Diagnosis of Hepatozoon canis in young

dogs by cytology and PCR. Parasit.

Vectors. 4: 55.

Skotarczak, B. 2003. Canine ehrlichiosis. Ann

Agric Environ Med. 10 (2): 137-141.

Solano-Gallego, L. and Baneth, G. 2011.

Babesiosis in dogs and cats—Expanding

parasitological and clinical spectra. Vet.

Parasitol. 181: 48-60.





การตรวจหาความเรวสงสดในการวงเรยบ ทรางกายสามารถรกษาระดบแลคเตท

ในกระแสเลอดใหคงท ในมาลกผสมพนเมองของไทย

พฒนพร ถาวรพฒนพงศ1 อารย ไหลกล2 ขนษฐา เพชรอดมสนสข2 วชรพล ปฐมสกลวงศ2

ณฐพล ภาณเสวกล2 และวรกจ เชดชธรรม2,#

1สาขาวชาคลนกศกษาทางสตวแพทย, 2ภาควชาเวชศาสตรคลนกสตวใหญและสตวปา คณะสตวแพทยศาสตร

มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตกาแพงแสน อ.กาแพงแสน จ.นครปฐม 73140

บทคดยอ: การศกษาวจยนมวตถประสงคเพอหาความเรวสงสดในการวงเรยบทรางกายสามารถรกษาระดบ

แลคเตทในกระแสเลอดใหคงท (Maximal Lactate Steady State Speed; MLSS) ในมาลกผสมพนเมองของ

ไทย (crossbred native Thai ponies; CNTP) 6 ตว โดยทาการประเมนจากระดบแลคเตทในกระแสเลอดท

มการเปลยนแปลงขณะทมาทาการวงตามวธการทดสอบทความเรวระดบตางๆพบวาคา MLSS ของมากลมนคอ 15±1.1 km/h ซงเปนความเรวทมาใชแลวไมเกดการสะสมของแลคเตทในกระแสเลอด เปรยบเทยบ

ความเรวเฉลยทแลคเตทตาทสด (lactate minimum speed; LMS) และความเรวทสงขนอก 10% ของ LMS

(10%LMS) พบวาทระยะ 4, 6, 8 และ 10 กโลเมตร มความแตกตางกนของระดบแลคเตทของมาทงสองกลม

อยางมนยสาคญทางสถต (P<0.05) บงชวาความเรวในการวงทระดบ LMS คอคา MLSS จรง ระดบแลคเตท

เฉลยทความเรว MLSS เทากบ 1.8±0.2 mmol/L การสะสมของแลคเตททสงสด (เฉลยท 8.0±1.1 mmol/L)

ใชเวลาสะสมเฉลยเทากบ 1±0 นาท และใชเวลาเฉลยในการกาจดแลคเตทใหกลบเขาสระดบระดบพนฐาน

เทากบ 71.6±9.8 นาท สรปไดวาจากผลงานวจยนคา MLSS ในมา CNTP อยท 15.0±1.1 km/h ซงจะเปน

ขอมลทสามารถนาไปใชประโยชนในการกาหนดโปรแกรมออกกาลงกายของมาในประเทศไทยตอไป

คาสาคญ: มาลกผสมพนเมองของไทย แลคเตทในกระแสเลอด ความเรวสงสดในการวงเรยบทรางกายสามารถ

รกษาระดบแลคเตทในกระแสเลอดใหคงท #ผรบผดชอบบทความ สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 11-21. E-mail address: [email protected]

พฒนพร ถาวรพฒนพงศ และคณะ / สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 11-21.

12

Determination of the Maximal Lactate Steady State Speed of Trotting in

Crossbred Native Thai Ponies

Pattanaporn Thawornpattanapong1, Aree Laikul2, Kanittha Phetudomsinsuk2, Watcharapol Pathomsakulwong2, Nuttapon Phanusaweekul2 and

Worakij Cherdchutham2,#

1Department of Veterinary Clinical Studies, 2Department of Large Animal and Wildlife Clinical science,

Faculty of Veterinary Medicine, Kasetsart University, Kamphaengsaen, Nakhon Pathom 73140, Thailand

Abstract: The purpose of this study aimed to determined maximal lactate steady state speed

(MLSS) of the 6 crossbred native Thai ponies (CNTP). Blood lactate concentrations during

different velocity of protocols were evaluated. The MLSS in CNTP was 15±1.1 km/h which did

not accumulate of blood lactate. Compared mean lactate minimum speed (LMS) and

comparison with 10% above LMS, found significant different lactate concentration (P<0.05) at

4, 6, 8 and 10 km. distance indicating that LMS was absolute MLSS (mean MLSS lactate was

1.8±0.2 mmol/L). The average peak blood lactate (LP) was 8.0±1.1 mmol/L. The mean of

lactate peak time was 1±0 min. after the exercise test, and mean of the time to base lactate

was 71.7±9.8 min. In conclusion, the MLSS of CNTP (15±1.1 km/h) was proposed from this

study that would be beneficial for tailoring the exercise program of this type of equids in

Thailand.

Keywords: Crossbred native Thai ponies, Blood lactate, Maximal lactate steady state speed (MLSS) #Corresponding author J. Mahanakorn Vet. Med. 2016. 11(1): 11-21. E-mail address: [email protected]

บทนา

การแขงขนกฬาขมามาราธอน (endurance)

เปนการแขงขนเ พอทดสอบทงในดานความเรว

(speed) แล ะค ว า ม แข ง แ ก ร ง (stamina หร อ

endurance ability) ของม า โดย ใ ชการ ว ง เ ร ยบ

(trotting) เ ป น ท า ว ง ห ล ก เ ป น ก า ร ท ด ส อ บ

ความสามารถของผข ในการวางแผนการขดวย

ความเรวทเหมาะสมกบสภาพรางกายของมาและวาง

แผนการเดนทางผานภมประเทศ มาทเหมาะกบการ

แขงขนกฬาประเภทนมากทสดไดแกมาพนธอารา

เบยน (Arabian) ซงมลกษณะทางสรระวทยาทเหมาะ

กบการแขงขนกฬาประเภทน (Prince et al., 2001)


13

ประ เทศ ไทย มก า ร เ ล ย ง ม า ล ก ผสม พน เ ม อ ง

(crossbred native Thai ponies; CNTP) โ ด ย

เกษตรกรเพอใชในงานตางๆ รวมถงมาขเลนเพอออก

กาลงกาย มาลกผสมพนเมองของไทยเหลานมการ

เลยงดไมยงยากและไมตองใชตนทนสงนก โดยม

ขนาดรางกายไมสงใหญมาก สามารถฝกหดไดจง

นาจะเหมาะสมสาหรบผขทเปนเยาวชนหรอผหดขมา

ใหม และใชในการแขงขนขมามาราธอนในระดบเบองตนหรอระดบฝกหดกอนทจะพฒนาไปสการ

แขงขนขมามาราธอนในระดบสงตอไป

การกาวยางหรอการวงของมาในลกษณะตางๆ

เชนการเดน (walk) การวงเรยบ (trotting) จะม

รปแบบการสรางพลงงาน 2 รปแบบหลกคอแบบใช

ออกซ เจน (aerobic) และแบบไ ม ใ ชออกซ เจน

(anaerobic) ซงอตราสวนของการใชพลงงานของ

สองรปแบบดงกลาวจะขนอยกบความหนกเบา

(intensity) และระยะเวลา (duration) ของการออก

กาลงกาย (exercise) เปนสวนใหญ (Desmecht et

al., 1996) โดยมาทมการออกกาลงกายอยางหนกใน

ชวงเวลาสน มกจาเปนตองการพลงงานในรปแบบ

ของ Adenosine triphosphate (ATP) อยางมาก

และรวดเรวเพอนาไปใชในการหดและคลายตวของกลามเนอเพอใหเกดการกาวยางอยางมประสทธภาพ

(efficient gait) (Evans, 2000) ดงนนมาจงตองการ

ใชการสรางพลงงานในรปแบบไมใชออกซเจนเปน

หลกเพราะสามารถใหพลงงานในรปแบบของ ATP

ไดปรมาณมากและรวดเรวการสรางพลงงานแบบไม

ใชออกซเจนจะเกดในไซโตพลาสซมของเซลล โดย

การนากลโคสเขามาใชในเซลลกลามเนอนจะม

glucose transporter-4 (GLU4) (Richter et al.,

2013) ซ ง จ ะ เ ป น ต ว ส ง ก ล โ ค ส ผ า น plasma

membrane ไปยง T-tubules ในขณะทกลามเนอม

การหดตว ซงกลโคสนมาจากการขบวนการสลายไกล

โคเจน (glycolytic pathway) ของกลามเนอหรอ

เปนกลโคสทอยในกระแสเลอดทมาจากขบวนการเม

แทบอลซมจากอวยวะอนของรางกาย และผลผลต

อยางหนงของการสรางพลงงานแบบไมใชออกซเจนก

คอเกดการสรางและการสะสมของกรดแลคตก

(lactic acid) หรอ อกรปแบบหนง กคอแลคเตท

(lactate) โดยแลคเตทจะไดจากขบวนการสรางพลงงาน (ATP) จากกลโคส โดยเกดจากการเปลยน

ไพรเวท (pyruvate) ไปเปนแลคเตทโดยเอนไซมแลค

แตทดไฮโดรจเนส (lactate dehydrogenase; LDH)

ซงการขจดแลคเตทออกจากเซลลจะมโปรตนท

เรยกวา monocarboxylate transporters (MCT)

เปนตวขนสงแลคเตทผานเยอหมเซลลเขาสกระแส

เลอด (Revold et al., 2010) ซงมปจจยหลายอยาง

ทมผลกระทบความสามารถในการกาจดกรดแลคตก

เชน มวลกลามเนอ การไหลเวยนของกระแสเลอด

และปรมาณเสนเลอดฝอยในกลามเนอ เปนตน

(Gollnick et al.,1986; Brooks, 1991)

ความเรวททาใหระดบแลคเตทในกระแสเลอด

เทากบ 4 mmol/L (V4) ซ งหมายความถงการท

รางกายตองการพลงงานมากขนจงเรมมการเปลยนไปใชการสรางพลงงานแบบไมใชออกซเจน (anaerobic

threshold; AT) จงทาใหมการสรางและสะสมของ

แลคเตทในกระแสเลอดคา V4 นจ งถกใชอยาง

แพรหลายในการนามาตดสนสมรรถภาพของมากฬา

(Lindner et al., 2009)

การทดสอบการออกกาลงกายมาตรฐาน

(Standardized exercise testing; SET) ถกนามาใช

ในการศกษาเพอตดสนระดบความสมบรณของมา

โดยการประเมนสมรรถนะทางดานการออกกาลงกาย

ในมา โดยมการใชพารามเตอรหลายชนดในการ


14

ประเมน คาความเขมขนของแลคเตทในกระแสเลอด

(blood lactate concentration; LA) ก เ ปนอกค า

หนงทนยมใชในการประเมนสภาพรางกายทงของคน

และมาในการออกกาลงกายหรอในการแขงขน

(Kobayachi, 2007; Lindner et al., 2009) LA ถก

นามาใชในการประเมนความหนกของการออกกาลง

กายในมากฬาอยางแพรหลาย (Foreman et al.,

1990, McGowan et al., 2002, Serrano et al., 2002)

ในป ค.ศ. 1994 มการศกษาถงความแตกตาง

ระหวางสายพนธมาเกยวกบระดบ LA เมอใหมาวงท

ความเรว 15, 20 และ 25 km/h พบวา มาพนธอารา

เบยนและพนธแองโกลอาหรบมระดบ LA ตากวา มา

พน ธ อนดาล เ ชยนส (Castejon et al., 1994) ใน

งานวจยเดยวกนน ยงพบวา เมอใหมาวงทความเรว

20 km/h มาพนธอนดาลเชยนส มอตราการเตนของ

ห ว ใจส งก วาม า อก 2 สายพน ธท เหลอ บ ง ชถ ง

ความสามารถในการปรบตวตอการขระยะทางไกล

ของมาพนธอาราเบยนและพนธแองโกลอาหรบ แต

เมอวงทความเรว 30 km/h พบวาไมมความแตกตาง

ระหวางมา 3 สายพนธ ทงระดบ LA และอตราการ

เตนของหวใจ (Castejon et al., 1994) ระดบแลคเตทคงทสงสด (maximum lactate steady state,

MLSS) แสดงใหเหนการทางานทสงสด ทสามารถ

รกษาระดบแลคเตทใหคงท กอนทจะมการสะสม

เกดขน ซงหมายถงการเรมทจะเกดการสรางแลคแต

ทจากการไมใชออกซเจนเกดขน (Mader et al.,

1976, cited in Lindner, 2010)

จดประสงคของการศกษาคร ง นค อการ

ประเมนหาความเรวสงสดในการวงเรยบทรางกาย

สามารถรกษาระดบแลคเตทในกระแสเลอดใหคงท

(MLSS) ของมาลกผสมพนเมองของไทย

อปกรณและวธการ

สตวทดลอง

การศกษาครงนจะใชมาลกผสมพนเมองของ

ไทย เพศผตอน อาย 4-12 ป นาหนกระหวาง 180-

230 กโลกรม คะแนนสภาพรางกายเฉลย 3.5 จาก

คะแนนเ ตม 5 (Carroll and Huntington, 1988)

จานวน 6 ตว ทมสขภาพแขงแรง และถกเลยงด

ภายใตสภาพแวดลอมเดยวกน มาทกตวทเขารวมการทดลองตองผานการตรวจรางกายภาวะขากระเผลก

การตรวจความสมบรณของเลอด (complete blood

count) และคาเคมโลหต (blood chemistry) คอ

เ อ น ไ ซ ม Aspartate aminotransferase (AST),

Alkaline phosphatase (ALP), Creatine kinase

(CK), Blood urea nitrogen (BUN), Creatinine

และ Total protein วาอยในเกณฑปกตกอนนามา

ทาการศกษา มาทใชเปนมาของหนวยงานสตวทดลอง

คณะสตวแพทยศาสตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร

ซงผานขนตอนเตรยมการวจยในระยะเวลา 1 ปโดย

เปนมาทเคยเขารวมการแขงขนกฬาขมามาราธอนใน

ระดบฝกหด ระยะทาง 20-40 กโลเมตร ทงนในชวง

กอนการทดลอง 6 เดอน มาจะไมไดเขารวมการ

แขงขน จะมเพยงถกใชในการสอนขมาตามโปรแกรมการขปกตเทานน และพนททใชในการวงทดสอบเปน

พนดนอดแนน (turf surface) เหมอนกบทใชตาม

โปรแกรมการขปกต

การเตรยมมากอนการศกษา

มาทง 6 ตว ในหนงสปดาหจะมโปรแกรมการออก

กาลงกาย (ตามโปรแกรมการใชขปกต) ดงน

วนท 1: พกมา

วนท 2-5: อบอนรางกายโดยการเดน (walk)

ระยะทาง 300 เมตรใชเวลา 5 นาท (ความเรวเฉลย


15

1 เมตรตอวนาท) และวงเรยบ (trotting) ระยะทาง

9400 เมตรนาน 45 นาท (ความเรวเฉลย 3.48 เมตร

ตอวนาท) และเดนคลายอนอกประมาณ 300 เมตร

โดยใชเวลา 5 นาท (ความเรวเฉลย 1 เมตรตอวนาท)

รวมเปนระยะทางทงสน 10 กม. วนละ 1 ครง (ตอน

เยน)

วนท 6-7: ใชการออกกาลงกายตามขนตอน

เหมอนวนท 2-5 แตปฏบตวนละ 2 ครง (เชาและเยน) รวมเปนระยะทาง 20 กม.ตอวน

ดงนนในหนงสปดาหมาแตละตวจะไดออก

กาลงกายประกอบดวยการเดน (คดเปน 6% ของการ

ออกกาลงกาย) และวงเรยบ (คดเปน 94% ของการ

ออกกาลงกาย) รวมเปนระยะทางตวละ 80 กโลเมตร

ตอสปดาห โดยมการเตรยมรางกายมาทงหมดเปน

เวลา 6 เดอนจงนามามาศกษาตามขนตอน ซงผาน

ก า ร อ น ม ต ก า ร ใ ช ส ต ว เ พ อ ง า นทด ล อ ง จ า ก

คณะกรรมการจรรยาบรรณการใชสตวเพองานวจย

มหาวทยาลยเกษตรศาสตร

ขนตอนการศกษา (ขนตอนท 1 และ 2 ประยกตจาก

Gondim และคณะ) (Gondim et al., 2007)

1. การประเมนสมรรถภาพทางกายภาพ (fitness) ของมา

1.1 การหาคาความเขมขนสงสดของการ

สะสมแลคเตทในกระแสเล อด ( lactate peak

concentration; LP) เวลาทเกดการสะสมถงระดบ

สงสด ( time to lactate peak; TLP) และเวลาท

ระ ดบแลคเตทลดลงส ระ ดบ พนฐาน (time to

baseline lactate; TLB) โดยวดคา LA ในขณะพก

( resting state) และก าหนด เ ปนระ ดบ พนฐาน

(baseline value) อบอนรางกายมา (warm up)

ประกอบดวยการเดน (walk) 10 นาท ว ง เรยบ

(trotting) 5 นาท และวงโขยก (canter) 1 นาท

จากนนจงขในจงหวะวงหอ (gallop) เปนระยะทาง

500 เมตร เพอกระตนใหเกดการสรางและสะสมของ

แลคเตท (Gondim et al., 2007) เมอหยดวงทาการ

เจาะเลอดวดคา LA ทกๆ 2 นาทจนกวาคา LA จะ

ลดลงจนถงระดบพนฐาน (baseline value) โดย

เจาะเลอดจากเสนโลหตดาทคอ (jugular vein) เปน

ปรมาณ 0.5 มลลลตร และนามาวดตามขนตอนดวยเ ค ร อ ง Accutrend®Plus (จ า ก บ ร ษ ท Roche

ประเทศสหรฐอเมรกา) (Kullmann et al., 2014)

1.2 ก า ร ท ด ส อ บ เ พ ม ก า ร อ อ ก ก า ล ง

( incremental exercise protocol) โดยจากการ

ทดลองท 1.1 จะไดทราบ คา TLP ทาการพกมาหลง

จบการทดลองท 1.1 เปนระยะเวลา 36 ชวโมง เรม

การทดลองท 1.2 โดยวดคา LA และวดอตราการเตน

ของหวใจในขณะพก (resting state) และกาหนด

เปนระดบพนฐาน (baseline value) จากนนอบอน

รางกายมาตามขนตอนเดม แลวจงขในจงหวะวงหอ

เปนระยะทาง 500 เมตร หยดพกมาครบตาม TLP ท

ไดจากการทดลองท 1.1 (เพอรอจนกระทงระดบแลค

เตทในกระแสเลอดส งสด ; LP) แลวขม า ว ง เ ปน

ระยะทางรอบละ 1,000 เมตร รอบแรกใชความเรว 10 km/h เมอครบ 1 รอบจงวดคา LA และวดอตรา

การเตนของหวใจและพกมา 1 นาท จงวงรอบตอไป

โดยเพมความเรวขนรอบละ 2 km/h เมอมา วง

ครบรอบจงปฏบตเชนเดม ทาเชนนจนคา LA เรมเพม

สงขนจงหยดการทดลอง ซงจะทราบความเรวในการ

วงทระดบแลคเตทในกระแสเลอดมคาตาสดหรอ

lactate minimum speed (LMS)

1.3 การหาคาความเรวสงสดในการวงเรยบท

รางกายสามารถรกษาระดบแลคเตทในกระแสเลอด

ใ หคงท ห ร อท เ ร ยก ว า Maximal blood lactate


16

steady state speed (MLSS phase confirmation

protocol) ทาการพกมาหลงจบการทดลองท 1.2

เปนระยะเวลา 36 ชวโมง เรมการทดลองท 1.3 โดย

วดคา LA ในขณะพก (resting state) และกาหนด

เปนระดบพนฐาน (baseline value) อบอนรางกาย

มา (warm up) ตามขนตอนเดม จากนนขมาวงดวย

ความเรว LMS ของมาแตละตว เปนระยะทางทงหมด

10 กโลเมตร โดยหยดเพอเจาะเกบเลอดและวดคา LA ทก 2 กโลเมตร หลงจากนนพกมา เปนระยะเวลา

36 ชวโมง เจาะเลอดวดคา LA เพอใชเปนคาพนฐาน

(baseline value) ทาการอบอนรางกายมา จากนน

วงดวยความเรวทเพมขน 10% จาก LMS ของมาแต

ละตว เปนระยะทางทงหมด 10 กโลเมตร โดยหยด

เพอเจาะเลอดวดคา LAทก 2 กโลเมตร

2. ก า ร ว เ ค ร า ะ ห ค า blood lactate

concentration (LA) ทไดในแตละการทดลองยอย

จากการทดลองท 1.1 จะไดคาเฉลยของคา

แลคเตทพนฐานขณะพก (lactate baseline resting

value, baseline lactate) (mmol/L) คาเฉลยของ

คา TLP (นาท) คาเฉลยของ TLB (นาท) และคาเฉลย

ของคา LP (mmol/L) ของมาท ง 6 ตว จากการ

ทดลองท 1.2 จะไดคาเฉลยของ baseline lactate, blood lactate at LMS และ LMS จากการทดลอง

ท 1.3 นาคา LA เฉลยในมาทง 6 ตว จากการวง 2

รอบมาเปรยบเทยบกนและเปรยบเทยบกบคา

baseline lactateหากคาเฉลยทวด ณ จด 2, 4, 6, 8

และ 10 กโลเมตร ของการวงดวยความเรวทระดบ

LMS กบ คา baseline lactate เฉลยไมแตกตางกน

แตแตกตางจากการวงดวยความเรวทเพมขน 10%

จาก LMS อยางมนยสาคญทางสถตและการวงดวย

ความเรวทเพมขน 10% จาก LMS กบ คา baseline

lactate เฉลยแตกตางกนอยางมนยสาคญทางสถต

จะบงชวาความเรวในการวงทระดบ LMS คอคา

MLSS

3. การวเคราะหขอมลทางสถต

ก า ร ว เ ค ร า ะ ห ข อ ม ล ท า ง ส ถ ต โ ด ย ว ธ

descriptive statistic analysis ถกนามาใชเพอหา

คาเฉ ลย (mean) และสวนเ บยงแบนมาตรฐาน

(standard deviation; SD) ของคาแลคเตทพนฐาน

ขณะพก (baseline lactate) เวลาทเกดการสะสมแลคเตทถงระดบสงสด (LTP) ระดบแลคเตทสงสดใน

กระแสเลอด (LP) ความเรวในการวงทระดบแลคเตท

ในกระแสเลอดมคาตาสด (LMS) และความเขมขน

ของแลคเตทในกระแสเลอดท LMS (blood lactate

concentration at LMS, LMS lactate) การใ ช ว ธ

paired sample t-test เพอเปรยบเทยบคาเฉลยของ

แลคเตทในกระแสเลอดของมาทง 6 ตวหลงจากการ

วงทความเรวระดบ LMS กบการวงทระดบความเรวท

เพมขน 10% ของ LMS ณ ระยะทาง 2, 4, 6, 8 และ

10 กโลเมตร โดยกาหนดให P-value <0.05 จง

ยอมรบวามความแตกตางอยางมนยสาคญทางสถต

ใชโปรแกรม SPSS19 ในการวเคราะหทางสถต

ผลการวจย ค า เ ฉ ล ย ข อ ง LP ค อ 8.0±1.1 mmol/L

คาเฉลยของ TLP คอ 1±0 นาท คาเฉลยของ TLB

คอ 71.7±9.8 นาท (ตารางท 1) คาเฉลยของคา

baseline lactate คอ 1.6±0.2 mmol/L คาเฉลย

LMS คอ 15±1.1 km/h คาเฉลยของ LMS lactate

คอ 1.8±0.2 mmol/L (ตารางท 2)

ตวอยาง ระดบ LA ทวดหลงจากทดสอบของ

มา D ทมแนวโนมลดลง เมอวงทความเรวตางๆ และ

เมอถงความเรวท LMS ของมา D จะพบวาคา LA ใน

กระแสเลอดจะเรมมการเพมขน (รปท 1)


17

ตารางท 1 แสดงคา อาย นาหนก คา LP คา TLP และคา TLB ของมาแตละตวและคาเฉลย

มา อาย(ป) นาหนก(kg) LP(mmol/L) TLP(นาท) TLB(นาท)

A 4 195 8.9 1 65 B 8 230 8.9 1 65

C 6 210 8.3 1 80

D 5 205 5.9 1 60

E 4 180 8.8 1 85

F 6 190 7.3 1 75

คาเฉลย±SD 5.5±1.5 201.7±17.5 8.0±1.1 1±0 71.7±9.8

ตารางท 2 แสดงคา LMS คา LMS lactate และคา baseline lactate ของมาแตละตวและคาเฉลย

มา

LMS

(km/h)

LMS lactate

(mmol/L)

Baseline lactate

(mmol/L)

A 14 1.8 1.4

B 14 1.5 1.9

C 16 1.8 1.7

D 16 1.7 1.4

E 14 2.0 1.7

F 16 2.2 1.4

คาเฉลย±SD 15.0±1.1 1.8±0.2 1.6±0.2

รปท 1 ลกษณะกราฟของระดบแลคเตทของมา D กบความเรวทใชในการวง

LMS


18

รปท 2 เปรยบเทยบระดบแลคเตทเฉลยของกลมมาทงหมด ในระหวางมาทวงดวยความเรวทระดบแลคเตท

นอยทสด (LMS) กบมาทวงดวยความเรวเพมขนอก 10% ของความเรวทระดบแลคเตทนอยทสด (10%LMS)

ทระยะทางตางๆ

วจารณผลการวจย

มาทกตวทใชทดสอบหา MLSS ในการศกษา

ครงนไมปรากฏพบการบาดเจบของกลามเนอ หรอ

ภาวะขากระเผลกในระหวางการศกษา ซงอาจเปนเพราะการศกษาครงนใชโปรแกรมการฝกฝนมา

(training exercise) ทมการออกกาล งกายอ ย ใน

ระดบทตา (low intensity) กอนนามามาทดสอบหา

MLSS

ความเรวในระดบ LMS ทไดจากทดสอบเปน

คา LMS ทแทจรง เนองจากเมอมการเพมระดบ

ความเรวขนจากระดบ LMS ของมาแตละตว จะ

พบวามการเพมขนหรอมการสะสมของแลคเตทใน

กระแสเลอด โดยทระดบพนฐานและระยะทางท 2

กโลเมตร ของทงสองกลมพบวาไมมความแตกตางกน

อยางมนยสาคญทางสถต (P>0.05) แตทระยะ 4, 6,

8 และ 10 กโลเมตร พบวามความแตกตางกนของ

ระดบแลคเตทในกระแสเลอดของมาทงสองกลมอยาง

มนยสาคญทางสถต (P<0.05) (รปท 2) จากกการศกษาครงนพบวามาลกผสมพนเมอง

ของไทยจะม LMS เฉลยท 15±1.1 km/h ซงตากวา

เมอเปรยบเทยบกบการศกษาของ Gondim และ

คณะในมาพนธอนๆ (อาราเบยน ควอเตอร และแอง

โกลอาหรบ) คอมความเรวเฉลยท 20.75 km/h และ

ยงพบวาคา TLP เฉลยคอ 1±0 นาท ซงตากวามา

พนธอนๆ (อาราเบยน ควอเตอร และแองโกลอาหรบ) ทได 5.8±6.09 นาท ทงนอาจเนองมาจากสดสวนของ

ชนดเสนใยกลามเนอของมาลกผสมพนเมองของไทย

มความแตกตางกบมาพนธอาราเบยน ซงมสดสวน

เสนใยกลามเนอชนดทใชพลงงานจากการสนดาป

ออกซเจน (type I) มากกวาเสนใยกลามเนอชนดอน

ซงเปนเปนปจจยในการสรางและกาจดแลคเตท

ภายในรางกาย (Gladden, 1996, Votion et al.,

2010) แตพบวาระดบ LP เฉลยทไดของมาลกผสม

พนเมองของไทย (8.0±1.1 mmol/L) ใกลเคยงกบ

มาพนธอน (อาราเบยน ควอเตอร และแองโกล

อ า ห ร บ ) (8.2±0.7 mmol/L) (Gondim et al.,

2007) ความเรวทใชและขนาดกลามเนอทตางกนของ

มาลกผสมพนเมองของไทย และมาพนธอนๆ (อารา

เบยน ควอเตอร และแองโกลอาหรบ) ตามหลกกายวภาค สงผลตอปรมาณไกลโคเจนทอยในกลามเนอจง

มผลตอปรมาณการสรางแลคเตททเกดขนจากกการ

สรางพลงงาน และชนดของเสนใยกลามเนอซงม

LMS

10%LMS


19

สดสวนท ตางกนกมผลตอการทางานและสราง

แลคเตทไดเชนเดยวกน (Snow and Valberg, 1994)

สรปผลการวจย

จากการศกษาการตรวจหาความเรวสงสดใน

การวงเรยบทรางกายสามารถรกษาระดบแลคเตทใน

กระแสเลอดใหคงท (MLSS) ในมาลกผสมพนเมอง

ของไทย พบวาความเรวสงสดทสามารถใชไดในมากลมนคอ 15±1.1 km/h ซงจะเปนความเรวทมาใช

แลวจะไมเกดการสรางแลคเตทในรางกายมากเกน

กวาทจะกาจดออกไดทนจนเกดการสะสมอย ใน

กระแสเลอด และพบวามากลมทดลองใชเวลาเฉลย

เทากบ 1±0 นาท ในการทเกดการสะสมของแลคเตท

ทสงสดหลงจากออกกาลงตามโปรแกรมการประเมน

สมรรถภาพทางกายภาพ (fitness) ของมา (ประยกต

จาก Gondim et al., 2007) และใช เวลาในการ

กาจดแลคเตททสรางขนใหกลบเขาสระดบปกต

(ระดบพนฐานของมาแตละตว) เฉลย 71.7±9.8 นาท

ซงจะเปนขอมลทสามารถนาไปใชประโยชนในการ

กาหนดโปรแกรมออกกาลงกายของมาลกผสม

พนเมองของไทย ในประเทศไทยตอไป

กตตกรรมประกาศ

ทางคณะผศกษาขอขอบคณ หนวยงานสตว

ทดลอง คณะสตวแพทยศาสตร มหาวทยาลย

เกษตรศาสตร วทยาเขตกาแพงแสน ทใหความ

อนเคราะหมาเพอใชในการศกษาครงน

เอกสารอางอง

Baldari, C., Bonavolonta, V., Emerenziani, G.P.,

Gallotta, M.C., Silva, A.J. and Guidetti, L.

2009. Accuracy, reliability, linearity of

Accutrend and Lactate Pro versus EBIO

plus analyzer. Eur. J. Appl. Physiol. 107:

105-111.

Brooks, G.A. 1991. Current concepts in lactate

exchange. Med. Sci. Sports. Exerc. 23 (8):

895–906.

Carroll, C.L. and Huntington P.J. 1988. Body

condition scoring and weight estimation of horses. Equine Vet. J. 20(1): 41-45.

Castejón, F., Rubio, D., Tovar, P., Vinuesa, M.

and Riber, C. 1994. A comparative study

of aerobic capacity and fitness in three

different horse breeds (Andalusian,

Arabian and Anglo-Arabian).

ZentralblVeterinarmed A. 41 (9): 645–

652.

Desmecht, D., Linden, A., Amory, H., Art, T. and

Lekeux, P. 1996. Relationship of plasma

lactate production to cortisol release

following completion of different types

of sporting events in horses. Vet. Res.

Commun. 20(4): 371-379. Evans, D.L. 2000. Training and fitness in

athletic horses. Barton, Camberra: Rural

Industries Research and Development

Corporation, 64p.

Foreman, J.H., Bayly, W.M., Grant, B.D. and

Gollnick, P.D. 1990. Standardized

exercise test and daily heart rate

response of Thoroughbreds undergoing

conventional race training and

detraining. Am. J. Vet. Res. 51: 914-920.


20

Gladden, L.B. 1996. Lactate transport and

exchange during exercise. In: Handbook

of Physiology. Section 12: Exercise:

Regulation and Integration of Multiple

Systems, L. B. Rowell and J. T. Shepherd

(Eds.). New York: Oxford University

Press, pp. 614–648.

Gollnick, P.D., Bayly, W.M. and Hodgson, D.R., 1986. Exercise intensity, training, diet,

and lactate concentration in muscle

and blood. Med. Sci. Sports. Exerc. 18

(3): 334–340.

Gondim, F.J., Zoppi, C.C., Pereira-da-Silva, L.

and Macedo, D.V. 2007. Determination

of the anaerobic threshold and

maximal lactate steady state speed in

equines using the lactate minimum

speed protocol. Comp. Biochem. Phys.

A. 146: 375-380.

Kobayashi, M. 2007. Simple lactate

measurement in horses using a

portable lactate analyzer with lancet skin punctures under field conditions. J.

Equine. Sci. 18(1): 5-11.

Kullmann, A., Sanz, M., Fosgate G.T., Sualez,

M.N., Page P.C., Rioja, E., 2014. Effects of

xylazine, romifidine, or detomidine on

hematology, biochemistry and splenic

thickness in healthy horses. Can. Vet. J.

55: 334–340.

Lindner, A. 2000. Use of blood biochemistry

for positive performance diagnosis of

sport horses in practice. Revue. Med.

Vet. 151: 611-618.

Lindner, A., Mosen, H., Kissenbeck, S.,

Fuhrmann, H., and Sallmann, H.P., 2009.

Effect of blood lactate-guided

conditioning of horses with exercises of

differing durations and intensities on

heart rate and biochemical blood variables. J. Anim. Sci. 87: 3211-3217.

McGowan, C.M., Golland, L.C., Evans, D.L.,

Hodson, D.R. and Rose, R.J. 2002.Effects

of prolonged training, overtraining and

detraining on skeletal muscle

metabolites and enzymes. Equine. Vet.

J. 34: 257-263.

Mykkanen, A.K., Poso, A.R., McGowan, C.M.

and McKane, S.A. 2010. Expression of

lactate transporters MCT1, MCT2, and

CD147 in the red blood cells of three

horse breeds: Finnhorse, Standardbred

and Thoroughbred. Equine. Vet. J.

42(34): 161-166. Perez, E.H., Dawood, H., Chetty, U.,

Esterhuizen, T.M. and Bizaare, M. 2008.

Validation of the Accutrend® lactate

meter for hyperlactatemia screening

during antiretroviral therapy in a

resource-poor setting. Int. J. Infect. Dis.

12: 553-556.

Prince, A., Geor, R., Harris, P., Hoekstra, K.,

Gardner, S., Hudson, C. and Pagan, J.

2001. Comparison of the metabolic


21

responses of trained Arabian and

Thoroughbred horses during high and

low intensity exercise. Proceedings 17th

Symposium of the Equine Nutrition and

Physiology Society, Lexington,

Kentucky, USA. pp. 267– 272.

Revold, T., Mykkanen, A.K., Karlstrom, K., Ihler,

C.F., Poso, A.R. and Essen-Gustavsson, B. 2010. Effects of training on equine

muscle fibres and monocarboxylate

transporters in young Coldblooded

Trotters. Equine Vet. J. 42(38): 289-295.

Richter, E.A. and Hargreaves, M. 2013.

Exercise, GLUT4, and skeletal muscle

glucose uptake. Physiol. Rev. 93: 993-

1017.

Serrano, M.G., Evans, D.L. and Hodgson, J.L.

2002. Heart rate and blood lactate

responses during exercise in

preparation for eventing competition.

Equine Vet. J. 34: 135-139.

Votion, D.M., Fraipont, A., Goachet, A.G., Rorert, C., VanErck, E., Amory, H.,

Ceusters, J., DeLaRebière DePouyade,

G., Franck, T., Mouithys-mickalad, A.,

Niesten, A. and Serteyn, D. 2010.

Alterations in mitochondrial respiratory

function in response to endurance

training and endurance racing. Equine

Vet. J. 42(38): 268-274.

Werkmann, J., Lindner, A. and Sasse, H.HL.

1996. Conditioning effects in horses of

exercise of a 5, 15 or 20 minutes

duration at two blood lactate

concentrations. Pferdeheikunde. 12:

474-479.





การศกษาลกษณะและการแสดงออกของรปแบบโปรตนในปทะเล (Scylla serrata)

ทมอาการอกทองแดงระยะแรก

ภทราวด ศรมเทยน1,2,# และสรยน ธญกจจานกจ3

1ศนยเทคโนโลยชวภาพเกษตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตกาแพงแสน จ.นครปฐม 73140 2ศนยความเปนเลศดานเทคโนโลยชวภาพเกษตร สานกพฒนาบณฑตศกษาและวจยดานวทยาศาสตรและเทคโนโลย

สานกงานคณะกรรมการการอดมศกษา กรงเทพฯ 10900 3ภาควชาเพาะเลยงสตวนา คณะประมง มหาวทยาลยเกษตรศาสตร เขตจตจกร กรงเทพฯ 10900

บทคดยอ: การศกษาลกษณะของปทะเล (Scylla serrata) ทมความผดปกตในระยะแรกทมอาการอกทอง

แดง จากฟารมปทะเล ตาบลคลองโคลน อาเภอเมอง จงหวดสมทรสงคราม นามาสงเกตลกษณะอาการเปน

เวลา 7 วน พบวาวนท 1, 2 และ 3 ปมลกษณะอาการคลายกบปปกต เชน มความตองการอาหารสงและมการ

เคลอนทอยางรวดเรว แตเมอเขาสวนท 4, 5, 6 และ 7 พบวาปกนอาหารนอยลงและการเคลอนทลดลง ซง

แตกตางจากปปกต สวนลกษณะภายนอกพบวา บรเวณอกทองมสสม และรยางคขามสสมและมจดสดาคลาย

กบสนมเกาะขณะทอวยวะภายในพบวา ตบเละไมคงรป เหงอกมสสม พองบวม ปลายเหงอกมสดานอกจากน

ยงพบวากระดองแตกหกงาย เปราะบางและกรอบ เมอนาปดงกลาวมาปรงเปนอาหารพบวามรสขม สวนเลอด

ปทะเลทมอาการอกทองแดงในระยะแรก สามารถแบงออกไดเปน 2 กลมลกษณะ ไดแก กลมลกษณะแรก

เลอดมสสมอมฟา พบในปทะเลทมอาการอกทองแดง หลงจากสงเกตในวนท 1, 2 และ 3 วน และกลมลกษณะ

ทสองมเลอดสสมชดเจนพบในปทะเลทมอาการอกทองแดงหลงจากสงเกตในวนท 4, 5, 6 และ 7 วน หลงจาก

นนนาเลอดไปทาการศกษารปแบบการแสดงออกของโปรตนดวยเทคนค Sodium Dodecyl Sulphate-

Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS PAGE) พบวากลมลกษณะเลอดสสมชดเจนมโปรตนนาหนกโมเลกลประมาณ 137 kDa เพมขน แตกตางจากกลมลกษณะเลอดปปกตและเลอดสสมอมฟา

คาสาคญ: ปทะเล อาการอกทองแดง รปแบบโปรตน #ผรบผดชอบบทความ สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 23-33. E-mail address: [email protected]

ภทราวด ศรมเทยน และสรยน ธญกจจานกจ / สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 23-33.

24

Characters and Protein Profile in the First Stage of Mud Crab (Scylla serrata)

Infected by Red Sternum Syndrome

Pattarawadee Srimeetian1,2,# and Suriyan Tunkijjanukij3

1Center for Agricultural Biotechnology, Kasetsart University, Kamphaeng Saen Campus, Nakhon Pathom,

Thailand, 73140; 2Center of Excellence on Agricultural Biotechnology: (AG-BIO/PERDO-CHE), Bangkok 10900,

Thailand; 3Department of Aquaculture, Faculty of Fisheries, Kasetsart University, Bangkok 10900, Thailand

Abstract: The first stage of mud crabs infected by red sternum symptom and normal mud

crabs were collected from a farm in Samut Songkhram province, Thailand and their used to

study in external-internal morphological characterization and their behavior. The symptoms

of red sternum syndrome showed orange color of abdominal thorax, black spots on joints and

very thin carapace. In internal organs were dark and soft as well as bitter meats. The behavior of mud crab were normal feeding and moving at 1st to 3rd day after infected by the syndrome.

While 4th to 7th day after infected found that mud crabs were lose appetite and limited moving.

The color blood of those crabs were classified into two groups; orange-blue (group I: 1st to 3rd

day) and orange (group II: 4th to 7th day). To determine the protein expression of red sternum

and normal mud crabs using Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis

(SDS PAGE) found that during 1st to 3rd day after red sternum syndrome infection demonstrated

that the pattern of proteins were same as normal crab, while 4th to 7th day after infection

showed that the additional protein was found compared to normal mud crab, approximately

137 kDa.

Keywords: Mud crab, Red sternum symptom, Protein profile #Corresponding author J. Mahanakorn Vet. Med. 2016. 11(1): 23-33. E-mail address: [email protected]

บทนา ปทะเลเปนสตว นาเศรษฐกจทสาคญของ

ประเทศไทยเนองจากมรสชาตดและมคณคาทาง

โภชนาการสง จงเปนทนยมบรโภคของทงชาวไทย

และตางประเทศ เ ชน ญ ปน แคนนาดา และออสเตรเลย เ ปนตน Department of Fisheries

(2015) รายงานการสงออกปของประเทศไทย

ประจาเดอนมกราคม-พฤษภาคม พ.ศ. 2557 มมลคา


25

402.76 ลานบาท ความตองการปของตลาดสงผลด

แกเกษตรผเลยงป การเลยงปทะเลนนเกษตรกรจะนา

ปเลกจากธรรมชาตมาเลยงจนไดขนาดตามทตลาด

ตองการ ไดแก ปเนอ ปไขและปนม โดยฟารมสวน

ใหญจะใชกลองในการเลยงปทะเล หนงกลองตอป

หนงตวเพอปองกนการตอสกนเองของปทะเลและ

สะดวกตอการเกบเกยว ปญหาทสาคญในการเลยงป

ทะเล เชน การขาดแคลนพนธป การลอกคราบไมสมบรณ และอาการผดปกตทบรเวณอกทองของปมส

แดงนอกจากนปทมอาการผดปกตดงกลาวยงพบวาม

การเปลยนแปลงของเลอดอกดวย โดย Areekijseree

et al. (2010) ไดแบงความผดปกตของปทะเลทม

อาการอกทองแดงซงจาแนกตามตามความรนแรงโดย

ใชลกษณะของสเลอดเปนเกณฑ โดยแบงออกไดเปน

3 ระยะดวยกนคอ ระยะแรกเลอดสสม ระยะท 2

เลอดสสมขาว และระยะท 3 เลอดมสขาวคลายนม

แตกตางจากเลอดของปปกตทใสไมมสซงเมอสมผส

กบออกซเจนจะมสฟา โดยระยะท 2 และระยะท 3

ของปทมอาการอกทองแดงนนเปนระยะทมความ

รนแรง โดยปจะมลกษณะอาการคลายเปนอมพาต

และตายภายในเวลา 24 ชวโมง (Intanakom, 2010)

Plainpun (2014) ร า ย ง า น ว า เ ช อ Vibrio parahaemolyticus ทาใหเลอดของปทะเลชนด

Scylla serrata เปลยนจากใสไมมเปนสสมโดย เมอ

อาการอกทองแดงเกดขนในปทะเล ปทมอาการ

ดงกลาวอาจจะมการเปลยนแปลงของสารชวโมเลกล

ภายในเซลล เชน สารส ไขมน คารโบไฮเดรต และ

โปรตน โดยโปรตนเปนสารชวโมเลกลทมความสาคญ

เปนอยางยงตอสงมชวต ซงโปรตนภายในเซลลจะทา

ห น าท ห ล ากหลายแตก ต า ง กน เ ชน เ อน ไซม

(enzyme) ก า ร ข จ ด ส า ร พ ษ (detoxification)

ฮอร โมน (hormone) และภม ค ม กน (immune

system) เปนตน โปรตนแตละชนดจะถกผลตและ

แ ส ด ง อ อ ก ใ น ส ภ า ว ะ ท แ ต ก ต า ง ก น อ อ ก ไ ป

( Thammasirirak, 2002) Salaenoi et al. (2006)

รายงานวาเลอดของปทะเลชนด S. serrata ทม

อาการอกทองแดง ระยะเลอดสขาวคลายนมไมพบ

ก า ร แ ส ด ง อ อ ก ข อ ง โ ป ร ต น ฮ โ ม ไ ซ ย า น น

(haemocyanin) เ ม อท าการศ กษา ด วย เทค นค

Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS PAGE) ความผดปก ต

ของปทะเลทแสดงอาการอกทองแดงนไดสรางความ

เสยหายใหแกเกษตรกรผเลยงปทะเล Salaenoi et

al. (2006) รายงานการระบาดของอาการอกทองแดง

พบ 10% ในฟารมปทะเล โดยอาการผดปกตอกทอง

แดงทาใหเกษตรกรสญเสยคาจายใชและสญเสย

รายไดเนองจากปทมอาการอกทองแดงนนจะไมลอก

คราบเพอเพมการเจรญเตบโต โดยสวนมากเกษตรกร

จะทราบวาปทะเลมอาการดงกลาวเมอเขาสระยะท

รนแรงใกลตายแลวซงปจจบนขอมลและการศกษา

เกยวกบอาการผดปกตอกทองแดงในปทะเลยงม

คอนขางนอย ดงนนผ วจยจงมความสนใจศกษา

ลกษณะและอาการของปทะเลทมอาการอกทองแดง

ในระยะแรกเพอจกเปนประโยชนแกเกษตรกรนาไปสงเกตลกษณะอาการอกทองแดงของปทะเลในระยะ

เรมแรก กอนทปทะเลจะเขาสระยะทรนแรงมากขน

สามารถชวยลดความเสยหายจากอาการอกทองแดง

เชน ลดการสญเสยคาจายใชและเวลาในการเลยงป

ทะเลทมอาการดงกลาว นอกจากนยงทาการศกษา

รปแบบการแสดงออกของโปรตนในเลอดของปทะเล

ทมอาการอกทองแดง ซงจะเปนขอมลเบองตนเพอใช

ในการศกษาระดบชวโมเลกลของอาการดงกลาวในป

ทะเลตอไป โดยงานวจยนจะเปนขอมลพนฐาน

สาหรบใชเปนแนวทางในการศกษาวนจฉยอาการ


26

ผดปกตอกทองแดงในปทะเลเพอหาทางปองกนและ

รกษาในอนาคต


การเตรยมสตวทดลอง

ทาการสารวจเกบตวอยางปทะเลจานวน 100

ตว จากฟารมปทะเล ตาบลคลองโคลน อาเภอเมอง

จงหวดสมทรสงคราม เดอนเมษายน พ.ศ. 2555 พบปทะเลเพศผและเพศเมยจานวน 5 ตว ทมอาการอก

ทองแดงในระยะแรกโดยสงเกตจากเลอดทมสสมและ

อาการผดปกตบรเวณอกทองของปทะเล ซงมขนาด

ความกวางของกระดอง 8.22±0.26 เซนตเมตร ความ

ยาว 5.70±0.19 เซนตเมตร ความหนา 3.15±0.10

เซนตเมตร และนาหนก 367±12.16 กรม และทา

การเกบปทะเลปกตเพศผและเพศเมยจานวน 5 ตว ม

ขนาดความกวางของกระดอง 8.27±0.24 เซนตเมตร

ความยาว 5.73±0.15 เ ซน ต เมตร ความหนา

3.17±0.08 เซนตเมตร และนาหนก 369.40±9.14

กรม นามาศกษาลกษณะภายนอกเชน สของบรเวณ

อกทอง จบปง และรยางคขา เปนตน หลงจากนนนา

ปลงเลยงในถงไฟเบอรทความเคม 25 สวนในพนสวน

ใหอากาศตลอดเวลา และให เ นอปลาสดขนาดประมาณ 2×1.5 เซนตเมตร เปนอาหารวนละ 1 ครง

สงเกตลกษณะอาการเปนเวลา 7 วน โดยนาปมาเจาะ

เลอดทกๆ วน ดวยเขมฉดยาเบอร 21 บรเวณโคนขา

เ ดน น า เล อด เ กบ ในหลอดพลาส ตกท ม 10%

trisodium citrate (อตราสวนเทากบ 5:1) แลวนาไป

ปนเหวยงทความเรวรอบ 12000 รอบตอนาท ท 4

องศาเซลเซยส เปนเวลา 30 นาท นาไปศกษารปแบบ

โปร ตน ดวย เทคนค SDS PAGE เม อครบ 7 วน

ทาการศกษาลกษณะภายนอกอกครง หลงจากนนทา

ใหปสลบโดยการแชในนาเยนจดเปนเวลา 3 นาท

แลวผาตดเพอศกษาอวยวะภายในการวางแผนการ

ท ด ล อ ง เ ป น แ บ บ ส ม ส ม บ ร ณ (completely

randomized design; CRD)

การวดปรมาณโปรตน

การวดปรมาณโปรตนในตวอยางเนอเยอตางๆ

ของปทะเล โดยใชวธ Bradford (Bradford, 1976)

เปรยบเทยบกบสารละลายโปรตนมาตรฐาน BSA (bovine serum albumin) วดคาดดกลนแสงทความ

ยาวคลนแสง 595 นาโนเมตร คานวณหาปรมาณ

โปรตนโดยเปรยบเทยบกบสารสาระลายโปรตน

มาตรฐาน

การแยกโปรตนดวยเทคนค SDS PAGE

นาตวอยางเลอดความเขมขนของโปรตน 5

ไ ม โ ค รก ร ม ผสมก บ 2X sample buffer (50%

glycerol, 250 mM tris-HCl buffer pH 6.8, 10%

SDS, 0.5% bromphenol blue, 0.5%

mercaptoethanol) โดยใชอตราสวน 1:1 ผสมให

เขากนนาไปตมทอณหภม 95 องศาเซลเซยสเปนเวลา

10 นาทหล งจาก นนแชใน นาแข งทนท เตรยม

separating gel (12% acrylamide) และ stacking gel (6% acrylamide) โหลดตวอยาง 10 ไมโครลตร

ลง ในหล ม เจลและ โหลดโปร ตนมาตรฐาน 5

ไมโครลตร โดยใชกระแสไฟฟาความตางศกย 70

โวลต เปนเวลา 20 นาท และกระแสไฟฟาความตาง

ศกย 120 โวลต เปนเวลา 100 นาท หลงจากนนนา

แผนเจลไปยอมดวย coomassie brilliant blue เปน

เ ว ล า 15 นาท ล า ง ด ว ย destaining solution

(methanol, acetic acid) 3 คร ง ๆ ละ 30 นาท

(Laemmli, 1970)


27

ผลการทดลอง

จากการเกบตวอยางปทะเลปกตและปทะเลใน

ระยะแรกทมอาการอกทองแดง จากฟารมปทะเล

นามาสงเกตลกษณะและอาการเปนเวลา 7 วน จาก

การศกษาสงเกตลกษณะอาการของปปกตเปนเวลา 7

วน พบวาปมลกษณะดรายมาก โดยแสดงอาการ

ตางๆ ดงน ชกามและกระโดดหนบสงทเขาไปกระตน

ไดอยางรวดเรวและทนททนใด มการตอสเพอปองกนตว เคลอนทไดอยางคลองแคลวและวองไว ปราด

เปรยว ปนปาย กนอาหารปลาสดหมดทก วน

นอกจากนยงพบวาเลอดของปปกตมเลอดใสไมมส

เมอสมผสกบออกซเจนจะมสฟา (Figure 1A, B, C,

D, E, F, G: a) เมอทาการศกษาอาการของปทะเล

หลงจากทมอาการอกทองแดงในระยะแรกสงเกต

ลกษณะอาการเปนเวลา 7 วน พบวาวนท 1, 2 และ

3 ปมการกนอาหารและการเคลอนทคลายคลงกบป

ปกต เชน ความดราย การตอบสนองตอสงทเขาไป

กระ ตนอยางรวดเร ว มการ ปนปาย เคล อนท

คลองแคลว กนอาหารหมด เมอสงเกตลกษณะของ

เลอดพบวาเลอดมสสมอมฟา (Figure 1A, B, C: b)

เมอทาการสงเกตในวนท 4, 5, 6 และ 7 พบวาปม

การกนอาหารนอยลง การเคลอนทลดลง ไมปนปาย มการยกชกามขนมาปองกนตวเอง เมอมสงกระตน

พยายามหลบซอนตวและหลบเลยงจากการตอส ไมม

การกระโดดหนบสงทเขาไปกระตน ลกษณะของ

เลอดพบวามสสมชดเจน (Figure 1D, E, F, G: b)

การศกษาลกษณะภายนอกกอนและหลง 7

วน ของปปกตพบวามลกษณะเหมอนกน คอทวทง

บรเวณอก ทอง และจบปง มสขาว (Figure 2A) สวน

อวยวะภายในทาการศกษาหลงเลยงได 7 วน พบวา

ตบจะคงรป เหงอกสดสขาวสะอาด และฉา นา

(Figure 2B) สวนรยางคขามสเงน (Figure 2C) และ

เนอบรเวณโคนขามสขาวขนปปกตกระดองมลกษณะ

หนาและแขงมาก ดานในของกระดองมสเทาอมเงน

(Figure 2D) สวนปทะเลในระยะแรกทมอาการอก

ทองแดง เมอนามาศกษาลกษณะและอาการ พบวา

ลกษณะภายนอกกอนและหลง 7 วน มลกษณะ

เหมอนกนคอบรเวณอกทองพบวามสสม โดยมสสม

เดนชดทบรเวณจบปง (Figure 3A) รยางค ขามสสม

อมชมพ (Figure 3C) นอกจากนบรเวณบรเวณโคนรยางคขายงพบวามจดสดาคลายกบสนมเกาะและ

เนอบรเวณโคนขามสสม สวนอวยวะภายในของป

ทะเลหลงจากทมอาการอกทองแดงเปนเวลา 7 วน

พบวาตบเละไมคงรป หวใจมสสมคลา เหงอกมสสม

พอง หลวม และคอนขางแหง สวนตรงบรเวณปลาย

เหงอกมสดา (Figure 3B) เมอใชกรรไกรตดกระดอง

พบวามลกษณะแตกงาย บางและกรอบ นอกจากนยง

พบวาลกษณะของเนอเยอใตกระดองจะรอนออกจาก

กระดองโดยงาย ไมตดกระดอง สวนดานในของ

กระดองมสสม (Figure 3D) นอกจากนยงพบวาเมอ

นามาทาใหสกและปรงเปนอาหารพบวามรสขม

Figure 1 Blood color changing of mud crab during 7

days; day 1 (A), day 2 (B), day 3 (C), day 4 (D), day 5

(E), day 6 (F) and day 7 (G), (a) Normal mud crab and

(b) the first stage of mud crab infected by red

sternum syndrome


28

Figure 2 Appearance of the normal mud crab. The

sternum was white and hard shell (A).The heart (h),

hepatopancreas (hep), and gills (g) were normal

(B).The legs were gray color (C). The carapace was

gray color (D).

Figure 3 Appearance of the red sternum mud crab.

The sternum was orange, especially orange

abdomen (a) and easily broken shell (A). The heart

(h) and gills (g) changed to orange. The

hepatopancreas (hep) were soft and unshaped (B).

The legs were orange color (C). The carapace was

orange color (D).

จากการศกษาลกษณะของเลอดปทะเลในระยะแรกทมอาการอกทองแดง สามารถแบงเลอด

ของปทะเลออกไดเปน 2 กลมลกษณะไดแก กลม

ลกษณะแรกเลอดทมสสมอมฟาซงพบในวนท1, 2

และ 3 หลงจากทปทะเลมอาการอกทองแดง และ

กลมลกษณะทสองเลอดมสสมอยางชดเจน ซงพบใน

วนท 4, 5, 6 และ7 วนหลงจากทปทะเลมอาการอก

ทองแดง หลงจากนนนาเลอดทง 2 กลมลกษณะมา

ทาการศกษารปแบบโปรตนดวยเทคนค SDS PAGE

บน 12% acrylamide gel ความเขมขนของโปรตน 5 ไมโครกรม โดยเทยบกบเลอดของปปกตทปรากฏส

ฟาเมอสมผสกบออกซเจน ผลการศกษาพบวากลม

ลกษณะเลอดทมสสมอมฟา มรปแบบโปรตนท

เหมอนกนกบเลอดของปปกต สวนกลมลกษณะทม

เลอดสสมอยางชดเจนมรปแบบโปรตนทแตกตาง

ออกไป พบวามการแสดงออกของโปรตนทนาหนก

โมเลกล (molecular weight)ประมาณ 137 กโล

ดาลตน (kDa) เพมขน โดยไมพบการแสดงออกของ

โปรตนทนาหนกโมเลกลดงกลาวในเลอดปปกตและ

เลอดสสมอมฟาของปทมอาการอกทองแดงระยะแรก

(Figure 4)

สรปและวจารณผล

ผลการศกษาพบวาปทมอาการอกทองแดงในระยะแรกนน กระดองจะเปราะและบาง ซงคลายกบ

โรค shell disease หรอ black spot ททาใหปชนด

Cancer pagurus เปนจดสดาทวโครงราง มสาเหต

มาจากการตดเชอกลม chitinolytic bacteria เชน

Aeromonas sp. แ ล ะ Vibrio sp. เ ป น ต น โ ด ย

แบคทเรยกลมนจะผลตเอนไซมไคตเนส (chitinase)

ซงทาหนาทในการยอยสลายไคตน (chitin) (Vogen

et al., 2002) โดยกระดองของป นนม ไคตนเปน

องคประกอบทสาคญ ซงทาใหโครงรางมความแขง

(Merzendorfer and Zimoch, 2003) ดง นนเมอม


29

การยอยสลายไคตนจงทาใหไคตนในกระดองของป

ลดลงกวาปปกตสงผลใหกระดองของปมลกษณะผ

กรอนและแตกหกงาย (Ayres and Edwards, 1982)

นอกจากนลกษณะจดสดาคลายสนมเกาะทรยางคขา

ของปทมอาการอกทองแดงนนอาจเกดจากการทเมด

เลอดเขาไปลอมรอบเพอทาลายเชอโรคซงทาใหเกดม

ลกษณะทเปนจดสดา (Noga et al., 1994)

สวนลกษณะภายนอกของปทมอาการอกทองแดงในระยะแรกนน พบวาบรเวณอกทอง รยางคขา

ของปทะเลทมอาการอกทองแดงพบวามสสม คลาย

ก บ โ ร ค pink crab disease ซ ง เ ป น โ ร ค ท ม

เปลยนแปลงปรมาณสารสทาใหอกและทองของป

ชนด C. pagurus เปลยนเปนสชมพ เมอนาปทม

อาการอกทองแดงมาทาใหสกและปรงเปนอาหาร

พบวามรสขม คลายกบโรค bitter crab disease

(Meyers et al., 1987) โดยโรคนทาใหเนอปชนด

Chionoecetes bairdi มรสขมซงมสาเหตมาจาก

ป ร ส ต (dinoflagellate) ส ก ล Hematodinium

ขณะ ท Taylor et al. (1996) ร า ย ง าน ว า เ ม อ

Hematodinium เ ข า ส ก ง ช น ด Nephrops

horvegicus แล ว นน Hematodinium จะอาศ ย

โปรตนและคารโบไฮเดรตในรางกายของกงเปนแหลงอาหาร ซงจะทาใหโปรตนและคารโบไฮเดรตในกงม

การเปลยนแปลง ดงนนอาจเปนเปนไปไดวาปทม

อาการอกทองแดง เมอนามาประกอบอาหารแลวมรส

ขม อาจมสาเหตเกดจากการเปลยนแปลงของโปรตน

และคารโบไฮเดรตในเนอเยอนนเอง นอกจากนเลอด

ของปทมอาการอกทองแดงคลายกบโรค milky

blood disease โดยโรคนจะทาใหเลอดมลกษณะ

ค ล า ย น ม (milky hemolymph) ใ น ก ง ช น ด

Exopalaemon carinicauda (Xu et al., 2010) ซง

มสาเหตมาจาก Hematodinium และยงทาใหปชนด

Paralithodes camtschaticus แ ล ะ ป ช น ด P.

platypus เปลยนจากเลอดใสไมมสเปนเลอดทม

ลกษณะคลายครม (cream colored) (Ryazanova,

2008) อกดวย

Figure 4 Lane M) molecular markers, Lane N) the

blood of normal mud crab. The blood in the first

stage of mud crab infected by red sternum

syndrome Lane O1) day 1, Lane O2) day2, Lane O3)

day3, Lane O4) day 4, Lane O5) day 5, Lane O6) day

6 and Lane O7) day 7

จากผลการศกษาพบวาเลอดของปทมอาการ

อกทองแดงในระยะแรกนน สามารถแบงตามลกษณะ

ของสเลอดออกไดเปน 2 กลมลกษณะ ไดแก กลม

ลกษณะเลอดทมสสมอมฟาและกลมลกษณะทมเลอด

สสมอยางชดเจน สวนพฤตกรรมพบวาปทมอาการอก

ทองแดงระยะแรกกลมเลอดสสมอมฟามพฤตกรรม

คลายคลงใกลเคยงกบปปกต สวนกลมลกษณะทม

เลอดสสมอยางชดเจนพบวามพฤตกรรมทแตกตาง

จากปปกต Srimarksuk (2012) รายงานวาลกษณะ

การแสดงออกของพฤตกรรมจะสมพนธกบความ

รนแรงของอาการปวยในกงชนด Litopenaeus

vannamei ส ว น Costa-Ramos and Rowley

(2004) พบวา ปชนด C. pagurus เม อ ไ ดรบ เ ชอ

Pseudoalteromonas atlantica ป จ ะ เ ร ม ก น


30

อาหารลดลง การเคลอนทลดลง ในเวลาตอมาจะไม

กนอาหาร ไมสามารถเคลอนทหรอเคลอนไหวไดและ

ตายลงในทสด จากผลการทดลองพบวาปทมอาการ

อกทองแดงระยะแรกกลมลกษณะเลอดทมสสมอมฟา

เกดขนในชวงวนท 1-3 (ปวนท 1-3 มพฤตกรรม

เหมอนกน) ซงอาจเปนไปไดวาปยงไมแสดงอาการ

ปวย โดยสงเกตจากลกษณะพฤตกรรมทคลายกบป

ปกต แตเมอเขาสวนท 4-7 (ปวนท 4-7 มพฤตกรรมเหมอนกน) พบวาปมพฤตกรรมการกนอาหารและ

การเคลอนทลดลง ซงอาจเปนไปไดวาปเรมทจะแสดง

อาการปวยเกดขน Nonwachai (2010) รายงานวา

กงชนด L. vannamei หลงจากไดรบเชอแบคทเรย

V. harveyi จะมพฤตกรรมอาการเชนเดยวกบกงปกต

แตหลงจากชวโมงท 24 หลงจากไดรบเชอแบคทเรย

ดงกลาว กงจะเรมแสดงลกษณะอาการปวย โดย

พฤตกรรมอาการของกงปวยคอจะไมมปฏกรยา

ตอบสนองตอสงเราตางๆ ไมวายนาและตายในทสด

นอกจากนในกงปวยดงกลาวยงพบวามการสรางเมลา

นน (melanin) แทรกทกลามเนอแตไมพบเมลานนใน

กงปกต ซงเมลานนดงกลาวเกดขนหลงจากทาการ

เหนยวนาเชอแลวเปนเวลา 24 ชวโมง โดยเมลานน

เปนสารสดาทมชวยในการยบยงและปองกนการเจรญเตบโตของแบคทเรยและเชอรา (Söderhäll

and Cerenius 1998) Somboonwiwat et al.

(2010) ยงพบวากงชนด Penaeus monodon หลง

ทาการเหนยวนาดวยเชอ V. harveyi กงจะเรมแสดง

อาการปวยในชวโมงท 24 เปนตนไป นอกจากนกงท

มอาการปวยในชวโมงท 24 และ 48 ยงพบวามการ

ผลตรปแบบโปรตนทเหมอนกนอกดวย ดงนนอาจ

เปนไปไดวาหลงจากทปมอาการอกทองแดง ปจะเรม

ทจะแสดงลกษณะอาการปวยในวนท 4-7 ซงวนท

4-7 ปดงกลาวมพฤตกรรมเหมอนกนและมเลอดทม

ลกษณะสสมอยางชดเจนเหมอนกน ซงอาจเปนไปได

วาตงแตวนท 4-7 มความรนแรงของอาการอกทอง

แดงในปทะเลเทาเดม โดยเลอดของปทมอาการอก

ทองแดงวนท 4-7 มการแสดงออกของโปรตนขนาด

ป ร ะ ม าณ 137 kDa เ พ ม ข น เ ห ม อ น ก น เ ม อ

ทาการศกษาดวยเทคนค SDS PAGE ซงไมพบขนาด

โปรตนดงกลาวในกลมเลอดทมสสมอมฟา (วนท 1-3)

และปปกต Plainpun (2014) รายงานวาเลอดของปชนด S. serrata ทมอาการอกทองแดงระยะเลอดส

ชานม (ระยะทสอง) พบการแสดงออกของโปรตน

ขนาดประมาณ 70 และ 53 kDa แตไมพบการ

แสดงออกของขนาดโปรตนดงกลาวในปปกต สวน

Qiao et al. (2011) พบโปรตนขนาดประมาณ 188

kDa ซงเปนโปรตน hemlymph clottable protein

ใ น เ ล อ ด ขอ งก ง ช น ด L. vannamei ท ท า ก า ร

เหนยวนาดวยเชอ V. parahemolyticus แตไมพบ

โปรตนดงกลาวในปปกต hemlymph clottable

protein เปนโปรตนทเกยวของกบระบบภมคมกน

โดยโปรตนดงกลาวทาหนาทในกระบวนการการ

แขงตวของเลอด ซงจะชวยในการปองกนการสญเสย

เลอดของรางกาย (Martin et al., 1991) ดงนนอาจ

เปนไปไดวาโปรตนทพบในเลอดของปทมอาการอกทองแดงระยะแรกแตไมพบในปปกต อาจเปนโปรตน

ทถกผลตออกมาเพอทาหนาทในการตอบสนองตอ

อาการอกทองแดงในปทะเล Liu et al. (2011)

ศกษาการแสดงออกของโปรตนทการตอบสนองตอ

เชอไวรสตวแดงดวงขาว (white spot syndrome

virus) ของปชนด S. serrata พบโปรตน catalase,

cryptocyanin และ heat shock protein 90-2 ท

ถกแสดงออกมาเพอทาหนาทในการตอบสนองตอเชอ

ไวรสดงกลาว สวน Somboonwiwat et al. (2010)

ร า ย ง าน ว า ก ง ช น ด P. monodon เ ม อ ท า ก า ร


31

เหนยวนาดวยเชอ V. harveyi จะมการแสดงออก

ของโปรตนทแตกตางจากกงทไมไดเหนยวนาเชอ

ดงกลาว

จากการศกษารปแบบโปรตนในปทมอาการอก

ทองแดงระยะแรกดวย SDS PAGE ซงเปนเทคนคท

ใ ช ในการแยก นาหนกโมเล กลของโปรตน ผล

การศกษาในครงนทาใหทราบถงปทมอาการอกทอง

แดงระยะแรก กลมทมเลอดลกษณะสสมชดเจนเทานนทมการแสดงออกของโปรตนทแตกตางจากป

ปกต ซงเปนขอมลพนฐานทสาคญทอาจจะนากลม

ลกษณะเลอดสสมชดเจนไปศกษาโปรตนดวยเทคนค

อนทสามารถทาการแยกไดทงนาหนกโมเลกลและคา

Isoelectric point (pI) ของโปรตน ซง pI เปนคาท

เฉพาะของโปรตนหนงๆ หรออาจกลาวไดวาโปรตน

แตละชนดจะมคา pI ทแตกตางกน (Klose, 1975)

เพอนาไปใชในการศกษาเพมเตมใหทราบถงชนดของ

โปรตนทแสดงออกในปทะเลกลมลกษณะเลอดทมส

สม แตไมแสดงออกในกลมลกษณะเลอดสมอมฟา

และเลอดปทะเลปกตตอไป

จากผลการศกษานจะเปนขอมลเบองตนทจะ

ชวยใหเกษตรกรสามารถนาไปใชสงเกตอาการ

ระยะแรกของปทมอาการอกทองแดง โดยสงเกตไดจากลกษณะภายนอก และอาการตางๆ ของปทะเล

นอกจากนอาจมการตรวจสอบลกษณะของสเลอด

เพมเตม (อาจโดยการตดทปลายขาเพยงเลกนอยของ

ปทะเล) เพอทเกษตรจะไดทาการแยกคดทงปทม

อาการดงกลาวกอนทจะนาลงเลยงในบอหรอในกลอง

และยงสามารถนาไปสงเกตในชวงระหวางการเลยงป

ทะเลไดดวยเชนกน ซงจะทาใหเกษตรกรลดการ

สญเสยคาใชจายในการเลยงปทะเลทมอาการอกทอง

แดง เนองจากปทมอาการนจะไมลอกคราบและเมอ

เขาสระยะทรนแรงปทมอาการดงกลาวจะตายในทสด

นอกจากนการศกษาการแสดงออกของรปแบบ

โปรตนยงเปนขอมลพนฐานเพอใชเปนแนวทางใน

การศกษาวนจฉยปทะเลทมอาการอกทองแดง

ทางดานชวโมเลกลตอไปในอนาคต


งานวจยนไดรบการสนบสนนจากศนยความ

เปนเลศดานเทคโนโลยชวภาพเกษตร สานกพฒนาบณฑตศ กษาและ วจ ย ด าน วทยาศาสตร และ

เทคโนโลย สานกงานคณะกรรมการการอดมศกษา

กระทรวงศกษาธการ สานกงานคณะกรรมการวจย

แหงชาต ประเภททนบณฑตศกษา สญญาเลขท

กบง./2557-อ6.03 ทนพฒนาอาจารยและบคลากร

สาหรบสถาบนอดมศกษาในเขตพฒนาเฉพาะกจ

จงหวดชายแดนภาคใตสานกงานคณะกรรมการการ

อดมศกษากระทรวงศกษาธการ สญญาเลขท

21/2554


Areekijseree, M., Chuen-I, T. and Panyarachun,

B. 2010. Characterization of red sternum

syndrome in mud crab farms from Thailand. Biologia (Section Zoology).

65(1): 150-156.

Ayres, P. and Edwards, E. 1982. Notes on the

distribution of ‘‘black spot” shell

disease in crustacean fisheries. J. Chem.

Ecol. 1: 125-130.

Bradford, M.M. 1976. A Rapid and sensitive

method for the quantitation of

microgram quantities of protein utilizing


32

the principle of protein-dye binding.

Anal. Biochem.72: 248-254.

Costa-Ramos, C. and Rowley, A. F. 2004. Effect

of Extracellular Products of Pseudo-

alteromonas atlantica on the Edible

Crab Cancer pagurus. Appl. Environ.

Microbiol. 70(2): 729-735.

Department of Fisheries. 2015. http://www. fisheries.go.th/. 12 December 2015.

Intanakom, J. 2010. Study on morphological,

bacterial identification and histology in

mud crab (Scylla sp.) with red thoracic-

abdominal syndrome. The thesis of

Kasetsart University.Bangkok. 93 p. (in

Thai)

Klose, J. 1975. Protein mapping by combined

isoelectric focusing and electrophoresis

of mouse tissues. A novel approach to

testing for induced point mutations in

mammals. Humangenetik. 26(3): 231-243.

Laemmli, U.K. 1970. Cleavage of structural

proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227:

680-685.

Liu, W., Qian, D. and Yan, X. 2011. Protemic

analysis of differentially expressed

proteins in hemolymoh of Scylla

serrata response to white spot

syndrome virus infection. Aquaculture.

314: 53-57.

Martin, G.G., Hose, J.E., Omori, S., Chong, C.,

Hoodbhoy, T. and McKrell, N. 1991.

Localization and roles of coagulogen and

transglutaminase in hemolymph

coagulation in decapods crustaceans.

Comp Biochem Physiol. 100(B): 517-522.

Merzendorfer, H. and Zimoch, L. 2003. Chitin

metabolism in insects: structure,

function and regulation of chitin

synthases and chitinases. J. Exp. Biol. 206: 4393-4412.

Meyers, T.R., Koeneman, T.M., Botelho, C. and

Short, S. 1987. Bitter crab disease: a

fetal dinoflagellate infection and

marketing problem for Alaska tanner

crabs Chionoecetes bairdi. Dis. Aquat.

Organ. 3: 195-216.

Noga, E.J., Engel, D.P., Arroll, T.W., McKenna S.

and Davidian, M. 1994. Low serum

antibacterial activity coincides with

increased prevalence of shell disease in

blue crabs Callinectes sapidus. Dis.

Aquat. Organ. 19: 121-128.

Nonwachai, T. 2010. Growth, survival and non-specific immune characteristics of

pacific white shrimp (Litopenaeus

vannamei) fed with supplement

Sehizochytrium sp. and ARA containing

diets, and challenged with Vibrio

harveyi. The thesis of Kasetsart

University.Bangkok. 113 p. (in Thai)

Plainpun, N. 2014. Induction of red thoracic –

abominal syndrome with bacteria

isolated from mud crab (Scylla sp.). The


33

thesis of Kasetsart University. Bangkok.

121 p. (in Thai)

Qiao, J., Du, Z., Zhang Y., Du H., Guo L., Zhong

M., Cao J. and Wang X. 2011. Proteomic

identification of the related immune-

enhancing proteins in shrimp

Litopenaeus vannamei stimulated with

vitamin C and Chinese herbs. Fish & Shellfish Immunol. 31: 736-745.

Ryazanova, T.V. 2008. Bitter crab syndrome in

two species of king crabs from the Sea of

Okhotsk. Russ. J. Mar. Biol. 34: 411-414.

Salaenoi, J., Sangcharoen, A., Thongpan, A. and

Mingmuang, M. 2006. Morphology and

haemolymph composition changes in

red sternum mud crab (Scylla serrata).

KasetsartJ. (Nat. Sci.) 40: 158-166.

Söderhäll, K. and Cerenius, L. 1998. Role of

the prophenoloxidase-activating

system in invertebrate immunity. Curr

Opin Immunol. 10: 23-28.

Somboonwiwat, K., Chikeeratisak, V., Wang, H.C., Lo F.C. and Tassanaka, A. 2010.

Proteomic analysis of differentially

expressed proteins in Penaeus

monodon hemocytes after Vibrio

harveyi infection. Proteome Sci. 8: 1-11.

Srimarksuk A. 2012. Growth, survival, non-

specific immune characteristics and

resistance to Vibrio harveyi of pacific

white shrimp (Litopenaeus vannamei)

fed with yeast cell debris. The thesis of

Kasetsart University.Bangkok. 114 p.

Stentiford, G.D., Green, M., Bateman, K., Small,

H.J., Neil, D.M. and Feist, S.W. 2002.

Infection by a hematodinium-like

parasitic dinoflagellate causes pink crab

disease (PCD) in the edible crab Cancer

pagurus. J. Invertebr. Pathol. 79: 179-191. Taylor, A.C., Field, R.H. and Parslow-Williams,

P.J. 1996. The effects of Hemato-

diniumsp infection on aspects of the

respiratory physiology of the Norway

lobster, Nephrops norvegicus (L.). J. Exp.

Mar. Biol. Ecol. 207: 217-228.

Thammasirirak, S. 2002. Proteomics. KKU Sci.

J. 30(3): 160-168. (in Thai)

Vogan, L. C., Costa-Ramos, C. and Rowley, A.

F. 2002. Shell disease syndrome in the

edible crab, Cancer pagurus – isolation,

characterization and pathogenicity of

chitinolytic bacteria. Microbiology.

148:743-754. Xu,W., Xie, J.,Shi H. and Li, C. 2010.

Hematodinium infections in cultured

ridgetail white prawns, Exopalaemon

carinicauda, in eastern China.

Aquaculture. 300: 25-31.

บทความวชาการ




การสญเสยแคปซลของเชอ Streptococcus suis

ณฐกานต มขนอน1,#

1ภาควชาเทคนคการสตวแพทย คณะเทคนคการสตวแพทย มหาวทยาลยเกษตรศาสตร กรงเทพมหานคร 10900

บทคดยอ: เชอ Streptococcus (S.) suis เปนเชอตดตอจากสตวสคนทสาคญ ซงสามารถกอใหเกดโรคได

หลากหลาย โดยเฉพาะอยางยงภาวะเยอบสมองอกเสบทพบไดทงในสกรและมนษย โดยผปวยทหายจากภาวะ

น มกเกดอาการหหนวกอยางถาวรตามมา จากการศกษาเกยวกบปจจยทเกยวของกบความรนแรงของการเกด

โรค พบวาแคปซลเปนปจจยหนงทสาคญททาใหเกดโรคทรนแรงได และจากความแตกตางกนของแอนตเจน

บนผวแคปซลของเชอ ทาใหสามารถแบงเชอ S. suis ไดหลายซโรไทป อยางไรกตาม การพบเชอทไมสามารถ

จาแนกซโรไทปได ไดเพมจานวนมากขน ซงการสญเสยแคปซลจดเปนสาเหตหนงททาใหเชอไมสามารถจาแนก

ซโรไทปได ทงน สาเหตของการสญเสยแคปซลสามารถเกดไดจากการเปลยนแปลงของยนทเกยวของกบการ

สรางแคปซล นอกจากนยงพบวา เชอ S. suis ทสญเสยแคปซลมความสามารถในการยดเกาะและการสรางไบ

โอฟลมเพมขน เนองจากการยดเกาะเซลลโฮสตถอเปนขนตอนเรมแรกในกระบวนการกอโรคจากการตดเชอ S.

suis การสญเสยแคปซลของเชอจงอาจเปนขนตอนสาคญทเกยวของกบการเกดความรนแรงของการตดเชอทง

ในสกรและมนษย

คาสาคญ: Streptococcus suis แคปซล ความรนแรง #ผรบผดชอบบทความ สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 57-68. E-mail address: [email protected]

ณฐกานต มขนอน / สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 57-68.

58

Loss of Capsule in Streptococcus suis

Nattakan Meekhanon1,#

1Department of Veterinary Technology, Faculty of Veterinary Technology, Kasetsart University,

Bangkok, 10900, Thailand

Abstract: Streptococcus (S.) suis is an important zoonotic pathogen. It can cause various

diseases, particularly meningitis in swine and human. Most patients recovering from meningitis

further develop permanent deaf. Among the proposed virulence factors described so far,

capsule is thought to be a significant factor contributing to severe diseases. According to the

antigenicity of the capsular polysaccharides, S. suis can be classified into different serotypes.

However, the nontypeable S. suis has increasingly been reported. The loss of capsule in S.

suis, which results in being the nontypeable strain, can be caused by the alteration of gene(s)

in a group of capsular polysaccharide synthesis genes. In addition, the non-encapsulated cells

were reported to have greater adherence and biofilm formation abilities than those of the

encapsulated cells. Since the adherence to host cell has been considered as the initial step for the pathogenesis of S. suis infection, the loss of capsule in S. suis may play an important

role in the severe infection in both swine and human.

Keywords: Streptococcus suis, Capsule, Virulence #Corresponding author J. Mahanakorn Vet. Med. 2016. 11(1): 57-68. E-mail address: [email protected]

บทนา

เ ชอ Streptococcus (S.) suis เ ปนเ ชอ

แบคทเรยทสามารถตดตอจากสตวสคนทสาคญ และ

กอใหเกดโรคทกระทบตอการทางานหลายระบบใน

รางกาย โดยเชอนสามารถพบไดบรเวณทางเดน

หายใจสวนตน โดยเฉพาะทตอมทอนซลและชองจมก

ของสกรสขภาพด บรเวณระบบสบพนธและทางเดน

อาหาร รวมทงบรเวณตอมนาลาย (Arends et al.,

1984; Gottschalk and Segura, 2000;

Padungtod et al., 2010) โดยอาจพบสกรในฟารม

ทเปนพาหะของเชอไดตงแต 0 - 100% (Clifton-

Hadley et al., 1986) แม วา อตราดงกลาวยงไม

พบวามความสมพนธกบระดบของโรคทเกดขนใน

ฟารม (Wisselink et al., 1999) แตสกรทเปนพาหะ

กจดวามบทบาทสาคญในการแพรกระจายของเชอ

ภายในฟารม


59

เชอ S. suis สามารถแบงไดหลายซโรไทป โดย

อาศยความแตกตางกนของแอนตเจนบนผวของ

แคปซลของเชอ จากรายงานทผานมาพบวาซโรไทป

2 เปนซโรไทปทพบไดมากทสดในการตดเชอทงใน

สกรและมนษย (Higgins and Gottschalk, 2006)

แมวาแคปซลจะจดเปนปจจยสาคญทกอใหเกดความ

รนแรง (virulence factor) ของการตดเชอ S. suis

(Baums and Valentin-Weigand, 2009; Fittipaldi et al., 2012) แตปจจบนมรายงานเกยวกบการพบ

เชอ S. suis ท ไมสามารถจดอยในซโรไทปใดได

รวมทงเชอ S. suis ทปราศจากแคปซลเพมขน ซง

การศกษาเกยวกบการสญเสยแคปซลของเชอ S. suis

น อาจนาไปสความรใหม ตลอดจนสามารถทาใหเกด

ความเขาใจในกระบวนการเกดโรคจากการตดเชอน

ไดดยงขน

การตดเชอ S. suis ในสกรและมนษย

สาหรบในสกร พบรายงานการตดเชอ S. suis

ในหลายประเทศทวโลก เชนสหรฐอเมรกา แคนาดา

บราซล สหราชอาณาจกร เบลเยยม เดนมารค

นอรเวย ออสเตรเลย และนวซแลนด รวมทงหลาย

ประเทศในทวปเอเชย ไดแก จน ฮองกง ญ ปน เวยดนาม และไทย (Staats et al., 1997; Wertheim

et al., 2009) การแพรกระจายของเชอภายในฟารม

นนสวนหนงเกดจากการถายทอดเชอจากแมสกรสลก

สกรผานทางมดลกหรอชองคลอด และสวนใหญมก

พบการแพรกระจายของเชอเมอลกสกรหลายตวถก

ยายเขามาเลยงรวมกนในชวงของการหยานม (Staats

et al., 1997) โดยอาการหลกทพบ คอ ภาวะเยอหม

สมองอกเสบ นอกจากนอาการทางคลนกอนทมกพบ

ไดบอย คอ ขออกเสบ เยอบหวใจอกเสบ และปอด

อกเสบ (Gottschalk et al., 2007) ทงนหากไมทา

การรกษาอาจพบอตราการตายไดถงรอยละ 20

(Cloutier et al., 2003)

สวนใหญเชอทแยกไดจากสกรปวยมกจากดอย

เพยงบางซโรไทป นอกจากซโรไทป 2 ซงเปนซโรไทป

ทพบบอยในเชอทกอใหเกดโรคในสกรแลว ยงพบเชอ

S. suis ซโรไทป 1, 9, 14 และ 1/2 ในประเทศใน

แถบทวปยโรป (Princivalli et al., 2009; Wisselink

et al., 2000) ซโรไทป 1, 7, 8, 9, 11 และ 14 ในประเทศบราซล (Costa et al., 2005) และซโรไทป

1, 3, 4, 5, 7, 8 และ 1/2 ในประเทศจน (Wei et al.,

2009) อยางไรกตาม จากการศกษาการตดเชอ S.

suis ในสกรของประเทศแคนาดา (Gottschalk et

al., 2013) พบเชอ S. suis ซโรไทป 2 จานวนไมมาก

เมอเทยบกบเชอทแยกไดจากในประเทศอน แสดงให

เหนวา ความแตกตางของซโรไทปทพบในประเทศท

ตางกนนอาจสงผลมาจากสภาพภมศาสตรในแตละ

พนท นอกจากน ยงพบวา ซโรไทปของเชอทแยกได

จากผปวยนนมกเปนซโรไทปเดยวกนกบเชอทมกแยก

ไดจากสกรในพนทนนๆ ซงชใหเหนถงความสาคญ

ของปญหาทางสาธารณสขของการตดเชอ S. suis

จากสกรสมนษยได

การรายงานผปวยตดเชอ S. suis เกดขนครงแรกทประเทศเดนมารคในป ค.ศ. 1968 หลงจากนน

กพบผปวยตดเชอนจานวนเพมขนในหลายประเทศ

โดยเฉพาะอยางยงประเทศทมการเลยงสกรกนอยาง

หนาแนน (Wertheim et al., 2009) และในชวงฤด

รอนของป ค.ศ. 2005 ไดมการระบาดครงใหญของ

การตดเชอ S. suis ซโรไทป 2 ในมนษย เกดขนใน

มณฑลเสฉวน ประเทศจน ทาใหพบผปวยตดเชอ

จานวน 215 คน และมผเสยชวต 39 ราย โดยอาการ

ของผปวยทพบจากการระบาดครงนไดแก การตดเชอ

ในกระแสเลอด ภาวะเยอหมสมองอกเสบ และ


60

ภาวะชอค (streptococcal toxic shock syndrome)

ซงคาดวาผปวยไดรบเชอโดยตรงผานทางเลอดหรอ

เนอเยอของสกรท ตดเชอ (Yu et al., 2006) และ

นอกจากการระบาดในครงนแลว ยงมรายงานการตด

เชอนในคนอยอยางตอเนองในหลายประเทศทวโลก

รวมทงประเทศไทยเองกพบผปวยทตดเชอ S. suis

เปนจานวนมาก โดยพบการรายงานจานวนผตดเชอ

ในประเทศไทยมากทสดเปนอนดบ 3 ของโลก รองจากจนและเวยดนาม (Wertheim et al., 2009)

สาหรบการตดเชอจากสกรสมนษยนนอาจเกดจาก

การไดรบเชอโดยตรงจากสกรปวย สกรทเปนพาหะ

หรอเนอสกรทปนเปอนเชอ ผานทางบาดแผลท

ผวหนงหรอบร เวณเ ยอเมอก ดง นนผทท างาน

เกยวของกบสกรหรอเนอสกร เชน เกษตรกรผเลยง

สกร ผททางานในโรงฆาสตว ผ ชาแหละเนอสกร

ผตรวจเนอ สตวบาล สตวแพทยและผจบตองเนอสกร

ดบ จงเปนผทมความเสยงในการตดเชอน (Lun et

al., 2007) นอกจากน ยงพบรายงานการแยกเชอ S.

suis ไดจากกระดก ตอมทอนซล ลนและหางสกรใน

ตลาดของประเทศฮองกง (Ip et al., 2007) และการ

แยกเชอ S. suis ไดจากเนอและเครองในสกรท

จาหนายในประเทศญปน (Arai et al., 2015) อกทงผปวยตดเชอสวนใหญทพบทงในประเทศไทยและ

เวยดนามมกมสาเหตจากการบรโภคเนอสกรหรอ

ผลตภณฑจากสกรทปรงไมสก (Fongcom et al.,

2009; Nghia et al., 2011; Takeuchi et al., 2012)

ดงนน การบรโภคเนอหรอผลตภณฑจากสกรทปรงไม

สกนนจงเปนอกสาเหตหนงทมความสาคญกบการ

ระบาดของเชอน

สาหรบการตดเชอในผปวยนนสวนมากมกพบ

ภาวะเยอหมสมองอกเสบ นอกจากนยงอาจพบภาวะ

ตดเชอในกระแสเลอด เยอบหวใจอกเสบ ขออกเสบ

และปอดอกเสบ (Segura, 2009) โดยอาการทพบได

บอยในผปวยทหายจากภาวะเยอหมสมองอกเสบ คอ

อาการหหนวกซงมความรนแรงแตกตางกน และสวน

ใหญไมสามารถรกษาใหหายได แมวาในการศกษา

ของ Tan et al. (2010) จะพบวาอาการหหนวกท

เกดขนในผปวยตดเชอ S. suis นาจะเปนผลจากการ

เกดห ชนในอกเสบแบบมเลอดออก แตสาเหตท

แทจรงของการเกดหหนวกหลงจากตดเชอ S. suis น น ย ง ไ ม ท ร า บ แ น ช ด ( Choi et al., 2 0 1 2 ;

Gottschalk et al., 2007) นอกจากซโรไทป 2 แลว

ยงพบรายงานผปวยตดเชอ S. suis ซโรไทป 1, 4, 5,

14, 16, 21 และ 24 ใ นหล ายประ เทศ อก ด ว ย

( Goyette-Desjardins et al., 2 0 1 4 ; Kerdsin et

al., 2011; Nghia et al., 2008; Takeuchi et al.,

2012; Wertheim et al., 2009) จากขอมลดงกลาว

จะเหนไดวาเชอ S. suis เปนเชอตดตอจากสตวสคนท

สาคญในหลายประเทศ โดยเฉพาะอยางยงประเทศใน

ทวปเอเชย

การบงชชนดของเชอและการแยกซโรไทปของเชอ

S. suis

เชอ S. suis เปนเชอแบคทเรยแกรมบวกขนาดเลก รปรางกลม มกพบการเรยงตวแบบเดยว เปนค

หรอตอกนเปนสายสนๆ (Wertheim et al., 2009)

ในการบงชชนดของเชอนน เบองตนจะอาศยการ

ทดสอบคณสมบตทางชวเคม อยางไรกตาม คณสมบต

ทางชวเคมของเชอมความผนแปรสง ทาใหตองอาศย

เทคนคอนรวมดวย เชน การตรวจหาซโรไทปของเชอ

และการใชเทคนคทางอณชววทยาซงเปนวธทมความ

นาเชอถอสงกวา โดยวธการตรวจยนยนเชอดวยวธ

ทางอณ ชววทยานน อาจทาไดโดยการทา PCR

ตรวจหายนทจาเพาะตอเชอ (species-specific PCR)


61

เ ช น ย น glutamate dehydrogenase (gdh)

(Okwumabua et al., 2003) ย น

recombination/repair protein (recN) (Ishida et

al., 2014) นอกจากนยงสามารถใชการหาลาดบเบส

ทบรเวณยน 16s rRNA ตลอดจนการใช probe เพอ

จบบรเวณทจาเพาะบนยน 16s rRNA

จากความแตกตางกนของแอนตเจนบนผวของ

แคปซลของเชอทาใหสามารถแบง S. suis ไดเปนซโรไทปทแตกตางกน 35 ซโรไทป (ซโรไทป 1 – 34 และ

1/2 ซงเปนซโรไทปทสามารถทาปฏกรยาไดทงตอ

แอนตบอดของซโรไทป 1 และ 2) อยางไรกตาม จาก

การศกษาของ Hill et al., (2005) ไดจาแนกเชอซโร

ไทป 32 และ 34 เปนเชอ Streptococcus orisratti

และจากการศกษาของ Tien le et al. (2013) ได

จาแนกเชอซโรไทป 20, 22, 26 และ 33 ออกมาเปน

เชออนเชนกน ซงลาสดเชอ S. suis ซโรไทป 20, 22

และ 26 ไดถกจดเปนเชอ Streptococcus parasuis

(Nomoto et al., 2015) สาหรบการตรวจหาซโร

ไทปสามารถใชวธทางซรมวทยา โดยอาศยปฏกรยา

ระหวางแอนตเจนบนผวแคปซลกบแอนตซรมท

จาเพาะกบแตละซโรไทป โดยอาจใชปฏกรยาการ

ตกตะกอน (capillary precipitation) หรอ การเกาะกลม (co-agglutination test) (Gottschalk et al.,

1989; Perch et al., 1983) อยางไรกตาม การใชวธ

ทางซรมวทยาคอนขางมความยงยากและมคาใชจาย

สง จงไดมการพฒนาวธ multiplex PCR โดยใช

primers 2-3 เซท เพอตรวจหาซโรไทปจากยนท

จาเพาะของเชอ S. suis แตละซโรไทป และปจจบน

สามารถใชวธนเพอตรวจหาซโรไทปของเชอ S. suis

ได (Kerdsin et al., 2014, Liu et al., 2013, Okura

et al., 2014) แตวธนไมสามารถแยกเชอซโรไทป 1

ออกจากซโรไทป 14 และไมสามารถแยกเชอ ซโรไทป

2 ออกจากซโรไทป 1/2 ได ดงนน การตรวจหาซโร

ไทปดวยวธทางซรมวทยายงคงมความจาเปนสาหรบ

การยนยนเชอในกลมน

การสญเสยแคปซลของเชอ S. suis และผลกระทบ

ตอกระบวนการเกดโรค

จ ากก า ร ศ กษ าท ผ า น ม า (Corbett and

Roberts, 2009) พบวาแคปซลจดเปนปจจยหนงทบ ง ช ค ว ามร นแร ง (virulence factor) ของกา ร

กอใหเกดโรคของแบคทเรยหลายชนด รวมทงเชอ S.

suis และเชออนๆในกลม streptococci โดยพบวา

แคปซลของเชอ S. suis สามารถปองกนเชอจากการ

ถ ก จ บ ก น โ ด ย phagocytic cell (Houde et al.,

2012) และยงเกยวของกบการตดเชอในกระแสเลอด

(Segura and Gottschalk, 2002) แ ล ะ ก า ร

แพรกระจายของเชอไปยงอวยวะตางๆ ทวรางกาย

(Meijerink et al., 2012) อยางไรกตาม ในระยะสบ

ป ท ผ า น ม า ไ ด ม ร า ย ง า น ก า ร พ บ เ ช อ ก ล ม

streptococci รวมถงเชอ S. suis ทไมสามารถจดอย

ในซโรไทปใดได รวมทงเ ชอทปราศจากแคปซล

จานวนมากขน (Bonifait et al., 2010; Crum et

al., 2004; Melchiorre et al., 2012) แ ม ว าการศกษาทผานมาพบวา เชอ S. suis ทมแคปซล

สามารถกอโรคจากการทดลองในหนและสกรได

มากก ว า เ ช อส าย พน ธ เ ด ยว กนท ไ ม ม แคปซ ล

(Charland et al., 1998; Smith et al., 1999) แ ต

จ ากการ ศกษาของ Salasia et al. (1995) และ

Benga et al. (2004 & 2005) พบวาเชอ S. suis ท

ถกทาใหยนทสรางแคปซลเกดการเปลยนแปลงจนไม

สามารถสรางแคปซลไดนน มความสามารถในการยด

เกาะกบเซลลหลายชนด เชน epithelial cell ของ

มนษยและสกรไดดกวาเชอทมแคปซล นอกจากน


62

จากผลการศกษาของ Tanabe et al. (2010) ยง

พบวาเชอทไมมแคปซลนน ยงสามารถสรางไบโอฟลม

ไดดกวาเชอทมแคปซลอกดวย ซงขนตอนทสาคญใน

กระบวนการกอใหเกดโรคของเชอนน นอกจากจะ

อาศยการหลบเลยงภมคมกนรางกายแลว ยงตอง

อาศยการยดเกาะเซลลโฮสต ตลอดจนการสรางไบโอ

ฟลมเพอทาใหเชอสามารถอยในรางกายไดนานขน

ด ง น น จ งม ค ว าม เ ปน ไป ไ ด ว า เ ช อท ส ญ เ ส ยความสามารถในการสรางแคปซลนน ยงสามารถ

กอใหเกดโรคทมความรนแรงได

จากการศกษาทผานมานน พบวาสามารถแยก

เชอ S. suis ทไมสามารถจดอยในซโรไทปใดได (ซง

อาจเกดจากเชอไดสญเสยความสามารถในการสราง

แคปซล) ไดจากทงตวอยางสกรสขภาพดหรอสกร

ป ว ย (Gottschalk et al., 2013; Katsumi et al.,

1997) สาหรบสาเหตของการสญเสยแคปซลของเชอ

S. suis นน ไดมการศกษาในเชอ S. suis ซงมยนบงช

วาเปนซโรไทป 2 (หรอ 1/2) ทพบจากตวอยางสกร

ปวยดวยภาวะเยอบหวใจอกเสบ (Lakkitjaroen et

al., 2011 & 2014) ซงพบวาเกดการเปลยนแปลง

ของยนบางสวนทเกยวของกบการสรางแคปซลของ

เชอ จงทาใหเกดการสญเสยแคปซลขน โดยลกษณะการเปลยนแปลงของยนทพบจนทาใหเชอไมสามารถ

สรางแคปซลได ไดแก การเกด deletion หรอการ

เกด insertion ซงโดยสวนมากเปนพวก Insertion

Sequence (IS) element ตลอดจนการแทนทของ

นวคลโอไทดบางตว รวมถงการเกด frameshift

mutation อกดวย นอกจากน ในการศกษาดงกลาว

นยงพบอกวา เชอทปราศจากแคปซลนนสามารถยด

เกาะกบเกลดเลอดไดดกวาเชอทมแคปซล เนองจาก

การยดเกาะของเชอกบเกลดเลอดจดเปนขนตอนหนง

ทสาคญในกระบวนการเกดภาวะเยอบหวใจอกเสบ

(Sullam et al., 1996) การสญเสยแคปซลของเชอท

แ ย ก ไ ด น จ ง อ า จ เ ป นป ร ะ โ ยช น อ ย า ง ย ง ต อ

กระบวนการเกดโรค ซงจากรายงานการพบเชอ S.

suis ทปราศจากแคปซลเ พมมากขน ตลอดจน

ความสามารถในการยดเกาะโฮสตทเพมขนหลงการ

สญเสยแคปซล จงอาจเปนไปไดวา การสญเสย

แคปซลของเชอ S. suis อาจเปนประโยชนตอขนตอน

ใดขนตอนหนงของกระบวนการกอโรคของเชอหรออาจเกยวของกบความรนแรงของโรคอกดวย

สรป

เชอ Streptococcus suis เปนเชอแบคทเรย

ทสามารถตดตอจากสตวสคนทส าคญในหลาย

ประเทศ ซงการตดเชอนอาจทาใหเกดภาวะตดเชอใน

กระแสเลอด เยอหมสมองอกเสบ เยอบหวใจอกเสบ

รวมถงขออกเสบ ทงในมนษยและสกร โดยในผปวย

สวนใหญทหายจากภาวะเยอหมสมองอกเสบมกพบ

อาการหหนวกอยางถาวรตามมา โดยทวไปเชอ S.

suis จดเปนเ ชอทมแคปซล ซ ง เมออาศยความ

แตกตางกนของแอนตเจนบนผวของแคปซลของเชอ

ทาใหสามารถแบงเชอ S. suis ออกไดเปนหลายซโร

ไทป โดยการตรวจหาซโรไทปของเชอสามารถทาไดดวยการตรวจโดยวธทางซรมวทยา และ/หรอ วธ

multiplex PCR นอกจากนแคปซลของเชอยงจดเปน

ปจจยสาคญททาใหเกดความรนแรงของการเกดโรค

อกดวย อยางไรกตาม ไดมการศกษาในหลายประเทศ

พบวาเชอ S. suis ทแยกไดจากสกรปกตและสกรปวย

บางสวนเปนเชอทไมมแคปซลหม และยงพบอกวา

เชอเหลานมความสามารถในการยดเกาะเซลลตางๆ

ตลอดจนการสรางไบโอฟลมเพมขน จงเปนไปไดวา

แมวาจะมการยนยนวาแคปซลเปนปจจยสาคญทชวย

ใหเชอ S. suis สามารถกอโรคได แตการสญเสย


63

แคปซลของเชอ S. suis อาจเปนกลไกหนงทเปน

ประโยชนตอกระบวนการเกดโรคหรออาจเกยวของ

การทาใหเกดโรคทรนแรงขน


Arai, S., Tohya, M., Yamada, R., Osawa, R.,

Nomoto, R., Kawamura, Y. and Sekizaki,

T. 2015. Development of loop-mediated isothermal amplification to

detect Streptococcus suis and its

application to retail pork meat in Japan.

Int. J. Food Microbiol. 208: 35-42.

Arends, J.P., Hartwig, N., Rudolphy, M. and

Zanen, H.C. 1984. Carrier rate of

Streptococcus suis capsular type 2 in

palatine tonsils of slaughtered pigs. J.

Clin. Microbiol. 20(5): 945-947.

Baums, C.G. and Valentin-Weigand, P. 2009.

Surface-associated and secreted factors

of Streptococcus suis in epidemiology,

pathogenesis and vaccine

development. Anim. Health Res. Rev. 10(1): 65-83.

Benga, L., Friedl, P. and Valentin-Weigand, P.

2005. Adherence of Streptococcus suis

to porcine endothelial cells. J. Vet.

Med. B. Infect. Dis. Vet. Public Health.

52(9): 392-395.

Benga, L., Goethe, R., Rohde, M. and Valentin-

Weigand, P. 2004. Non-encapsulated

strains reveal novel insights in invasion

and survival of Streptococcus suis in

epithelial cells. Cell. Microbiol. 6(9):

867-881.

Bonifait, L., Gottschalk, M. and Grenier, D. 2010.

Cell surface characteristics of nontypeable

isolates of Streptococcus suis. FEMS

Microbiol. Lett. 311(2): 160-166.

Charland, N., Harel, J., Kobisch, M., Lacasse, S.

and Gottschalk, M. 1998. Streptococcus suis serotype 2 mutants deficient in

capsular expression. Microbiology. 144:

325-332.

Choi, S.M., Cho, B.H., Choi, K.H., Nam, T.S.,

Kim, J.T., Park, M.S., Kim, B.C., Kim, M.K.

and Cho, K.H. 2012. Meningitis caused

by Streptococcus suis: case report and

review of the literature. J. Clin. Neurol.

8(1): 79-82.

Clifton-Hadley, F.A., Alexander, T.J. and

Enright, M.R. 1986. Monitoring herds for

Streptococcus suis type 2: chance

contamination of slaughter pigs. Vet.

Rec. 118(10): 274. Cloutier, G., D'Allaire, S., Martinez, G.,

Surprenant, C., Lacouture, S. and

Gottschalk, M. 2003. Epidemiology of

Streptococcus suis serotype 5 infection

in a pig herd with and without clinical

disease. Vet. Microbiol. 97(1-2), 135-151.

Corbett, D. and Roberts, I.S. 2009. The role of

microbial polysaccharides in host-

pathogen interaction. F1000 Biol. Rep.

1: 30.


64

Costa, A.T., Lobato, F.C., Abreu, V.L., Assis, R.A.,

Reis, R. and Uzal, F.A. 2005. Serotyping

and evaluation of the virulence in mice

of Streptococcus suis strains isolated

from diseased pigs. Rev. Inst. Med. Trop.

Sao Paulo 47(2): 113-115.

Crum, N. F., Barrozo, C. P., Chapman, F. A.,

Ryan, M. A. and Russell, K. L. 2004. An outbreak of conjunctivitis due to a

novel unencapsulated Streptococcus

pneumoniae among military trainees.

Clin. Infect. Dis. 39(8): 1148-1154.

Fittipaldi, N., Segura, M., Grenier, D. and

Gottschalk, M. 2012. Virulence factors

involved in the pathogenesis of the

infection caused by the swine pathogen

and zoonotic agent Streptococcus suis.

Future Microbiol. 7(2): 259-279.

Fongcom, A., Pruksakorn, S., Netsirisawan, P.,

Pongprasert, R. and Onsibud, P. 2009.

Streptococcus suis infection: a

prospective study in northern Thailand. Southeast Asian J. Trop. Med. Public

Health. 40(3): 511-517.

Gottschalk, M., Higgins, R., Jacques, M., Mittal,

K.R. and Henrichsen, J. 1989.

Description of 14 new capsular types of

Streptococcus suis. J. Clin. Microbiol.

27(12): 2633-2636.

Gottschalk, M., Lacouture, S., Bonifait, L., Roy, D.,

Fittipaldi, N. and Grenier, D. 2013.

Characterization of Streptococcus suis

isolates recovered between 2008 and

2011 from diseased pigs in Quebec,

Canada. Vet. Microbiol. 162(2-4): 819-825.

Gottschalk, M. and Segura, M. 2000. The

pathogenesis of the meningitis caused

by Streptococcus suis: the unresolved

questions. Vet. Microbiol. 76(3): 259-272.

Gottschalk, M., Segura, M. and Xu, J. 2007. Streptococcus suis infections in

humans: the Chinese experience and

the situation in North America. Anim.

Health. Res. Rev. 8(1): 29-45.

Goyette-Desjardins, G., Auger, J.P., Xu, J.,

Segura, M. and Gottschalk, M. 2014.

Streptococcus suis, an important pig

pathogen and emerging zoonotic agent-

an update on the worldwide

distribution based on serotyping and

sequence typing. Emerg. Microbes

Infect. 3(6): e45.

Higgins, R. and Gottschalk, M. 2006. Diseases

of Swine. Blackwell publishing, Ames, Iowa.

Hill, J.E., Gottschalk, M., Brousseau, R., Harel,

J., Hemmingsen, S.M. and Goh, S.H.

2005. Biochemical analysis, cpn60 and

16S rDNA sequence data indicate that

Streptococcus suis serotypes 32 and 34,

isolated from pigs, are Streptococcus

orisratti. Vet. Microbiol. 107(1-2): 63-69.

Houde, M., Gottschalk, M., Gagnon, F., Van

Calsteren, M.R. and Segura, M. 2012.


65

Streptococcus suis capsular

polysaccharide inhibits phagocytosis

through destabilization of lipid

microdomains and prevents

lactosylceramide-dependent recognition.

Infect. Immun. 80(2): 506-517.

Ip, M., Fung, K.S., Chi, F., Cheuk, E.S., Chau,

S.S., Wong, B.W., Lui, S., Hui, M., Lai, R.W. and Chan, P.K. 2007. Streptococcus suis

in Hong Kong. Diagn. Microbiol. Infect.

Dis. 57(1): 15-20.

Ishida, S., Tien le, H.T., Osawa, R., Tohya, M.,

Nomoto, R., Kawamura, Y., Takahashi,

T., Kikuchi, N., Kikuchi, K. and Sekizaki, T.

2014. Development of an appropriate

PCR system for the reclassification of

Streptococcus suis. J. Microbiol.

Methods. 107: 66-70.

Katsumi, M., Kataoka, Y., Takahashi, T., Kikuchi,

N. and Hiramune, T. 1997. Bacterial

isolation from slaughtered pigs

associated with endocarditis, especially the isolation of Streptococcus suis. J.

Vet. Med. Sci. 59(1): 75-78.

Kerdsin, A., Dejsirilert, S., Sawanpanyalert, P.,

Boonnark, A., Noithachang, W.,

Sriyakum, D., Simkum, S., Chokngam, S.,

Gottschalk, M., Akeda, Y. and Oishi, K.

2011. Sepsis and spontaneous bacterial

peritonitis in Thailand. Lancet.

378(9794): 960.

Kerdsin, A., Akeda, Y., Hatrongjit, R.,

Detchawna, U., Sekizaki, T., Hamada, S.,

Gottschalk, M. and Oishi, K. 2014.

Streptococcus suis serotyping by a new

multiplex PCR. J. Med. Microbiol. 63:

824-830.

Lakkitjaroen, N., Takamatsu, D., Okura, M.,

Sato, M., Osaki, M. and Sekizaki, T. 2011. Loss of capsule among Streptococcus

suis isolates from porcine endocarditis

and its biological significance. J. Med.

Microbiol. 60: 1669-1676.

Lakkitjaroen, N., Takamatsu, D., Okura, M.,

Sato, M., Osaki, M. and Sekizaki, T. 2014.

Capsule loss or death: the position of

mutations among capsule genes sways

the destiny of Streptococcus suis. FEMS

Microbiol. Lett. 354(1): 46-54.

Liu, Z., Zheng, H., Gottschalk, M., Bai, X., Lan,

R., Ji, S., Liu, H. and Xu, J. 2013.

Development of multiplex PCR assays

for the identification of the 33

serotypes of Streptococcus suis. PLoS

One. 8(8): e72070. Lun, Z.R., Wang, Q.P., Chen, X.G., Li, A.X. and

Zhu, X.Q. 2007. Streptococcus suis: an

emerging zoonotic pathogen. Lancet

Infect. Dis. 7(3): 201-209.

Meijerink, M., Ferrando, M.L., Lammers, G.,

Taverne, N., Smith, H.E. and Wells, J.M.

2012. Immunomodulatory effects of

Streptococcus suis capsule type on


66

human dendritic cell responses,

phagocytosis and intracellular survival.

PLoS One. 7(4): e35849.

Melchiorre, S., Camilli, R., Pietrantoni, A.,

Moschioni, M., Berti, F., Del Grosso, M.,

Superti, F., Barocchi, M. A. and Pantosti,

A. 2012. Point mutations in wchA are

responsible for the non-typability of two invasive Streptococcus

pneumoniae isolates. Microbiology.

158: 338-344.

Nghia, H.D., Hoa, N.T., Linh le, D., Campbell,

J., Diep, T.S., Chau, N.V., Mai, N.T., Hien,

T.T., Spratt, B., Farrar, J. and Schultsz, C.

2008. Human case of Streptococcus

suis serotype 16 infection. Emerg.

Infect. Dis. 14(1): 155-157.

Nghia, H.D., Tu le, T.P., Wolbers, M., Thai, C.Q.,

Hoang, N.V., Nga, T.V., Thao le, T.P., Phu,

N.H., Chau, T.T., Sinh, D.X., Diep, T.S.,

Hang, H.T., Truong, H., Campbell, J.,

Chau, N.V., Chinh, N.T., Dung, N.V., Hoa, N.T., Spratt, B.G., Hien, T.T., Farrar, J. and

Schultsz, C. 2011. Risk factors of

Streptococcus suis infection in Vietnam.

A case-control study. PLoS One. 6(3):

e17604.

Nomoto, R., Maruyama, F., Ishida, S., Tohya,

M., Sekizaki, T. and Osawa R. 2015.

Reappraisal of the taxonomy of

Streptococcus suis serotypes 20, 22 and

26: Streptococcus parasuis sp. nov. Int.

J. Syst. Evol. Microbiol. 65: 438-443.

Okura, M., Lachance, C., Osaki, M., Sekizaki, T.,

Maruyama, F., Nozawa, T., Nakagawa, I.,

Hamada, S., Rossignol, C., Gottschalk, M.

and Takamatsu, D. 2014. Development

of a two-step multiplex PCR assay for

typing of capsular polysaccharide synthesis gene clusters of

Streptococcus suis. J. Clin. Microbiol.

52(5): 1714-1719.

Okwumabua, O., O'Connor, M. and Shull, E.

2003. A polymerase chain reaction

(PCR) assay specific for Streptococcus

suis based on the gene encoding the

glutamate dehydrogenase. FEMS

Microbiol. Lett. 218(1): 79-84.

Padungtod, P., Tharavichitkul, P., Junya, S.,

Chaisowong, W., Kadohira, M., Makino,

S. and Sthitmatee, N. 2010. Incidence

and presence of virulence factors of

Streptococcus suis infection in slaughtered pigs from Chiang Mai,

Thailand. Southeast Asian J. Trop. Med.

Public Health. 41(6): 1454-1461.

Perch, B., Pedersen, K.B. and Henrichsen, J.

1983. Serology of capsulated

streptococci pathogenic for pigs: six

new serotypes of Streptococcus suis. J.

Clin. Microbiol. 17(6): 993-996.

Princivalli, M.S., Palmieri, C., Magi, G., Vignaroli,

C., Manzin, A., Camporese, A., Barocci,


67

S., Magistrali, C. and Facinelli, B. 2009.

Genetic diversity of Streptococcus suis

clinical isolates from pigs and humans

in Italy (2003-2007). Euro Surveill.

14(33): pii: 19310.

Salasia, S. I., Lammler, C. and Herrmann, G.

1995. Properties of a Streptococcus suis

isolate of serotype 2 and two capsular mutants. Vet. Microbiol. 45(2-3): 151-156.

Segura, M. 2009. Streptococcus suis: an

emerging human threat. J. Infect. Dis.

199(1): 4-6.

Segura, M. and Gottschalk, M. 2002.

Streptococcus suis interactions with the

murine macrophage cell line J774:

adhesion and cytotoxicity. Infect.

Immun. 70(8): 4312-4322.

Smith, H. E., Damman, M., van der Velde, J.,

Wagenaar, F., Wisselink, H. J., Stockhofe-

Zurwieden, N. and Smits, M. A. 1999.

Identification and characterization of

the cps locus of Streptococcus suis serotype 2: the capsule protects against

phagocytosis and is an important

virulence factor. Infect. Immun. 67(4):

1750-1756.

Staats, J.J., Feder, I., Okwumabua, O. and

Chengappa, M.M. 1997. Streptococcus

suis: past and present. Vet. Res.

Commun. 21(6): 381-407.

Sullam, P. M., Bayer, A. S., Foss, W. M. and

Cheung, A. L. 1996. Diminished platelet

binding in vitro by Staphylococcus

aureus is associated with reduced

virulence in a rabbit model of infective

endocarditis. Infect. Immun. 64(12):

4915-4921.

Takeuchi, D., Kerdsin, A., Pienpringam, A.,

Loetthong, P., Samerchea, S., Luangsuk,

P., Khamisara, K., Wongwan, N., Areeratana, P., Chiranairadul, P.,

Lertchayanti, S., Petcharat, S., Yowang,

A., Chaiwongsaen, P., Nakayama, T.,

Akeda, Y., Hamada, S., Sawanpanyalert,

P., Dejsirilert, S. and Oishi, K. 2012.

Population-based study of

Streptococcus suis infection in humans

in Phayao Province in northern

Thailand. PLoS One. 7(2): e31265.

Tan, J.H., Yeh, B.I. and Seet, C.S. 2010.

Deafness due to haemorrhagic

labyrinthitis and a review of relapses in

Streptococcus suis meningitis.

Singapore Med. J. 51(2): e30-33. Tanabe, S., Bonifait, L., Fittipaldi, N., Grignon,

L., Gottschalk, M. and Grenier, D. 2010.

Pleiotropic effects of polysaccharide

capsule loss on selected biological

properties of Streptococcus suis. Can. J.

Vet. Res. 74(1): 65-70.

Tien le, H.T., Nishibori, T., Nishitani, Y.,

Nomoto, R. and Osawa, R. 2013.

Reappraisal of the taxonomy of

Streptococcus suis serotypes 20, 22, 26,


68

and 33 based on DNA-DNA homology

and sodA and recN phylogenies. Vet.

Microbiol. 162(2-4): 842-849.

Wei, Z., Li, R., Zhang, A., He, H., Hua, Y., Xia, J.,

Cai, X., Chen, H. and Jin, M. 2009.

Characterization of Streptococcus suis

isolates from the diseased pigs in China

between 2003 and 2007. Vet. Microbiol. 137(1-2): 196-201.

Wertheim, H.F., Nghia, H.D., Taylor, W. and

Schultsz, C. 2009. Streptococcus suis:

an emerging human pathogen. Clin.

Infect. Dis. 48(5): 617-625.

Wisselink, H.J., Reek, F.H., Vecht, U.,

Stockhofe-Zurwieden, N., Smits, M.A.

and Smith, H.E. 1999. Detection of

virulent strains of Streptococcus suis

type 2 and highly virulent strains of

Streptococcus suis type 1 in tonsillar

specimens of pigs by PCR. Vet.

Microbiol. 67(2): 143-157.

Wisselink, H.J., Smith, H.E., Stockhofe-Zurwieden, N., Peperkamp, K. and

Vecht, U. 2000. Distribution of capsular

types and production of muramidase-

released protein (MRP) and

extracellular factor (EF) of

Streptococcus suis strains isolated from

diseased pigs in seven European

countries. Vet. Microbiol. 74(3): 237-248.

Yu, H., Jing, H., Chen, Z., Zheng, H., Zhu, X.,

Wang, H., Wang, S., Liu, L., Zu, R., Luo,

L., Xiang, N., Liu, H., Liu, X., Shu, Y., Lee,

S.S., Chuang, S.K., Wang, Y., Xu, J. and

Yang, W. 2006. Human Streptococcus

suis outbreak, Sichuan, China. Emerg.

Infect. Dis. 12(6): 914-920.


สตวแพทยสตวแพทยมหานครสารมหานครสาร JJOOUURRNNAALL OOFF MMAAHHAANNAAKKOORRNN VVEETTEERRIINNAARRYY MMEEDDIICCIINNEE


การตรวจหาเชอ Brucella melitensis โดยวธ Real-time PCR และวธการเพาะแยกเชอ

จากตวอยางอวยวะของแพะเนอในประเทศไทย

ลขณา รามรน1 เรขา คณตพนธ2 มนยา เอกทตร2 และองอาจ เลาหวนจ1,#

1ภาควชาจลชววทยาและวทยาภมคมกน คณะสตวแพทยศาสตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร กรงเทพมหานคร 10900 2สถาบนสขภาพสตวแหงชาต กรมปศสตว กรงเทพมหานคร 10900

บทคดยอ: Brucella melitensis เปนสาเหตหลกของโรคบรเซลโลสสในแพะ ทาใหแพะเกดการแทงลก

นอกจากนโรคบรเซลโลสสยงเปนโรคตดตอระหวางสตวและคนทสาคญ วธมาตรฐานสาหรบการชนสตรโรค บรเซลโลสสคอวธการเพาะแยกเชอ แตเชอบรเซลลาเปนเชอทกออนตรายตอผปฏบตงาน และตองใชเวลานาน

ในการวเคราะห ดงนนงานวจยครงนมวตถประสงค เพอประเมนความสามารถวธการตรวจหาเชอ B.

melitensis โดยวธ Real-time PCR เปรยบเทยบกบวธการเพาะแยกเชอ โดยเกบตวอยางอวยวะจากแพะเนอ

ทใหผลบวกและผลสงสยทางซรมวทยา liver, spleen, mammary/inguinal lymph node, mandibular

lymph node, popliteal lymph node, parotid lymph node, pre-femoral lymph node และ pre-

scapular lymph node ทงหมด 320 ตวอยาง โดย primers และ probe ทใชมความจาเพาะตอยน IS711

ของโรคบรเซลโลสส ผลการศกษาพบวา ความเขมขนของดเอนเอตาสดท วธ Real-time PCR สามารถ

วเคราะหได คอ 2 เฟมโตกรม ไมมปฏกรยาขามกบแบคทเรยชนดอน และวธ Real-time PCR มคาความไว

92.45% ความจาเพาะ 92.88% และคาความถกตอง 92.81% ดงนนวธ Real-time PCR สามารถนามาใชใน

การตรวจวนจฉยโรคบรเซลโลสสทมความจาเพาะ ความไว รวดเรว และปลอดภย

คาสาคญ: เชอ Brucella melitensis วธ Real-time PCR วธการเพาะแยกเชอ แพะเนอ #ผรบผดชอบบทความ สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 35-46. E-mail address: [email protected]

ลขณา รามรน และคณะ / สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 35-46.

36

Detection of Brucella melitensis Using Real-time PCR and Isolation from

Organs of Meat Goat in Thailand

Luckana Ramrin1, Reka Kanitpun2, Monaya Ekgatat2 and Ongard Lawhavinit1,#

1Department of Veterinary Microbiology and Immunology, Faculty of Veterinary Medicine,

Kasetsart University, Bangkok 10900 2National Institute of Animal Health, Department of Livestock Development, Bangkok 10900

Abstract: Brucella melitensis is the most prevalent causative agent of goat brucellosis: one

of the most important zoonotic diseases related to the reproductive losses and abortion.

Conventional culture method is considered the gold standard for brucellosis diagnosis.

However, this method is hazardous, labor-intensive and time-consuming. Therefore, the

present study aims to evaluate an efficiency of Real-time PCR diagnosis method: the more

convenient and less time consuming method by comparing to culture method. Total 320

samples of liver, spleen, mammary/inguinal lymph node, mandibular lymph node, popliteal

lymph node, parotid lymph node, pre-femoral lymph node and pre-scapular lymph node were collected from seropositive and suspicious meat goats. Primer and probe specific for

the insertion sequence (IS711) gene of B. melitensis were used. The limit of detection (LoD)

of Real-time PCR assay is 2 femtogram (fg) with no cross reactions with other 20 related

pathogens. Compared to the gold standard method, Real-time PCR assay contains 92.45%

sensitivity, 92.88% specificity and 92.81% accuracy. In conclusion, Real-time PCR assay is

sensitivity and specificity method for the rapid and safe detection of brucellosis diagnosis.

Keywords: Brucella melitensis, Real-time PCR, Isolation, Meat goat #Corresponding author J. Mahanakorn Vet. Med. 2016. 11(1): 35-46. E-mail address: [email protected]

บทนา

โรคบรเซลโลสส (Brucellosis) มสาเหตมา

จากเชอบรเซลลา พบไดในสตวเลยงลกดวยนมหลาย

ชนด รวมทงในปศสตว เชน โค กระบอ สกร แพะ

แ ก ะ แ ล ะ ส ต ว ป า ( Lapaque et al., 2005)

โดยเฉพาะโรคบรเซลโลสสในแพะ เกดจากเชอ

แบคทเรย Brucella melitensis ทมการระบาดทว

โลก แพะทเปนโรคจะเกดความลมเหลวของระบบ


37

สบพนธ เชน ทาใหเกดการแทงลก มดลกอกเสบ

อณฑะอกเสบ ทาใหแพะเปนหมน ผสมไมตด หรอ

ผสมตดยาก เกดขออกเสบ และใหผลผลตลดลง

(Blood and Henderson, 1968) โดยแพะมกจะ

แทงในระยะสดทายของการตงทอง แตในรายทไมเกด

การแทง แพะจะปลอยเชอมาพรอมกบนานม รก

หรอนาคราเวลาคลอด แพะทเปนโรคสามารถแพร

เชอตอไปยงสตวอนได (Nielsen, 2002) นอกจากนโรคบรเซลโลสสยงเปนโรคตดตอระหวางสตวและคน

พบวาโรคบรเซลโลสส ทเกดจากเชอ B. melitensis

เปนสายพนธทกอโรครนแรงมากทสดในคน โดยจะ

แสดงอาการคลายไขหวด ทาใหคนทตดเชอมอาการ

ปวดศรษะ ไขสงๆ ตาๆ (undulant fever) ปวดตาม

ขอ สนและออนแรง หรอมการตดเชอเฉพาะท เชน

กระดก เนอเยอ และอวยวะในระบบตางๆ แตในราย

ทรนแรงจะมผลกบระบบประสาทและหวใจ การ

รกษาตองตอเนองและใชเวลานาน (Pellicer et al.,

1988) โรคบรเซลโลสสจงจดเปนโรคสาคญทสราง

ความสญเสยทงระบบสาธารณสขและเศรษฐกจ

(Godfroid et al., 2005; Pappas et al., 2006)

ปจจบนการตรวจวนจฉยโรคบรเซลโลสสทาง

หองปฏบตการของกรมปศสตว ใชการตรวจทางซรมวทยาโดยว ธ Rose bengal test (RBT), Enzyme-

linked immunosorbent assay (ELISA) แ ล ะ

Complement fixation test (CFT) เพ อ ต รวจห า

แอนตบอดตอเชอบรเซลลา แตการตรวจทางซรม

วทยาจะมปฏกรยาขามกบเชอแบคทเรยอนๆ ได เชน

Yersinia enterocolitica O:9 (Bounaadja et al.,

2009) วธการชนสตร โรคบรเซลโลสสทไดรบการ

ยอมรบวาสมบรณทสดในปจจบน คอ วธการเพาะ

แยกเชอ ถอวาเปนวธมาตรฐานสาหรบชนสตรโรคบร

เซลโลสส (Alton et al., 1975) แตการปฏบตการ

เกยวกบเชอบรเซลลามความเสยงตอการตดเชอของ

ผปฏ บ ตงาน ดงนนจ งจาเปนตองใช เครองมอท

เหมาะสมและมประสทธภาพ รวมทงผปฏบตงานตอง

มท กษะในการใช เครองมอและตองปฏ บ ตตาม

มาตรฐานความปลอดภยทางชวภาพในหองปฏบตการ

ระดบ 3 เพอลดความเสยงของผปฏบตงาน (OIE,

2012) นอกจากนการเพาะแยกเชอตงแตขนตอนการ

เตรยมตวอยาง จนทราบผลการจาแนกเชอตองใชเวลานาน (Bounaadja et al., 2009) ตอมาจงไดม

การนาเทคนคทางชวโมเลกลโดยวธ conventional

PCR มาใชในการพสจนเชอบรเซลลา ออกจากเชอ

แบคทเรยชนดอน (Kanitpun et al., 2006) อยางไร

กดมขอจากดของวธคอไมสามารถตรวจวเคราะหเชง

ปรมาณได นอกจากนนยงกอใหเกดการฟงกระจาย

แ ล ะ ก า ร ป น เ ป อ น ข อ ง PCR products จ า ก

ก ร ะ บ ว น ก า ร ท า PCR โ ด ย ว ธ agarose gel

electrophoresis ซงเปนสาเหตสาคญของการเกด

การปนเปอนแบบ carry over contamination ทา

ให เกดผลบวกเทจได (false positive) (Kwok and

Higuchi, 1989) วธ Real-time PCR เปนเทคนคการ

เพมขยายปรมาณดเอนเอจากตวอยาง โดยสามารถ

ตรวจวดปรมาณ PCR products ท เกดขนจรง ณ เวลานนๆ มวธทาสะดวก ไมยงยาก มอนตรายนอย

และมความไวสง (Bricker, 2002) สามารถตรวจโรค

โดยตรงจากตวอยางสงตรวจ

ด งนนงาน วจยค รงนม วตถประสงค เพ อ

ประเมนความสามารถวธการตรวจวนจฉยโรคบร

เซลโลสสสาหรบใชตรวจหาเชอ B. melitensis โดยวธ

Real-time PCR เปรยบเทยบกบวธการเพาะแยกเชอ

ในแพะทเลยงในประเทศไทย เพอนามาใชในการตรวจ

วนจฉยโรคทมความปลอดภย รวดเรว ถกตอง แมนยา

และสามารถนาไปใชตรวจในหองปฏบตการได


38

ตารางท 1 รายละเอยดลาดบเบส (sequence) ของ primers และ probe

Name Primer sequence 5’-3’ Location

Forward-primer CGCTCGCGCGGTGGAT 421

Reverse-primer CTTGAAGCTTGCGGACAGTCACC 511

Probe FAM-ACGACCAAGCTGCATGCTGTTGTCGATG-TAMRA 438

ทมา: Bounaadja et al. (2009)


ต ว อ ย า งส าห ร บ ก า รท วน ส อบ ค ว าม ใช ไ ด

(Validation) ของวธ Real-time PCR

- เ ช อ อ า ง อ ง ( reference strain) ใ ช เ ช อ B.

melitensis biovar 1 ref 16M ATCC 23456

สาหรบทดสอบความไว (Analytical Sensitivity,

ASe หรอคา Limit of Detection, LoD)

- เ ช อ แ บ คท เร ย ช น ด อ น (non-Brucella spp.)

จานวน 20 ตวอยาง สาหรบทดสอบความจาเพาะ

(Analytical Specificity, ASp)

ตวอยางอวยวะสาหรบทดสอบเปรยบเทยบวธการ

เพาะแยกเชอกบวธ Real-time PCR

เปนตวอยางอวยวะจากแพะเนอทใหผลบวก

และผลสงสยทางซรมวทยา โดยวธ Rose bengal

test (RBT), Complement fixation test (CFT)

และวธ Enzyme-linked immunosorbent assay

(ELISA) จากตวอยางแพะเนอ จานวน 40 ตว โดย

เกบในระหวางป พ.ศ. 2557 ทาการเกบตวอยางจาก

ตอมนาเหลองและตวอยางอวยวะ ไดแก liver,

spleen, mammary/inguinal lymph node,

mandibular lymph node, popliteal lymph

node, parotid lymph node, prefemoral

lymph node แ ล ะ pre-scapular lymph node

ทงหมด 8 ตวอยางตอตว รวมตวอยางทงหมด 320

ตวอยาง

Primers และ probe

Primers และ probe ทใชมความจาเพาะตอ

ยน IS711 ของโรคบรเซลโลสส ซง probe ทใชเปน

ชนด hydrolysis probe ท ตดฉลากดวย FAM (6-

carboxyfluorescein) ทดานปลาย 5’ ทาหนาทเปน

reporter dye แ ล ะ TAMRA (6-carboxy-tetra-

methyl-rhodomine) ทปลาย 3’ เปน quencher

โดยมรายละเอยดลาดบเบสแสดงในตารางท 1

การเตรยมดเอนเอของเชออางอง

เลยงเชอ B. melitensis biovar 1 ref 16M

ATCC 23456 บนอาหาร selective media จากนน

นาไป บมใน 5% CO2 incubator ท อณ หภม 37

องศาเซลเซยส นาน 4 วน นาโคโลนปรมาณ 1 ลป

มาสกดดเอนเอ โดยใชชดสกดดเอนเอสาเรจรป QIA®

DNA Mini Kit (Qiagen, Cat. No. 51306) ว ธการ

และขนตอนตามขอบงใชของบรษทผผลต จากนนวด

ปรมาณดเอนเอดวยเครองสเปกโตรโฟโตมเตอร

(SmartSpecTM Plus, Biorad) ทความยาวคลนแสง

260 นาโนเมตร เกบทอณหภม -20 องศาเซลเซยส


39

การทดสอบหาสภาวะท เหมาะสมของปฏกรยา

Real-time PCR

น าด เอน เอของเชอ อางอ ง B. melitensis

biovar 1 ref 16M ATCC 23456 ทาเปนตวควบคม

บวก และใชนากลนทปราศจาก RNase และ DNase

แทนดเอนเอ เปนตวควบคมลบ มาทาปฏกรยา Real-

time PCR โดยใชเครอง LightCycler®480 (Roche,

Germany) แตละปฏกรยามปรมาตร 20 ไมโครลตร ป ระก อบ ด วย น าย า LightCycler®480 Probes

Master (Roche, Germany) (2x) 10 ไม โค รล ต ร

Forward-primer Reverse-primer แ ล ะ Probe

(Sigma-Proligo, Singapore) เขมขน 10 ไมโครโมล

อยางละ 0.5 ไมโครลตร นากลน 3.5 ไมโครลตร และ

DNA template 5 ไมโครลตร โดยตงโปรแกรมดงน

Pre-incubation 95 องศาเซลเซยส เปนเวลา 10

นาท Amplification 95 องศาเซลเซยส เปนเวลา 15

วนาท และ 60 องศาเซลเซยส เปนเวลา 40 วนาท

จานวน 45 รอบ และ Cooling ท 40 องศาเซลเซยส

เปนเวลา 30 วนาท เมอปฏกรยาสมบรณจะไดคา

Crossing point (Cp) ซงเปนจานวนรอบทแสดงผล

เปนบวก ทตรวจวดสญญาณไดดวย Software ของ

เครอง LightCycler®480 ตวอยางทใหผลเปนบวก จะใหคา Cp นอยกวา 45 รอบ

การทา Standard curve

เจอจางดเอนเอของเชออางอง B. melitensis

biovar 1 ref 16M ATCC 23456 ดวยนากลนแบบ

10-fold dilution ทระดบความเขมขน 10-1 ถง 10-

10 จากนนนาแตละความเขมขนมาทาปฏกรยา Real-

time PCR โดยใช primers และ probe ชดนายา

และวธการทดสอบโดยวธ Real-time PCR ตามทได

กลาวไวขางตน คา Cp ทไดถกคานวณโดย Software

ของเครอง LightCycler®480 ซงพจารณาจากคา

Efficiency; E คอการทไดจานวนเพมเปน 2 copy

ตอรอบ (อโณทย, 2549) เพอแสดงถงปฏกรยาทม

ประสทธภาพมากทสด

การทดสอบความไว (Analytical Sensitivity;

ASe หรอคา Limit of Detection; LoD)

ความไวจะตองพจารณาจากคาความเขมขนของดเอนเอตาสดท ว ธ Real-time PCR สามารถ

ตรวจวดได (Limit of Detection; LoD) โดยนาด

เอนเอของเชออางอง B. melitensis biovar 1 ref

16M ATCC 23456 ททราบคาความเขมขนของดเอน

เอมาเจอจางดวยนากลนแบบ 10-fold dilution

จากนนนามาทดสอบโดยวธ Real-time PCR ตามท

ไดกลาวไวขางตน และนาขอมลทไดมาคานวณหาคา

ส ม ป ร ะ ส ท ธ ก า ร ต ด ส น ใ จ (Coefficient of

determination; R2) ซ งค า R2 ควรมค ามากกวา

0.99

ก า ร ท ด ส อ บ ค ว า ม จ า เพ า ะ ( Analytical

Specificity, ASp)

ทาการทดสอบกบเชอแบคท เรยชนด อน (non-Brucella spp.) จานวน 20 ตวอยาง สกดด

เอนเอโดยใชชดสกดดเอนเอสาเรจรป QIA® DNA

Mini Kit (Qiagen, Cat. No. 51306) ว ธ ก ารและ

ขนตอนตามขอบงใชของบรษทผผลต จากนนวด

ปรมาณดเอนเอดวยเครองสเปกโตรโฟโตมเตอร

(SmartSpecTM Plus, Biorad) ทความยาวคลนแสง

260 นาโนเมตร นามาเจอจางดวยนากลนใหมความ

เขมขน เท ากนท ก ตวอยางเพ อ เปรยบ เท ยบผล

หลงจากนนนามาทาปฏกรยา Real-time PCR โดย

ใช primers และ probe ชดนายาและวธการทดสอบ


40

โดยวธ Real-time PCR ตามทไดกลาวไวขางตน เพอ

ทดสอบหาความจาเพาะตอเชอ Brucella spp. ผล

การทดสอบพจารณาจากคา Cp ตวอยางทใหผลเปน

ลบและตวควบคมลบ จะใหคา Cp มากกวา 45 รอบ

ขนตอนการทดสอบเปรยบเทยบระหวางวธการ

เพาะแยกเชอกบวธ Real-time PCR

การทดสอบตวอยางอวยวะ โดยวธการเพาะแยกเชอ ตดตวอยางอวยวะเปนชนเลกๆ ประมาณ 5

ก ร ม ใ ส ใ น Tissue grinder เ ต ม ส า ร ล ะ ล า ย

phosphate-buffer saline (PBS) pH 7.2 ปรมาตร

5 มลลลตร บดเนอเยอ ประมาณ 5-10 นาท นาสวน

ของ suspension จานวน 1 มลลลตร ใสหลอดไว

สาหรบใชในการสกดดเอนเอ (DNA extraction)

และดดสวนของ suspension จานวน 0.1 มลลลตร

หยดบนอาหารเลยงเชอ selective media จานวน 2

เพลท โดยวธ Spread plate หลงจากนนนาไปบมใน

5% CO2 incubator ทอณหภม 37 องศาเซลเซยส

นาน 5-10 วน ทาการพสจนเชอดวยวธทางชวเคม

และวธ conventional PCR

การทดสอบตวอยางอวยวะ โดยวธ Real-time PCR นาตวอยางจากการเตรยมตวอยางขางตน

ปรมาตร 200 ไมโครลตร มาสกดดเอนเอ โดยใชชด

สกดดเอนเอสาเรจรป DNeasy® Blood&Tissue Kit

(Qiagen, Germany, Cat. No. 69506) ว ธการและ

ขนตอนตามขอบงใชของบรษทผผลต จากนนนาดเอน

เอทสกดไดจากตวอยาง มาทาการทดสอบโดยวธ

Real-time PCR ตามทไดกลาวไวในหวขอการทดสอบ

โดยวธ Real-time PCR ตวอยางทใหผลเปนบวกและ

ตวควบคมบวก จะใหคา Cp นอยกวา 45 รอบ

การวเคราะหผลการทดสอบหาคาความไว คา

ความจาเพาะ และคาความถกตองของวธทดสอบ

หลงจากทาการตรวจหาเชอ B. melitensis

โดยวธการเพาะแยกเชอ และวธ Real-time PCR

เสรจแลว นาขอมลจากผลการทดลองมาวเคราะหหา

ความสมพนธกน โดยใชผลการทดลองโดยวธ Real-

time PCR เทยบกบวธการเพาะแยกเชอ แลวหาคา

ความไวของวธทดสอบ (Sensitivity) ความจาเพาะของวธทดสอบ (Specificity) และคาความถกตอง

ของวธทดสอบ (Accuracy) ของวธ Real-time PCR

เทยบกบวธการเพาะแยกเชอทสมพนธกน โดยวธ

chi-square และใชระดบความเชอมนท 95%

ผลการทดลอง

การทา Standard curve

จากการทา Standard curve ทระดบความ

เขมขน 10-1 ถง 10-10 นามาวเคราะหตามสภาวะท

กาหนดของวธ Real-time PCR เมอปฏกรยาดาเนน

ไปครบ 45 รอบ ไดคา Crossing point (Cp) ดงน ท

ระดบความเขมขน 10-1 Cp = 14.04, 10-2 = 17.80,

10-3 = 21.47, 10-4 = 25.09, 10-5 = 28.89, 10-6 =

32.73 และ 10-7 = 36.41 ตามลาดบ ผลการคานวณค า Efficiency; E จาก เค ร อ ง LightCycler®480

สามารถหาคา E ไดเทากบ 1.857 (รปท 1) ซงแสดง

ให เห น วา primers และ probe ท ออกแบบ ให

ปฏกรยาทมประสทธภาพ

การทดสอบความไว (Analytical Sensitivity;

ASe หรอคา Limit of Detection; LoD)

จากการวดปรมาณดเอนเอของเชออางอง B.

melitensis biovar 1 ref 16M ATCC 23456 ดวย

เครองสเปกโตรโฟโตมเตอร (SmartSpecTM Plus,


41

Biorad) ทความยาวคลนแสง 260 นาโนเมตร นาด

เอนเอทวดไดมาเจอจางดวยนากลนใหมคา 20 นาโน

กรม/ปฏกรยา จากนนเจอจางดวยนากลนแบบ 10-

fold dilution พบวาปรมาณดเอนเอตาสด (Limit of

Detection; LoD) ท ว ธ Real-time PCR สามารถ

วเคราะหไดคอ 2 เฟมโตกรม (รปท 2) เมอสราง

กราฟมาตรฐานของความสมพนธระหวางความ

เขมขนของดเอนเอและคา Cp กราฟทไดเปนเสนตรง สามารถวเคราะหไดคอ 2 เฟมโตกรม (รปท 2) เมอ

สรางกราฟมาตรฐานของความสมพนธระหวางความ

เขมขนของดเอนเอและคา Cp กราฟทไดเปนเสนตรง

และความสมพนธในเชงถดถอย หรอสมประสทธการ

ต ด ส น ใ จ (Coefficient of determination; R2)

เทากบ 0.999 แสดงดงรปท 3

การทดสอบความจาเพาะ (Analytical Specificity,

ASp) จากการทดสอบปฏกรยา Real-time PCR กบ

เชอแบคทเรยชนดอน (non-Brucella spp.) จานวน

20 ตวอยาง ทความเขมขนของดเอนเอ 2 นาโนกรม/

ปฏกรยา พบวาใหผลลบทกตวอยาง ซงใหคา Cp

มากกวา 45 รอบ แสดงดงตารางท 2

การทดสอบเปรยบเทยบระหวางวธการเพาะแยก

เชอกบวธ Real-time PCR

จากการตรวจหาเชอ B. melitensis จาก

ตวอยางอวยวะของแพะเนอ วทยา liver, spleen,

mammary/inguinal lymph node, mandibular

lymph node, popliteal lymph node, parotid

lymph node, pre-femoral lymph node แ ล ะ

pre-scapular lymph node จานวน 320 ตวอยาง

โดยวธ Real-time PCR เมอเปรยบเทยบกบวธการ

เพาะแยกเชอ พบวาใหผลบวกทงวธ Real-time PCR

และวธการเพาะแยกเชอ จานวน 49 ตวอยาง ให

ผลบวกโดยวธการเพาะแยกเชอ แตใหผลลบโดยวธ

Real-time PCR จานวน 4 ตวอยาง ใหผลลบตอ

วธการเพาะแยกเชอ แตใหผลบวกตอวธ Real-time

PCR จานวน 19 ตวอยาง และใหผลลบตอการตรวจ

ท งว ธ Real-time PCR และวธการเพาะแยกเชอ

จานวน 248 ตวอยาง และพบวาวธการเพาะแยกเชอสามารถตรวจพบเชอ B. melitensis ได 53 ตวอยาง

สวนวธ Real-time PCR สามารถตรวจพบเชอ B.

melitensis ได 68 ตวอยาง (ตารางท 3)


42

ตารางท 2 เชอแบคทเรยชนดอน (non-Brucella spp.) ทใชทดสอบความจาเพาะ

Species Source Real-time PCR result

Burkhoderia cepacia DMST 15507 negative

Burkhoderia pseudomallei DMST 19919 negative

Burkhoderia pseudomallei DMST 25426 negative

Burkhoderia pseudomallei IMM/NIAH negative

Burkhoderia thailandensis DMST 6431 negative

Corynebacterium pseudotuberculosis IMM/NIAH negative Eschericia coli ATCC 25922 negative

Escherichia coli O157:H7 BACT/NIAH negative

Listeria monocytogenes BACT/NIAH negative

Mycobacterium paratuberculosis IMM/NIAH negative

Mycobacterium ovis IMM/NIAH negative

Pseudomonas aeruginosa BACT/NIAH negative

Salmonella enteritidis ATCC 13076 negative

Salmonella typhimurium ATCC 14028 negative

Staphylococcus aureus BACT/NIAH negative

Staphylococcus epidermidis BACT/NIAH negative

Streptococcus agalactiae BACT/NIAH negative

Vibrio cholerae BACT/NIAH negative

Vibrio parahaemolyticus BACT/NIAH negative

Yersinia enterolitica ATCC 9610 negative

วจารณการทดลอง

จากผลการศกษา พบวาความเขมขนของดเอน

เอตาสดทวธ Real-time PCR สามารถวเคราะหได คอ 2 เฟมโตกรม ผลการทดสอบความจาเพาะ ไมม

ปฏกรยาขามกบแบคทเรยชนดอน และวธ Real-

time PCR มค าความไว 92.45% ความจ าเพาะ

92.88% และคาความถกตอง 92.81% พบวาวธการ

เพาะแยกเชอสามารถตรวจพบเชอ B. melitensis ได

53 ตวอยาง สวนวธ Real-time PCR สามารถตรวจ

พบเชอ B. melitensis ได 68 ตวอยาง จ า ก ก า ร ศ ก ษ า ข อ ง Bounaadja et al.

(2009) โดยศกษาการตรวจหาเชอบรเซลลาดวยวธ

Real-time PCR ใชยน IS711 ยน bcsp31 และยน

per เปนยนเปาหมาย กบเชอ B. melitensis 16 M

พบวายน IS711 เปนยนทใหคาความไวดกวา ยน

bcsp31 และยน per และพบวาไดคาปรมาณดเอน

เอตาสด (LoD) เทากบ 2 เฟมโตกรม ซงในการวจย


43

ครงนใชยน IS711 เชนเดยวกนพบวาใหผลเหมอนกน

ซ งแตก ตางจากการศ กษาของ Probert et al.

(2004) ทใหคา LoD สงกวามาก สวนการศกษาทใช

ยนเปาหมายท แตกตางกน โดย Sohrabi et al.

(2014) ไดศกษาโรคบรเซลโลสสในคนทตดเชอ B.

melitensis จากตวอยางซรมโดยวธ Real-time PCR

ใชยน bcsp31 และ Bogdanovich et al. (2004) ท

ใชยน per ในการตรวจหาเชอบรเซลลาพบวา ไดคาดเอนเอตาสด (LoD) ของเชอ B. melitensis ทมคาสง

กวาการศกษาครงน และจากการศกษาการทดสอบ

ความจาเพาะกบเชอ non-Brucella spp. พบวา

ใหผลลบตอเชอ Brucella spp. คดเปน 100%

เหม อน กบการศ กษาของ Bogdanovich et al.

(2004) Probert et al. (2004) Bounaadja et al.

(2009) และ Sohrabi et al. (2014) ดงนนวธ Real-

time PCR สามารถนามาใชในการตรวจหาเชอ B.

melitensis ได จ ากผลการเป ร ยบ เท ยบ ว ธก าร

ตรวจหาเชอ B. melitensis โดยวธ Real-time PCR

กบวธการเพาะแยกเชอ จากตวอยางอวยวะของแพะ

เนอคร ง น พบวาไดค าความไว (Sensitivity) คา

ความจาเพาะ (Specificity) และคาความถกตอง

(Accuracy) คอนขางสง สวนวธการเพาะแยกเชอ

สามารถตรวจพบเชอ B. melitensis ไดนอยกวาวธ

Real-time PCR อาจเนองมาจากเชอบรเซลลาเปน

เชอทโตชาและเพาะเลยงเชอยาก (Seleem et al.,

2010) และอาจเกดจากผลลบเทจ (false negative)

จากการเพาะแยกเชอ เนองจากตวอยางททดสอบม

การปนเปอนเชอชนดอน ทาใหไมสามารถดโคโลน

ของเชอบรเซลลาไดอยางชดเจนหรออาจเปนผลมาจาก เกดการยบยงเชอของยาบางตวทอยในอาหาร

selective agar ทใชสาหรบเลยงเชอ B. melitensis

(Blasco, 1 9 9 2 ) ว ธ Real-time PCR เ ป น ว ธ ท

สามารถเพมจานวนผลบวกของสตวทตดเชอไดใน

กรณทตรวจดวยวธทางซรมวทยาหรอวธการเพาะ

แยกเชอแลวใหผลการตรวจเปนลบ (Hinic et al.,

2009) จากการศกษาการตรวจวนจฉยโรคบรเซลโล

สสโดยวธ Real-time PCR ในครงน สามารถใชตรวจ

โรคจากสงสงตรวจไดโดยตรง โดยไมตองใชวธการ

เพาะแยกเชอ ทาใหลดการสมผสเชอและลดความ

เสยงในการตดเชอจากการปฏบตงานได การตรวจ

ว น จ ฉ ย โรค บ ร เซ ล โล ส ส ท ม ค ว าม ถ ก ต อ ง ม

ความสาคญมากในการควบคม และกาจดเชอ วธ

ตารางท 3 เปรยบเทยบผลการตรวจหาเชอ B. melitensis จากตวอยางอวยวะ ระหวางวธ Real-time PCR

กบวธการเพาะแยกเชอ โดยวธ chi-square

Isolation

Real-time PCR

+ - Total

+ 49 19 68

- 4 248 252

Total 53 267 320

ความ ไว (Sensitivity) = 49/(49+4) X 100 = 92.45%

ความจาเพาะ (Specificity) = 248/(248+19) X 100 = 92.88%

ความถกตอง (Accuracy) = (49+248)/(49+19+4+248) X 100 = 92.81%


44

Real-time PCR เป น ว ธ ห น งท ม ป ระส ท ธภ าพ

สามารถวเคราะหไดรวดเรว มความไวเปนทยอมรบ

สาหรบตรวจวนจฉยโรคบรเซลโลสส ความถกตอง

แมนยา และความจาเพาะ คอนขางสง รวมทงลด

ระยะเวลาในการตรวจวเคราะหได ปจจบนราคา

คอนขางถก สามารถนามาใชตรวจในบรเวณทเปน

endemic area ได และแนะนาใชเปนทางเลอกใน

การตรวจเชอบรเซลลา (Probert et al., 2004; Redkar et al., 2001)

สรปผลการทดลอง

การศกษาครงน พบวาวธ Real-time PCR

สามารถตรวจหาความเขมขนของดเอนเอท ตามาก

ซงใช primers และ probe ทมความจาเพาะตอยน

IS711 ขอ งโรคบ ร เซ ล โลส ส พบม ค าค วาม ไว

(Sensitivity) คาความจาเพาะ (Specificity) และคา

ความถกตอง (Accuracy) คอนขางส ง สามารถ

นามาใชในการตรวจวนจฉยโรคทมความปลอดภย

รวดเรว ถกตอง แมนยา ไดอกวธหนง เพอทาใหเพม

ประสทธภาพในการชนสตรโรคบรเซลโลสสไดถกตอง

และรวดเรวมากขน


คณะผวจยขอขอบคณเจาหนาทกลมอมมน

และซรมวทยา และเจาหนาทกลมแบคทเรยและเชอ

รา สถาบนสขภาพสตวแหงชาต กรมปศสตว ทกๆ

ทานทใหความชวยเหลอ และใหคาแนะนาตางๆ ท

เปนประโยชน และขอขอบคณ Animal and Plant

Quarantine Agency, Anyang, Gyeonggi do,

สาธารณรฐเกาหลทสนบสนนคาใชจายในการวจยครง

นจนสาเรจลลวงดวยด


อโณทย โภคาธกรณ. 2549. เอกสารประกอบประชม

เชงปฏบตการ เรอง Introduction to Real

time-PCR and its applications. ภาควชา

พ ย า ธ ว ท ย า ค ณ ะ แ พ ท ย ศ า ส ต ร

มหาวทยาลยสงขลานครนทร.

Alton, G.G., Jones, L.M. and Pietz, D.E. 1975.

Laboratory techniques in brucellosis, second ed. Monograph Series No. 55

World Health Organisation, Geneva.

Blasco, J.M. 1992. Diagnosis of Brucella

melitensis infection in small ruminants.

In: Plommet, M. (Ed.), Prevention of

Brucellosis in the Mediterranean

Countries. Puduc Scientific Publishers,

Wageningen, The Netherlands. 272-278.

Blood, D.C. and Henderson, J.A. 1968.

Veterinary medicine. Bailliere Tindal

Cassel Ltd. London, England.

Bogdanovich, T., Skurnik, M., Lubeck, P.S.,

Ahrens, P. and Hoorfar, J. 2004.

Validated 5’ Nuclease PCR Assay for Rapid Identifidation of the Genus

Brucella. J. Clin. Microbiol. 42: 2261-

2263.

Bounaadja, L., Albert, D., Chenais, B.,

Henault, S., Zygmunt, M.S., Poliak, S.

and Garin-Bastuji, B. 2009. Real-time

PCR for identification of Brucella spp.:

A comparative study of IS711, bcsp31

and per target genes. Vet. Microbiol.

137:156-164.


45

Bricker, B.J. 2002. PCR as a diagnostic tool for

brucellosis. Vet. Microbiol. 90: 435-446.

Godfroid, J., Cloeckaert, A., Liautard, J.P.,

Kohler, S., Fretin, D., Walravens, K.,

Garin-Bastuji, B. and Letesson, J.J.

2005. From the discovery of the Malta

fever’s agent to the discovery of a

marine mammal reservoir, brucellosis has continuously been a re-emerging

zoonosis. Vet. Res. 36: 313-326.

Hinic, V., Brodard, I., Thomann, A., Holub, M.,

Miserez, R. and Abril, C. 2009. IS711-

based real-time PCR assay as a tool for

detection of Brucella spp. in wild

boars and comparison with bacterial

isolation and serology. BMC Vet. Res.

5:22.

Kanitpun, R., Ekgatat, M., Thammasart, S. and

Nokdhes, C. 2006. Identification of

Brucella spp. by polymerase chain

reaction. J. Regional Bureau Anim.

Health Sanitary. 6. 3: 1-9. Kwok, S. and Higuchi, R. 1989. Avoiding false

positive with PCR. Nature. 339: 273-8.

Lapaque, N., Moriyon, I., Moreno, E. and

Gorvel, J.P. 2005. Brucella

lipopolysaccharide acts as a virulence

factor. Microbiology. 8: 60-66.

Nielsen, K. 2002. Diagnosis of brucellosis by

serology. Vet. Microbiol. 90: 447-459.

Office International Des Epizooties. 2012.

(cited 18 July 2013). Terrestrial Manual.

Biosafety and biosecurity in the

veterinary microbiology laboratory and

animal facilities. Available from:

http://www.oie.int/fileadmin/Home/en

g/Health_standards/tahm/1.01.03_BIOS

AFETY.pdf.

Pappas, G., Panagopoulou, P., Akritidis, N.,

Christou, L. and Tsianos, E.V. 2006. The new global map of human brucellosis.

Lancet Infect. Dis. 6: 91-99.

Pellicer, T., Ariza, J., Foz, A., Pallares, R. and

Gudiol, F. 1988. Specific antibodies

detected during relapse of human

brucellosis. J. Infect. Dis. 157: 918-924.

Probert, W.S., Schrader, K.N., Khuong, N.Y.,

Bystrom, S.L. and Graves, M.H. 2004.

Real-Time Multiplex PCR Assay for

Detection of Brucella spp., B. abortus,

and B. melitensis. J. Clin. Microbiol. 42:

1290-1293.

Redkar, R., Rose, S., Bricker, B. and

DelVecchio, V. 2001. Real-time detection of Brucella abortus, Brucella

melitensis and Brucella suis. Mol. Cell.

Probe. 15: 43-52.

Seleem, M.N., Boyle, S.M. and

Sriranganathan, N. 2010. Brucellosis: A

re-emerging zoonosis. Vet. Microbiol.

140: 392-398.

Sohrabi, M., Mobarez, A.M., Khoramabadi, N.,

Doust, R.H. and Behmanesh, M. 2014.

Efficient diagnosis and treatment


46

follow-up of human brucellosis by a

novel quantitative TaqMan real-time

PCR assay: A human clinical survey. J.

Clin. Microbiol. 52: 4239-4243.


สตวแพทยสตวแพทยมหานครสารมหานครสาร JJOOUURRNNAALL OOFF MMAAHHAANNAAKKOORRNN VVEETTEERRIINNAARRYY MMEEDDIICCIINNEE


การยอยไดของโภชนะไขมนโครงสรางทมกรดสเตยรกและกรดปาลมมตกเปนองคประกอบในสนข

เฉลมพล เยองกลาง1,2 ไกรสทธ วสเพญ1,2,# ศศพนธ วงศสทธาวาส1.2 และ Anton C. Beynen2,3

1สาขาวชาเทคโนโลยการเกษตรและสงแวดลอม คณะวทยาศาสตรและศลปศาสตร มหาวทยาลยเทคโนโลยราชมงคลอสาน

วทยาเขตนครราชสมา อ.เมอง จ.นครราชสมา 30000 2สาขาวชาสตวศาสตร คณะทรพยากรธรรมชาต มหาวทยาลยเทคโนโลยราชมงคลอสาน อ.พงโคน จ.สกลนคร 47160

3Vobra Special Petfoods, Veghel, ประเทศเนเธอรแลนด

บทคดยอ: ไขมนโครงสรางทมกรดสเตยรกและกรดปาลมมตกเปนองคประกอบนาจะมประสทธภาพการยอย

ไดตา ซงมบทบาทเสมอนวตถดบอาหารเพอสขภาพ ทใหพลงงานตามากและสามารถใชประกอบในอาหารสตร

เพอลดนาหนกสาหรบสนขได จากรายงานพบวาครงหนงของไขมนโครงสรางน ประกอบดวย กรดสเตยรกรอย

ละ 55 และกรดปาลมมตกรอยละ 44 ในการศกษาครงนเปนการทดสอบอาหารสาหรบสนข ดาเนนการโดย

วดคาสมประสทธการยอยไดของไขมนโครงสรางดวยวธผลตาง (difference method) โดยเปรยบเทยบกบ

นามนปาลม วางแผนงานทดลองแบบ 3 × 3 ละตนสแควร โดยใชสนขพนธโกลเดนทรทรฟเวอร จานวน 11

ตว ซงไดรบอาหารแหงสาเรจรปจากบรษททไมเสรมนามนปาลม หรอ เสรมนามนปาลมรอยละ 10 หรอ เสรม

ไขมนโครงสรางรอยละ 10 ผลการศกษาพบวาคาสมประสทธการยอยไดของนามนปาลมและไขมนโครงสราง

เทากบรอยละ 96.6 และ รอยละ 68.8 ตามลาดบ ดงนนจากการศกษาครงนสามารถสรปไดวาคาสมประสทธ

การยอยไดของไขมนโครงสรางมคาการยอยไดทสงมากเกนไปสาหรบประกอบสตรอาหารทใหพลงงานตามาก

เพอชวยลดนาหนกสนข นอกจากนการเสรมอาหารดวยไขมนโครงสรางทดแทนนามนปาลมสงผลใหเพม

ปรมาณมลทขบออก ซงมสาเหตมาจากการลดลงของคาสมประสทธการยอยไดของวตถแหง อนมผลมาจาก

การยอยไดทตาของไขมนโครงสรางและการลดลงของการยอยไดของคารโบไฮเดรตทไมใชโครงสราง

คาสาคญ: ไขมนโครงสราง กรดสเตยรก กรดปาลมมตก คาสมประสทธการยอยไดของโภชนะ สนข #ผรบผดชอบบทความ สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 47-56. E-mail address: [email protected]

เฉลมพล เยองกลาง และคณะ / สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 47-56.

48

Digestibility of a Structural Fat Consisting of Stearic and Palmitic Acid in Dogs

Chalermpon Yuangklang1,2, Kraisit Vasupen1,2,#, Sasiphan Wongsuthavas1.2

and Anton C. Beynen2,3

1Department of Agricultural Technology and Environment, Faculty of Sciences and Liberal Arts, Rajamangala

University of Technology-Isan, Nakhon Ratchasima Campus, Muang, Nakhon Ratchasima 30000 Thailand 2Department of Animal Science, Faculty of Natural Resources, Rajamangala University of Technology-Isan,

Sakon Nakhon Campus, Phang Khon, Sakon Nakhon 47160 Thailand 3Vobra Special Petfoods, Veghel, The Netherlands

Abstract: It was speculated that a structured fat consisting of stearic and palmitic acid

would have sufficiently low digestibility that it could serve as functional ingredient in a very-

low energy, weight-reduction diet for dogs. The fatty-acid moiety of the structured fat under study contained 55 % stearic acid and 44 % palmitic acid. In a feeding trial with dogs, the

apparent digestibility of the structured fat was determined by the difference method and

compared with that of palm oil. In a 3x3 Latin square-design, 11 dogs were fed a commercial

dry food without or with 10% added palm oil or structured fat. The digestibility of palm oil

was found to be 96.6 % and that of the structured fat was 68.8 %. It is concluded that the

digestibility of the structured fat is too high for the formulation of a very-low energy, canine

weight-reduction diet. The addition to the diet of the structured fat, instead of palm oil,

increased the amount of feces. This was caused by a lower apparent digestibility of dietary

dry matter, due to the low digestibility of the structured fat and a decrease in the

digestibility of non-structural carbohydrates.

Keywords: Structured fat, Stearic acid, Palmitic acid, Nutrients digestibility, Dog #Corresponding author J. Mahanakorn Vet. Med. 2016. 11(1): 47-56. E-mail address: [email protected]

Introduction Obesity is common in dogs, the

prevalence being as high as 30% in many

countries. The condition is associated with

an increased incidence of diseases such as osteoarthritis, cardiovascular disorders,

diabetes mellitus, hyperlipidemia, cancer

and skin problems (German, 2006). The


49

development of overweight has been shown

to reduce longevity in dogs (Kealy et al.,

2002). It is anticipated that weight loss in

obese dogs reduces the severity of disease

or prevents its development. Indeed, it has

been shown that weight loss improves the

clinical signs of osteoarthritis in obese dogs

(Mlacnik et al., 2006). Weight loss can only be achieved by creating a negative energy

balance: energy intake must be less than

energy expenditure. This implies food

restriction, ideally in combination with

increased exercise. A specific weight-

reduction diet with low energy content may

have surplus value in the treatment of

canine obesity. A low energy value can be

achieved by the combination of a low

content of fat and a high level of crude

fiber. On a weight basis, fats provide twice as

much energy as proteins or carbohydrates.

The energy value of crude fiber is

considered negligible in canine nutrition. Time-limited feeding of a low-energy, high-

fiber diet lowers energy intake (Weber et al.,

2007). In addition, such a diet may reduce

pet owner’s pitying because a reasonable

amount of food can be supplied while

imposing energy restriction. Technically, the

energy value of a low-fat, high-fiber, weight-

reduction diet can be lowered further by the

replacement of carbohydrates by a fat

source that is indigestible or poorly

digestible. Indigestible fats do not provide

energy. For poorly digestible fats to be

applicable, they must provide substantially

less energy than carbohydrates. Ideally, the

indigestible or poorly digestible fat

contributes to diet palatability. In rats,

digestibilities of different fat sources are

negatively correlated with melting points above 30 oC (Clifford et al., 1986). It is likely

that high-melting point, and thus solid state,

impairs the emulsifying capacity of the

digestive tract. Higher degree of saturation

and longer chain length of the constituent

fatty acids of fats are associated with higher

melting point. Fats that are rich in stearic

and palmitic acid can be structured by

enzymatic hydrolysis, fractionation and

selective re-esterification of palm oil. It

would be anticipated that such fats have

low digestibility and might be useful as

ingredient of a weight-reduction diet for

dogs. Clearly, it should be excluded that the structured fat has any negative impact on

health. It is reassuring that the long-term

feeding to dogs of a dry diet containing 10 %

of an indigestible sorbitol fatty acid

polyester did not cause steatorrhea or any

other negative effects (Miller et al., 1991).

The questions to be addressed in the

present experiment with dogs were as

follows. 1) What is the apparent digestibility

of a structured fat consisting of stearic and


50

palmitic acid? To answer this question the

apparent digestibility of the fat preparation

was determined by the difference method

and compared within the same experiment

with that of palm oil. 2) Does inclusion of

the structured fat into the diet of dogs affect

feed intake, body weight and feces quality?

3) Does the structured fat versus palm oil have an effect on the digestibility of crude

protein, non-structural carbohydrates

(nitrogen-free extract), crude fiber and

minerals?

Materials and Methods

Dogs and housing

Eleven Golden Retrievers, aged 8

months, were used. There were 8 intact

males and 3 spayed females. The dogs were

housed as a group in a confinement (10 ×

10 m) located under a roof, but otherwise

with open air. Within the confinement there

were 12 cages (1.0 × 0.5 × 0.6 m) with

plastic grated floor. The animals could move freely within the confinement, including the

open cages. However, during feeding and

feces collection intervals, the dogs were

locked up in their own cage.

Experimental design

The dogs were subjected to a 3 × 3

Latin square design with three experimental

diets and three periods of three weeks each.

Per diet order there were 3 or 4 dogs. Table

1 shows the ingredient and analyzed

composition of the three experimental diets.

The control diet was a commercial diet of

one production batch. The extruded diet

was homogenized, water was added and the

mixture was put through a pelleting

machine. The pellets were sundried. The test diets were made in the same manner,

but after homogenizing either 10 % palm oil

or the structured fat, (Cargill, Schiedam, The

Netherlands), was added. According to the

manufacturer, the structured fat contained

44% palmitic acid (P) and 55% stearic acid

(S). The composition of triacylglycerols (with

P or S at the 1, 2 and 3 position of the

glycerol molecule) was as follows: PPP,

6.3%; SSS, 6.7%; SPS, 4.8%; PSP, 33.9%; SSP,

35.7% and PPS, 8.1%. The manufacturer

declared a slip melting point of 55-60 oC for

the structured fat.

A restricted amount of each diet was fed in two equal portions per day. During

feeding, the dogs were confined in their own

cage for a period of 15 min. The daily

amount of food provided was equivalent to

5,752 kJ (1,375 kcal) and 4,314 kJ (1,031 kcal)

of metabolizable energy for the males and

females, respectively. The amounts of

energy were equivalent to those fed prior to

the experiment. To calculate the energy

value of the experimental diets, the energy


51

values for protein, fat and non-structural

carbohydrates were taken to be 17 (4.06), 37

(8.84) and 16 (3.82) kJ (kcal) metabolizable

energy per gram. It was assumed that crude

fiber and the structured fat would not

provide energy. The calculated energy value

of the control diet was 1,612 kJ (385

kcal)/100 g. For the test diets with palm oil or structured fat the calculated energy

densities were 1,821 (435) and 1,451 (347

kcal) kJ/100 g. The energy density of the

control diet was based on the guaranteed

analysis panel on the packaging: crude

protein, 27 %; crude fat, 13 %; crude fiber, 3

%; ash, 6 %; moisture, 9 %. During the last 5

days of each period, the dogs were locked

up in their own cage. From each dog the

feces were collected quantitatively.

Measurements

At the beginning of each period, body

weights of the dogs were determined. Throughout the experiment, the feces

quality was scored on a 1-5 scale (Waltham

Faecal Grading System). Feed and feces

samples were processed for the proximate

analysis of macronutrients (dry matter, crude

fat, crude protein, crude fiber, ash) and

minerals (calcium, phosphorus) as described

(Vasupen et al., 2008). Nitrogen-free extract

was calculated as residual fraction.

Statistical analysis

The data were evaluated for diet

effects with the use of ANOVA. If there were

statistically significant diet effects, the three

diet groups were compared with the Tukey

test. The paired Student’s t test was used to

evaluate the digestibilities of the two fat

sources. P<0.05 was taken as criterion of statistical significance.

Results

Table 1 shows the analyzed

composition of the experimental diets. The

protein content of the control diet was

lower than that declared by the

manufacturer. As would be expected the

addition of palm oil and structured fat raised

the amount of crude fat in the diet, the

increase being somewhat smaller than that

calculated. The addition of extra fat lowered

the concentrations of crude prSotein and

minerals. It was detected that the feces collected

during the first period of the Latin-square

design was not pooled properly. The feces

samples were discarded and the experiment

was extended by repetition of the first

period. Throughout the experiment there

were no food refusals: each dog ate its

ration within 15 min after administration.

Within each feeding period, there was no

significant change in body weight. Initial


52

Table 1 Ingredient and analysed composition

of the experimental diets Control Palm

oil

Structured

fat

Ingredient, g

Commercial

diet

1,000 900 900

Palm oil - 100 -

Structured fat - - 100

Chemical analysis, % of dry matter

Dry matter* 92.8 94.4 92.6

Crude fat 13.3 20.0 20.7

Crude protein 22.8 21.3 21.7

Crude fiber 3.6 3.3 3.9

Nitrogen-free

extract

53.5 49.3 47.6

Ash 6.8 6.1 6.1

Calcium 1.12 0.98 1.04

Phosphorus 0.74 0.68 0.66

*Expressed on product basis.

body weights were 26.8 ± 0.4 kg (mean ±

SEM) for the males and 20.9 ± 0.5 kg for the

females. The final body weights were 31.5 ±

0.5 and 25.3 ± 0.7 kg.

The inclusion of structured fat versus

palm oil in the diet significantly elevated the

amount of fresh and dry feces (Table 2). The

diet containing structured fat significantly

increased the percentage of dry matter in

feces. The mean values were 30.9 % for

both the control and palm-oil diet. After

feeding the structured-fat diet, the feces

contained 34.1 % dry matter. The SEM was

0.34 %. The feces score was slightly, but

significantly, lowered by the addition of

either palm oil or structured fat to the diet

(Table 2). A feces score of 2.5 is equivalent

to well formed stools with a slightly moist

surface.

Apparent digestibility of dry matter

was reduced by 2.7 % units after feeding the diet with structured fat (Table 3). The intake

of palm oil did not influence dry-matter

digestibility. Structured fat versus palm oil in

the diet significantly reduced apparent,

total-fat digestibility. The digestibility of

crude protein was not differently influenced

by the experimental diets. The addition of

fat to the diet markedly raised the apparent

digestibility of crude fiber, irrespective of the

type of fat. Group mean apparent

digestibility of the nitrogen-free extract was

lowered by the addition of palm oil to the

diet, but more so, and significantly, by the

addition of structured fat. The three diets did not differently influence the apparent

digestibility of ash. Calcium absorption was

not clearly affected by diet, but phosphorus

absorption was significantly lowered by high

fat intake (Table 3).

The apparent digestibilities of palm oil

and structured fat were calculated by the

difference method. The mean digestibility of

palm oil was found to be 96.6 ± 2.61 % and

that of structured fat was 68.8 ± 18.71%


53

Table 2. Feces production and score for dogs (n=11) fed the experimental diets

Control Palm oil Structured fat SEM P value

Feces g/day 225a,b 204b 255a 7.3 0.027

g dry matter/day 69b 63b 87a 2.3 <0.001

Score 2.6a 2.5b 2.5b 0.02 0.028 a,b Means not sharing the same superscript letter are significantly different (P<0.05)

Table 3. Apparent digestibility of nutrients in dogs (n =11) fed the experimental diets

Control Palm oil Structured fat SEM P value

Apparent digestibility, % of intake

Dry matter 79.0 79.0 76.3 0.62 0.079

Crude fat 93.9b 95.1b 83.8a 1.40 <0.001

Crude protein 79.2 79.1 79.9 2.05 0.959

Crude fiber 33.7a 43.1b 44.1b 1.65 0.004

Nitrogen-free extract 83.0b 81.4b 77.8a 1.27 0.028

Ash 33.0 30.9 37.1 2.12 0.578

Calcium 49.0 47.0 50.3 2.57 0.670 Phosphorus 64.0b 57.5a 58.6a 1.77 0.033 a,b Means not sharing the same superscript letter are significantly different (P<0.05)

(means ± SD). The difference was statistically significant (P<0.001).

Discussion

This study shows that the apparent

digestibility of palm oil in dogs is 96.6 %. For

comparison, an earlier experiment with dogs

documents that the apparent digestibility of

soybean oil, lard and beef tallow is 98 % for

all three fat sources (Gröner and Pfeffer,

1997). The observed digestibility for palm oil can be considered accurate.

The slip melting point of the

structured fat was 55 - 60 OC and the

apparent digestibility in the dogs was 68.8 %.

In rats, there is a strong, negative correlation

between fat digestibility and melting point

above 30 oC (Clifford et al., 1986). The rats in

the study of Clifford et al. (1986) were fed

diets containing 0.82 % safflower oil and 8%

of either trimyristin, tripalmitin or tristearin.


54

For safflower oil a digestibility of 95 % was

assumed and the digestibilities of the

variable fats were calculated. Trimyristin,

tripalmitin and tristearin were found to have

an apparent digestibility of 86, 31 and 13%,

respectively. The melting points were

reported to be 57, 64 and 73 oC (Clifford et

al., 1986). Thus, the observed digestibility of the structured fat in dogs corroborates the

negative relationship between melting point

and digestibility in rats.

The nutritional energy value of fat in

dog food is commonly set at 37 kJ (8.84

kcal) metabolizable energy per gram.

According to this study, the energy value of

the structured fat would be equivalent to

(68.8/96.6) x 37 = 26 kJ (6.21 kcal). For

dietary non-structural carbohydrates

(nitrogen-free extract), the assumed energy

value is 16 kJ (3.82 kcal)/g. The energy value

of the structured fat is much higher than

that of non-structural carbohydrates. Clearly, the structured fat cannot serve as substitute

for carbohydrates to lower the energy value

of dog food. Consequently, the structured

fat cannot be used for the formulation of a

very-low energy, weight-reduction diet.

The addition of the structured fat to

the diet instead of palm oil increased the

amount of feces. This is explained by the

lower average digestibility of dry matter seen

after feeding the diet with structured fat.

The lower digestibility of dry matter in turn

is explained by the significantly lower

digestibility of fat and nitrogen-free extract.

Possibly, the presence of the structured fat

in the digesta interferes with the enzymatic

digestion and/or absorption of

carbohydrates. The structured fat versus

palm oil did not significantly influence the apparent digestibility of crude protein, crude

fiber and ash.

The two high-fat diets versus the

control diet significantly increased the

apparent digestibility of crude fiber and

decreased that of phosphorus. These

observations are difficult to explain. High fat

intake would be expected to lead to higher

contents of fatty acids in the hindgut. This

would inhibit microbial fermentation of fiber

and thus induce lower apparent digestibility

of crude fiber. High fat intake would be

expected to cause the formation of calcium

soaps in the small intestinal lumen. The resulting decrease in calcium availability for

the formation of calcium phosphate

precipitate would raise apparent phosphorus

absorption. We are not aware of other

studies in dogs fed a high-fat diet and

describing the effect on fiber and

phosphorus digestibility. In cats, the addition

of beef tallow to the diet, at the expense of

an isoenergetic amount of carbohydrates,


55

did not influence phosphorus absorption

(Beynen and Opitz, 1994).

In conclusion, in this study with dogs

the structured fat consisting of stearic and

palmitic acid was found to have a low

digestibility, when compared with regular fat

sources. However, the digestibility was not

low enough to make the structured fat under study a candidate ingredient for the

formulation of very-low energy, weight-

reduction diets. The structured fat

significantly reduced the digestibility of non-

structural carbohydrates, thereby lowering

the energy value of this diet constituent, but

with little impact on the energy content of

the whole diet.

References

Beynen, A.C. and Opitz, R. 1994. Isoenergetic

substitution of dietary fat (beef tallow)

for carbohydrates (cooked corn starch

plus dextrin) does not affect magnesium absorption in cats. J. Anim.

Physiol. Anim. Nutr. 72: 176-183.

Clifford, A.J., Smith, L.M., Creveling, R.K.,

Hamblin, C.L. and Clifford, C.K. 1986.

Effects of dietary triglycerides on

serum and liver lipids and sterol

excretion of rats. J. Nutr. 116: 944-956.

German, A.J. 2006. The growing problem of

obesity in dogs and cats. J. Nutr. 136:

1940S-1946S.

Gröner, T. and Pfeffer, E. 1997. Digestibility of

organic matter and digestible energy in

single ingredients of extruded dog feeds

and their effects on faecal dry matter

concentration and consistency. J. Anim.

Physiol. Anim. Nutr. 77: 214-220.

Kealy, R.D., Lawler, D.F., Ballam, J.M., Mantz,

S.L., Biery, D.N., Greeley, E.H., Segre, M., Smith, G.K. and Stowe, H.D. 2002.

Effects of diet restriction on life span

and age-related changes in dogs. J.

Am. Vet. Med. Assoc. 220: 1315-1320.

Miller, K.W., Wood, F.E., Stuard, S.B. and

Alden, C.L. 1991. A 20-month olestra

feeding study in dogs. Fd Chem.

Toxicol. 29: 427-435.

Mlacnik, E., Bockstahler, B.A., Műller, M.,

Tetrick, M.A., Nap, R.C. and Zentek J.

2006. Effects of caloric restriction and

a moderate or intense physiotherapy

program for treatment of lameness in

overweight dogs with osteoarthritis. J. Am. Vet. Med. Assoc. 229: 1756-1760.

Vasupen, K., Yuangklang, C., Wongsuthavas,

S., Srenanul, P., Mitchaothai, J. and

Beynen, A.C. 2008. Macronutrient

digestibility in Kadon pigs fed diets

with isonitrogenous amounts of various

carbohydrate sources. Trop. Anim.

Health Prod. 40: 249-253.


56

Weber, M., Bissot, T., Servet, E., Sergheraert,

R., Biourge, V. and German, A.J. 2007. A

high-protein, high-fiber diet designed

for weight loss improves satiety in

dogs. J. Vet. Intern. Med. 21: 1203-

1208.

สัตวแพทย์มหานครสารjo ouurrn naall off mma ahhaanaakkoorrnn...

Documents